CN101522713A - Il-31单克隆抗体的可变区序列和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了来源于具有对于IL－31的亲和力的免疫球蛋白的抗原结合位点的新型组合物。组合物展示能够特异性结合人IL－31的抗体分子的免疫结合特性。提供了来源于相同或不同免疫球蛋白部分的CDR区域。还提供了其中VH和VL结构域相连接的单链多肽。sFv分子可包括可具有生物活性或提供其他有用部分的附着位点的辅助多肽部分。组合物用于特异性结合测定、亲和纯化方案、药物或毒素靶向、成像以及用于炎性疾病的遗传或免疫治疗。因此本发明提供了新的多肽、编码此类多肽的DNA、包含此类DNA的表达盒以及诱导所述多肽产生的方法。本发明还提供了单克隆抗体的可变区的氨基酸序列和这些单克隆抗体或抗体片段与人IgG4 Fc分子结合的用途。

Description

IL-31单克隆抗体的可变区序列和使用方法
发明背景
[1]皮肤在免疫***中起着重要的作用并由多层组成。表皮是表面层。表皮下面是真皮，一层***。真皮下面是皮下组织，一层大量的脂肪组织。循环T淋巴细胞在正常和炎性条件下迁移至皮肤。皮肤淋巴细胞抗原(CLA)被认为是一种对皮肤具有趋向性的T细胞的归巢受体(homing receptor)。Santamaria-Babi，L.，Eur.J.Dermatol.14：13-18，2004。
[2]已知几种皮肤疾病表达高水平的CLA+T细胞，包括特应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性(skin-tropic)病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃(alopeciaaerata)、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮。存在对治疗这类皮肤T细胞介导的疾病的需要。
[3]所证实了的细胞因子家族的体内活性显示了其它细胞因子、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂的巨大临床潜力，以及对它们的需要。IL-31，一种新鉴定的细胞因子。IL-31当在小鼠中过度表达时，导致皮炎样症状。已经将皮肤归巢T细胞和表皮角质细胞(kerationcyte)牵连于人类皮肤疾病的病理学中。本发明通过提供致炎细胞因子IL-31的拮抗剂来解决这些需要。本发明的这种拮抗剂可阻断、抑制、减少、对抗或中和IL-31的活性，包括可溶性IL-31RA受体和抗-IL-31中和抗体。本发明进一步提供了在炎性疾病中为此的用途，以及相关的组合物和方法。
[4]单克隆抗体技术已提供了大量的用于鉴定和治疗疾病的治疗剂以及诊断剂。许多临床应用已集中在于小鼠细胞中产生的但特异性结合人抗原的鼠抗人单克隆抗体。此外，还开发了由人和非人氨基酸序列组成的嵌合抗体。特别地，已描述了具有来源于例如鼠免疫球蛋白的融合至来源于人免疫球蛋白的恒定区的可变区的杂种抗体分子。参见例如，美国专利No.4,816,567；Winter等(1991)Nature349：293-299；和Lobuglio等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：4220-4224。此外，因为恒定区不是抗原识别或结合所需要的，因此不含有Fc部分的抗体片段例如F(ab)、F(ab′)2和Fv已表明示为用于临床治疗的有用候选物。
[5]已描述了许多包含啮齿类抗原结合位点的重组或生物合成的分子。特别地，已描述了具有通过只将啮齿类结合位点而非完整的可变结构域嫁接入人免疫球蛋白重链和轻链结构域而直接建立在人抗体上的啮齿类抗原结合位点的分子。参见例如，Riechmann等(1988)Nature 332：323-327和Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536。具有其中可变结构域的至少一个互补决定区(CDRS)来源于鼠单克隆抗体并且分子的剩余免疫球蛋白来源的部分来源于人免疫球蛋白的分子已在1994年9月21日公布的英国专利公开号GB 2,276,169中进行了描述。也已描述了许多单链抗原结合位点多肽和单链Fv(sFv)分子。参见例如，属于Huston等的美国专利Nos.5,132,405和5,091,513；以及以属于Ladner等的美国专利No.4,946,778。
[6]抗体的Fc结构域的效应子作用包括吞噬作用、炎症介质的释放、抗体产生的调控以及最重要地依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)。这些效应子作用的任一个被诱导的程度取决于Fc结构域与相关蛋白质介质的相互作用、Fcγ受体和Clq的相关作用，并且差异取决于IgG亚类恒定区(Fc)和它们与这些蛋白质的相互作用。
[7]IgG1的Fc结构域与免疫***效应细胞上的FcγRI，、FcγRIIa和FcγRIII相互作用。不同Fcγ受体的精确作用仍待阐明，但FcγRIIIA据认为是NK细胞而且还是单核细胞和巨噬细胞上主要表达的最重要的ADCC介导受体。IgG1也结合Clq并且可触发主要由表达Fcγ RIII的NK细胞介导的CDC。IgG4 Fc结构域具有大大减少的对不同Fcγ受体和Clq的结合亲和力，相应于减少的ADCC和CDC。然而IgG1通常显示对ADCC和CDC两者的高活性，IgG4据认为具有低ADCC或CDC活性至无ADCC或CDC活性。
[8]当与其他IgG同种型mAb相比，效应器阴性IgG4 mAb的结合亲和力大大减少，如果不是被消除的话。然而，与Brambell受体(FcRn)相互作用的能力保持在IgG4中，从而通过延长的半衰期影响IgG4同种型mAb的药物动力学。
[9]因此，存在对提供与人IgG4Fc分子结合的用于治疗IL-31介导的炎症的抗人IL-31的氨基酸序列的分子的需要。
附图概述
[10]图1是来自克隆292.12.3.1、292.84.1.6、292.63.5.3和294.144.3.5的轻链和重链的可变结构域的氨基酸序列的比对。
[11]图2是来自克隆292.12.3.1和292.84.1.6的轻链和重链的可变区的氨基酸序列的比对。
[12]图3和4是小鼠抗人IL-31单克隆抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列的比对。
发明详述
[13]在更详细地示于本发明之前，定义下列术语对于理解其是有帮助的。
[14]如在此使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和-纯化的多克隆抗体、单克隆抗体，以及抗原-结合片段，例如F(ab′)2和Fab蛋白水解片段。一般而言，工程化的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等，以及合成的抗原-结合肽和多肽也包括在内。非人抗体可通过移植非人CDR至人的框架区和恒定区，或通过整合整个非人的可变结构域(任选通过置换暴露残基用类似人的表面来“掩饰”它们，其中产物是一种“镶嵌化的(veneered)”的抗体)来进行人源化。在一些情况中，人源化抗体可在人可变区框架结构域中保留非-人残基，以增强正常的结合特性。通过人源化抗体，可延长生物半衰期，并减小在施用给人时不利的免疫反应的可能性。
[15]术语“嵌合抗体”指其轻链和重链基因通常通过遗传工程，从属于不同种属的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建而来的抗体。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区片段与人恒定区片段，例如γ1和γ3连接。因此，典型的治疗性嵌合抗体是一种杂合蛋白，其由来自小鼠抗体的可变或抗原-结合结构域和来自人抗体的恒定结构域组成，虽然也可以使用其它哺乳动物物种。
[16]如在此使用的，术语“免疫球蛋白”指由基本上通过免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。一种形式的免疫球蛋白构成了抗体的基本结构单位。这种形式是一个四聚体并由相同的两对免疫球蛋白链组成，每对链具有一条轻链和一条重链。在每对链中，轻链和重链的可变区一起负责结合至抗原，而恒定区负责抗体效应子作用。
[17]全长的免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)由NH2-末端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码。全长的免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其它上述恒定区基因之一(约330个氨基酸)编码。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并分别定义抗体的同种型为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多氨基酸的“J”区连接，且重链还包含约10个或更多氨基酸的“D”区。(通常参见，FundamentalImmunology(Paul，W.，ed.，第2版.Raven Press，N.Y.1989)，Ch.7(为所有目的通过全文引入作为参考)。
[18]免疫球蛋白的轻链或重链可变区由通过3个高可变区中断的“框架”区组成。因此，术语“高可变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高可变区含有来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3))(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunologicalinterest，第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991))，和/或来自“高可变loop区”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917)(将两者都在此通过引入作为参考)。“框架区”或“FR”残基是那些可变结构域的残基，而不是如在此定义的高可变区的残基。在一种物种中，不同轻链或重链的框架区序列是相对保守的。因此，“人框架区”是与天然存在的人免疫球蛋白的框架区基本一致的(约85％或更高，一般为90-95％或更高)。抗体的框架区，即组成性轻链和重链的组合框架区，用来定位和对齐CDR。CDR主要负责结合至抗原表位。
[19]因此，术语“人源化的”免疫球蛋白指含有人框架区和来自非人(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。不需要存在恒定区，但是如果它们存在，则它们必须与人免疫球蛋白的恒定区基本一致，即至少约85-90％，优选约95％或更一致。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分(可能除了CDR)基本上与天然的人免疫球蛋白序列的对应部分一致。“人源化抗体”指含有人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体将不包括如上定义的典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非人的。
[20]术语“遗传改变的抗体”表示其中氨基酸序列已与天然抗体的氨基酸序列不同的抗体。由于重组DNA技术在抗体产生中的实用性，人们不需要受限于在天然抗体中发现的氨基酸序列；可重新设计抗体来获得期望的特性。可能的改变有许多，从仅一个或少数氨基酸的改变到例如可变区或恒定区的完全重新设计。一般而言，将对恒定区作改变以便提高或改变特性，例如补体结合、与膜的相互作用以及其它效应子作用。将会对可变区作改变以便提高抗原结合特性。
[21]除了抗体，免疫球蛋白可以多种其它形式存在，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab′)2，以及双体、线性抗体、多价体或多特异性杂合抗体(如上面描述的以及在Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.17，105(1987)中详述的)，以及单链(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird等，Science，242，423-426(1988)，将其在此通过引入作为参考)。(通常参见，Hood等，“Immunology”，Benjamin，N.Y.，第2版.(1984)，以及Hunkapiller和Hood，Nature，323，15-16(1986)，将其在此通过引入作为参考)。
