JPH04344465A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固体微粒子を用い検体
中の抗原、抗体などの免疫的に活性な物質の測定法に関
する。さらに詳しくは、本発明は、検体中の被測定物質
と免疫的に活性な物質を担持した固体微粒子と標識化し
た免疫的に活性な物質の２種類を用いて、被測定物質を
定量する測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫的に活性な物質、例えば抗体を担持
したポリスチレン等の微粒子を水などの液体媒体中に分
散させた分散液（ラテックス試薬）に、上記の免疫的に
活性な物質に対し選択的に反応性を有する検体中の物質
（被測定物質、例えば抗原）を作用させることにより起
こる凝集を観察することにより被測定物質を測定するラ
テックス凝集イムノアッセイ法（ＬＡＩＡ）がジェー・
エム・シンガーら（Ｊ．Ｍ．Ｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ
）により見出され［Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２１　８８８
（１９５６）参照］、その後様々な検討がなされている
。その中でも凝集の度合を視覚により判定する方法が、
定量的な測定は困難だが、簡便でかつ結果が短時間に得
られるという利点があることから実用上広く普及してい
る。また、近年になって凝集の度合を光学的に濁度の変
化として捉えることで定量分析も可能となり、広く行な
われるようになった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述した凝集
の度合を視覚的に捉える方法、光学的に捉える方法、い
ずれにしても、たとえば抗体を担持した固体微粒子の分
散液の場合、固体微粒子表面の抗体分子数に比べ、検体
中の抗原分子数が大過剰な系になると、過剰な抗原が抗
体と結合し多量体を形成し、凝集に関与する抗体の活性
部位を封鎖してしまうために生ずる抗原過剰域現象（い
わゆるプロゾーン現象）がみられる。すなわち、検体中
の抗原量が大過剰となると、抗原の濃度と反応後の凝集
状態が１：１の対応関係をとらず、検体との反応後の一
つの凝集状態に対し複数の対応する濃度がみられること
になる。このため、たとえば検体を希釈して２以上の濃
度で、それぞれ測定を行なう方法、凝集の状態を反応後
複数の時点で測定し、時間的な変化を、予め既知の濃度
の資料の時間的な変化と対照させて濃度の測定を行なう
方法などが行なわれている。しかし、上述の方法は操作
が煩雑であるため、より好ましいプロゾーン現象回避策
が求められている。又、プロゾーン現象の顕在化する検
体中の抗原濃度は、抗原の種類、用いる抗体の種類等に
より異なるため、画一的測定条件の設定は困難である。

【０００４】以上の説明では固体微粒子上に結合した抗
体により検体中の抗原を測定する例を示したが、その逆
、即ち、固体微粒子上の抗原により検体中の抗体を測定
する態様においても同様に考えてよい。以下、前者に基
づき説明を行なうが、文中抗体と抗原を入れ換えて考え
ることができ、その態様も本発明の技術的範囲に包含さ
れる。但し、一般的には、固体微粒子上への結合は、抗
体が抗原より容易であり、又、特異性の観点からも１価
抗体を担持させ、抗原を被測定物質とするほうが簡便と
いえる。

