CN101974433A - 一种多菌灵复合降解菌和降解多菌灵的方法 - Google Patents

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呼世斌
朱凤晓
冯贵颖
王军玲
许炳云
孔洁
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Abstract

本发明公开了多菌灵复合降解菌和降解多菌灵的方法，该复合降解菌由两种菌组成，分别为产碱杆菌M-1和红平红球菌L-1；所述产碱杆菌M-1和所述红平红球菌L-1的复配比例为1∶4。降解多菌灵的方法为：接种量7％，降解条件为pH＝6，温度为30℃，降解时间为24h。24小时多菌灵降解率可以达到75.76％。

Description

一种多菌灵复合降解菌和降解多菌灵的方法 
技术领域
本发明涉及一种多菌灵复合降解菌和降解多菌灵的方法，属于生物高新技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于多菌灵污染土壤的生物修复及现代农业中的绿色无公害农产品的生产。 
背景技术
在农业生产中，人们广泛使用各种杀虫剂、杀菌剂、杀螨剂以及除草剂等有机类农药。其中，多菌灵是需求量为万吨级的杀菌剂品种，是我国农药出口的主要品种。自1967年由美国杜邦公司研制以来，多菌灵广泛应用于由真菌引起的作物病害和工业材料的防霉防腐。但是，多菌灵化学性质稳定，在自然环境中降解半衰期较长，对土壤中微生物群落的丰富度和优势度能产生一定的抑制作用，其在水果、植物、土壤中的残留可通过食物链的积累效应影响人类健康。 
由于多年来大量连续使用多菌灵，使得许多植物病菌对其产生了抗药性。为了达到防治效果，农民在使用时都加大了多菌灵的用量，导致了其在农产品中的残留量严重超标的问题，成为我国绿色农副产品出口贸易的壁垒。2007年，欧盟委员会将多菌灵在柑橘中的最大残留限量(MRL)由5mg/kg调整为0.05mg/kg；在食用菌类中的MRL由1mg/kg调整为0.1mg/kg。 
目前，化学农药的农业生产中的应用是不可完全替代的，因此，如何有效去除化学农药带来的污染问题受到普遍关注。相对于物理化学处理，微生物修复农药残留是一种更有效、更节约的污染治理途径，亦可带来显著的社会和生态效益。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种多菌灵复合降解菌和一种使用该复合降解菌降解多菌灵的方法。 
本发明提供的多菌灵复合降解菌由两种菌组成，分别为产碱杆菌M-1(Alcaligenes sp.)，编号为A，和红平红球菌L-1(Rhodococcus erythropolis)，编号为R。 
产碱杆菌M-1(Alcaligenes sp.)分离自长期施用多菌灵的杨凌地区大棚土壤。该菌株能以多菌灵为唯一碳源生长，菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面***、湿润光滑。菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，甲基红和V.P.反应阴性。在琼脂上的菌落不产生色素，氧化酶、接触酶阳性。不产生吲哚，不能水解淀粉、能够水解明胶，硝酸盐还原实验为阳性。又经16S rDNA序列分析初步将该菌株确定为产碱菌属(Alcaligenes sp.)。降解最适pH值为6.0，最适温度为25℃，72小时可将200mg/L的多菌灵降解90％以上。 
红平红球菌L-1(Rhodococcus erythropolis)分离自多年生产多菌灵的原药厂下水道污泥。该菌也可多菌灵为唯一碳源和能源生长，菌落呈红色、不透明的圆形，光滑，表面***，湿润，边缘完整。降解最适pH值为6.0，最适温度为30℃，72小时可完全降解初始浓度为200mg/L的多菌灵。其生理生化特性如下： 
表1菌株L-1的生理生化特性 
Figure BSA00000311018800021
+：POSITIVE；-：NEGATIVE 
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。 