[22]如在此使用的，术语“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv”指这样的抗体片段：其含有来自重链和轻链两者的可变区，但缺少恒定区，但位于单个多肽链内。通常，单链抗体另外含有在VH和VL结构域之间的多肽连接物，其使得它能形成将会供抗原结合用的期望结构。单链抗体由Pluckthun在The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，vol.113，Rosenburg和Mooreeds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)中详细论述；还可参见国际专利申请案出版号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203，将它们的公开内容为任何目的通过引入作为参考。在特定的实施方案中，单链抗体也可以是双特异性的和/或人源化的。
[23]“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
[24]“Fab′片段”含有一条轻链和一条重链，该重链在CH1和CH2结构域之间具有多个恒定区的，这样可在两条重链之间形成链间二硫键而形成F(ab’)2分子。
[25]“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链，重链在CH1和CH2结构域之间具有一部分恒定区，这样链间二硫键在两条重链之间形成。
[26]通过不精确的分析法(例如，凝胶电泳)测定的聚合物的分子量和长度应该理解为是近似值。当这种值表示为“大约”X或“近似”X时，所述的X值将理解为将会精确到±10％。
[27]在此引用的所有参考文献在这里通过全文引入作为参考。
[28]本发明部分基于2006年5月8日提交的共同拥有的美国专利申请系列No.11/430,066(其作为美国专利申请No.2006-0275296(通过在此引用作为参考)于2006年12月7日公开)中描述的单克隆抗体的氨基酸序列的确定。在布达佩斯条约下，将表达针对上述人IL-31的中和单克隆抗体的杂交瘤作为原始存放物交托给美国典型培养物保藏中心(ATCC；10801 University Blvd，Manassas VA 20110-2209)patent depository，并且给予下列ATCC登记号：克隆292.12.3.1(ATCC专利保藏名称PTA-6815，于2005年6月29日保藏)、克隆292.72.3.1(ATCC专利保藏名称PTA-6816，于2005年6月29日保藏)、克隆292.63.5.3(ATCC专利保藏名称PTA-6829，于2005年7月6日保藏)、克隆292.118.6.4(ATCC专利保藏名称PTA-6830，于2005年7月6日保藏)、克隆294.163.2.1(ATCC专利保藏名称PTA-6831，于2005年7月6日保藏)、克隆292.84.1.6(ATCC专利保藏名称PTA-6871，于2005年7月19日保藏)、克隆294.35.2.6.3(ATCC专利保藏名称PTA-6872，于2005年7月19日保藏)、克隆294.154.5.6(ATCC专利保藏名称PTA-6875，于2005年7月19日保藏)和克隆294.144.3.5(ATCC专利保藏名称PTA-6873，于2005年7月19日保藏)。
[29]本发明提供了由这些用于产生抗体和抗体片段的杂交瘤产生的单克隆抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链和重链可变区结合IL-31配体且可通过例如表达为融合蛋白与人IgG4 Fc分子结合使用，来拮抗IL-31，从而通常抑制、阻断、减少或中和炎症，以及皮炎和搔痒症疾病的症状。这样的抗体可包括含有或由轻链可变区和重链可变区组成的抗体或抗体片段，其可以是中和、抑制、减少、防止或使IL-31对其受体的效应最小化的嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。所述抗体或抗体片段的临床结果可以是炎性疾病例如此处进一步描述的皮炎和搔痒症疾病的减轻。在一个实施方案中，皮炎是特应性皮炎。在另一个实施方案中，皮炎是结节性痒疹。在另一实施方案中，皮炎是湿疹。
[30]IL-31是一种新发现的T细胞细胞因子，其在小鼠中过度表达时导致类似皮炎的症状。也参见，Dillon等，Nature Immunol.5：752-760，2004。已经将皮肤归巢T细胞和表皮角质细胞牵连于人类皮肤疾病的病理学中。在特应性皮炎(AD)患者和正常个体两者中，IL-31mRNA和蛋白质的表达只限于皮肤归巢CLA+T细胞群，同时通过免疫组织化学(IHC)对IL-31的受体IL-31RA的分析显示，与正常个体比较，在急性和慢性AD患者的皮肤活组织检查中，在皮肤角质细胞上有稍微更高水平的IL-31RA的表达。
[31]IL-31是先前已在公开的美国专利申请案中描述为Zcyto17rlig的细胞因子的HUGO名称(参见，出版号20030224487，Sprecher，Cindy等，2003，在此将其通过引入作为参考)。也参见，Dillon等，Nature Immunol.，同上。IL-31的异二聚体受体也在20030224487中描述为zcytor 17(HUGO名称，IL-31RA)，其与OncostatinM受体β(OSMRβ)形成异二聚体。IL-31可从由根据CD3选择的活化的人外周血细胞(hPBC)产生的cDNA文库分离。CD3是淋巴源细胞，尤其是T细胞特有的细胞表面标记。人IL-31的多肽序列在SEQ ID NO：2中显示。鼠IL-31的多肽序列在SEQ ID NO：4中显示。如在此使用的，术语IL-31表示如在美国专利出版号20030224487中使用的IL-31，如上文中显示。IL-31的分泌信号序列由氨基酸残基1(Met)至23(Ala)组成，而成熟的多肽由氨基酸残基24(Ser)至164(Thr)组成(如在SEQ ID NO：2中显示)。对来自293T细胞的纯化的IL-31的进一步N-端序列测定分析显示，如在SEQ ID NO：2中显示的N-端位于残基27(Leu)，同时成熟的多肽由氨基酸残基27(Leu)至164(Thr)组成(如在SEQ ID NO：2中显示)。
[32]IL-31是先前已在公开的美国专利申请案中描述为Zcyto17rlig的细胞因子的HUGO名称(参见，出版号20030224487，Sprecher，Cindy等，2003，在此将其通过引入作为参考)。也参见，Dillon等，Nature Immunol.，同上。IL-31的异二聚体受体也在20030224487中描述为zcytor17(HUGO名称，IL-31RA)，其与OncostatinM受体β(OSMRβ)形成异二聚体。IL-31可从由根据CD3选择的活化的人外周血细胞(hPBC)产生的cDNA文库分离。CD3是淋巴源细胞，尤其是T细胞特有的细胞表面标记。人IL-31的多聚核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：1和2中显示。鼠IL-31的多聚核苷酸和多肽序列分别在SEQ ID NO：3和4中显示。如在此使用的，术语IL-31表示如在美国专利出版号20030224487中使用的IL-31，如上文中显示。IL-31的分泌信号序列由氨基酸残基1(Met)至23(Ala)组成，而成熟的多肽由氨基酸残基24(Ser)至164(Thr)组成(如在SEQ ID NO：2中显示)。对来自293T细胞的纯化的IL-31的进一步N-端序列测定分析显示，如在SEQ ID NO：2中显示的N-端位于残基27(Leu)，同时成熟的多肽由氨基酸残基27(Leu)至164(Thr)组成(如在SEQ ID NO：2中显示)。
[33]IL-31RA(IL-31受体)的多肽序列在SEQ ID NO：5中显示，而OncostatinM受体β(OSMRβ)的多肽序列在SEQ ID NO：6中显示。
[34]IL-31RA和OSMRβ受体属于I型细胞因子受体亚家族，该亚家族包括，但不限于IL-2、IL-4、IL-7、Lif、IL-12、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF和G-CSF的受体(关于综述，参见Cosman，“TheHematopoietin Receptor Superfamily”in Cytokine 5(2)：95-106，1993)。IL-31RA亚基在公有的PCT专利申请案No.US01/20484(WIPO出版号WO 02/00721)中得以充分描述。对IL-31RA亚基的mRNA的组织分布分析显示了在激活的CD4+和CD8+T细胞亚类、CD14+单核细胞中的表达，以及在CD19+B细胞中较弱的表达。此外，mRNA存在于休眠或活化的单核细胞系THP-1(ATCC No.TIB-202)、U937(ATCC No.CRL-1593.2)和HL60(ATCC No.CCL-240)中。
[35]通过包含轻链可变结构域和/或重链可变结构域的分子(在此处称为“IL-31结合分子”或“IL-31拮抗剂”)抑制、中和、阻断信号转导可通过本领域技术人员已知的大量测定法测量。例如，测量增生减少的测定法包括用于染料例如AlamarBlueTM(AccuMedInternational公司，Westlake，Ohio)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯溴化四唑(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，1983)、3，(4，5二甲基噻唑-2基)-5-3-羧基甲氧基苯基-2H-四唑、2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑氢氧化物(tetrazolium hydroxide)，以及氰基联甲苯(cyanoditolyl)-氯化四唑(其可从Polyscienoes公司，Warrington，PA商业获得)减少的测定法；有丝***发生测定法(mitogenesis assays)，例如对3H-胸苷的整合的测量；使用例如萘黑或锥虫蓝的染料排除测定法；使用二乙酰基荧光素的染料吸收法；以及铬释放法。通常，参见Freshney，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，3rd ed.，Wiley-Liss，1994，将其在此通过引入作为参考。除了上述的，对于表达IL-31RA和全长OSMRβ的BaF3细胞的实例，参见公开的美国专利出版号20030224487(Sprecher，Cindy等，2003)。
[36]用于制备编码在此描述的抗体的多聚核苷酸(包括DNA和RNA)的方法是本领域熟知的。可采用异硫氰酸胍提取，之后通过在CsCl梯度中离心分离来制备总RNA(Chirgwin等，Biochemistry 18：52-94，1979)。可采用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad. Sci.USA 69：1408-12，1972)，从总RNA制备聚(A)+RNA。互补DNA(cDNA)用已知的方法从聚(A)+RNA制备。备选地，可分离基因组DNA。随后，通过例如杂交或PCR来鉴定和分离编码IL-31抗体的多聚核苷酸。
[37]本发明还包括结合IL-31多肽的功能片段和编码这种功能片段的核苷酸分子的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。如在此定义的，“功能性”IL-31或其片段表征为它的增殖或分化活性、它诱导或抑制特定的细胞功能的能力，或者它特异性结合至抗-IL-31抗体或IL-31RA或抗体或这些受体的IL-31RA/OSMRβ异二聚体(可溶的或固定的)的能力。如先前在这里描述的，IL-31表征为含有螺旋A(氨基酸残基38-52)、螺旋B(氨基酸残基83-98)、螺旋C(氨基酸残基104-117)和螺旋D(氨基酸残基137-152)的四-螺旋-束结构，如SEQID NO：2中显示的。因此，本发明进一步提供了融合蛋白，所述的融合蛋白包含：(a)含有一个或多个如上描述的螺旋的多肽分子；和(b)含有一个或多个这些螺旋的功能性片段。该融合蛋白的其它多肽部分可由另外的四-螺旋-束细胞因子，例如IL-15、IL-2、IL-4和GM-CSF，或者由促使该融合蛋白分泌的非天然和/或不相关的分泌信号肽提供。
[38]本发明还提供了结合至多肽片段或肽的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂，所述的多肽片段或肽含有在此描述的IL-31多肽的带有表位的部分。这种片段或肽可含有“免疫原性表位”，其为当整个蛋白质用作免疫源时，引起抗体应答的蛋白质的一部分。带有免疫原性表位的肽可用标准的方法鉴定(参见，例如Geysen等，Proc.Nat’ 1 Acad.Sci.USA 81.：3998(1983))。抗体结合这些功能性片段导致抑制、阻断、中和和/或减少了IL-31在其同源受体上的信号转导。