【０００５】本発明は、上記従来技術の問題点を解決し
、免疫反応に基づく測定法において発生しやすいプロゾ
ーン現象を抑止し、安定的に正確な測定を行ないうる方
法を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の問題
点につき検討を加えた結果、上述の、抗体（第１の物質
）を結合させた固体微粒子からなる第１の試薬と検体中
の抗原（被測定物質）を反応させ、ひき続き前記抗体と
は異なる、検体中の抗原に対する抗体（第２の物質）を
標識してなる第２の試薬を反応させ、生じた第１の試薬
／被測定物質／第２の試薬からなる複合体の標識量を測
定することにより、検体中の被測定物質を定量する方法
において、前記複合体を生成させる反応を、第１の試薬
を構成する微粒子同士の、被測定物質を媒介とした複数
の複合体（多量体）が生じないように、あるいは生じる
多量体の比率が一定の水準以下になるよう物理的作用を
及ぼしながら行なうことによりプロゾーン現象を確実に
抑止できることを見出し本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、検体中の被測定物質
に対し免疫的に活性な第１の物質を固体微粒子（以下、
微粒子という。）の表面に結合させてなる第１の試薬と
検体を液体媒体中に反応させて、第１の試薬と被測定物
質との複合体１を生ぜしめ、次いで、被測定物質に対し
免疫的に活性な、第１の物質とは異なる第２の物質を予
め標識してなる第２の試薬を加え、前記第１の試薬／被
測定物質の複合体１と反応させて、第１の試薬／被測定
物質／第２の試薬からなる複合体２を生ぜしめ、つづい
て、複合体２の標識量を測定することにより、検体中の
被測定物質を定量する方法において、前記複合体１と第
２の試薬の反応を、下記で定義される複合体１の単分散
度ｘ（％）を９０以上になるよう物理的作用を及ぼしな
がら行なうことを特徴とする免疫測定法である。

【０００８】

【数２】 （式中、ｎは単量体である複合体１の数、Ｓは総粒子数
を示す。）以下、本発明について詳細に説明する。まず
、本発明において検体として対象となるものは、血液、
リンパ液、腹水、尿などの生体試料、組織培養液、細胞
培養液、組織抽出液などの試料液であり、被測定物質と
しては、免疫グロブリン、ホルモン、血漿たんぱく、バ
クテリア類、原虫類、薬物類およびそれらの抗体等を列
挙でき、１価、多価の抗原又は抗体であって、免疫反応
に基づき測定し得るものであれば対象とするとができる
。

【０００９】図１は本発明に基づく反応の模式図および
多量体を生じた従来技術に基づく反応の模式図である。 但し、本図においては第１および第２の物質として抗体
、被測定物質として抗原を採用した態様を示しているが
、前述したように、本発明においては、それぞれを入れ
換えて考えることができ、本図に何ら限定されるもので
ない。

【００１０】図１に示すように、従来技術においては、
第１の試薬と検体を反応させたときに、被測定物質が複
数の第１の物質を捉えるため、この状態ですでに単分散
でなくなっており、これに標識した第２の物質を結合さ
せ被測定物質を測定しようとしても、多量体の形成状態
によって第２の物質との反応性が変化するため正確な測
定は不可能となる。一方、本発明においては、第１の試
薬と検体を反応（即ち、第１の物質と被測定物質の反応
）にあたり、反応液に物理的作用を及ぼし（本図では攪
拌）ながら行なうため多量体は生成しないか、あるいは
生成しても再び解離し、ある一定以下に多量体の数を制
御するため、第２の物質との反応性は一定となる。これ
は、微粒子表面と第１の物質との結合力が、第１の物質
と被測定物質との結合力より強く、所定の物理的力の作
用により前者の結合を切ることなく後者の結合を選択的
に多量体形成に関与するものを切ることが可能となるた
めである。

【００１１】即ち、微粒子と第１の物質との結合は、後
述するが、例えばアミノ基、カルボキシル基、アルデヒ
ド基などを介した化学的結合又はファンデアワールス力
、静電引力などによる物理的結合であり、一方、第１の
物質と被測定物質との結合は免疫反応に基づくものであ
り、例えば疎水結合、水素結合による結合であり、後者
の結合は前者のものより一般的に弱く適当な処理を施す
ことにより選択的に切ることができる。ここで、第１の
物質と被測定物質の複合体１が単分散（単量体）ではな
く凝集状態（多量体）にある場合、適当な物理力の作用
は、凝集体の破壊、単量体の破壊、第１の物質の微粒子
表面からの剥離、の順に及ぶことになる。従って、ある
物理力の作用を加えることで、単量体を選択的に生成さ
せることが可能となるのである。