培养基：①LB液体培养基：NaCl 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。②无机盐培养基：NaCl 1.0g，K2HPO4 1.5g，，KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO42.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。 
试剂和仪器：多菌灵(由陕西石油化工研究院提供，纯度98％)；UV-1200型紫外可见分光光度计，购自上海美谱达仪器有限公司；SKY-200B型恒温培养振荡器购自上海苏坤实业有限公司；高效液相色谱仪LC-2010AHT，购自日本岛津公司。 
多菌灵含量的测定方法： 
三波长校正法：配制5g/L(有效成分)的多菌灵标准溶液，按需稀释成相应浓度。移取100μL样品，用稀盐酸(1+11)定容至10mL。分别测定其在278、281和290nm波长处的吸光度，由ΔA＝A281-(A278+A290)/2计算出校正吸光度ΔA，根据标准曲线对样品中的多菌灵含量进行定量分析。 
高效液相色谱法：参见中华人民共和国农业行业标准NY/T 1680-2009。 
种子液的制备： 
将保存于斜面的两种菌株分别进行活化和驯化培养，挑取一环菌体，接种至LB液体培养基中，30℃下震荡培养24h。使用前调整其OD600均为1.0，移取5mL菌液，在4℃，4000r/min下离心5min，收集菌体，用灭菌的无机盐液体培养基洗涤1次后，用等体积的灭菌无机盐液体培养基悬浮，备用。 
单菌及复合菌对多菌灵的降解试验： 
在无机盐液体培养基中添加多菌灵标准溶液，使其浓度为200mg/L，总体系为100mL，调节pH为6.0。按5％的接种量接入单菌A、R和复合菌AR(复配比例为1∶4)，以接入无菌水为空白对照，每个处理设置3个平行。置于30℃，150r/min下摇床振荡培养。结果如表2所示： 
表2单菌及复合菌对多菌灵的降解 
Figure BSA00000311018800041
复合菌对不同浓度多菌灵的降解 
在无机盐培养基中添加多菌灵标准溶液，使其浓度分别为100、200、300、400、500、600mg/L，调节pH值为6.0，以5％的接种量接入复合菌群AR(复配比例为1∶4)，于30℃、150r/min的条件下摇床培养。结果如表3所示： 
表3复合菌对不同浓度多菌灵的降解 
Figure BSA00000311018800042
复合菌正交优化试验 
本实验在单菌对多菌灵的降解特性研究的基础上，考察温度、pH值和接种量三个因素对复合菌降解多菌灵的影响。采用三因素三水平正交实验方案，根据L9(34)正交表，进行有空列无重复试验。运用直观分析法及方差分析法对各因素的影响程度进行评估，并给出最佳组合条件。最佳组合为第5组试验，即温度30℃，接种量为7％，pH6.0，复 合菌AR即AR(1∶4) 
测定结果如下： 
表4单菌与复合菌对不同浓度多菌灵降解率的比较 
Figure BSA00000311018800051
表5正交试验数据处理 
Figure BSA00000311018800052
表6正交试验方差分析结果 
  Source   df   SS   MS   F   Pr＞F
  温度   2   22.2998   11.1499   0.43   0.7005
  pH   2   2924.04816   1462.0240   56.08   0.0175
  接种量   2   23.9013   11.9506   0.46   0.6857
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 
Figure ISA00000311018900011
Figure ISA00000311018900021
Figure ISA00000311018900031

Claims (4)

1.一种多菌灵复合降解菌，其特征在于，该复合降解菌由两种菌组成，分别为产碱杆菌M-1和红平红球菌L-1。
2.根据权利要求1所述的多菌灵复合降解，其特征在于，所述产碱杆菌M-1和所述红平红球菌L-1的复配比例为1∶4。
3.一种使用权利要求1所述多菌灵复合降解菌降解多菌灵的方法。
4.根据权利要求3所述的降解多菌灵的方法，其特征在于，接种量7％，降解条件为PH＝6，温度为30℃，降解时间为24h。
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