[39]比较而言，多肽片段或肽可含有“抗原表位”，其为抗体可特异性与其结合的蛋白质分子的区域。某些表位由线性或连续的一段氨基酸组成，并且这种表位的抗原性不会受变性剂破坏。本领域已经知道，能模拟蛋白质表位的相对短的合成肽可用于刺激产生对抗该蛋白质的抗体(参见，例如Sutcliffe等，Science 219：660(1983))。因此，本发明的带有抗原表位的肽和多肽可用于产生与在此描述的多肽结合的抗体(例如，中和抗体)。Hopp/Woods亲水性图可用于确定具有最大抗原潜力的区域(Hopp等，1981，同时以及Hopp，1986，同上)。例如，在人IL-31中，亲水性区域包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基54-59、SEQ ID NO：2的氨基酸残基129-134、SEQ ID NO：2的氨基酸残基53-58、SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-40，以及SEQ ID NO：2的氨基酸残基33-38。例如，在鼠IL-31中，亲水性区域包括SEQ ID NO：4的氨基酸残基34-39、SEQ ID NO：4的氨基酸残基46-51、SEQ ID NO：4的氨基酸残基131-136、SEQ ID NO：4的氨基酸残基158-163，以及SEQID NO：4的氨基酸残基157-162。
[40]带有抗原表位的肽和多肽优选含有SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4的至少4至10个氨基酸，至少10至14个氨基酸，或者约14至约30个氨基酸。这种带有表位的肽和多肽可通过片段化IL-31多肽，或通过化学肽合成产生，如在此描述的。此外，表位可通过随机肽文库的噬菌体展示选择(参见，例如Lane和Stephen，Curr.Opin.Immunol.5：268(1993)；以及Cortese等，Curr.Opin.Biotechnol. 7：616(1996))。用于鉴定表位和从含有表位的小肽获得抗体的标准方法例如，由Mole，“Epitope Mapping，”in Methods in Molecular Biology，第10卷，Manson(ed.)，pages 105-116(TheHumana Press公司，1992)、Price，“Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter和Ladyman(eds.)，pages 60-84(Cambridge University Press 1995)，以及Coligan等(eds.)，Current Protocols in Immunology，pages 9.3.1-9.3.5和pages9.4.1-9.4.11(John Wiley & Sons 1997)描述。
[41]如在此描述的抗体的活性可采用多种测量增殖和/或与表达IL-31RA受体的细胞结合的测定法，通过它们抑制或减少增殖的能力来测量。特别重要的是IL-31-依赖性细胞的改变。工程化为IL-31-依赖性的合适的细胞系包括IL-3-依赖性BaF3细胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985、Mathey-Prevot等，Mol.Cell. Biol.6：4133-4135，1986)、FDC-P1(Hapel等，Blood 64：786-790，1984)和MO7e(Kiss等，Leukemia 7：235-240，1993)。生长因子-依赖性细胞系可根据公开的方法建立(例如，Greenberger等，Leukemia Res.8：363-375，1984；Dexter等，Baum等编辑，Experimental Hematology Today，8th Ann.Mtg.Int.Soc.Exp.Hematol.1979，145-156，1980)。
[42]在此描述的抗-IL-31抗体的活性可通过基于硅的生物感受器微生理测量仪测量，该仪器可测量与受体结合以及随后的生理细胞反应相关的细胞外酸化率(acidification rate)或质子分泌(proton excretion)。一种示例性装置是由Molecular Devices，Sunnyvale，CA生产的CytosensorTM微生理测量仪测量。多种细胞反应，例如细胞增殖、离子转移、能量生产、炎症应答、调节和受体激活等都可通过本方法测量。参见，例如McConnell，H.M.等，Science 257：1906-1912，1992；Pitchford，S.等，Meth.Enzymol. 228：84-108，1997；Arimilli，S.等，J Immunol.Meth.212：49-59，1998；Van Liefde，I.等，Eur.J.Pharmacol.346：87-95，1998。
[43]拮抗剂还可用作用于鉴定配体-受体相互作用位点的研究试剂。拮抗剂可用于抑制参与调控红细胞生成的细胞的扩增、增殖、激活和/或分化。IL-31活性的抑制剂(IL-31拮抗剂)包括抗-IL-31抗体和可溶性IL-31受体，以及其它肽和非肽制剂(包括核酶)。
[44]抑制IL-31的活性可通过多种测定法测量。除了在此公开的那些测定法，可在多种设计用来测量受体结合、IL-31-依赖性细胞反应的刺激/抑制或IL-31RA受体-表达细胞的增殖的测定法中，检测样品对IL-31活性的抑制。
[45]IL-31-结合多肽，包括IL-31结合分子或IL-31拮抗剂，也可用于配体的纯化。将该多肽固定在在使用条件下稳定的固体载体，例如琼脂糖小球、交联琼脂糖、玻璃、纤维素树脂、基于硅的树脂(silica-based resins)、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺或类似的材料上。用于将多肽连接至固体载体的方法是本领域已知的，并包括胺化学、溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化和酰肼活化。通常将会使得到的介质成形为柱的形式，并且让含有配体的流体通过该柱一次或多次以使得配体结合至受体多肽。随后，改变盐浓度、促溶剂(盐酸胍)或pH，用以破坏配体-受体结合来洗脱出配体。
[46]可有利地采用利用配体-结合受体(或抗体，补体/抗补体对的一个成员)或其结合片段的检测***，以及可商业获得的生物感受器装置(BIAcore，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。将这种受体、抗体、补体/抗补体对的成员或片段固定在受体芯片表面上。该装置的使用由Karlsson，J.Immunol.Methods 145：229-40，1991以及Cunningham和Wells，J.Mol.Biol.234：554-63，1993公开。使用胺或巯基化学，将受体、抗体、成员或片段共价连接至葡聚糖纤维上，葡聚糖纤维连接流式细胞仪(flow cell)中的金膜。让试验样品通过该仪器。如果样品中存在配体、表位或补体/抗补体对的相对的成员，则它会分别结合上述固定的受体、抗体或组成成分，导致介质的屈光率改变，其可检测为金膜的质子表面共振的改变。该***能够测定结合速率和解离速率，可从中计算出结合亲合力，并评估结合的化学定量关系。备选地，配体/受体结合可用SELDI(TM)技术(Ciphergen公司，Palo Alto，CA)分析。
[47]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可用于阻断致炎性IL-31的生物作用，并可用作如在此描述的多种疾病的抗-炎性治疗剂。本领域的技术人员将会理解，抗原性的、带有表位的多肽含有至少6个，优选至少9个，并且更优选至少15至约30个IL-31多肽(例如SEQ IDNO：2)的连续氨基酸残基。含有更大部分的IL-31多肽，即从30至100个残基直至全长的氨基酸序列的多肽也包括在内。抗原或免疫原性表位还可包括连接的标记、佐剂、赋形物和载体，如在此描述的。合适的抗原包括由SEQ ID NO：2的氨基酸号24至氨基酸号164，或者其连续的9-141个氨基酸片段编码的IL-31多肽。其它合适的抗原包括，全长和成熟的IL-31、如在此描述的IL-31四-螺旋-束结构的螺旋A-D，以及单独的或多个螺旋A、B、C和D。优选用作抗原的肽是亲水性肽，例如本领域技术人员从如在此描述的疏水性图预测的那些亲水性肽，如SEQ ID NO：2的氨基酸残基114-119、101-105、126-131、113-118和158-162，以及SEQ ID NO：4的氨基酸残基34-39、46-51、131-136、158-163和157-162。此外，将例如采用DNASTAR Protean程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，通过Jameson-Wolf图预测的IL-31抗原表位用作优选的抗原，并且很容易由本领域的技术人员确定。
[48]如果：1)IL-31结合分子或IL-31拮抗剂显示出阈水平的结合活性，和2)它们不会与相关的多肽分子显著交联，则所述IL-31结合分子或IL-31拮抗剂被认为是特异性结合。如果这里的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂以比与对照(非-IL-31)多肽的亲合力大至少10倍的亲合力结合IL-31多肽、肽或表位，则测定了结合的阀水平。优选的是，抗体显示出106M-1或更大的亲合力(Ka)，优选107M-1或更大，更优选108M-1或更大，并且最优选109M-1或更大。IL-1结合分子的结合亲合务或IL-31拮抗剂的亲合力可例如通过Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)，由本领域的一般技术人员容易地测定。
[49]例如通过IL-31结合分子或IL-31拮抗剂检测IL-31多肽而不是已知的相关多肽的抗体，用标准的蛋白印迹分析(Ausubel等，同上)来显示IL-31结合分子或IL-31拮抗剂是否不会与相关的多肽分子显著交联。已知的相关多肽的实例是在现有技术中公开的那些，例如已知的直系同源物，和paralog，以及蛋白质家族中类似的已知成员。筛选也可采用非人IL-31和IL-31突变型多肽完成。此外，IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可“针对已知的相关多肽来筛选”，以分离出特异性结合IL-31多肽的群体。例如，将IL-31结合分子或IL-31拮抗剂吸附至粘附在不溶解基质上的相关多肽；对IL-31特异性的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂将会在适当的缓冲条件下流过基质。Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(eds.)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988；Current Protocols in Immunology，Cooligan，等(eds.)，National Institutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995。
[50]对从组织培养基中纯化的单克隆抗体进行鉴定，鉴定它们阻断或减少BaF3/MPL-IL-31细胞上的纯化的重组huIL-31的受体结合活性(“中和测定”)的能力。
[51]可以确定IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的结合亲合力。将山羊-抗-大鼠IgG-Fcγ特异性抗体(Jackson)固定在CM5 Biacore芯片上。优化该测定法以使每个mAb结合至抗-大鼠捕获表面上，并随后将一浓度系列的IL-31注射通过mAb来观察结合常数(Ka)和解离常数(Kd)。在每次运行后，通过2次注射20mM HCl来使表面再生为抗-大鼠抗体。产生了每种抗体的数据，并采用评估软件(BIAevaluation software version 3.2，Pharmacia BlAcore，Uppsala，Sweden)来评估抗-IL-31抗体结合IL-31蛋白质的动力学。
[52]如实施例1中所示确定克隆编号292.12.3.1、292.84.1.6、292.63.5.3、294.144.3.5、292.39.5.3、292.51.5.2、292.64.6.5.5、292.105.4.1、292.109.4.4、292.118.6.4、292.72.3.1的轻链和重链可变区的多核苷酸和多肽序列。如实施例2中所示确定克隆编号的轻链和重链可变区的氨基端的多肽序列。
[53]就当在纯化的重组蛋白质人IL-31存在的情况下培养时就它们阻断、抑制、防止或减少受体结合的能力鉴定组织培养基中的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。例如，可以用许多方法包括框并法(即，确定每一种抗体是否可抑制任何其他结合的结合)、相对亲和力和中和来鉴定IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。
[54]可通过多种方法来检测通过在此描述的方法产生的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的中和作用。例如，可采用如在公开的美国专利申请(参见出版号20030224487，Sprecher，Cindy等，2003)中描述的荧光素酶测定法。另外，中和作用可通过测量在存在配体和单克隆抗体时，角质细胞培养物中致炎趋化因子例如TARC和MDC的产生的减少来检测。中和作用还可通过在此描述的体内模型测量。
