CN101611133A - 高效装置及培养细胞的方法 - Google Patents

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CN101611133A CNA2007800510375A CN200780051037A CN101611133A CN 101611133 A CN101611133 A CN 101611133A CN A2007800510375 A CNA2007800510375 A CN A2007800510375A CN 200780051037 A CN200780051037 A CN 200780051037A CN 101611133 A CN101611133 A CN 101611133A
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Abstract

本发明涉及提高细胞培养效率的方法和装置。它们包括使用透气培养室，以减少空间的使用，同时维持均匀的培养条件，并且更适合自动液体操作。它们包括将透气材料集成至传统的多层形式以解决培养条件不均匀的问题。它们包括培养装置，其使用由透气材料构成的表面，充有等离子体的硅酮，并且集成传统的附着表面，例如由传统的经组织培养处理的聚苯乙烯构成的那些表面。它们包括集成了透气透液膜的培养装置。这样产生多种优点，包括放大期间更优化的培养条件，以及对存量空间、培养箱空间和处理空间更有效的利用。还有，可以减少工作量和污染风险。

Description

高效装置及培养细胞的方法
相关申请
本申请要求2006年12月7日的美国临时申请60/873,347的权利，通过引用将该申请全部并入本文。
本文引证的各申请和专利，或所述各申请和专利中引证的参考文献(包括各授权专利审查期间，“申请引用文献”)，以及与任意这些申请和专利相应的和/或要求任意这些申请和专利的优先权的各PCT和外国申请，以及各所述申请引用文献中引证或参考的各文献，以及以John Wilson为发明人的全部专利和共同未决申请，通过引用在此明确地并入本文。更一般地，本文引证的文献或参考，且各所述文献或参考(“本文引证参考”)，以及各所述“本文引证参考”中引证的各文献或参考(包括任意制造商的说明和介绍)，通过引用在此明确地并入本文。
政府利益
本发明的形成得到了美国政府通过国家卫生研究院小企业创新研究基金(National Institutes of Health Small Business Innovative Research)授予号DK0659865“Islet culture，shipping，and infusion device”的部分支持。美国政府在本发明中拥有一定权利。
技术领域
本发明涉及改进细胞培养效率的方法和装置。它们包括透气培养室的使用，在维持均匀的培养条件时可减少空间的使用，并且更适个液体的自动处理。它们包括将透气材料集成到传统的多层形式内，以解决细胞培养条件不均匀的问题。它们包括使用由透气的、充有等离子体的硅酮构成的表面，它们还能与传统的附着表面，例如由传统的经组织培养处理(tissueculture treated)的聚苯乙烯构成的那些表面，集成为一体。它们包括将透气、透液的膜集成为一体的培养装置。
背景技术
细胞培养是生物技术的核心部分。组织培养瓶是细胞培养常用的装置，因为它们可以培养粘附性细胞类型也可以培养非粘附性细胞类型，是一次性的，并且可在静态方式下工作而无需灌注培养基的设备。传统瓶有一个培养室。它们的设计要求在装置内存在供培养物气体交换的气-液界面。培养基的驻留高度必须很低，使得向细胞的氧传递不会受到削弱。对于组织培养瓶，建议的培养基高度为2mm～3mm。然而，瓶体必须足够大以保持气体，并允许使用(通常是)移液管吸取培养基。因此，相对其盛装的培养基体积，培养瓶具有较大的装置体积。例如，常用的T-175培养瓶具有大约长23cm、宽11cm的底面，大约高3.7cm，并因此需占936cm3的空间。但是，其工作时培养基通常为约50ml。因此，相对培养瓶瓶体所占的空间(936cm3)，在瓶体中的培养基(50ml)显示仅有瓶容积的约5％被培养基占用。而且，将由培养瓶瓶体占用的空间(936cm3)的容积除以供细胞驻留在上面的表面区域(175cm2)，表明由培养瓶占用的空间的容积是其提供给细胞驻留其上的表面积的5倍以上。培养瓶制造成具有各种数量的供细胞驻留其上的表面积，通常的面积为25cm2～225cm2，因此，只有较小的培养容量。因为在培养放大期间使用越来越多的培养瓶，相对于它们提供的较小的培养基体积和有限的培养表面积，它们占用的整个空间量导致了固有的对于空间的低效利用，这加重了培养过程的负担，因为与运输、灭菌、储藏、培养箱空间以及废弃处理相关的成本过高。工作量以及污染风险的大幅增加进一步加深了这个问题。
多层培养瓶，如NUNCTM Cell Factory(美国专利No.5,310,676)和
Figure G2007800510375D00021
(美国专利No.6,569,675)，试图通过以垂直方向堆叠培养层以在一各培养瓶内形成多个培养室，来解决培养瓶放大效率低的问题。这在一个装置内形成了更多的表面积，并且这使得可以有比传统培养瓶中更多的细胞驻留在多层培养瓶内。这样，一个多层培养瓶可以代替多个传统培养瓶。该多层培养瓶可设置成使得培养基可以通过共用汇集点取放，从而不需要用移液管通向各个培养室。这使得与传统培养瓶的高度相比，多层培养瓶的各层之间的距离可以减低。例如，NUNCTM Cell Factory的培养层之间的空间为约1.4cm，相对常用的T-175培养瓶的底部和顶部之间3.7cm的距离，在储藏、运输、灭菌、培养和废弃处理空间的利用方面有了一些改善。多层培养瓶中通气口允许与环境大气之间的气体交换，以调节pH、供氧以及有助于维持温度控制。然而，在多层培养瓶内的任意给定位置的气体与通气口位置的距离不同。由于在放大时多层培养瓶内培养室数量增多，离通气口最远点的气体和最近点的气体之间的距离随之增大，在多层培养瓶内的全部气体中会形成CO2和O2浓度梯度。因此，多层培养瓶设计本身具有在整个装置内存在不均匀的培养条件不均匀的可能性，该问题在放大时更加严重。
有许多静态细胞培养装置，它们通过使装置的下壁透气来实现气体传递。气体通过透气下壁扩散，以响应形成在培养基和环境气体之间形成的浓度梯度。这种方式不以气-液界面作为唯一的气体交换源。因为细胞驻留其上的表面是透气的，与所述多层培养瓶相比会存在更均匀的培养条件。培养袋是静态透气装置，其包含单一培养室。为了放大培养，培养袋必须沿水平方向伸长，以获得供细胞驻留其上的更大表面积。因此，在放大时，它们很快变得难以处理并且超出细胞培养箱的尺寸。OriGen BiomedicalGroup(OriGen PermaLifeTM Bags)、Baxter(
Figure G2007800510375D00031
X-FoldTM涉及美国专利4,829,002，4,937,194，5,935,847，6,297,046B1)、Medtronic(Si-CultureTM，美国专利No.5,686,304)、Biovectra(VectraCellTM)以及American Fluoroseal(VueLifeTM Culture Bag System，由美国专利4,847,462和4,945,203保护)有市售培养袋。透气培养器是和培养袋以同样的方式工作的装置，区别在于它们具有刚性的侧壁。市售透气培养器包括
Figure G2007800510375D00032
Culture Cassettes(由Laboratories MABIO-
Figure G2007800510375D00033
提供)和
Figure G2007800510375D00034
透气培养器(美国专利6,455,310和6,410,309)(由BioChrystal Ltd.提供)。对于培养袋，为了提供更多供细胞驻留其上的表面积，这些装置必须在水平方向伸长。在美国专利No.6,821,772中，
Figure G2007800510375D00035
的发明人提出了多个透气培养室。不幸的是，这种方案仅仅增加了水平方向上的培养室数量。因此，无论培养室的数量是多少，为了增加这些装置的培养容量，它们必须在水平方向上制作得更大。这些透气装置都不能在垂直方向放大。
在更有效地利用空间的努力中，美国专利No.6,673,595记载了通过在垂直方向堆叠独立的物理上不同的培养器，并且以非常复杂的自动化***来操作各独立培养器，来放大
Figure G2007800510375D00036
透气培养器。这种放大方式明显背离了传统多层培养瓶具有的简单性。
美国专利No.6,759,245记载了一种多层透气培养装置，其通过采用透气不透液膜将氧输送和培养基输送相分离。该发明基于这样的发现，如果通过透气不透液膜将液体培养基和含氧流体的流动分开，且细胞附着于膜的液体侧生长，那么装置可用于利用穿过所述膜的氧传输来培养细胞，而无需考虑液体培养基经过装置的流量。其优点在于液体培养基的流量不再依赖于将氧携带至细胞的需求。然而，虽然培养基的流动大幅降低，因为其仅需要携带如葡萄糖之类的物质，其失去了培养悬浮细胞的能力，因为在使用时悬浮细胞会被从装置洗出。在这种方式中，细胞必须附着于胶原基体。另外的缺陷是需要灌注气体空间和/或液体空间。这需要泵、流体管道，与传统多层培养瓶相比大大提高了复杂程度。因此，这种方式还没有商业化。