【００１２】以下、本発明の測定法に係る各要素につい
て具体的に説明する。本発明に用いられる第１の試薬を
構成する成分の１つである微粒子としては、生物に由来
する微粒子、無機系微粒子、有機系微粒子を挙げること
ができる。前記生物に由来する微粒子としては、例えば
、赤血球分散処理されたブドウ球菌、連鎖球菌等の細菌
類等が挙げられる。前記無機系微粒子としては、例えば
、シリカ、アルミナ、ベントナイト等が挙げられる。 また前記有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩
化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸
エステル類、メタクリル酸エステル類などのビニル系モ
ノマーの単一重合体および／又はそれらの共重合体、ス
チレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−
ブタジエン共重合体などのブタジエン系共重合体などの
微粒子が挙げられる。こうした微粒子への免疫的に活性
な物質の結合は、後述するように、物理的および／又は
化学的になされるが、その中で物理的結合は微粒子表面
が疎水性であることが好ましく、スチレン単一重合体微
粒子、スチレンを主成分とするビニル系重合体微粒子又
はスチレンを主成分とするスチレン−ブタジエン共重合
体が特に好ましい。上述の微粒子の粒子径は、生物に由
来する微粒子、無機系微粒子、有機系微粒子のいずれの
場合にあっても０．１μｍ乃至１０μｍが好ましく、０
．５μｍ乃至５μｍが特に好ましい。粒子径が０．１μ
ｍを下廻ると光学的な測定が難しくなり、又１０μｍを
上廻ると分散液の安定性が不良になる。

【００１３】本発明に用いられる微粒子の表面に結合さ
せる免疫的に活性な物質（第１の物質）および標識化す
る免疫的に活性な物質（第２の物質）としてはそれぞれ
独立に、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＥなどの免疫グロブリン
：補体、ＣＲＰ，フェリチン，α１　マイクログロブリ
ン，β２　マイクログロブリンなど血漿蛋白およびそれ
らの抗体：α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥ
Ａ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ−
１９−９、ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれら
の抗体：黄体化ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（
ＦＳＨ）、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、エス
トロゲン、インスリンなどのホルモン類およびそれらの
抗体：ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ，ＨＢｅ，ＨＢｃ），Ｈ
ＩＶ，ＡＴＬなどウイルス感染関連物質およびそれらの
抗体：ジフテリア菌、ボツリヌス菌、マイコプラズマ、
梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およびそれらの抗
体：トキソプラズマ、トリコモナ、スリーシュマニア、
トリパノゾーマ、マラリア原虫などの原虫類およびそれ
らの抗体：フェニトイン、フェノバルビタールなどの抗
てんかん薬、キニジン、ジゴキシニンなどの心血管薬、
テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコール、
ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物類およびそれ
らの抗体：その他酵素、菌体外毒素およびそれらの抗体
などがあり、検体中の被測定物質と特異的に抗原−抗体
反応を起こす物質が検体の種類に応じて適宜選択されて
使用される。

【００１４】微粒子と第１の物質の結合は、例えば特開
昭５３−５２６２０号公報、特公昭５３−１２９６６号
公報等に記載の、物理的および／又は化学的結合する公
知の方法により行なうことができる。

【００１５】微粒子と第１の物質を化学的に結合させる
には、微粒子表面に例えばアミノ基、カルボキシル基、
ヒドロキシル基、オキシラン基などを配向させポリアミ
ド化合物、ポリイミド化合物、ポリアルデヒド化合物、
ポリオキシラン化合物などを介し第１の物質と化学的に
結合させる方法、微粒子表面にアルデヒド基、オキシラ
ン基などを配向させ第１の物質と化学的に結合させる方
法などがある。

【００１６】この微粒子と第１の物質との結合反応は、
水又は水およびアルコール類、ケトン類などの水と相溶
性のある有機溶媒との混合溶媒中で行なうことが好まし
い。又反応系中には微粒子の単分散系としての安定化、
非特異凝集の防止などの目的でリン酸塩緩衝液−生理食
塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などの緩衝液、牛血清ア
ルブミンなどの不活性蛋白質、界面活性剤などを添加す
ることが好ましい。反応溶液（即ち、分散媒）のｐＨは
通常６〜１０、好ましくは７〜９である。又、反応溶液
（分散媒）中の微粒子の濃度は通常０．０１〜２．０（
重量）％である。