[55]在一个实施方案中，本发明的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂是本发明的人抗原-结合抗体片段，并且包括但不限于，Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键-连接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH结构域的片段。抗原-结合抗体片段(包括单链抗体)可以只含有可变区(例如，SEQ ID NO：1、2、3或4)，或者含有可变区与全部或部分以下区域：绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的组合。还包含于本发明内的是也含有可变区与绞链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合的抗原-结合片段。
[56]在另一实施方案中，IL-31的结合分子或IL-31拮抗剂可以是单一特异性的、双特异性的、三特异性的或有更多的多特异性。多特异性抗体可以是对本发明多肽的不同表位有特异性，或者可以是对本发明多肽以及异源表位，例如异源多肽或固体载体物质两者都有特异性。参见，例如PCT出版物WO 93/17715、WO 92/08802、WO91/00360、WO 92/05793、Tutt等，J.Immunol.147：60-69(1991)、美国专利号4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819、Kostelny等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
[57]本发明还包括功能上等价于上述抗体的经遗传改变的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。优选提供增强的稳定性和/或治疗效果的经修饰的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。经修饰的抗体的实例包括，具有氨基酸残基的保守置换，以及一个或多个不会显著有害改变抗原结合效用的氨基酸的缺失或添加的那些抗体。置换可从改变或修饰一个或多个氨基酸残基到完全重新设计一个区域，只要治疗效果得以维持。可翻译后修饰(例如，乙酰化和磷酸化)或合成修饰(例如，连接标记基团)本发明的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。
[58]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂还包括嵌合抗体或嵌合片段，基包含此处公开的可变区和来源于人的恒定区，这样所述嵌合抗体或嵌合片段具有更长的半衰期，并且在对人受受试者施用时具有较少的免疫原性。制备嵌合抗体和嵌合片段的方法在本领域内是已知的。可将这些IL-31抗体分子或IL-31拮抗剂的可变区与人IgG的恒定区连接来形成期望的嵌合抗体。IgG Fc分子可融合至IL-31结合分子。为避免效应子作用的诱导，所述IgG Fc分子可来自IgG4Fc分子。因此，此处公开的可变区和可变区的氨基酸序列可用于产生嵌合抗体，其中恒定区是人IgG分子，轻链和重链可变区可选自克隆292.12.3.1、292.84.1.6、292.63.5.3、294.144.3.5、292.39.5.3、292.51.5.2、292.64.6.5.5、292.105.4.1、292.109.4.4、292.118.6.4和292.72.3.1的轻链和重链可变区。这样的嵌合抗体可具有：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；h)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；或j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区，以及与人IgG4 Fc分子结合使用。
[59]还可产生具有或不具有信号序列的这样的可变区。因此，此处公开的可变区和可变区的氨基酸序列可用于产生嵌合抗体，其中恒定区是人IgG分子，轻链和重链可变区可选自克隆292.12.3.1、292.84.1.6、292.63.5.3、294.144.3.5、292.39.5.3、292.51.5.2、292.64.6.5.5、292.105.4.1、292.109.4.4、292.118.6.4和292.72.3.1的轻链和重链可变区。这样的嵌合抗体可具有：a)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQID NO：35的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链可变区；h)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的重链可变区；i)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的重链可变区；或j)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的重链可变区，以及与人IgG4 Fc分子结合使用。可产生具有或不具有信号序列的这样的可变区。
[60]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂包括在此描述的人源化形式的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。人源化IL-31结合分子或IL-31拮抗剂含有小鼠供体免疫球蛋白的CDR以及人受体免疫球蛋白的重链和轻链框架区。制备人源化抗体的方法公开于美国专利号5301101、5585089、5693762和6180370中(将它们每一篇通过全文引入作为参考)。然后，可将这些抗体的CDR移植到任意选择的人框架区内，这是本领域已知的，以便产生期望的人源化抗体。
[61]本发明还提供了竞争性抑制单克隆抗体结合至本发明的多肽，优选SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。竞争性抑制可通过本领域的任何已知方法测定，例如，采用在此描述的竞争性结合测定法。在优选的实施方案中，所述的抗体至少90％、至少80％、至少70％、至60％或至少50％地竞争性抑制本发明的单克隆抗体结合至SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽。
[62]本发明还提供了竞争性抑制抗体结合至本发明的表位的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂，如通过本领域中用于测定竞争性结合的任意已知方法，例如在此描述的免疫测定法测定。在优选的实施方案中，该抗体至少90％、至少80％、至少70％、至60％或至少50％地竞争性抑制了与表位的结合。
[63]本发明的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂包括经修饰的衍生物，例如，但不作为限制，衍生物包括已例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基团/阻断基团的衍生、溶蛋白性裂解、连接至细胞配体或其它蛋白质等修饰的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。众多化学修饰的任意一种可通过已知的技术完成，包括，但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一种或多种非-典型的氨基酸。
[64]本发明IL-31结合分子或IL-31拮抗剂也包括在哺乳动物，优选人中具有长于15天，优选长于20天、长于25天、长于30天、长于35天、长于40天、长于45天、长于2个月、长于3个月、长于4个月或长于5个月的半衰期(例如，血清半衰期)的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。在哺乳动物，优选人中，本发明的抗体或其片段延长的半衰期导致哺乳动物中所述抗体或抗体片段的血清滴定度更高，并从而减少了所述抗体或抗体片段的施用频率和/或降低了要施用的上述抗体或抗体片段的浓度。
[65]可通过修饰(例如，取代、删除或添加)已确定为参与Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基来增加IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的体内半衰期(参见，例如国际出版物号WO97/34631和WO 02/060919，将其在此通过全文引入作为参考)，或通过连接至聚合物分子例如高分子量的聚乙二醇(PEG)来增加IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的体内半衰期。可以用或不用多功能连接物，通过将PEG位点-专一性缀合至所述抗体或抗体片段的N-或C-端，或者通过存在于赖氨酸残基上的ε-氨基基团，将PEG连接至所述的抗体或抗体片段上。将会使用导致生物活性损失最小化的线性或分支聚合物。缀合水平将会通过SDS-PAGE和质谱法密切监控，以确保PEG分子适当地缀合至抗体。未反应的PEG可通过，例如分子排阻色谱或离子交换色谱来与抗体-PEG缀合物分离。
[66]应理解，通过本发明方法设计的人源化来增加IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可具有另外的保守氨基酸置换，其基本上不会影响抗原结合或其它的免疫球蛋白功能。保守置换意指组合例如gly，ala；val，ile，leu；asp，glu；asn，gln；ser，thr；lys，arg；以及phe，tyr。
[67]用于使非-人抗体人源化的方法是本领域中所熟知的。通常，人源化免疫球蛋白，包括人源化抗体，已通过基因工程构建。先前已描述的大多数人源化免疫球蛋白(Jones等，如前述所引用的；Verhoeyen等，如前述所引用的；Riechmann等，如前述所引用的)含有与特殊的人免疫球蛋白链(受体)的框架区一致的框架区、以及来自非-人供体免疫球蛋白链的三个CDR。特别地，人源化抗体是来自结合期望的抗原的非-人种抗体的、具有来自非-人种的一个或多个互补性决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子。
[68]本发明包括这样的标准，通过该标准，选择人源化免疫球蛋白链的框架中的有限数量氨基酸，使其与供体而不是受体中那些位置处的氨基酸相同，以便增加含有人源化免疫球蛋白链的抗体的亲合力。
[69]本发明的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂部分是基于这样的模式产生：在先前产生人源化抗体(例如，用小鼠抗体作为CDR的来源)的方法中导致亲合力丧失的两个起作用的原因是：
[70](1)当小鼠CDR与人框架结合时，靠近CDR的框架区中的氨基酸变成是人的而不是小鼠的。尽管不愿受理论束缚，这些改变的氨基酸可能使CDR稍微变形，因为它们产生了与供体小鼠抗体中不同的静电力或疏水性力，并且变形的CDR可能不会与抗原产生与CDR在供体抗体中进行的一样有效的接触；以及
[71](2)靠近CDR，但不是它的一部分(即，仍然是框架区的一部分)的初始小鼠抗体中的氨基酸可与抗原进行有助于亲合性的接触。当抗体进行人源化时丧失了这些氨基酸，因为所有的框架氨基酸都是人的
[72]为了避免这些问题，并且为了产生对期望的抗原具有非常强的亲合力的人源化抗体，本发明采用了一条或多条下列原则用于设计人源化免疫球蛋白。同样，所述标准可单独使用，或者当需要时组合使用，来获得期望的亲合力或其它特性。
[73]一条原则是，作为受体，采用来自与要进行人源化的供体免疫球蛋白显著同源的特殊的人免疫球蛋白的框架区，或者采用来自许多人抗体的共有框架区。例如，比较数据库(例如，NationalBiomedical Research Foundation Protein IdentificationResource)中的小鼠重链(或轻链)可变区与人重链(或轻链)可变区的序列显示，对于不同的人区域，同源性程度变化很大，通常约40％至约60-70％。通过选择与供体免疫球蛋白的重链(各自的轻链)可变区最同源的人重链(各自的轻链)可变区作为受体免疫球蛋白，在从供体免疫球蛋白变成人源化免疫球蛋白中将会改变较少的氨基酸。因此，尽管再次不愿受理论束缚，据信仅存在更小的可能性来改变CDR附近的氨基酸而使它们的构象变形。此外，含有人源化免疫球蛋白链的人源化抗体的精确的总体形状可更接近类似于供体抗体的形状，这也减少了使CDR变形的可能性。
[74]通常，将会选择代表性收集的至少约10至20种不同的人重链中的，3-5个最同源的重链可变区序列之一来作为受体，以提供重链框架，并且对轻链也类似操作。优选地，将会使用1-3个最同源的可变区中的一种。所选择的受体免疫球蛋白链将最优选在框架区与供体免疫球蛋白具有至少约65％的同源性。