共同未决美国专利申请No.10/961,814(Wilson等)记载了一种更有效地利用空间的透气装置。Wilson等的‘814记载的所述透气装置允许在垂直方向放大，同时保留传统多层培养瓶的简单性。例如，Wilson等的‘814记载了透气装置的垂直放大，所述透气装置由一个一个堆叠的供细胞驻留其上的培养层构成。气体传递通过装置的壁进行。与传统透气装置的放大不同，可通过增加装置在垂直方向而非水平方向的尺寸来增加培养规模。因为不需要气-液界面，这使得在垂直放大培养规模时优化了空间效率。得到了相对所述多层培养瓶更加紧凑的装置。存在传统多层培养瓶中不可能的特性。例如，所述装置可以倒转，以使得粘附细胞可以在堆叠培养层的上表面和下表面上培养以进一步优化空间效率。本文记载的发明在共同未决申请Wilson等的‘314上进一步发展，得到了新的几何形状，其为传统多层培养瓶提供了优良的替代方式。
本发明的目的是提供改进的细胞培养装置和方法，将整个装置内存在不均匀培养条件的可能性降到最低，允许对粘附细胞或悬浮细胞进行空间效率较高的培养放大，易于使用，可在无需灌注培养基或气体的前提下工作，并使得使用者可以有效利用各培养室的上、下或侧壁表面。通过随后的说明和附图可以使进一步的目的和优点变得清楚。
发明内容
本发明通过集成至少两个透气培养室，克服了现有静态细胞培养装置的许多缺点，所述培养室至少部分地将气体空间保持在它们之间，以使得气体可以与培养室的透气区域接触。这使得各培养室可以与邻近该培养室的气体空间直接交换气体，将培养条件不均匀的可能性降到最低。培养室的选定表面可以制成是透气的，以在与细胞相对和/或靠近细胞的表面上进行气体交换。培养室内的表面可由各种材料构成，以提供供细胞驻留其上的最佳表面。如果有需要(例如在培养粘附细胞或在三维基体中生长的细胞的情况下可能需要)，培养室内的表面积可以增大。细胞还可以直接驻留在培养室的透气材料上。通过增加培养室使得气体空间至少部分地处在各培养室之间，以允许气体与培养室的透气区域接触，来实现装置的放大。通过一个或多个共用集流腔，或通向各培养室的独立通路，可以实现与培养室的通路。凭借这种构造，可以用简单的方式放大培养规模，这种方式易于使用，有效利用空间，并将发生培养条件不均匀的可能性降到最低。可以包括各种部件，并可以设置成各种构造，以提供附加的优点，包括使得装置可以在一种以上的状态下操作，允许培养粘附细胞，允许培养悬浮细胞，允许共培养，防止日常操作期间细胞离开它们各自的培养室，将补料频次减到最低，利用传统培养瓶的操作方式，允许在培养期间增加或减少共细胞驻留其上的表面积，允许在培养期间增加或减少培养基体积与共细胞驻留其上的表面积的比率，以及/或允许细胞驻留在替代材料上或驻留在替代材料附近。
本发明的一个方面中，各培养室包括第一壁和相对的第二壁，所述第一壁和/或第二壁由透气材料构成，且气体空间存在于各培养室的至少一部分之间。
在本发明的另一方面中，各培养室包括多个壁，包括但不限于第一壁和相对的第二壁，第三壁和相对的第四壁，以及第五壁，所述第一壁和/或第二壁和/或第三壁和/或第四壁和/或第五壁由透气材料构成，气体空间靠近各培养室的至少透气部分。
在本发明的另一方面中，所述培养室由一集流腔平行连接。所述集流腔可设置成防止气体置换保持在培养室内的培养基，并且/或者可以设置成在操作期间将细胞保留在培养室内，并且/或者可以设置成将培养基和气体保留在培养室内。
本发明的另一方面中，培养室由超过一个集流腔平行连接。
在本发明的另一方面中，培养室的高度可以改变。
在本发明的另一方面中，培养室支架位于培养室之间，以将培养室保持在基本上水平状态，并且/或者使得气体可以与培养室的透气表面接触。
本发明的另一方面中，培养室的壁包括于其相邻培养室中的至少一个接触的突起部，以将培养室保持在基本上水平的状态，并使得气体可以与培养室的透气表面接触。
本发明的另一方面中，提供了防止培养室的壁与相邻的培养室壁接触的结构。
本发明的另一方面中，培养室串联连接。
本发明的另一方面中，可以直接通向各培养室。
本发明的另一方面中，环境气体和透气多层装置的气体空间之间的接触可以有选择地被终止，限制或不受限制。
本发明的另一方面中，将细胞从一个培养室扩展到多个培养室是可能的。
本发明的另一方面中，当透气多层培养装置被定向成使得细胞驻留在培养室最下方的培养表面上，一个培养室的至少部分没有培养室直接位于其上，以方便显微镜评价。
本发明的另一方面中，当透气多层培养装置被定向成使得细胞驻留在培养室最下方的培养表面上，最下面的培养室和位于其上的培养室之间的气体空间使得光可以存在在最下方培养室上，以方便用倒置式显微镜对最下方培养室的评价。
本发明的另一方面中，通过将细胞接种到培养表面，并且重新定位装置以使细胞的另一接种物沉降到不同培养表面，可以实现共培养细胞的方法。
本发明的另一方面中，通过仅仅转动装置来一个表面一个表面地重新定位细胞，可以实现在特定表面、在特定氧压力、和特定培养基高度、和/或在特定的培养基体积与表面积之比率下培养细胞的方法。还可以培养至少5种不同的细胞系，各细胞系驻留在培养室的不同壁上。
本发明的另一方面中，培养室被制造成整体单元以将密封件的数量减到最少。
本发明的另一方面中，透气多层装置可设置成保留市售的传统多层培养瓶的结构，同时解决培养条件不均匀的问题。
本发明的另一方面中，公开了采用透气不透液材料，用于包括培养室支架以及气体空间与环境气体之间的无菌屏障的透气细胞培养装置。
本发明的另一方面中，公开了用充等离子体的硅酮构造透气装置，以将其向其它表面的迁移减到最低。
附图说明
图1A和图1B示出了一种透气多层装置的实施方式，该装置设置成使气体交换直接通过培养室的壁进行。该培养室通过集流腔平行连接以形成完整单元，该单元包括存在于培养室之间的气体空间。通行端口允许流体进出透气多层装置。
图2示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，该装置设置成允许气体通过培养室的第一壁传递，以允许通过处于离细胞最远距离的培养基的表面进行气体交换。
图3示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，该装置设置成允许气体通过培养室的第二壁传递，以允许细胞附近的气体交换。
图4示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，该装置被设置成允许通过培养室的第一壁和通过培养室的第二壁进行气体传递，以增加用于气体交换的表面积。
图5A、5B和5C示出了透气多层装置的立体图，所述装置被设置成具有第一壁和相对的第二壁，第三壁和相对的第四壁，以及第五壁。通过有选择地制造具有预定长度、宽度、表面积和材料成分的各个壁，以及具有预定材料和表面积的各培养表面，使用者可以从多种培养方式种进行选择。因此，通过仅仅改变所述透气多层装置的朝向，使用者可以使细胞处于各种培养表面类型、培养表面积、氧压力和培养基体积与培养表面积之比率。例如，当透气多层装置定向成如图5B所示时，培养基可以处于比透气多层装置定向成如图5A所示时更高的高度。当透气多层装置定向成如图5C所示，培养基会所处的高度可以超过当装置定向成如图5A或图5B中所示时可能达到的高度。
图6示出了透气多层装置的剖视图，该装置设置有气阱，以防止气体从培养室内部置换培养基。
图7A和7B示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，其设置成防止细胞在日常操作时离开培养室。图7C、7D和7E示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，其被设置成使得培养基和气体以预定的体积处于培养室内。
图8A、8B、8C和8C-1示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，该装置设置有两个集流腔。培养室平行地连接在集流腔之间，形成包括邻近各培养室的气体空间的整体单元。图8D和8E示出了在培养过程前或培养过程中如何改变培养基体积和/或透气表面积与培养室容积的比率。
图9A和9B示出了培养室支架的用途，用于使得气体与培养室的透气材料接触，并且/或者用于将培养室保持在基本上水平状态，以使得细胞均匀地分布在培养室内。
图10示出了培养室支架的用途，所述支架呈从培养室的壁部突出的突起部形式，用于使得气体与培养室的透气材料接触，并且/或者用于将培养室保持在基本上水平状态，以使得细胞均匀地分布在培养室内。
图11示出了处于培养室内的内部间隔件的作用，其用于防止壁以及/或者培养表面互相接触。
图12示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，其中培养室与进口和出口以串联方式连接。培养室形成整体单元，并包括邻近各培养室的气体空间。
图13示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，所述装置设置有独立的培养室和邻近各培养室的气体空间。其还示出了如何有选择地控制环境气体至气体空间的通路。
图14示出了透气多层装置的另一种实施方式，其被设置为控制环境气体至气体空间的通路。
图15示出了透气多层装置的另一种实施方式，其被设置为控制环境气体至气体空间的通路。
图16A和16B示出了使用透气多层装置从一个培养室向多个培养室扩展细胞的方法。
图17A示出了由硅酮成型的整体培养室，其将可能泄漏的连接件数量减到最少。图17B示出了作为单个工件制造的培养室整体组合。图17C示出了透气多层装置的分解图，其包括整体培养室，包覆成型法兰、两个集流腔和培养室支架。
图18A示出了传统多层培养瓶制造商推荐的用于解决培养条件不均匀问题的方式。图18B示出了该方式的放大图。图18C、18D和18E示出了透气多层装置的实施方式，所述装置设置成解决培养条件不均匀的问题，同时集成了市售的传统多层培养瓶的特点。在一实施方式中，气体传递通过装置的壁直接进行，使得在各培养室上的气体与周围环境的气体可以直接进行气体交换。在另一实施方式中，气体空间位于装置内，使得装置内的气体的气体交换通过气体空间的壁进行。气体空间的上壁可适用于使得气体交换独立于气-液界面，并且/或者气体空间的下壁可适用于使得气体通过气-液界面传递到培养物。在另一实施方式中，气体空间通过透气装置的壁与环境气体连通，气体空间的透气上壁作为培养室下壁，使得气体向培养物的传递独立于气-液界面而进行。