【００１７】次に、本発明に用いられる標識した免疫的
に活性な物質（第２の物質）からなる第２の試薬は次の
ように調製されうる。

【００１８】まず、第２の物質の標識化には、例えばラ
ジオアイソトープを用いる方法（ラジオイムノアッセイ
）、酵素を用いる方法（酵素標識イムノアッセイ）、蛍
光試薬を用いる方法（蛍光標識イムノアッセイ）等があ
るが、取扱い上の安全性、簡便性などから蛍光試薬を用
いる方法が好適である。蛍光試薬としては、従来公知の
物質が使用可能であり、例えばフルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネー
ト、スルホローダミン１０１酸クロリドなどが挙げられ
る。これらの蛍光試薬による第２の物質の標識化はいず
れも公知の方法により行なうことができ、例えば、抗体
のＦＩＴＣ標識体は、ｐＨ９の炭酸ナトリウム緩衝液中
で抗体とＦＩＴＣを低温（４℃）で１２時間反応させた
後に、分離精製することにより得られる。

【００１９】次に、上述のようにして用意された第１お
よび第２の試薬を用いて検体中の目的物質の測定を行な
う。

【００２０】まず、第１の試薬と検体を混合攪拌し第１
の反応を行なわせる（以下、第１及び第２の物質は抗体
、被測定物質は抗原の例を挙げる）。これにより、検体
中に第１の試薬の微粒子表面に結合された抗体（第１抗
体という。）に対する抗原が含まれる場合、抗原−抗体
反応により第１の試薬中の抗体と抗原は結合し、第１の
試薬／抗原からなる複合体１を生ずる。この反応により
抗原を媒介に第１の試薬の微粒子同士の複合体（多量体
）を同時に生じる場合凝集反応も起こることになる。 本発明では、抗原−抗体反応時物理的力を加えることに
より、第１の試薬と検体を均一に混合・反応させるとと
もに生じた多量体を、第１の試薬１粒子と検体中の抗原
との複合体（単量体）に解離させ、及び第１の反応時多
量体を生じさせない。この多量体から単量体への解離は
、微粒子表面／第１抗体の結合力と第１抗体／抗原の結
合力の差異を利用したものである。即ち、所定の大きさ
の物理的力の作用により多量体は単量体へ解離するが、
単量体はそれ以上破壊されることなくかつ微粒子上の第
１抗体も破壊されない。ここで、所定の大きさの物理的
力とは、多量体を単量体へ解離するに充分であるが、単
量体を破壊することのない大きさの力である。化学的作
用により多量体を解離する方法や、希釈度調整により多
量体生成を抑制する方法に比べ、本発明の物理的解離方
法では安定的に簡易に単量化を実現することができる。

【００２１】物理力としては、例えば攪拌具による攪拌
、超音波等による水分子等の振動（キャビテーション）
等によるものを例示できる。攪拌具によるものは、究め
て得簡便に物理力を有効に作用させることができ、具体
的な攪拌手段としては、各種攪拌羽、スターラーを用い
て所定の回転数で対象の反応液を攪拌すればよい。 又、超音波を用いる方法は反応液量を少なくすることが
できる。これら物理力を加える手段もその特長を生かし
適宜選択することができる。

【００２２】物理的作用の付与は、抗原−抗体反応（被
測定物質−第１の物質の反応）の際に当所から実施する
か、又は標識した抗体（第２の物質）の反応を始める前
に実施し、いずれにしても標識した抗体の反応前に単量
化が終了していればよい。好ましくは、抗原−抗体反応
当所から物理的作用を付与するとよい。

【００２３】付与する物理的作用の大きさは、目的とす
る被測定物質の種類、用いる第１の物質、微粒子の種類
、及び担持方法等により異なり、適宜、下記の測定によ
り単量体量を測定し適正条件を設定すればよい。