[75]在许多情形中，将来自相同人抗体的轻链和重链用作受体序列可认为是优选的，以确保人源化的轻链和重链将会彼此发生有利的接触。在该情况下，供体的轻链和重链将会只与来自其整个序列已知的人抗体，例如Eu、Lay、Pom、Wol、Sie、Gal、Ou和WEA抗体的链进行比较(Kabat等，如前述所引用的；有时候，人链的最后几个氨基酸是未知的并且必须根据与其它人抗体的同源性来推断)。将会选择其中轻链和重链可变区序列(一并考虑)整体与供体的轻链和重链可变区序列最同源的人抗体。有时，将会更偏重于重链序列。所选择的人抗体则将会提供轻链和重链受体序列。实际上，经常发现人Eu抗体会起到该作用。
[76]根据所谓的“最佳-匹配”方法，相对于已知的人可变-结构域序列的整个库，筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后，把与啮齿动物的序列最接近的人序列用作人源化抗体的人框架(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法采用了一种特殊框架，该框架源自特殊轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列。相同的框架可用于多种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immnol.，151：2623(1993))。
[77]不管怎样选择受体(acceptor)免疫球蛋白，更高的亲合力可通过选择人源化免疫球蛋白链框架中的少量氨基酸，使其与供体而不是受体中那些位置的氨基酸一样来实现。通常，人框架区中的框架残基将会用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选提高抗原结合。这些框架取代可通过本领域熟知的方法确定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用来确定对抗原结合重要的框架残基，并通过序列比较来确定在特殊位置的特殊框架残基。(参见，例如Queen等，美国专利号5,585,089；Riechmann等，Nature 332：323(1988)，其在此通过全文引入作为参考)。可采用多种本领于已知的技术来使抗体人源化，例如CDR-嫁接(EP 239,400、PCT出版物WO 91/09967、美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶嵌术(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等，PNAS91：969-973(1994))，以及链替换(美国专利号5565332)。因此，这种“人源化”抗体是其中基本上少于完整的人可变结构域已由非-人种的相应序列取代的嵌合抗体(美国专利号4816567)。
[78]对于人治疗中的使用，人源化抗体通常具有优于小鼠或在某些情况下优于嵌合抗体的至少3个潜在优势：
[79](1)由于效应子部分是人的，它可与人免疫***中的其它部分更好的相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)来更有效地破坏靶细胞)。
[80](2)人免疫***将不会将人源化抗体的框架或恒定区识别成外来物，并从而对抗这种注入的抗体的抗体反应应该比对抗完全外源的小鼠抗体或部分外源的嵌合抗体的抗体反应弱。
[81](3)已报道注入的小鼠抗体在人循环中具有比一般抗体的半衰期短许多的半衰期(D.Shaw等，J.Immunol.，138，4534-4538(1987))。注入的人源化抗体将大概具有与天然存在的人抗体更相似的半衰期，使得能施用更少以及较少频率的剂量。
[82]在一个方面，本发明旨在设计通过表达连接至编码受体人框架区的DNA片段的重组DNA片段产生的人源化抗体，所述的重组DNA片段编码能够结合至期望抗原，例如IL-31的供体免疫球蛋白的重链和轻链CDR。
[83]DNA片段通常将会进一步含有可操作性地连接至人源化免疫球蛋白编码序列的表达控制DNA序列，包括天然-相关的或异源的启动子区。该表达控制序列将会是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子***，但是也可使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体已整合进合适的宿主中，将该宿主保持在适合高水平表达所述核苷酸序列的条件下，并且，根据需要，之后可收集和纯化人源化的轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式(参见，S.Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis，Academic Press，N.Y.，(1979)，将其在此通过引入作为参考)。所述抗-IL_31分子，例如，可通过在哺乳动物宿主细胞例如中国仓鼠卵巢和HEK 293F细胞中表达来制备。
[84]人恒定区DNA序列可按照熟知的方法，从多种人细胞，但优选从永生化B-细胞中分离(参见，Kabat(如前述所引用的)和WP87/02671)。用于产生本发明免疫球蛋白的CDR将会类似地源自能够结合预定抗原，例如IL-31的单克隆抗体，并通过熟知的方法在能够产生抗体的任何合适的哺乳动物源(包括小鼠、大鼠、兔子或其它脊椎动物)中产生。恒定区和框架DNA序列的合适的源细胞，以及用于免疫球蛋白表达和分泌的宿主细胞可从许多来源，例如美国典型培养物保藏中心获得(“Catalogue of CellLines and Hybridomas”，第6版(1988)Rockville，Md.U.S.A.，将其在此通过引入作为参考)。
[85]除了特别在此描述的人源化免疫球蛋白外，其它与天然序列“充分同源”的经修饰的免疫球蛋白可采用本领域那些技术人员熟知的多种重组DNA技术容易设计和产生。多种不同的人框架区可单独或组合使用，用作本发明的人源化免疫球蛋白的基础。一般而言，基因的修饰可容易通过多种熟知的技术，例如定位诱变完成(参见，Gillman和Smith，Gene，8，81-97(1979)以及S.Roberts等，Nature，328，731-734(1987)，将两者在在此通过引入作为参考)。
[86]本发明的人源化抗体包括片段以及完整的抗体。通常，这些片段与它们源自的完整抗体竞争结合抗原。片段通常以至少107M.-1，并且通常以108或109M.-1的亲合力结合(即在与完整的抗体相同的范围内)。人源化的抗体片段包括单独的重链、轻链Fab、Fab’F(ab’)2和Fv。片段通过重组DNA技术，或者通过完整的免疫球蛋白的酶学性或化学性***产生。
[87]对于人源化抗体的进一步详细的内容，可参见欧洲专利No.EP 239400、EP 592106和EP 519596；国际出版物No.WO 91/09967和WO 93/17105；美国专利No.5225539、5530101、5565332、5585089、5766886和6407213；以及Padlan，1991，MolecularImmunology 28(4/5)：489 498；Studnicka等，1994，ProteinEngineering 7(6)：805 814；Roguska等，1994，PNAS 91：969 973；Tan等，2002，J.Immunol.169：1119 25；Caldas等，2000，ProteinEng.13：35360；Morea等，2000，Methods 20：26779；Baca等，1997，J.Biol.Chem.272：10678 84；Roguska等，1996，ProteinEng.9：895 904；Couto等，1995，Cancer Res.55(23Supp)：5973s5977s；Couto等，1995，Cancer Res.55：1717 22；Sandhu，1994，Gene 150：409 10；Pedersen等，1994，J.Mol.Biol.235：95973；Jones等，1986，Nature 321：522-525；Reichmann等，1988，Nature332：323-329；以及Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。
[88]已经发展了多种技术来用于产生抗体片段。传统上，这些片段通过蛋白水解消化完整的抗体产生(参见，例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，这些片段目前可直接由重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可从如上讨论的抗体噬菌体文库中分离。备选地，Fab’-SH片段可从大肠杆菌直接回收并经化学偶联而形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab’)2片段可从直接重组宿主细胞培养物中分离。用于产生抗体片段的其它技术对熟练从业人员来说将是显而易见的。此外，可用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括在美国专利4 946 778和5 258 498、Huston等，Methods inEnzymology 203：46-88(1991)、Shu等，PNAS 90：7995-7999(1993)，以及Skerra等，Science 240：1038-1040(1988)中描述的那些。
[89]本发明包括重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至本发明的多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20或50个氨基酸)来产生融合蛋白的抗体。因此，本发明还涉及含有在此描述的抗体的免疫缀合物，其中所述抗体缀合至细胞毒素剂，例如化学治疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射缀合物)。
[90]本发明包括重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至本发明的多肽(或其部分，优选该多肽的至少10、20或50个氨基酸)来产生融合蛋白的抗体。融合不一定是直接的，而是可通过连接序列发生。抗体可以是对不同于本发明的多肽(或其部分，优选多肽的至少10、20或50个氨基酸)特异性的。例如，抗体可通过融合或缀合本发明多肽至对特殊的细胞表面受体特异性的抗体，用于体外或体内靶向本发明多肽至特殊的细胞类型。融合或缀合至本发明多肽的抗体也可采用本领域已知的方法，用于体外免疫测定法和提纯方法。参见，例如Harbor等，同上，以及PCT出版物WO 93/21232、EP439,095、Naramura等，Immunol.Lett.39：91-99(1994)、美国专利5,474,981、Gillies等，PNAS 89：1428-1432(1992)、Fell等，J.Immunol.146：2446-2452(1991)，将其通过全文引入作为参考。
[91]本发明进一步包括含有融合或缀合至异源多肽序列(例如，不是可变区的抗体的结构域)的本发明多肽(例如，含有免疫原性表位或抗原表位的那些多肽)的组合物。例如，本发明的多肽可融合或缀合至抗体的Fc区，或其部分。例如，本发明的多肽(包括其片段或变体)可与免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定结构域，或其部分(CH1、CH2、CH3或它们以及其部分的任意组合)融合，产生嵌合多肽。融合至本发明多肽的抗体部分可包括恒定区、绞链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，或者全部结构域或其部分的任意组合。多肽也可融合或缀合至上述抗体部分而形成多聚体。例如，与本发明多肽融合的Fc部分可通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。更高的多聚体形式可通过将多肽与IgA和IgM部分融合而产生。用于融合或缀合本发明的多肽至抗体部分的方法是本领域已知的。参见，例如美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,112,946、EP 307,434、EP 367,166、PCT出版物WO 96/04388、WO91/06570、Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)、Zheng等，J.Immunol.154：5590-5600(1995)，以及Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341(1992)(将所述的参考文献通过全文引入作为参考)。作为另一个非限制性实例，本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可与白蛋白(包括但不限于重组的人血清白蛋白或其片段或变体(参见，例如美国专利5,876,969，出版于1999年3月2日，EP专利0413622，以及美国专利5,766,883，出版于1998年6月16日，将其在这此通过全文引入作为参考))融合。本发明的多肽和/或抗体(包括其片段或变体)可融合至异源蛋白质(例如免疫球蛋白Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N-或C-末端。编码本发明的融合蛋白的多聚核苷酸也包括在本发明内。