图19示出了从胰岛细胞培养中采集的数据的柱状图，因胰岛细胞高的氧需求，胰岛细胞培养是一种非常具有挑战性的培养类型。良好的结果证实，将有利的几何结构包括到其培养室支架中，透气多层装置独特的容量节约了空间，并提供了均匀的培养条件。
图20示出了一种试验装置的剖视图，该装置用于证实在将透气多层装置暴露于诸如伽马辐射之类的常用无菌处理之前，对由硅酮构成的材料充等离子体以将硅酮向其它表面的迁移减到最少的作用。
具体实施方式
图1A和图1B用于图示本发明的一些基本特征。在图示中，透气多层装置1集成了两个透气培养室20，这两个培养室部分地由气体空间50隔开。示出的两个培养室可说明一些基本的透气多层装置特征，但是可以设置任意的附加数量的培养室。图1A为立体图，去除了侧壁以暴露培养室20的内部。图1B示出了透气多层装置1的剖视图。培养室20包括第一壁110和相对的第二壁120。第一壁110、第二壁120、或第一壁110和第二壁120两者，可包括透气材料。象传统的细胞培养袋一样，第一壁110和第二壁120可固定在一起而无需侧壁。然而，最好具有侧壁，使得在整个培养室范围内，培养室的第一和第二壁之间的距离相同。还有，当所选的壁和侧壁包括透气材料时，透气多层培养装置的朝向可设置成使其能以多种位置工作，包括第一壁朝下、第二壁朝下或任意侧壁朝下。这使得细胞可驻留于(靠近)任意壁。当培养室的长度、高度和宽度的尺寸不同时，透气多层培养装置通过在接种和/或培养期间改变其位置，可提供独特的细胞上培养基高度以及/或者独特的培养基与表面积的比率。根据接种时的朝向，细胞会沉降到培养室内的任意表面。例如，处于图1B的位置时，细胞朝第二壁120沉降。细胞接触的表面可以仅仅是培养室壁的内表面。然而，细胞驻留其上的材料的期望成分和几何结构可以不是培养室壁的表面所代表的材料成分和几何结构。这样，任意能提供期望的材料和几何结构的部件、插件、基体等可构造成透气多层装置。因此，培养表面130可以仅仅是给定的培养室壁的内表面，或者可以是任意位于培养室内的部件、插件、基体等。仅仅为方便起见，在本申请通篇中，培养表面130被描述为在装置壁的内表面上，但这不限制本发明的范围。
如图1B所示，集流腔60形成培养室20之间的流体通道。通行口70使得可以加入或移除流体和细胞。在该图示中，通行口70包括颈部和以传统培养瓶的方式覆盖通行口70的盖子30。然而，通行口可以是任意构造，并且可以位于任意位置，只要能够实现将流体移入和移出透气多层装置的目的。细胞培养装置设计领域的普通技术人员可以认识到，可以有很多方法来实现该目标，包括许多封闭***构造，封闭***构造可包括使用设置成可无菌插接的隔板、快拆配件、或管道。
气体空间50不需要是装置的密封部分。该气体空间不需要具有强制气流，或适合于强制气流，来使装置工作。在该最简单和优化的形式中，仅仅是环境气体与装置的任意或全部透气部分相接触。然而，可以有一个或多个壁包围该气体空间。
在简单的操作方法中，将培养基和细胞送入透气多层装置内，并将透气多层装置放到标准的细胞培养箱内，该装置的朝向设置成使得细胞沉降到期望的表面。在较复杂的操作方式中，可进行追加接种，使得细胞沉降到另外的表面。例如，在接种时定期地对装置重新定位，细胞会驻留在所有的培养表面。
各培养表面130可以是任意合适的材料、任意可用于培养细胞的形状，所述表面可以与也可以不与细胞培养室的壁成为一体。例如，培养表面可以仅仅是包括了培养室的壁的内表面，也可以是经或不经组织培养处理。该材料可以是如专利号为5,935,847的美国专利记载的，层积于培养室的壁的材料。可以是与培养室的壁物理分离的材料，如位于壁上方的由聚苯乙烯制成的分离部，可以是固定或不固定于壁，如以纤粘蛋白或胶原蛋白为基质的***件。如细胞和组织培养领域的技术人员已知的，对任意培养表面的采用没有限制。
图2示出了怎样利用跨过培养室20的透气第一壁110的气体交换来实现均匀的培养条件。氧气流箭头100示出了，作为培养基80和气体空间50之间的氧浓度梯度的结果，氧怎样跨过透气的第一壁110输送到利用培养基80驻留在培养表面130上的细胞90。根据第一壁110的透气程度，最多事实上培养基的整个上表面可同时暴露于包围着装置的环境气体，不象传统的多层烧瓶，环境气体在位于离装置内各培养基位置不同距离的单一透气部位进入装置。如本文所述，在一些实施方式中，透气多层装置被构造成可以使气体和培养基驻留在培养室内。因此，运行期间，气体可驻留在透气第一壁110的两侧。通常，气体因气体空间和培养室内流体之间的分压差而进出培养室。
图3示出了跨过培养室的透气第二壁120的气体交换。氧气流箭头100示出了，作为培养基80和气体空间50之间的浓度梯度的结果，氧怎样通过透气第二壁120输送到驻留于培养室20内的细胞90。这样，各细胞室中的细胞比传统多层培养瓶中的细胞离环境气体可以更近。应注意确保构成培养表面130的材料对气体传递的阻碍，不会影响到对期望的细胞量进行供氧的需求和维持合适的pH的需求。例如，如果透气第二壁120由高透气性的材料如二甲基硅酮构成，而透气性较低的培养表面如聚苯乙烯位于该硅酮上，则向细胞的气体传递会被阻碍。通常，位于细胞和环境气体源之间的、对气体传输的阻碍程度最高的材料将成为限速因素。因此，为了优化透气多层装置的功能，设计时应考虑用于构建透气壁的材料的透气性，被使用的任意附加培养表面的透气性，以及培养物的氧需求。透气的多层装置为提供合意的气体交换和合意的供细胞驻留的材料考虑到了许多可选方案。然而，如果期望使用将会限制培养物气体交换的材料作为培养表面，可以通过培养室的相对壁和/或侧壁来加强气体交换。
图4示出了跨过培养室的透气第二膜120和跨过透气第一壁110的气体交换。氧气流箭头100示出了，作为培养基80和气体空间50之间的浓度梯度的结果，氧怎样通过透气第二壁120和透气第一壁110输送到培养室20。这样，各培养室都可以实现高水平的气体传递。
虽然图2，图3和图4示出了通过特殊的壁的气体传递，但透气多层装置的任意壁可以是透气性的。由于氧可直接通过细胞驻留的表面，和/或通过培养室的侧壁，以及/或通过集流腔壁输送至细胞，从而可以获得各种优点。Wilson等的‘814记载了通过增加可驻留在透气培养室内的培养基高度可以获得的优点。透气多层装置中的培养基高度的增加可远超过传统培养瓶的2mm～3mm的限度，从而将培养基更换的频次降低到最低，减少工作量并减少污染的风险。因此，如果可以进行跨越培养室的透气壁的气体传递，有利的是，将培养室构造成使得透气壁和相对壁之间的距离允许增加培养基高度。最佳距离取决于培养物的代谢需求和期望的培养基更换频次。
图5A、图5B和图5C示出了透气多层装置的放置方式的例子，这些放置方式提供了许多可供选择的培养方式。例如，当第一壁110、和/或第二壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、和/或第五壁126由具有不同透气性的材料构成时，通过将透气多层装置2定向成给定的状态，细胞会处于不同的氧压力下。然而，不必使用不同的透气材料来进行费力的操作方式。在第一壁110、和/或第二壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、和/或第五壁126附近的、与之成为一体或未成为一体的培养表面，其材料或表面积可以不同。当第一壁110、和/或第三壁122和/或第五壁126的大小不同时，将透气多层装置2朝向任意方位，也可提供了在培养之前或期间的任意时刻变更培养基的最大高度。对培养室的形状进行改变甚至可产生更多的可选方式。例如，由于装置朝向的变换，八角形为细胞提供了额外的可驻留其上的表面。
为达到在透气多层装置内实现均匀的培养条件的目标，设计应包含这样的目标：将基本等量的细胞放置在各培养室内，并促使各培养室内的那些细胞基本均匀地分布于整个培养室内。使各培养室的几何结构基本相同、将各培养室的相对的壁构造成基本平行、并使得培养室可放置成水平状态，以使得细胞可均匀地沉降到培养表面上，这样会有助于达成该目标。然后，当接种期间细胞处于均匀悬浮状态，且培养表面具有一致的几何结构时，接种物会以均匀的体积驻留在各培养室的培养表面上，且细胞会以均匀的分布沉积在各培养室的培养表面上。在培养表面不平坦，例如，存在起皱的表面的情况下，将培养室设置成在每单位培养表面上具有相同的空间体积，可有助于接种期间均匀的细胞分布。例如，如果培养表面起皱，且相对壁也起皱，该起皱的相对壁与培养表面之间的空间体积沿培养室的长度方向会保持恒定。无论培养表面是怎样的几何结构，将培养室构造成使得该培养室内的任意给定区域存在基本等体积的接种物，可有助于实现均匀的细胞分布。
优选地，当利用集流腔向培养室输送培养基时，该集流腔应构造成使得接种物均匀地分配到各培养室中，并使得沉积在集流腔内的细胞数量最少。使集流腔容积不大于能让培养基快速并容易地充入培养室所需的大小，这是有利的，因为驻留在滞留于集流腔内的培养基中的细胞会沉积到集流腔的底部，并与驻留在培养室内的细胞处于不同的培养条件。虽然在接种期间集流腔容积应最小化，以防止细胞沉积至不希望的区域，但是，允许过量的培养基驻留在集流腔内以减少装置高度可能是有用的，因为那些培养基会有助于提高各培养室内的培养基体积与表面积的比率。换句话说，集流腔内的培养基体积会使驻留在细胞室内的细胞获取基质。
图6示出了透气多层装置3的剖视图，该装置被设置成使装置内可能出现的气体进入不会对均匀培养条件的建立造成破坏的区域。集流腔60包括气阱61。气阱61的至少一部分高于最上面的培养室20。在该图示中，通行口70由隔片72覆盖。装置中的过量气体升到气阱61内，由此防止培养基被置换出任意的培养室。