【００２４】即ち、単量体の確認は、例えばフローサイ
トメータなどにより行なうことができ、複合体１（第１
試薬／抗原）の解離状態を次の方法で測定できる。

【００２５】攪拌されている第１の反応により得られた
ものの一部を希釈し、フローセルに導く。希釈の度合は
複合体１の塊が１つずつ送られる濃度に適宜調整される
。一つずつ送られた複合体１はレーザ光や紫外光等の光
を照射し、その結果生ずる光学的反作用、例えば散乱光
を測定することにより凝集の度合（単分散度）がわかる
。本発明の目的であるプロゾーン現象を回避するために
は、このときの単分散度が大きな影響を与えるが、本発
明者らは単分散度と測定精度の関係を鋭意研究の結果、
複合体１の総粒子数Ｓに対し単一粒子複合体１の数ｎの
比率ｚ（単分散度）を

【００２６】

【数３】 とした場合、ｘ≧９０を満足させる程度の単分散系とす
ることにより上記目的が達せられることを見出したので
ある。ｘが９０未満では多量体によるバイアスが有意に
測定値に影響を及ぼすが、９０以上であればその影響を
許容範囲内に抑えることができる。好ましくは９５以上
である。

【００２７】次に、第１の反応で単分散度が上述の範囲
になることを確認してから、複合体１と標識抗体からな
る第２の試薬との第２の反応に進む。単分散度を上述の
範囲に満足させることにより、複合体１と第２の試薬の
反応量比は実質上一定となり、すなわち検体中の抗原量
に応じ第２の試薬との反応量比も実質上一定となるため
、検体中の抗原量に応じ一定の組成の第１の試薬／抗原
／第２の試薬からなる複合体２が得られる。

【００２８】第２の試薬を加え反応を終了した反応液中
に含まれる複合体２に起因する標識の信号をとり出すこ
とにより抗原量が測定されるわけであり、このことによ
り、抗原量に対応した一定の測定値が得られることにな
る。

【００２９】複合体２に含まれる標識の測定は、たとえ
ば前述の複合体１の解離状態を測定したのと同様の方法
によりなされる。即ち、第２の反応により得られた複合
体２を含む反応液を、複合体２の塊が１つずつ送られる
濃度に希釈調整後フローセルに導く。１つずつ送られた
複合体２はレーザ光や紫外光等の光を照射し、その結果
生ずる光学的反作用、例えば散乱光、蛍光等を順次測定
することによりなされる。

【００３０】上記測定には、例えば臨床検査３０（１１
）１２５９に示されるような光軸直交型、同一光軸型の
フローサイトメータなどが好適に用いられる。上記装置
を用い、検体中の抗原量を求めるには、上記方法により
測定された複合体２の単量体中の標識量データと、予め
つくられた抗原量と標識量の関連を示す検量線データと
を対比することにより、検体中の抗原量を求めればよい
。以上述べたように、本発明によれば、検体中の被測定
物質の量に拘らず、プロゾーン現象のない、高感度で高
精度の測定が可能である。