[92]如上讨论的，本发明的多肽可采用本领域已知的方法，与上述抗体部分融合或缀合以延长该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。此外，可将本发明的多肽融合或缀合至上述抗体部分以促进纯化。一个报道的实例描述了由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链恒定区的多个结构域组成的嵌合蛋白质。(参见，例如EP 394,827；Traunecker等，Nature 331：84-86(1988))。已证实了关于与FcRn结合伴侣例如IgG或Fc片段缀合的抗原(例如，胰岛素)具有增强的递送抗原穿过上皮屏障到达免疫***的能力(参见，例如PCT出版物WO 96/22024和WO 99/04813)。与具有二硫键-连接的二聚体结构(由于IgG)的抗体融合或缀合的本发明多肽也比单独的单体分泌性蛋白质或蛋白质片段更有效地结合和中和其它分子。(Fountoulakis等，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。在许多情形中，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有利的，并因此可导致，例如改善的药代动力学特性。(EP A 232,262)。备选地，在融合蛋白已经表达、检测和纯化后除去Fc部分将是期望的。例如，如果融合蛋白用作用于免疫接种的抗原，则Fc部分可能妨碍治疗和诊断。在药物发现中，例如，已将人蛋白质，例如hIL-5与Fc部分融合，以用于鉴定hIL-5的拮抗剂的高通量筛选测定法。(参见，D.Bennett等，J.Molecular Recognition 8：52-58(1995)；K.Johanson等，J.Biol.Chem.270：9459-9471(1995)0)。该技术还包括(但不限于)利用双功能缀合剂(参见例如，U.S.Pat.Nos.5,756,065、5,714,631、5,696,239、5,652,361、5,505,931、5,489,425、5,435,990、5,428,139、5,342,604、5,274,119、4,994,560和5,808,003，特此将它们每一个的内容通过全文引入作为参考)。
[93]此外，可将本发明的多肽(例如抗体或其片段)融合至标记序列，例如肽来帮助它们的纯化。在进一步的实施方案中，编码本发明多肽的核酸(包括，但不限于编码免疫原和/或抗原表位的核酸)也可与作为表位标签的目标基因(例如，血凝素标签“HA”或flag标签)重组，来帮助检测和纯化所表达的多肽。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六-组氨酸肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标记，其中，多数可商业获得。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA86：821-824(1989)中所描述的，例如，将六-组氨酸用于方便纯化融合蛋白。可用于纯化的其它肽标签包括，但不限于相应源于流感血凝素蛋白质的表位的“HA”标记(Wilson等，Cell 37：767(1984))，以及“flag”标签。
[94]本发明进一步包括缀合至诊断剂或治疗剂的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。所述IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可在诊断上用于，例如，监控肿瘤的发生或进展(作为临床检测程序的部分)，来例如测定所提供的治疗、诊断、检测和/或预防方案的效力。可通过将该抗体偶联至可检测物质来方便检测。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用多种正电子发射断层扫描术的正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。关于可与抗体缀合而用作根据本发明的诊断剂的金属离子，参见，例如美国专利4741900。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性物质的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
[95]此外，IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可与治疗性部分例如细胞毒素，例如细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子缀合。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害的任何制剂。实例包括紫杉醇(paclitaxol)，细胞松弛素B、D短杆菌肽、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、红比霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、***(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同系物。治疗剂包括，但不限于抗代谢物(例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、瘤可宁(thioepa chlorambucil)、美法兰(melphalan)、卡氮芥(carmustine)(BSNU)和罗氮芥(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C，以及顺二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，红比霉素(以前叫道诺霉素(daunomycin))和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素(dactinomycin)(以前叫更生霉素(actinomycin))、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，以及抗有丝***制剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
[96]本发明的缀合物可用于调节给定的生物应答，不能把治疗剂或药物部分理解为限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如，毒素如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、血栓形成制剂(thrombotic agent)或抗-血栓形成剂，例如血管他丁或内皮他丁；或者生物应答调节剂例如，淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生长因子。
[97]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂还可连接至固体载体，其尤其可用于靶标抗原的免疫测定或纯化。这种固体载体包括，但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
[98]用于将这种治疗剂部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见，例如Arnon等，“Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy，Reisfeld等，(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，inControlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等，(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody CarriersOf Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in MonoclonalAntibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等，(eds.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等，(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，以及Thorpe等，“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
[99]备选地，如由Segal在美国专利4676980中描述的，IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可与第二抗体缀合而形成抗体异缀合物(heteroconjugate)，将其在此通过全文引入作为参考。
[100]可将单独施用或与细胞毒素因子和/或细胞因子组合施用的、与或不与治疗剂部分缀合的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂用作治疗剂。
[101]本领域那些技术人员已知的多种测定法可用于检测结合至IL-31蛋白质或多肽的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。示例性的测定法在Ant ibodies：A Laboratory Manual，Harlow and Lane(Eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中详细描述。这种测定法的代表性实例包括：并行免疫电泳(concurrentimmunoelectrophoresis)、放射免疫测定法、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、斑点印迹或蛋白质印迹测定法、抑制或竞争测定法，以及夹心测定法。另外，可根据结合野生型对突变型IL-31蛋白质或多肽来筛选抗体。
[102]针对IL-31的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可用于对表达IL-31的细胞进行标签；用于通过亲和提纯来分离IL-31；用于测定IL-31多肽的循环水平的诊断测定；用于测定或定量可溶性IL-31作为潜在的病理或疾病的标志；用于采用FACS的分析方法；用于筛选表达库；用于产生抗-个体基因型抗体；以及用作中和抗体或用作拮抗剂来阻断体外和体内的IL-31活性。合适的直接标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制因子、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等；间接标签或标记可特征性地使用生物素-亲和素或其它补体/抗补体对作为媒介物。在这里，还可以直接或间接地将抗体与药物、毒素、放射性核素等缀合，并且这些缀合物用于体内诊断或治疗应用。而且，IL-31的抗体或其片段可在测定法，例如本领域已知的蛋白质印迹或其它测定法中，用于体外检测变性的IL-31或其片段。
[103]Fc结构域的选择可牵连(i)抗体的效应子作用(结合FcγR(ADCC)/结合Clq(CDC))和潜在地相伴的副作用，(ii)其药代动力学性质(结合FcRn)包括半衰期，以及(iii)可能地牵连免疫复合物的清除。Fc结构域的效应子功能包括吞噬作用、炎症介质的释放、抗体产生的调控以及最重要地依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)。这些效应子作用的任一个被诱导的程度取决于Fc结构域与相关蛋白质介质的相互作用、Fcγ受体和Clq的相关作用，并且差异取决于IgG亚类恒定区(Fc)和它们与这些蛋白质的相互作用。
[104]IgG1的Fc结构域与免疫***效应细胞上的FcγRI，、FcγRIIa和FcγRIII相互作用。不同Fcγ受体的精确作用仍待阐明，但FcγRIIIA据认为是在NK细胞而且还在单核细胞和巨噬细胞上主要表达的最重要的介导ADCC的受体。IgG1也结合Clq并且可触发主要由表达FcγRIII的NK细胞介导的CDC。参见Gessner，J.E.，等，TheIgG Fc Receptor Family，Ann.Hematol.1998 Jun：76(6)：231-248。IgG4Fc结构域具有大大减少的对不同Fcγ受体和Clq的结合亲和力，相应于减少的ADCC和CDC。例如，Sharma等检查了IgG1mAb和其IgG4衍生物(其各自具有靶向CD4的相同的可变区)的直接比较。两种mAb都以等剂量水平减少CD4的表达并且具有相同的药物代谢动物力学性质，但IgG1形式显示更有效的ADCC效应。参见Sharma A.，等，Comparative pharmacodynamics of keliximab and clenoliximab intransgenic mice bearing human CD4.J Pharmacol Exp Ther.2000Apr；293(1)：33-41。