在一些应用场合，期望在使用期间改变集流腔的形状或体积。将集流腔构造成改变形状或体积应该以不会导致染菌的方式进行，例如可以通过挠性壁或采用垫圈或O形圈来实现。例如，期望通过共用集流腔将细胞送入培养室，并且防止细胞从一个培养室移动到另一培养室或从培养室移动到集流腔内。当以这样的方式操作装置时，可能会使培养室定向至会不小心使细胞离开培养室的状态。堵塞培养室的一个或多个开口可以防止这种情况发生。作为另一例子，譬如当细胞已附着在培养室内时，在使用期间定期改变驻留在集流腔内的培养基的量是有利的，并且更多的培养基有利于将补料频次降低到最低。这样，可将集流腔设置成具有更大的容积。在其它应用场合，譬如当所期望的培养表面积与培养基体积的比率要求培养基的驻留高度应该低于培养室高度时，培养基最好不充满整个培养室。
图7A和图7B示出了实现这些目标的方式的图示。在图7A中，透气多层装置4的集流腔壁62处于第一状态，允许将细胞和培养基经通行口70通过集流腔60导入培养室20。图7B示出了处于第二状态的集流腔壁，其中集流腔60缩进，堵塞了培养室20的开口，防止细胞或培养基流出培养室20。培养室20可部分地盛有培养基，使得培养室20内驻留有培养基和气体，并且集流腔壁62可移动到图7B的状态以防止培养基流失到集流腔60内。然而，该实施方式也允许透气多层装置4被培养基完全充满，而无需移动集流腔壁62。
图7C、图7D和图7E示出了用培养基部分填充培养室的例子。图7C示出了透气多层装置4处于集流腔60朝向培养室20下方的状态，并且处于其内部驻留有预定量的培养基80的第一开启状态。该预定量的培养基体积少于各培养室的总容积。图7D示出了集流腔60被压缩，将培养基80从集流腔60赶入培养室20。图7E示出了透气多层装置4呈水平朝向，使得各培养室内驻留有培养基80和气体。当集流腔被闭合时，透气多层装置的内部容积减少，压力升高。压力升高和培养室内气体与液体的比率、培养室壁的挠性以及集流腔容积与装置容积的比率有关。压力的降低最终取决于培养室的哪些表面是透气性的。然而，集流腔随着其容积减小而产生的无菌通风可以更快地释放压力。本领域普通技术人员应认识到，有许多方法将集流腔构造成符合这些目标，包括采用挠性壁、在径向密封构造中设置有O形圈的刚性壁、以及其它方法(包括Wilson的美国专利No.7,229,820中记载的)。
当在使用期间培养基的温度下降时，移动集流腔壁62可能也是有利的。例如，胰岛细胞的培养的初始温度通常为37℃，然后降低至22℃。当透气多层装置是封闭体且盛有培养基时，培养基会随温度下降而收缩。许多透气材料是高挠性的。因此，当培养基收缩时，所述装置的壁会发生移动，以保持与培养基的接触。当所述壁移动，且细胞均匀地分布在壁上时，细胞会从均匀状态移动至不受控制的密度，并因此会损伤培养物的活力。因此，改变集流腔的容积以适应培养基体积的降低可以防止细胞从其均匀状态迁移。
如有需要，底脚135可以升高透气多层装置。底脚135使得气体可到达装置下侧并且/或者防止划伤第二壁120。底脚135可以是任何形式，装置的上壁适于可将一个装置以联锁方式放置在另一个装置之上。
将培养室与一个以上的集流腔平行连接，可使气体更容易被进入装置的液体置换。例如，当一个集流腔被使用时，在培养基进入集流腔的相反方向，气体被置换。带有一个集流腔的透气多层装置中，随着培养室高度的降低，变得有必要倾斜该透气多层装置以加速气体置换。形成附加的集流腔使得气体能以培养基进入装置方向之外的方向置换，并可减低或消除倾斜的必要性，由此简化自动流体处理。在测试装置中，作了判定是否无需倾斜所述装置就可以灌满培养室的评估，当集流腔中的培养基体积为测试装置中总容积的约7.0％时，可以实现灌满而无需倾斜。图8A、图8B和图8C示出了采用两个集流腔的一实施方式。图8A示出了透气多层装置5，删去了壁以暴露培养室20。气体空间50位于培养室20之间。在该图示中，气体空间50为穿通透气多层装置5的整个主体的开口。图8B示出了透气多层装置5，有部分被删去以暴露培养室20、第一壁110和集流腔60。图8C和图8C-1示出了图8A中沿8C-8C线的剖视图，露出了培养室20、气体空间50和集流腔60。在该实施方式中，液体进入通行口70并灌满集流腔60和培养室20，气体经由培养室20的远端上的另一集流腔60和第二通行口70被置换。
培养室的高度可以改变，以提供更多的操作方式。例如，如果将胰蛋白酶的使用量减到最少，或增加培养基的高度，可能是有利的。图8D和图8E示出了一种构造，其通过简单地由可打褶的挠性材料制作所述装置来实现培养室高度改变，使得培养室20的高度可以上升或下降。例如，界定气体空间的外壳和/或材料可以是挠性的。这样，透气多层装置可以膨胀，以使各培养室内的容积更大或更小，这会有利于降低补料频次、减少胰蛋白酶和/或PBS的使用、以及/或改变透气表面积与培养室容积之比。在该图示中，集流腔壁62是起皱的，但所述装置可适于通过多种其它方式允许培养室高度的变化，包括美国专利No.7,229,820记载的方式。本领域普通技术人员可以认识到实现这种特性的多种方式。
透气多层装置的优化性能中的一种因素是使用期间培养室的朝向。在使用期间，透气多层装置最好应该处于基本上水平的状态，以使细胞均匀地分布到细胞培养表面上。培养室支撑架可以象图5A所示的培养室支撑架40那样简单。这样，培养室支架40只提供简单的结构支撑以防止培养室互相坍缩。然而，根据构成培养室的壁的材料的刚性，最好形成更加精心制作的培养室支架。例如，一些重要的细胞培养应用最好在非常受控的几何结构内进行，其涉及分布非常均匀细胞沉积物，如胰岛细胞、肝细胞和多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cell)的培养。例如，胰岛细胞在高表面密度处接触时会发生聚集，多能成体祖细胞如果它们互相之间太接近可能会发生分化。肝细胞和胰岛细胞还需要高的气体传输速率来维持健康。因此，最坚固的培养室支架应该通过把有细胞向其沉降的壁保持在基本水平的状态而实现均匀分布，并且不会过度地限制气体传输。为实现这些优点，培养室支架应与培养室的壁接触。接触点的数量、接触点之间的距离和与培养室支架直接接触的透气材料的表面积的大小属于设计所需考虑的因素。实施例1和实施例2提供了进一步的指导。
虽然可以将培养室支架永久固定于透气多层装置，但并非必须这样。当使用者需要变换所述装置以适合更加受控的应用，或需要减低制造成本时，这样做是较佳的。图9A和图9B示出了一种实施方式，其中培养室支架是可重复使用的，并且透气多层装置的主体是一次性的。在图9A中，示出了培养室支架42从透气多层装置6分离。在图9B中，培养室支架42被放置成与透气多层装置6接触。突起部131从培养室支架42突出。突起部131的高度及它们之间的距离应设计成它们可与透气多层装置的培养室充分接触，以将细胞培养室保持在基本水平的状态，使得能在接种期间实现均匀的细胞沉积。然而，与透气表面的接触会减少气体传递量。因此，必须考虑实现水平状态的期望和想要的气体传递程度之间的平衡。根据被培养的细胞类型，可以有不止一种优化设计。当希望与环境条件更好地连通时，可以设置气体通行开口132。在没有气体通行开口132时，气体会在突出有突起部131的表面，例如表面133之间移动，并且培养室气体交换的阻力是突起部的数量、突起部的高度以及装置宽度的函数。在该图示中，为了说明设计选项的多样性，最上面的培养室的第一壁没有处于被培养室支架42保持的状态。如果培养室处于水平状态，如果盛有流体或受压流体，或者如果它(该第一壁)由刚性材料构成，那种状态是可以的。还有，培养室的第二壁120，如果其由刚性足够的材料构成而能在培养基处于其内部的时候保持其形状，就不必与培养室支架接触。
培养室它们自身可构造成能起到使得环境气体可以与相邻培养室连通的作用，同时保持期望的几何结构。Wilson等的美国专利No.5,693,537记载了具有突起部的壁可用于为培养室的相邻的壁提供支撑。图10为剖视图，其提供了一个如何保持期望的形状的例子。在该例子中，透气多层装置7的第一壁110由刚性材料形成，并且透气第二壁120由如二甲基硅酮之类的挠性材料构成。壁突起部150从第二壁120的表面突出，以保持气体空间50。Wilson等的美国专利No.5,714,384示出了突起部可用于增加气体传递的表面积。本领域普通技术人员应理解，所述突起部可从第二壁(或者从上壁和第二壁)的表面突出与相邻培养室的第一壁接触。作为选择方式，从培养室的壁的外侧表面突出的突起部可以在突起部之间互锁，或者与培养室支架互锁。在另一方式中，所有的壁可以是挠性的，并且它们能在培养基充入培养室时获得期望的形状。
给定培养室的上、下壁以及/或上下培养表面不应相互接触。例如，当一培养表面是经组织培养处理的，且与相对壁接触，可能潜在地影响所述经组织培养处理的表面，可以在培养室内放置内部隔离物来确保阻止接触。内部隔离物可以是任意生物相容材料，并且应该设置成使得培养基和流体可以容易地移入和移出培养室。所述内部隔离物无需是独立部件，可以通过从上壁和/或下壁、以及/或者上培养表面和/或下培养表面突出的突起部，而实现在任意壁和/或培养表面之间保持希望的空间。图11示出了示范性的例子，其中透气多层装置8的内部隔离物160是从培养表面130或壁110突起的凸起部。本领域普通技术人员应认识到，内部隔离物可通过多种方式构造，只要那些方法不会阻止培养基进入培养室或从培养室离开。
当培养室成竖向堆叠时，由于光线减少，对培养物中的细胞的显微镜观察会受到妨碍。因此，如共同未决Wilson等的‘814，中记载的那样，将培养室从堆叠中偏移，对于允许采用倒置显微镜可能是有用的。另一可选的方式是使所述气体空间能够接收光线，使得可以用倒置显微镜进行观察。为此，培养室之间的距离应该足够大，以使光源可以照亮最下面的培养室的内容物。光强度取决于培养室的材料和培养基的高度。优选使用透光性好的材料。