【００３１】

【実施例】以下、実施例を示し本発明を説明する。 第１の試薬の製造： 抗ヒトＣＲＰヤギ血清（Ｂｉｏ　Ｍａｋｏｒ　製）をＰ
ｒｏｔｅｉｎ−ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ　（ファルマシア
製）のカラムクロマトグラフィーによりＩｇＧ分画に精
製し、ｐＨ５．５の０．１Ｍリン酸塩緩衝液に１０ｍｇ
／ｍｌの濃度となるように希釈した。粒径０．７１ｎｍ
のカルボキシル化ポリスチレン（日本合成ゴム（株）製
Ｇ０７０１）１０％水−懸濁液１０ｍｌに縮合剤として
１−シクロヘキシル−３−［２−モルホリニル−（４）
−エチル］カルボジイミド　　メト−ｐ−トルエンスル
ホネート（以下カルボジイミドＴｓ）の１％水溶液２５
ｍｌを加え、さらに上述のＩｇＧ分画抗体２０ｍｌを加
え、室温で３時間攪拌し、感作ラテックスを得た。上記
感作ラテックスを遠心洗浄後、１％牛血清アルブミン３
％ショ糖となるよう調製したｐＨ７．２のリン酸塩緩衝
液−生理食塩水（以下ＰＢＳ）を加え、微粒子濃度０．
２重量％のＣＲＰ抗体感作微粒子（第１の試薬）の分散
液を得た。 第１の試薬とＣＲＰ血清反応： 標準ＣＲＰ血清（協和油化製）をＴｒｉｓ　　ＨＣｌ緩
衝液で希釈し、５０μｇ／ｍｌの濃度としたものをＣＲ
Ｐ検体とした。上記第１の試薬１ｍｌをスターラーで攪
拌しながら、上記ＣＲＰ検体１ｍｌを添加、反応させな
がら、反応液の一部を採り、フローサイトメータにより
単分散度ｘを求めたところ９６であった。 第２の試薬の反応および蛍光強度の測定：上記単分散度
ｘが９６の反応溶液１ｍｌをスターラーで攪拌しながら
、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＲＰヒツジＴｇＧ（バインディ
ングサイト製）をｐＨ５．５の０．１Ｍリン酸塩緩衝液
で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈後１ｍｌ添加し室温で６０
分間スターラーで攪拌反応させた。反応液を遠心洗浄後
ＰＢＳを加えスターラーで攪拌、分散させ微粒子濃度０
．１重量％のＣＲＰ抗体感作微粒子／ＣＲＰ／ＦＩＴＣ
標識抗ヒトＣＲＰヒツジＴｇＧ複合体の分散液を得た。 上記反応液の一部を採り、フローサイトメータにより複
合体の蛍光強度を求め、あらかじめ作成してある検量線
より、ＣＲＰ濃度を求めたところ再現性よく、値が得ら
れた。

【００３２】

【発明の効果】以上説明したように、ラテックス試薬を
用いるイムノアッセイ法において微粒子に担持した第１
の物質と被測定物質との抗原−抗体反応を行なう際、多
量体生成を抑止するよう物理的作用を付与することによ
り、測定の正確性及び感度が向上し、又安定的な測定が
可能となる。又、本発明によれば、検体中の被測定物質
量によれば、常に一定の測定を簡便に実施することがで
き、第１の物質に１価あるいは多価抗体又は抗原を測定
目的の物質に応じ選択することにより、所望の測定を可
能とする。特に、反応の際の物理的作用を攪拌により生
起させ、又蛍光標識物質を第２の物質とすることで、簡
便性はさらに向上する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定原理を説明するための反応模式図
である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　検体中の被測定物質に対し免疫的に活
   性な第１の物質を固体微粒子の表面に結合させてなる第
   １の試薬と検体を液体媒体中で反応させて、第１の試薬
   と被測定物質との複合体１を生ぜしめ、次いで、被測定
   物質に対し免疫的に活性な、第１の物質とは異なる第２
   の物質を予め標識してなる第２の試薬を加え、前記第１
   の試薬／被測定物質の複合体１と反応させて、第１の試
   薬／被測定物質／第２の試薬からなる複合体２を生ぜし
   め、つづいて複合体２の標識量を測定することにより、
   検体中の被測定物質を定量する方法において、前記複合
   体１と第２の試薬の反応を、下記で定義される複合体１
   の単分散度ｘ（％）を９０以上になるよう物理的作用を
   及ぼしながら行なうことを特徴とする免疫測定法。 【数１】 （式中、ｎは単量体である複合体１の数、Ｓは総粒子数
   を示す。）
2. 【請求項２】　　物理的作用が、液体媒体の攪拌による
   作用である請求項１に記載の測定方法。
3. 【請求項３】　　被測定物質が抗原、第１及び第２の物
   質が該抗原に対する抗体である請求項１に記載の測定方
   法。
4. 【請求項４】　　第２の試薬の標識が蛍光標識である請
   求項１に記載の測定方法。