[105]当与其他IgG同种型mAb相比，效应器阴性IgG4 mAb的结合亲和力大大减少，如果不是被消除的话。然而，与Brambell受体(FcRn)相互作用的能力保持在IgG4中，从而通过延长的半衰期影响IgG4同种型mAb的药代动力学。然而IgG1通常显示对ADCC和CDC两者的高活性，IgG4据认为具有低ADCC或CDC活性至无ADCC或CDC活性。
[106]在市场上、临床中或研究和开发的不同阶段上使用的IgG4同种型mAb的几个实例。这些治疗用mAb被开发用于肿瘤学、自身免疫炎症中的多种适应症以及用于抗病毒疗法。
[107]如由Aalberse等报道的(参见Aalberse RC，Schuurman，J.IgG4 breaking the rules，Immunology 2002，105：9-19)，人(IgG4)由于分泌的人IgG4的一部分中的铰链区中的重链内二硫键的不均一性而以两种分子形式存在。该不均一性仅在其中检测到HL“半抗体”的变性、非还原条件下显现出来，在其他人IgG同种型中未观察到该现象。Taylor报导样品操作过程中的人工假象例如当暴露于还原剂时快速的二硫化物不规则(rapid disulfide scrambling)和再氧化可促成一定量的半抗体出现(Taylor FR，等，.Suppressionof Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel ElectrophoresisSample Preparation Artifacts for Analysis of IgG4 Half-Antibody.Analytical Biochemistry 2006，353：204-208)。在天然条件下，非共价键要互作用确保抗体以H2L2四聚体形式保持在一起。虽然，IgG4据报导与循环中的其他IgG4分子异二聚化。连接人IgG重链的抗体的F[ab]和Fc部分的铰链序列的分析显示在残基241上丝氨酸的存在可能是该不均一性的原因：IgG4铰链区包含Cys-Pro-Ser-Cys序列而非IgG1中的Cys-Pro-Pro-Cys序列。小鼠/人嵌合重链中241上的丝氨酸至脯氨酸(见于IgG1和IgG2中的该位点)的变化导致均一抗体的产生和消除不均一性。此外，与原始嵌合IgG4相比，变体IgG4具有显著延长的血清半衰期和显示提高的组织分布。
[108]合适的可检测分子可直接或间接连接至多肽或抗体，并且包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制因子、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等。合适的细胞毒素分子可直接或间接连接至多肽或抗体，并且包括细菌或植物毒素(例如白喉毒素、皂草素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素等)，以及治疗性放射性核素，例如碘-131、铼-188或钇-90(可直接连接至多肽或抗体，或者通过利用例如螯合部分来间接连接)。多肽或抗体还可以与细胞毒类药物，例如阿霉素缀合。为了间接连接可检测分子或细胞毒素分子，可将可检测分子或细胞毒素分子与补体/抗补体对的一个成员缀合，而另一个成员则与多肽或抗体部分结合。为此目的，生物素/抗生蛋白链菌素是一种示例性的补体/抗补体对。
[109]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂还可用作IL-31“拮抗剂”来体外和体内阻断IL-31结合以及信号转导。这些IL-31结合分子或IL-31拮抗剂应该可用于抑制IL-31活性或蛋白质-结合
[110]多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白可用于靶向的细胞或组织的抑制或切除(例如，来治疗癌细胞或组织)。备选地，如果所述的多肽具有多个功能结构域(即，活化结构域或受体结合结构域，加上靶向结构域)，则仅包含靶向结构域的融合蛋白可适合用于引导可检测分子、细胞毒素分子或补体分子至目标细胞或组织类型中。在其中仅有该结构域的融合蛋白包括补体分子的情况下，可将抗-补体分子与可检测分子或细胞毒素分子缀合。这种结构域-补体分子融合蛋白因而代表了用于细胞/组织-特异性递送通用的抗-补体-可检测/细胞毒素分子缀合物的通用靶向载体或媒介物。
[111]本发明的另外的目的是分离的核酸分子或其互补链或简并序列，所述核酸分子编码上本文中上述或下述的任何抗体。在这点上，术语“核酸分子”包括所有不同类型的核酸，包括但不限于脱氧核糖核酸(例如.，DNA、cDNA、gDNA、合成的DNA等)、核糖核酸(例如，RNA、mRNA等)以及肽核酸(PNA)。在优选实施方案中，核酸分子是DNA分子，例如双链DNA分子或cDNA分子。术语“分离的”指已鉴定的并且与通常在天然来源中与其结合的至少一种污染性核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不以其中它在自然界中被发现的形式或背景(setting)存在。分离的核酸分子因而与specific核酸分子相区别，因为其存在于天然细胞中。简并序列是指编码与参照核苷酸序列相同的氨基酸序列的任何核苷酸序列，但作为遗传密码简并性的结果，其包括不同的核苷酸序列。
[112]本发有的另外的目的是包含编码上述或下述抗体的任一个的DNA的载体。所述载体可以是任何克隆或表达载体，整合复制或自主复制，在任何原核或真核细胞中具有功能。特别地，所述载体可以是质粒、粘粒、病毒、噬菌体、附加体、人造染色体等。所述载体可包含调控元件例如启动子、终止子、增强子、选择标记、复制起始区等。这样的载体的特定实例包括原核质粒例如pBR、pUC或pcDNA质粒；病毒载体，包括逆转录病毒载体、腺病毒载体或AAV载体；噬菌体；杆状病毒；BAC或YAC等也将在下面讨论。可通过多种方法将合适的核酸序列***载体。一般而言主，使用本领域内已知的技术将DNA***合适的限制性核酸内切酶位点。包含一个或多个这些组件的合适的载体的构建使用本领域技术人员已知的标准连接技术。
[113]本发有的另外的目的是重组宿主细胞，其中所述细胞包含如上定义的核酸分子或载体。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。原核细胞的实例包括细菌，例如大肠杆菌(E.coli.)。真核细胞的实例是酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞，包括任何原代细胞培养物或已建立的细胞系(例如，3T3、Véro、HEK293、TN5等)。用于表达糖基化蛋白的合适的宿主细胞来源于多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞例如果蝇S2和果蝇Sf9以及植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(用于悬浮培养的亚克隆的293或293细胞，Graham等.，J.Gen Virol.，36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl，Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)。本发明的特别优选哺乳动物细胞是CHO细胞。
[114]如此处上面所公开的，本发明的抗体可通过本身在本领域内已知的任何技术例如通过重组技术、化学合成、克隆、连接或其组合来产生。在特定的实施方案中，抗体通过重组技术例如通过在合适的宿主细胞中表达相应的核酸来产生。本发明的另一个目的因而是产生本发明的抗体的方法，所述方法包括在允许所述核酸分子表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞，和回收产生的多肽。产生的多肽可进行糖基化或不进行糖基化，或可包含其他翻译后修饰，这取决于所使用的宿主细胞。许多书和综述提供了关于如何使用载体和原核或真核宿主细胞克隆和产生重组蛋白的教导，例如由Oxford UniversityPress出版的系列“A Practical Approach”中的一些书名(“DNACloning 2：Expression Systems”，1995；“DNA Cloning 4：MammalianSystems”，1996；“Protein Expression“，1999；“ProteinPurification Techniques”，2001)。
[115]用于产生根据本发明的抗体的方法的载体可以是附加体或非同源/同源整合的载体，其要通过任何合适的方法(转化、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙-沉淀、直接显微注射等)导入合适的宿主细胞。选择特定质粒、病毒或逆转录病毒载体的重要因素包括：包含载体的受体细胞可被识别和从不包含载体的那些受体细胞中选择的容易程度；在特定宿主中期望的载体的拷贝数目；和是否想要能够使载体在宿主细胞或不同的物种之间“穿梭”。载体应当允许本发明的多肽或融合蛋白在原核或真核宿主细胞中在合适的转录起始/终止调控序列的控制下表达，所述调控序列经选择在所述细胞中具有组成型活性或诱导型活性。然后可将在这样的细胞中充分富集的细胞系分离，从而提供稳定的细胞系。
[116]宿主细胞用此处描述的表达或克隆载体进行转染或转化以用于蛋白质的产生，将所述细胞培养在视适合于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望的序列的情况而改进的常规培养基中。培养条件例如培养基、温度、pH等可由本领域技术人员选择而无需过度的实验。一般而言，用于使细胞培养物的产率最大化的原理、方案和实施技术见于Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach，M.Butler，ed.(IRL Press，1991)和Sambrook等，同上。
[117]用于本发明的优选细胞是真核宿主细胞例如哺乳动物细胞，例如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们提供对蛋白质分子的翻译后修饰，包括正确折叠或在正确的位点进行糖基化。合适的哺乳动物细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570；ATCC CRL 8544，ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCCCCL34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44(Chasin等.，Som.Cell.Molec.Genet.12：555，1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝细胞瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40-转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL1650)、Bowes黑素瘤和人肝细胞癌(例如Hep G2)、鼠胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)和许多其他细胞系。备选的真核宿主细胞是用酵母表达载体转化的酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces)、克鲁维酵母等)。同样，酵母细胞可进行翻译后肽修饰，包括糖基化。存在许多利用强启动子序列和高拷贝数的质粒的可用于在酵母中产生期望的蛋白质的重组DNA策略。酵母细胞识别克隆的哺乳动物基因产物中的前导序列和分泌具有前导序列的多肽(即，前肽)。
[118]关于重组多肽的长期、高产率的产生，稳定的表达是优选的。例如，稳定地表达目的多肽的细胞系可使用可表达载体进行转化，所述表达载体可在相同或分开的载体上包含病毒复制起始区和/或内源表达元件和选择标记基因。在载体导入后，可在将细胞转移至选择培养之前让它们在加富培养基上培养1至2天。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功地表达导入的序列的细胞生长和回收。可使用适合于细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性克隆。然后分离在这样的细胞中充分富庥的细胞系以提供稳定的细胞系。
[119]本发明的重组多肽的重组多肽的高产率产生的特别优选方法是通过在DHFR缺陷型CHO细胞中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)，通过使用不断增加的水平的甲氨喋呤来进行的，如US 4,889,803中所描述的。获得的多肽可以以糖基化的形式存在。