图12示出了一种实施方式，其将培养室20串联连接。通过通行口70输送进透气多层装置9的液体通过另一通行口70置换气体，并且驻留在任意期望数量的培养室20内。与环境气体连通的气体空间50处于培养室20之间，并邻近透气材料。在该图示中，气体空间50处于穿通透气多层装置9的整个主体的开口中。
在一些情况下，例如当各培养室含有不同的细胞类型或含有用于同一细胞类型的不同培养基组成时，可能期望个别地通向各培养室，即使它们被集成为同一装置。可以有多种构造来实现这种方式。优选地，与各培养室的通路被构造成使得可通过标准的液体操作方法(如移液或灌注)或者无菌或封闭体系方法(如隔膜或无菌管件连接)来实现这种方式。图13示出了一种选择。在该以隔膜形式示出的图示中，可通过通行口70个别地通向透气多层装置10的培养室20。一个或多个通行口70与各培养室20连接。在该图示中，气体空间50被设置成使得使用者可以将该气体空间与环境气体连通，或阻止与环境气体连通。气体空间50由气体空间外壳51封闭。气体空间外壳51中的气体空间通行开口55使得气体空间50可以与周围环境连通。气体空间通行开口55可构造成根据需要开启和闭合。对气体空间50和环境气体之间的气体运动有选择地进行终止、限制或开启这样的功能，可能是有用的。这种特征可存在于任意实施方式。例如，当透气多层装置临时从CO2环境移出时，关闭或限制气体空间通行开口55可防止或延缓pH的变化。在另一例子中，给定细胞系的细胞可放置在各培养室中，与给定培养室连通的气体空间可注入预定氧浓度，该气体空间可以封闭，且可以对各种氧浓度对细胞生长和/或功能的影响进行研究。本领域普通技术人员应认识到，有很多种用于开启或关闭气体空间通行开口55的方法，包括鲁尔(luer)接头和塞子、端口和盖子等。
图14示出了透气多层装置的另一实施方式，该装置被设置成，当该装置从标准组织培养箱取出以在福乐罩(flow hood)中进行液体操作时，可以限制pH变化的速度。气体空间外壳51封闭透气多层装置11的气体空间50。通过在从培养箱取出之前关闭开口55的气体通行盖53，可以将气体空间50与环境气体隔离，从而在气体空间50内保留期望的CO2水平。优选地，气体空间50内的气体容量足以支撑气体通行盖53关闭期间培养物的氧需求。因此，所述装置中的细胞或组织的数量以及氧需求，是确定最佳容量时需要考虑的。
图15示出了透气多层装置的另一实施方式，该装置被设置成，当该装置从标准组织培养箱取出以在福乐罩(flow hood)中进行液体操作时，可以限制pH变化的速度。这种情况下，气体空间50沿该透气多层装置的一侧向环境气体开放。气体交换控制缘57从透气多层装置12的该侧延伸，在该图示中作为气体空间外壳51的结构件。当透气多层装置12朝向为，使得气体交换控制缘57与平坦表面，例如层流罩的底板平齐时，气体空间50和环境气体之间的气体交换被终止或基本上被限制，以此降低pH变化速度。当透气多层装置不具有控制pH变化的结构并且从培养箱被移出时，使pH变化速度最小化的另一种简单的方法是，将其放置于密闭空间，例如带盖的箱体内。为提供该优点，所述盖不必是气密性的。只要所述盖和箱体之间的气体通道的剖面开口小于气体空间和环境气体之间的剖面开口，就会产生对气体交换速度的限制以及pH变化的延缓。当透气多层装置位于箱体内部时，箱体内的气体体积应该减到最小。而且，在将透气多层装置放入箱体内之前，可对箱体做预先处理，使其包含培养箱的气体组成。
新的透气多层装置允许在传统多层培养瓶中不可能的操作方式。例如，细胞可从一层扩展到其它层。接种、扩展和收集粘附细胞这样的循环(其不受剩余的胰蛋白酶的不利影响)，提供了该封闭体系过程如何发挥功能的一个例子。图16A示了透气多层装置13的剖视图，培养基80和细胞处于其下层培养室20内。为了将粘附细胞扩展至如图16B所示的多个培养室内，可以进行简单的操作顺序。首先，移除培养基80。然后将PBS引入下层培养室以冲洗残留培养基。随后移除PBS。然后，将胰蛋白酶或任意其它脱壁材料(detachment material)引入下层培养室，以从附着表面释放细胞。然后，可通过加入培养基80将细胞再分布到上培养室，这将胰蛋白酶稀释至不会影响细胞附着的水平。如果细胞受到任何残留胰蛋白酶的影响，可以移除细胞并用常规手段离心出残留的胰蛋白酶。然后，可将细胞再引入到适当体积的培养基中，使得它们驻留在期望数量的培养室内。对于悬浮细胞，只要添加适量体积的培养基就可以容易地扩展至另外的培养室。这样，相对传统的多层培养瓶，可以将用来形成接种物的辅助装置的采用最少化。由于透气多层装置可设置成适合密闭的体系通路(closedsystem access)，也可以降低污染的可能性。
细胞驻留于侧壁表面上的能力也可形成优点，所述优点包括使细胞从具有一尺寸的表面区域扩展到尺寸更大的表面上的能力。例如，当通过使透气多层装置定向成如图5C所示的状态，可利用少量的接种物开始培养，该接种物将驻留在壁126附近。然后，当培养物的数量扩增时，通过将所述装置重新定向至图5B的状态，可以获得更多的表面积。如果需要，细胞可以在重定向前从壁126被胰蛋白酶化以增加表面积。如果需要进一步扩增，可再对所述装置进行重新定向至图5A的状态。接着，通过前面段落描述的方法可以进一步扩增。
通常与细胞培养装置或医疗器械相关的任意材料可用于遍及所述透气多层装置。优选地，选用的材料符合USP(美国药典)VI和/或ISO 10993的相容性标准。还有，最好具有透光性，因为这使得可以对污染和pH进行目视检测。为了形成可以通过倒置型显微镜观察的表面，优选SPE 2(球概率误差2)或更高。
用于使得气体可以传递进/出透气多层装置透气材料的透气材料可由透气细胞培养装置所使用的，或者如前面记载的用于透气细胞培养装置的任意膜、薄膜、材料或所用材料的组合构成，例如硅酮、氟乙烯聚丙烯(flouroethylenepolypropylene)、聚烯烃、聚苯乙烯薄膜，以及乙烯-醋酸乙烯共聚物。可以获得很多用来了解透气材料及其细胞培养中的用途的指南资料，包括但不限于美国专利No.5,693,537、美国专利No.6,455,310、美国专利No.6,297,046、国际专利申请公开WO 01/92462和共同未决美国专利申请No.10/961,814。其它的信息来源可以在Plastic Design Library，William Andrew Publishing，“Permeability and Other Film Properties ofPlastics and Elastomers”，1995中找到。本说明书通篇使用的词语硅酮包括美国专利No.6,045,877中记载的制剂。
如Wilson等的美国专利5,693,537记载，透气材料可以是透液性材料。这些材料包括其整个横截面为亲水性的膜，例如由纤维素、醋酸纤维素和再生纤维素构成的膜。然而，在评价这些材料的效用的试验中，发现最好采取防止污染的措施，这在Wilson等的‘537没有预期。应小心确保选用的材料的透液性足够的低，以在培养室内保持期望体积的培养基。而且，液体损失会使摩尔渗透压浓度升高到有害的水平。优选地，在给定的培养基静压力条件下，在补料间隔期，选用的材料能够将大于约90％的培养基体积保持在培养室内。在补料期间，摩尔渗透压浓度得以恢复。在补料间隔为两天的情况下，由静压力导致的液体损失因此最好应该限制于培养装置内的培养基体积每天损失的比率小于约5％。例如，已经发现，在培养基体积为每cm2膜至少对应10.16ml培养基的情况下，截留分子量为10,000的80M
Figure G2007800510375D00191
膜是可以接受的材料。所述材料可以是薄的且能提供充分的气体传递。在由Wilson Wolf Manufacturing制造的CELLine CL1000细胞培养器产品中进行的试验中，使用由80M
Figure G2007800510375D00192
构成的低透气材料，证明了在其上培养至少400×106个鼠杂交瘤细胞的能力。除了不使用80M
Figure G2007800510375D00193
作为低透气膜，所述装置的所有其它方面与市售产品相同，其集成了不透液的透气膜。在该试验中，表面密度至少为4×106个细胞/cm2透气膜。然而，虽然在培养室内没有检测到污染，但膜外侧被污染了。因此，用透气透液材料制造透气多层装置最好应该通过采用由无菌过滤器保护的、通向气体空间的气体空间通路开口来限制通向气体空间的通路。可以采用通常用于防止污染的任意透气过滤材料，例如微孔膜。为了最大程度地防止污染，孔径可以在0.45μm以下，最好为0.2μm。然而，采用透气透液材料并不限于仅仅是所述透气多层装置的实施方式。其它透气结构，包括象例如OpticellTM产品(在美国专利No.6,821,772中有部分记载)那样简单的结构，可以集成至少一种透气透液膜(例如
Figure G2007800510375D00194
)。作为其它例子，通过配置包括与两透析膜或任一透析膜接触的气体空间的优选结构，并通过采用由无菌过滤器保护的通向气体空间的气体空间通路开口，通常与细胞培养无关的Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes(美国专利No.5,503,741)可以作为培养装置使用。
当将透气多层装置设置成，其可被定向成其中培养悬浮细胞的第一状态，或者其可被定向成其中培养粘附细胞的另一状态时，构造透气多层装置的优选设置应该使得细胞培养室的一个培养表面是疏水的，而另一表面是亲水的。可通过任意的剖视图来阐述实例。例如，参考图4，第一壁110可以是透气的且其内表面可以经组织培养处理以形成一培养表面，而第二壁120的内表面可以是疏水的，以形成另一培养表面。因此，为培养粘附细胞，操作透气多层装置时可以使第一壁110位于第二壁120下方。因此，为培养悬浮细胞，操作透气多层装置时可以使第二壁120位于第一壁110下方。如果粘附细胞附着于第一壁110，然后对装置重新定向以使悬浮细胞可以处于第二壁120上，可以进行共培养。可用于其上培养悬浮细胞的材料为硅酮，可用于在其上培养粘附细胞的典型材料为经组织处理的聚苯乙烯。因此，在本实例中，优选的实施方式可以是，第二壁120由硅酮构成，而第一壁110的培养表面由经组织培养处理的聚苯乙烯构成。然而，已经发现，如果使用硅酮，其会在伽马辐射或电子束杀菌期间发生迁移，并且覆盖培养室内经组织处理的表面。这使得该经组织处理的表面变得不是最适合粘附细胞。因此，在存在该最有用的材料时，常用的灭菌方法变得不实用。其它的灭菌方法也会有问题。例如，ETO(环氧乙烷)会保留在硅酮中，且不经很大范围的毒素冲洗，就会存在对细胞有害的环境。化学手段灭菌也需要冲洗。通过向硅酮添加色素、和/或改变固化温度和时间、和/或将硅酮预先暴露于高剂量的伽马辐射、和/或改变硅酮至聚苯乙烯的距离来解决问题的努力并没有消除问题。然而，已经发现，在使所述装置经受伽马辐射之前用等离子体充硅酮，并可以将硅酮迁移到聚苯乙烯表面上的问题减到最小或者消除该问题。因此，在存在经组织培养处理的表面(优选聚苯乙烯)的情况下，采用硅酮的优选工艺是，确保在伽马辐射之前对硅酮充等离子体。这种形成细胞培养装置的方法不限于透气多层装置。这种方法使得任意透气培养装置可以在存在经组织处理表面的情况下集成充有等离子体的硅酮，其好处是可以防止硅酮在使用如伽马辐射或电子束之类的传统灭菌方法期间发生迁移。例如，通过在存在处理表面的情况下采用充有等离子体硅酮，对Wilson等的‘814或美国专利No.6,821,772中记载的装置是有益的。例如，市售的OpticellTM产品可以集成一经组织培养处理的聚苯乙烯表面和相对的由充有等离子体硅酮构成的透气表面。这样，当用标准方法灭菌时，可以在由硅酮构成的表面上培养悬浮细胞，并且/或者可以在由聚苯乙烯构成的表面上培养粘附细胞。该产品能将膜之间的惯常距离整合在一起，就像现在的情况，或者将如Wilson等的‘814记载的增加的距离整合在一起。
图17A示出了由硅酮成型的培养室，其使导致泄漏的连接件数量最少。采用二甲基硅酮是有利的，因为它可以成型成复杂的几何样式，并且这对许多悬浮细胞培养应用是有益的。培养室20’包括法兰21。在该构造中，可以省去壁交叉处的连接件。这样，它是一体化培养室，其可以进行模块化装置设计。法兰21可以胶粘到其它硅酮表面，或固定于任意表面，从而可制成一连串培养室用于装配至集流腔壁。或者，一连串的培养室可以预制，以装配到集流腔壁，所述装配至集流腔壁通过下述方法进行：在法兰前面设置刚性板，在法兰后面设置刚性板，将这些刚性板连接在一起，然后将该子配件装配至集流腔壁。在装配之前，可以在培养室内设置任意替换的培养表面。该一体化培养室不必限于只有一个培养室。可以将一个以上的培养室成型为整体件以形成也可以进行模块化装配的一体化培养室。虽然对于高需求的培养，气体传递区域中的厚度希望优选为小于或等于约0.022英寸，更优选地小于或等于0.010英寸，且最好小于约0.008英寸，当细胞没有呈现出高的氧需求时，更大的厚度也是可以采用的。在制造过程中，较厚的硅酮截面可能是有利的。通常，硅酮越厚，其越容易制造。然而，上壁和下壁为约0.007英寸厚的一体化的二甲基硅酮培养室是可以制造的。侧壁为约0.004英寸厚的一体化的二甲基硅酮培养室也是可以制造的。虽然图中示出了不止一个法兰，但一体化培养室不必有一个以上的法兰。因此，当希望只有一个集流腔时，培养室的一端可以封死。
在优选实施方式中，所有培养室模制成整体件，该整体件带有可固定于集流腔壁的共用法兰。图17B示出了一体化培养室20”，其是包括法兰152的一连串成型的透气材料培养室(最好是二甲基硅酮)。作为法兰支承件的塑料(例如聚碳酸酯)刚性件可直接成型(即，包覆成型)到法兰上，以作为后续进一步装配的垫板。在该图示中，法兰支承件153包覆成型到各法兰152上。如图17C的分解装配图所示，法兰支承件153以液体不能渗透的方式配合至集流腔壁62，以形成位于培养室各端部的集流腔。在评价将二甲基硅酮粘结至刚性塑料的能力时，获得二甲基硅酮和生物相容性聚碳酸酯之间的不透液粘结。所述聚碳酸酯材料放置于模具中，并将硅酮以液体注射成型工艺直接配合至所述聚碳酸酯。可以加入培养室支架，所述支架可以是例如本文记载的和/或图10和图11所示的任意结构。如果形成为如图11所示的那样，突起部可以是延伸穿越整个培养室的肋部。在图17C的图示中，存在一系列培养室支架42’。对于多种悬浮细胞而言，这是一种有用的构造，甚至不需要通过引入培养表面作进一步改造。然而，增加培养表面仍然是可选方式。当预定的应用可能包括使用粘附细胞时，优选地，硅酮的内表面覆盖有适合被培养细胞类型的典型粘附表面。对多种粘附细胞而言，***经组织处理的聚苯乙烯作为培养表面可能是有利的。这使得可以进行多种培养方式。例如，为培养粘附细胞和悬浮细胞两者，所述装置可定向成使得粘附细胞可以沉降到经组织处理的培养表面，并且在附着后，旋转180度以使悬浮细胞可以驻留在相对的硅酮壁上。
如果图17的构造希望形成为包括经组织处理培养表面而非硅酮，通过用不同的培养表面覆盖所有硅酮内表面，对硅酮充等离子体以防止电子束或伽马灭菌期间的迁移能够避免。例如，可***薄的经组织处理聚苯乙烯，使其覆盖全部硅酮。当集流腔壁不是会发生迁移的材料时，经处理聚苯乙烯表面将保持为适合粘附性培养物。虽然所述培养表面(本实例中为聚苯乙烯)提供了供细胞附着的表面，与假如它只是硅酮的情况相比，它会阻止气体传递进细胞培养室。因此，期望细胞驻留其上的培养表面(或多个表面)应该是薄的，以使气体传递仍然是充分的。优选地，在细胞驻留其上的聚苯乙烯区域的厚度为约0.003英寸或更薄。这种方式减少了连接件的数量并降低了渗漏的可能性，同时提供适合任意给定应用的培养表面。
图18C、图18D和图18E示出了另一实施方式的优点，其使得培养室可以部分地盛有培养基，并且/或者使胰蛋白酶、PBS或任意其它与从细胞室移除细胞有关的液体的体积最小。在该实施方式中，本发明的优点被直接整合至传统的多层培养瓶(诸如NUNCTM Cell Factory、NUNCTM TripleFlask和
Figure G2007800510375D00221
)的形式。图18A是NUNCTM在网站上的示图，描绘了它们的Cell Factory for Active Gassing的运行，其期望克服气体组成不均匀的问题。该气体处理***使工艺复杂化，其需要管道连接件、无菌过滤器、独立的气体供给和备用的增湿过程，因为干燥气体混合物的持续流动会使培养基很快蒸发，并使摩尔渗透压浓度增加到影响细胞生长和功能的水平。图18B是图18A的NUNCTM方式的放大图，具有表示强制气流的箭头，并标出了壁224和222以供参考。该透气多层培养瓶可以解决气体组成不均匀的问题，而不需要传统多层培养瓶必须的辅助设备或强制气流。图18C、图18D和图18E所示的实施方式的优点是，它们可以集成传统多层培养瓶(例如市售的培养瓶，以及例如美国专利No.5,310,676、美国专利No.6,569,675和英国专利说明书GB 1539263A中记载的那些培养瓶)的结构特征，包括使得培养基可以等量地被分配至各层的任意或全部结构特征。图18C示出了透气多层培养瓶200的实施方式，其中无需传统多层培养瓶必需的辅助装置或强制气流就可以实现均匀的培养条件。至少壁224和/或壁222的一部分是透气的，允许气体空间250与环境气体之间的气体连通。传统培养室可位于该装置内，优选地，具有由聚苯乙烯构成的培养层220。培养室壁220被构造成处在传统的高度以保持培养基和细胞，使得，作为在培养基80和气体空间250之间的界面气体传递的结果，细胞90接收氧。集流腔260可构造成如在传统培养瓶中那样。对于透气材料而言，二甲基硅酮是好的选择，因为其可以液体注射成型成壳体，或者，其可以包覆成型到如聚碳酸酯之类的刚性壁上。然而，如前所述，在预期使用伽马辐射的情况下，硅酮应该是充有等离子体。优选地，壁的透气面积以相等的几何关系分布于各培养室，从而使得各培养室可以获得相等的气体传递。换言之，各培养室与透气材料的间距应该相等。在透气材料区域，可以设置防止损坏的保护装置和结构支架，只要提供这些特性的构件允许气体可以通向气体空间。因此，可选用的侧壁支架240起到该功能。其由气体通行开口242和/或突起部241构成。优选地，侧壁支架是刚性的透明材料。
图18D示出了另一种消除对强制通气的需求的方式，在传统多层装置中，强制通气是作为一种提供均匀培养条件的方式。该构造将透气材料集成在装置本体内。气体空间251是穿过透气多层装置201的至少一部分本体的开口。因此，气体空间251由上气体空间壁210和下气体空间壁215限定。它可以是贯穿整个本体的开口，类似于图8A和图8B示出的图示。它不需要完全穿过装置，而可以在装置内终止。它的任意壁可以是透气的。然而，上气体空间壁210不必是透气的来克服传统多层培养瓶中的培养条件不均匀的问题。当气体空间251的任意其它壁由透气材料构成时，就可解决该问题。例如，气体空间壁210可以是聚苯乙烯，其厚度不提供足够的气体传递，只要气体空间251的至少其它一个壁或几个壁由确实提供足够气体传递的材料构成。在装置本体内均衡的区域进行气体传递，为利用气液界面进行气体交换的传统细胞培养提供了比传统多层培养瓶更加均匀的气体环境。透气多层装置不需要仅以传统多层培养瓶的方式操作。如果上气体空间壁210由透气材料构成，气体传递可独立于气液界面而进行。上气体空间壁210可与侧壁225紧密配合以形成细胞培养室。然后，例如，如果期望增加培养基高度以将补料频次减到最少或延缓由蒸发引起的摩尔渗透压浓度的变化，可将培养基加至任意期望高度，只要培养室侧壁225的高度相应增加，如Wilson等的‘314记载。
图18E示出了改造传统多层培养瓶形成透气多层培养瓶的图示，该透气多层培养瓶设有透气壁，当通过装置的侧壁发生气体传递时，该透气壁供细胞驻留其上。与传统多层培养瓶相比，这提供了为培养方法提供了更多的选择，并解决了培养条件不均匀的问题。透气多层培养瓶202设置为它的壁(如侧壁224和222)的至少一部分由透气材料构成。如果需要，透气区域应该象图18C描述的那样被支撑。再参见图18E，培养室底部245由透气材料构成，并最好由培养室支架243支撑，所述支架可包括突起部241和/或气体通行开口242。培养室壁225可以是允许培养基80处于期望高度所需的任意高度。集流腔260可构造成如传统培养瓶那样。
实施例
实施例1和实施例2评估了培养室支架的交替几何结构，以定量地表明透气多层培养瓶可以解决传统培养瓶的对货运、灭菌、存储、培养箱和处理空间的资源利用过多的问题，同时将存在不均匀培养条件的可能性降到最低。
实施例3记载了伽马辐射之前充有等离子的硅酮能限制或防止其迁移到经组织培养处理的聚苯乙烯表面，以此使得硅酮和经组织培养处理的塑料可以共存在同一培养室内而仍可利用标准灭菌工艺。
实施例1
用于氧需求非常高的培养物的培养室支架结构
通过构建试验装置来展示培养室支架的物理结构，该结构可以改善胰岛细胞培养(已知是氧需求最高的类型之一)，所述装置的下壁由测得的平均厚度为0.0072英寸、表面积为98cm2的成型二甲基硅酮片构成。MOCON(Minneapolis，MN)利用他们的Oxtran 2/21 Instrument，根据美国材料试验协会ASTM-1927测得的二甲基硅酮橡胶的透气率在37℃时约为14,300mlO2/100in2/24hours。支撑二甲基硅酮的培养室由与所述硅酮直接接触的0.048cm厚、46％敞口格网构成。敞口格网由一组聚丙烯线构成，所述聚丙烯线各自的直径为0.018-0.020英寸，呈垂直和水平排列，使得每英寸水平距离以及每英寸垂直距离有16股线。所述格网由厚度为0.19cm的聚碳酸酯成型塑料板保持在其位置上，具有均匀分布的突起，所述突起将格网架高在所述片上方，使得气体空间位于所述膜下面。各突起部为统一的“Y”形，而“Y”的各个边成120度分开。各个边的长度为0.45cm，且宽度为0.127cm。因此，各突起部的、可用于支撑格网的表面积为约0.175cm2。每cm2上有约1.1个突起部。因此，可用于支撑格网的突起部的累积表面积为约18.87cm2。各突起部自塑料板起的高度为0.127cm。气体空间处于硅酮底部和塑料板顶部之间。被突起部取代的累积气体体积为2.4cm3。被格网取代的累积气体体积为2.54cm3。因此，处于硅酮膜下方并处于塑料板上方的气体为约17.2ml。处于硅酮膜下方并处于塑料板上方的气体与透气膜表面积之比为17.6％。内塑料板包括作为气体通行开口的通孔(各通孔的截面定向为与塑料板的平面垂直)，使得环境气体可以通过被动扩散与气体空间连通。位于所述表面积为98cm2的二甲基硅酮下面的五个均匀隔开的通孔(各孔具有0.29cm2的截面积和0.075英寸的长度)，形成1.45cm2的累积截面积。因此，通孔的截面积与硅酮膜的截面积的比率为1.45cm2/98cm2，或约1.48％。从而，通孔的截面积与处于硅酮膜和塑料板的上表面之间的气体体积的比率为1.45cm2/17.2ml，或约8.4％。足部高出塑料板底部0.51cm。因此，位于硅酮膜下面的培养室支架的总高度为0.87cm。
下述定义和缩略语用于理解胰岛细胞的评估：
培养瓶对照        依赖于气液界面获得氧的装置，最大接种200
                  IE/cm2，IE与培养基之比为1000IE/ml，得到0.2cm
                  的最大培养基深度。该对照用于将GP装置(透气装
                  置)与培养瓶中的标准胰岛细胞培养方法作比较。
GP装置            试验装置，其底部由包括表面积98cm2的透气二甲基
                  硅酮构成并由如实施例1和实施例2中记载的结构支
                  撑。
IE(胰岛细胞当量)  胰岛细胞体积的度量，等于直径150μm胰岛细胞的体
                  积。作为具有刚刚分离的胰岛皱褶的脉管***，其体
                  积下降且其密度增加。因此，在第0天和第2天，IE
                  具有相同的体积，质量不同。
由DNA计量的IE
或DNA IE          胰岛细胞质量的直接度量，等于11.4ng DNA。
IE人工计数        IE数量传统地由人工计数，这种方式不考虑胰岛细胞
                  的平坦度和密度。对于18例猪胰岛分离物，第0天
                  通过DNA计量的IE为人工计数IE的63±12％(范围
                  为49-93％)。数量通常随培养物中胰岛细胞体积的下
                  降而减小，但情况并非总是如此，因为人工计数易于
                  出错。除非另有注明，IE指传统地由人工计数的IE。
胰岛细胞比活力    存活胰岛细胞量的比
胰岛细胞表面密度  在给定表面积上培养的胰岛细胞的体积，用IE/cm2
                  表示。150μm直径的胰岛细胞的合流方阵列具有4444
                  IE/cm2。
培养基稀释度      培养基体积与驻留在装置内的胰岛细胞数量的比例，用
                  μl/IE表示。
非GP装置          一种对照装置，具有与GP装置相同的几何结构，但是
                  没有透气膜(用作试验对照，具有与GP装置相同的培
                  养条件，以定量分析透气膜结构的优点)。
猪分离     采用Ricordi法(Ricordi Method)从猪胰腺获得胰岛细
           胞的过程。
OCR        氧消耗速率，以nmol/min表示。活胰岛细胞量的度
           量。
OCR/DNA    每DNA含量的OCR，以nmol/min·mg DNA表示。
p值        报告的p值针对双尾配对Student t检验。
回收       在后来时间仍存在胰岛细胞属性(例如，DNA、IE、OCR)
           的比例。
利用猪胰岛细胞进行初始评估，以确定需要什么样的培养基体积对IE的比率。猪胰岛细胞在二甲基硅酮表面积为18cm2的小型GP装置内于37℃培养2天，在200IE/cm2下，1μl/IE和4μl/IE的培养基稀释度没有表现出胰岛细胞活力(通过OCR/DNA评估)的统计学差异。对于5例猪分离样，4μl/IE时的OCR/DNA是1μl/IE时的97.5％～102.4％，综合平均值为101％。基于该发现，采用1μl/IE的培养基稀释度进行实施例1和实施例2中记载的批量评估。
在一系列试验中使用来自10例猪分离物的胰岛细胞，其主要目的是：确定在GP装置内是否可以达到超过常规方法的、范围为约1000IE/cm2～2551IE/cm2(人工计数)(DNA计数为490IE/cm2～2551IE/cm2)表面密度，而与小于约200IE/cm2(人工计数)的常规表面密度下的培养瓶对照(即，气液界面)相比没有损失比活力。非GP装置对照存在这样的假设，培养室支架结构仅仅使得细胞驻留其上的表面成水平状态，而没有提供气体输送，从而会导致差的胰岛细胞活力。需讨论的是，在设法使胰岛细胞处于均匀分布而不会因聚集而损伤健康的同时，按如上所述设置的培养室支架允许向胰岛细胞输送足够的氧的能力。GP装置构造成使得胰岛细胞在98cm2的二甲基硅酮表面上均匀分布。在GP装置内的平均胰岛细胞表面密度为1526IE/cm2(人工计数)。基于GP装置的比活力与代表性的培养瓶对照的比活力的比率，GP装置表现出相等的活力，标准偏差为9.4％，p值为0.9987。因此，表明了培养室支架能使气体被动传递进入培养室，所述被动传递进入的速率允许表面密度至少比传统方法平均高7倍，而不损失胰岛细胞的活力(通过OCR/DNA测定)。其表明，培养室支架可构造成使得环境气体可以存在于培养室支架的、与邻近该培养室支架的透气表面相对的相反侧，沿培养室支架被动地移动，然后与细胞驻留其上的表面垂直，然后被动地在细胞驻留于其上的透气表面下方流通，此时以超过传统培养装置所允许的七倍提供足够的氧传递来支持胰岛细胞。
实施例2
在另一胰岛细胞培养应用中对与实施例1不同的培养室支架的物理结构进行考察。在本实施例中，试验装置包括与实施例1中本质上相同的透气材料。支撑二甲基硅酮的培养室由与硅酮直接接触的敞口格网构成，并且机加工的聚碳酸酯塑料板将所述格网支撑成基本呈水平状态。与实施例1的培养室支架不同，格网直接位于塑料板的上表面上。格网的几何形状和材料成分与实施例1的相同。对于每cm2的硅酮膜表面积，硅酮下表面和塑料底部的上表面之间的气体体积在被格网取代后为0.022ml。换言之，塑料板和透气膜之间的气体体积与透气膜的表面积之比为2.2％。为了使得环境气体可以通过被动扩散与气体空间连通，在塑料底部中存在作为气体通行开口的通孔，各通孔的截面定向为与格网的平面垂直。各通孔的直径为0.125英寸。所述通孔在二甲基硅酮下面以栅格形式均匀隔开，使得各孔中心之间的距离为0.375英寸。各通孔的长度为0.13英寸。通孔的截面积与硅酮膜的截面积的比率为约16％。通孔的截面积与塑料板和透气膜之间的气体体积的比率为273％。由于格网的高度为0.019英寸，二甲基硅酮和处于塑料底部下面的气体之间的总计高度为约0.15英寸。八个均匀分布的底脚，从其所处的培养层表面计，将塑料底部的周边部分抬高0.41cm。底部的周长为23.94cm。塑料底部下侧和其处于上面的表面(该表面由此向环境气体的运动开放)之间的截面积为7.59cm2。不考虑作为气体运动限流器的底脚，绕将气体运动开放至透气二甲基硅酮位置的周边的截面积为9.85cm2。因此，培养室支架的高度为约0.5英寸。
在一系列试验中采用来自5例猪分离的胰岛细胞，主要目的是确定是否能够在GP装置中达到平均约1628IE/cm2(人工计数)(DNA计数为927IE/cm2)的、超过常规的表面密度，而与培养瓶对照和非GP装置相比不损失比活力。需讨论的是，在设法使胰岛细胞处于均匀分布而不会因聚集而损伤健康的同时，按如上所述设置的培养室支架允许向胰岛细胞输送足够的氧的能力。如果如实施例1中所示，胰岛细胞显示出与对照类似的活力，培养室支架形成为替代几何形状的能力将得到体现。几何形状的主要差别是，实施例1采用突起部，而实施例2使得格网直接位于平坦的塑料底部上。为了对缺少突起部进行补偿，实施例2的几何形状中，气体通行开口截面积与透气材料表面积的比率与实施例1相比增加约8倍。将胰岛细胞放置到GP装置内，使得胰岛细胞均匀地分布在二甲基硅酮表面上。基于GP装置的比活力与代表性的培养瓶对照的比活力的比率，GP装置表现出相等的活力，标准偏差为13.8％，p值为0.9681。因此，证实了替代几何形状的培养室支架可以使得气体能以允许与传统方法相比至少平均增加8倍的表面密度的速率被动传递进入培养室，而不损伤通过OCR/DNA测得的胰岛细胞活力。
以与对照相比大幅度增加的表面密度(超过培养瓶的常规表面密度200IE/cm2约7倍至41倍)，来考验所述透气试验装置。以平均比培养瓶的传统表面密度增大约18倍的表面密度，对总共20例猪分离物进行评价。数据具有较大程度的可变性，GP装置表现出代表性培养瓶对照的96.0％的平均活力，标准偏差为21.9％，p值为0.43。
图19概括示出了与非GP装置比较的结果，结果以培养瓶对照的百分比表示。显然，仅仅将培养室保持水平从而均匀分布胰岛细胞的培养室支架必须包括提供足够气体交换的容量，如通过随着增加非GP装置内的表面密度而损伤胰岛细胞健康所表明的。实施例1和实施例2说明了至少有两种截然不同的培养室支架，在被集成到透气多层装置设计中时，可以获得有效利用空间的独特优点。
该信息有利于表明透气多层装置相对传统多层装置的空间优势。例如，在胰岛细胞移植来治愈I型糖尿病的领域中，目标是培养至800,000IE(人工计数)。目前的200IE/cm2表面密度的培养瓶方法将需要4000cm2的培养表面积。如果使用市售传统多层培养瓶，例如NUNCTM Cell Factory，形成4000cm2的培养表面积将需要约六个它的632cm2培养层。这样构造的NUNCTM Cell Factor将占用约416立方英寸的空间，并且胰岛细胞处于可能不均匀的生长条件。然而，考虑到上述实施例，透气多层装置可以在小得多的空间内培养800,000IE。例如，其能以约1526IE/cm2～1628IE/cm2的平均表面密度培养胰岛细胞，使得它只需要约500cm2的培养表面积来成功培养800,000IE。如果在透气多层装置内采用六个培养层，如NUNCTM CellFactory所要求的，各层将只需要83cm2的表面积。如果培养基直接位于胰岛细胞上，各培养室的高度为约1.6cm(0.63英寸)以达到与Cell Factory(即1uL/IE)相同的补料频次。培养室支架的高度(即，培养室之间的垂直距离)不需超过实施例中的高度。上述实施例表明，各培养室支架的高度可以是0.344英寸。就尺寸而言，透气多层装置可以约5.8英寸高、3.6英寸宽和3.6英寸长，占用空间约76英寸3。与传统多层培养瓶占用416英寸3空间相比，这样可以减少超过500％的货运、灭菌、储藏、培养箱以及废弃处理空间。而且，克服了传统培养瓶的培养条件不均匀的问题。注意到使用例如图10中所示的构造可以进一步降低培养室之间的距离，就象上述实施例的培养室的下底脚距离所展示的的那样。
实施例3
将伽马辐射期间的硅酮迁移减到最低
试验装置162构造成如图20的截面图所示。测试样品165由二甲基硅酮构成，并被放置到市售聚苯乙烯组织处理六孔板167(
Figure G2007800510375D00291
3516)的本体的顶部上。然后将聚苯乙烯盖168放置到六孔板167上。通过在伽马辐射之前对测试样品165充等离子体，对硅酮迁移到盖内表面169上以及迁移到经组织培养处理表面166上最小化的能力进行评价。测试样品165位于距离经组织培养处理表面166约1.78cm的位置，并距离盖内表面169小于2mm。在一次评价中，在将测试样品165放置到试验装置162内之前，对其进行充等离子体，通过水滴接触角为96度以及表面能小于30达因确认等离子体电荷的存在。在另一次评价中，在将测试样品165放置到试验装置162内前未进行充等离子体。在两次评价中，对装置依次进行伽马辐射。然后，实施化学分析用电子能谱法(ESCA)，以定量分析各种表面的元素组成。评估经组织培养处理表面166与作为对照的6孔板的经组织培养处理表面相比是否存在硅酮、氧和碳，所述作为对照的6孔板在没有硅酮测试样品165的情况下进行伽马辐射。对盖内表面169是否存在硅酮进行评估。表1汇总了测试结果。
Figure G2007800510375D00292
这些结果显示，在伽马辐射前将等离子电荷施加到硅酮防止了不希望的硅酮迁移，并且为细胞培养处理的表面保持基本不变。
Figure G2007800510375D00301
六孔板，在不存在硅酮的条件下进行伽马辐射(即，对照)，就象集成了带等离子体硅酮的
Figure G2007800510375D00302
六孔板那样，呈现出其经组织培养处理表面上存在约20％的氧。相反，集成了不带等离子体硅酮的
Figure G2007800510375D00303
六孔板呈现出氧成分变化很大，为51％。未带等离子体的硅酮迁移到所有表面。带等离子体的硅酮则没有迁移到除靠近硅酮的表面之外的表面。
这为细胞培养装置的新的构造打开了一扇门。通常，可以有简单的方法来制造细胞培养装置，包括但不限于如图17A和图17B所示的那些装置。包括硅酮表面和经组织处理表面的培养装置可以进行伽马辐射，通过至少对与经组织处理表面气体连通的硅酮表面充等离子体，经组织处理表面无论与硅酮的距离是多少，在伽马辐射之后基本上没有变化。不可能迁移到经组织处理表面的硅酮表面不需经等离子体照射，如由硅酮构成的培养室外侧表面。需注意，只是部分由硅酮构成的表面也应该按说明充等离子体，因为硅酮部分会在辐射期间迁移。通常，可以有简单的方法来制造细胞培养装置。例如，可以通过成型硅酮外壳并***供细胞驻留在上面的处理后聚苯乙烯板，制造如基本培养瓶或OpticellTM透气培养器之类的单培养室装置。硅酮独特的延伸能力使得开口(培养表面穿过该开口加入)可以小于被***部件，并且在***后很快恢复至端口形状。成型的硅酮中可以存在隔膜，可以存在其它类型的通行口。对于基本培养瓶的情况，培养瓶的高度可以大幅度减低，因为通过采用透气硅酮消除了以气-液界面的途经获取氧的需要。参见图17A，当第一壁110为透气硅酮，并且培养表面130为如经组织培养处理聚苯乙烯之类的粘附表面时，可以获得附加的通用性。这样，可以将装置定向为，第一壁110朝下以培养悬浮细胞，培养表面130朝下以培养粘附细胞，或者如前所述培养粘附和悬浮细胞。如果期望共同培养粘附细胞，可以将附加的培养表面，如非常薄的、透气聚苯乙烯***到第一壁110附近。装置的高度可以增加，以允许各种所需的培养基体积与表面积之比率，以优化培养。制造具有褶皱侧壁的装置，使得容积可以根据使用者的需要改变。透气多层培养瓶也可以将这些优点集成在一起。
本领域普通技术人员应理解，可以在不脱离本发明精神的前提下对其进行各种改动。因此，本发明的范围不限于所阐述或记载的具体实施方式。而且，本发明的范围由所附权利要求和其等价物确定。

Claims (16)

1.一种细胞生长装置，包括：
至少一个细胞培养室，其具有至少一透气透液的壁；和
培养室支架，其与所述透气透液的壁接触；和
至少一个气体通行开口，其向所述培养室支架开放；以及
透气无菌过滤器，其覆盖所述气体通行开口。
2.如权利要求2所述的装置，包括：
至少两个细胞培养室，各培养室具有至少一透气透液的壁，并且各所述透气、透液的壁与气体空间接触；和
培养室支架，其与所述透气、透液的壁接触；和
至少一个气体通行开口，其向所述培养室支架开放；以及
透气无菌过滤器，其覆盖所述气体通行开口。
3.一种细胞生长装置，包括：
至少一个细胞培养室，其至少具有第一壁和第二壁；和
至少一细养表面，并且
所述第一壁由包括充有等离子体的硅酮的材料组成。
4.如权利要求3所述的细胞培养装置，其中所述培养表面是经组织培养处理的。
5.如权利要求4所述的装置，其中所述培养表面由聚苯乙烯组成。
6.如权利要求3所述的装置，包括至少两个细胞培养室。
7.如权利要求6所述的装置，其中所述培养室由集流腔连接。
8.如权利要求6所述的装置，其中所述培养室至少部分是透气的，且所述细胞培养室由气体空间隔开。
9.如权利要求8所述的装置，其中所述培养室由集流腔连接。
10.一种经改良的传统多层培养瓶，包括：
至少一外壁，所述外壁的部分由透气材料组成。
11.如权利要求10所述的装置，包括侧壁支架(240)。
12.如权利要求11所述的装置，其中至少一培养室底部(245)由透气材料组成。
13.如权利要求12所述的装置，其中所述培养室底部(245)与培养室支架(243)接触。
14.一种经改良的传统透气多层培养瓶，包括：
至少一个开口，所述开口进入所述传统多层培养瓶的瓶体的至少部分，所述开口呈气体空间(251)的形式，所述气体空间(251)至少部分由透气材料组成，且所述气体空间(251)由上气体空间壁(210)和下气体空间壁(215)限定。
15.如权利要求14所述的装置，其中所述上气体空间壁(210和侧壁(225)形成细胞培养室。
16.如权利要求15所述的装置，其中所述上气体空间壁(210)由透气材料组成。
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