[120]此处公开的抗体还可在其他真核细胞例如鸟类、真菌、昆虫、酵母或植物细胞中表达。杆状病毒***提供有效的方法来将克隆的基因导入昆虫细胞。用于杆状病毒/昆虫细胞表达***的材料以试剂盒的形式从(除其他以外)Invitrogen商购获得。
[121]除了重组DNA技术外，本发明的抗体可通过化学合成技术来制备。化学合成技术的实例是固相合成和液相合成。对于固相合成，例如，将相应于待合成的多肽的羧基端的氨基酸结合至不溶于有机溶剂的载体，并且通过交替重复的反应(例如，通过氨基酸利用它们的用合适的保护基团保护的氨基和侧链官能团进行的连续缩合)使多肽延伸。取决于所使用的保护基团的类型，固相合成方法大致分为tBoc法和Fmoc法。完全合成的蛋白质公开于文献(Brown A等，1996)。
[122]可产生、配制、施用本发明的抗体，或可在属类上以根据期望的使用和/或生产方法可以是优选的其他备选形式使用其。本发明的蛋白质可进行翻译后修饰，例如通过糖基化修饰。本发明的多肽或蛋白质可以以分离的(或纯化的)生物活性形式或以其前体、衍生物和/或盐的形式提供。
[123]在另一个实施方案中，IL-31结合分子或IL-31拮抗剂融合蛋白可用于体内杀死其中表达IL-31受体的靶组织(通常参见，Hornick等Blood 89：4437-47，1997)。所描述的融合蛋白能够使IL-31结合分子或IL-31拮抗剂靶向至期望的作用位点，从而提供提高了局部浓度的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂，靶向不期望的细胞或组织(即肿瘤或白血病)，并且融合的细胞因子介导了提高的由效应细胞进行的靶细胞溶解。用于此目的的合适的细胞因子包括，例如白细胞介素2和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
[124]可测量本发明的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂抑制、阻断或中和IL-31配体的能力，如通过本领域已知的和在此描述的多种体内模型，包括但不限于NC/Nga模型、Ova上表皮模型(epicutaneous model)、慢性过敏反应模型和慢性半抗原模型(chronic hapten model)测定。
[125]已经将皮肤归巢T细胞(skin-homing T Cell)和表皮角质细胞牵连于人类皮肤疾病的病理学中。在人中，IL-31mRNA和蛋白质表达局限于皮肤-归巢CLA+T细胞群。参见2006年2月14日提交的美国专利申请号11/353,427，在此引用作为参考。因而，IL-31的拮抗剂，包括抗体或受体拮抗剂将可用于治疗具有CLA+T细胞表达的皮肤和表皮疾病。这种疾病包括，例如特应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮。趋化因子标记例如TARC和MDC可用于测量中和性单克隆抗体对IL-31的效力。使用在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的治疗的抑制效果可通过监控TARC和MDC的水平测量。
接触性皮炎
[126]过敏性接触性皮炎可定义为T细胞介导的对与皮肤接触的抗原的免疫反应。由于变应原依赖性T细胞应答很大程度上限于CLA+细胞群(参见Santamaria-Babi，L.F.，等，J Exp Med：181，1935，(1995))，CLA+T细胞群被认为涉及皮炎的引发。最近的数据已发现，只有记忆性(CD45RO+)CD4+CLA+而不是CD8+T细胞在响应镍(一种普通的接触性过敏变应原)时增殖并产生了1型(IFN-)和2-型(IL-5)细胞因子。此外，表达CLA与CD4、CD45RO(记忆)或CD69组合的细胞在镍-特异性刺激后增加，并表达了趋化因子受体CXCR3、CCR4、CCR10而不是CCR6。参见Moed H.，等，Br J Dermatol：51，32，(2004)。
[127]在动物模型中，已证明过敏性接触性皮炎是T-细胞依赖性的，而且过敏性-应答T细胞迁移到了变应原作用位点。一般参见：Engeman T.M.，等，J Immunol：164，5207，(2000)、Ferguson T.A.& Kupper T.S.JImmunol：150，1172，(1993)，以及Gorbachev A.V.& Fairchild R.L.Crit Rev Immunol：21，451(2001)。由于CLA+T细胞产生IL-31并且IL-31刺激皮肤角质细胞可诱发炎症促进趋化因子，例如TARC和MDC，IL-31可能涉及接触性皮炎的病理生理学。在接触性过敏反应的小鼠模型中使用中和性IL-31抗体。参见实施例5。
[128]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可用于通过抑制、减少、中和、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓，来改善接触性过敏反应的临床效果。
特应性皮炎
[129]特应性皮炎(AD)是一种近十年来具有显著增加的发病率的、慢性复发性炎性皮肤病。临床上AD表征为高搔痒性的、通常为显示一个慢性复发性病程的表皮剥脱斑和丘疹。AD的诊断主要基于重大的及较小的临床发现。参见Hanifin J.M.，Arch Dermatol；135，1551(1999)。组织病理学显示为急性病患中的棘细胞层水肿、过度不全角化和灶性角化不全，然而伴随有过度不全角化和灶性角化不全、棘皮症/颗粒层增厚的明显的表皮超常增生，以及淋巴细胞和大量肥大细胞在真皮的血管周围浸润是慢性病患的标志。
[130]T细胞在组织的局部免疫应答的引发中起着重要的作用，并且有证据显示，皮肤-浸润性T细胞尤其在皮肤的失调的免疫应答的引发和维持中起关键作用。在表皮的炎性位点中，约90％的浸润性T细胞表达结合内皮细胞选择素(在内皮上的一种诱导性黏附分子)的皮肤淋巴细胞-相关的Ag(CLA+)(在Santamaria-Babi L.F.等，EurJ Dermatol.14，13，(2004)中综述)。与对照个体比较，在AD患者中循环CLA+T细胞的显著增加已得以证明(参见，Teraki Y.等，BrJ Dermatol：143，373(2000))，同时其它研究已证明，与CLA-群比较，AD患者的记忆CLA+T细胞优先相应变应原浸出物(参见Santamaria-Babi，L.F.等，J Exp Med：181，1935，(1995))。在人中，已将皮肤特应性疾病的发病机理与表达增加水平的Th-2-型细胞因子，如IL-5和IL-13 9、10的CLA+T细胞的增加联系起来。参见，AkdisM等，Eur J Immunol：30，3533(2000)，以及Hamid Q等，JAllergy Clin Immunol：98，225(1996)。
[131]约6-8周大的NC/Nga小鼠在无非特异性病原体的(非-SPF)条件下圈养时，会自发地产生类似AD的损伤，其在许多方面类似人AD，包括临床过程和征兆、组织病理学和免疫病理学。相反，保持在SPF条件下的NC/Nga小鼠不会发生皮肤病损。然而，可通过每周皮内注射粗的粉尘螨抗原，来使在SPF实验室中圈养的NC/Nga小鼠同步发生自发性皮肤病损和搔抓行为。参见Matsuoka H等，Allergy：58，139(2003)。因此，NC/Nga中AD的发生是用于评估用于治疗AD的新治疗剂的有用模型。
[132]除了自发性AD的NC/Nga模型，使用OVA的小鼠的上表皮致敏作用也可用作模型来在致敏的小鼠的皮肤中，诱导抗原-依赖性表皮和真皮增厚，同时单核细胞侵润其中。这通常与总的和特异性IgE的血清水平升高同时发生，然而，在该模型中一般不会发生皮肤屏障机能障碍或搔痒症。参见Spergel J.M等，J Clin Invest，101：1614，(1998)。可以修改本方法以便通过用OVA使DO11.10 OVA TCR转基因小鼠致敏来诱导皮肤屏障失调和搔痒症。增加能够识别致敏性抗原的抗原-特异性T细胞的数量可增加皮肤的炎症水平而诱导明显的皮肤搔抓行为和皮肤苔癣化/鳞屑化。
[133]NC/Nga自发性AD模型和OVA表皮DO11.10模型都可用于评估在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂抑制、减少或中和IL-31的效果的能力。施用IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可导致搔抓的减少，这可有效地治疗搔痒性疾病，包括但不限于特应性皮炎、结节性痒疹和湿疹，因为搔抓行为的停止将会使皮炎停止发展，皮炎的发生依赖于搔抓行为。
[134]用于测量在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的抑制效果的另外的模型由Umeuchi，H.等，European Journal ofPharmacology，518：133-139，2005，以及由Yoo，J等，J.Experimental Medicine，202：541-549，2005描述。
[135]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31可用于通过抑制、减少、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善皮炎和搔痒性疾病，包括特应性皮炎、结节性痒疹和湿疹的临床结果。
药物-诱导的迟发型皮肤变应性反应
[136]药物-引发的迟发型皮肤变应性反应是十分异质性的，并且可反映出许多特殊的病理生理事件。参见Brockow K等，Allergy：57，45(2002)。涉及这些反应的免疫机理已显示为抗体或细胞介导的。在即发型药物过敏中，IgE-介导的抗体反应可通过阳性皮肤穿刺和/或皮内试验在20分钟后证明，而对药物的非-即刻反应可在最后用药长于1小时后发生，并且通常是T-细胞介导的。非-即刻T-细胞介导的迟发型反应可例如在对青霉素类产生有害的药物反应的患者中发生。已显示，对青霉素类的增殖性T细胞反应局限于来自青霉素过敏患者的T细胞的记忆(CD45RO+)CLA+亚群，而CD45RO+CLA-亚群未显示增殖反应。参见Blanca M.，Leyva L等，Blood Cells Mol Dis：31，75(2003)。迟发型过敏(DTH)反应可在小鼠中人为地再现，使得能评估可参与DTH反应的起始和维持的因子。I1-31中和抗体或IL-31拮抗剂在迟发型变应性反应中是有效的。
[137]中毒性表皮坏死溶解(TEN)是一种非常罕见但非常严重的药物反应，其特征在于伴随有大量水疱的大范围表皮细胞调亡。研究已经显示，浸润水疱的淋巴细胞是CLA+T细胞并且可显示出对表皮角质细胞的细胞毒性。参见Leyva L等，J Allergy Clin Immunol：105，157(2000)，以及Nassif A.，Bensussan A等，J Allergy ClinImmunol：114，12092004。已产生了一种转基因小鼠***来建立TEN的动物模型，所述的转基因小鼠***中，OVA在角蛋白-5(K5)启动子的控制下在小鼠的表皮和毛囊的角质细胞中表达。OVA特异性CD8+T细胞在获得性地转移进K5-OVA小鼠中时，在皮肤-引流***中得到激活和增殖并靶向K5-OVA小鼠的皮肤，导致表明TEN的皮肤病损产生。参见Azukizawa H等，Eur J Immunol：33，1879(2003)。
[138]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31，可用于通过抑制、减少、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善TEN的临床结果。
大疱性类天疱疮
[139]大疱性类天疱疮是一种表皮下障碍，其表现为表皮下的水疱，伴随有中性粒细胞和嗜酸性细胞的皮肤浸润。诊断的特征是，对抗表皮和真皮-表皮交界部的特异性黏着蛋白的抗原-特异性抗体的存在。参见Jordon R.E等，JAMA：200，751(1967)。通过分析PBL和皮肤水泡T细胞，来分析T细胞在大疱性类天疱疮的发病机理中的作用的研究已经发现了占优势的CLA+T细胞，其表达增加水平的Th2-细胞因子，例如IL-4和IL-13。参见Teraki Y等，J Invest Dermatol：117，1097(2001)。在全身性皮质类固醇治疗后的大疱性类天疱疮患者中，产生白细胞介素-13的CLA+细胞而不是CLA-细胞的频率显著减少。皮质类固醇治疗后CLA+细胞的减少与临床改善有关。参见Teraki，同上。
[140]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31，可用于通过抑制、减少、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善大疱性类天疱疮的临床结果。
斑秃(Alopecia areata)
[141]斑秃(AA)认为是一种毛囊的组织-限制性自身免疫性疾病，其中毛囊活性由于持续的淋巴细胞性浸润活性而受到抑制。AA导致身体任何部位块状的全部毛发脱落，可是不发生实际上的毛囊的丧失，甚至是在无毛病变处。虽然不存在炎症的临床征兆，但是活动性疾病位置的皮肤活组织检查显示出毛囊周围的原发性CD4+细胞的淋巴细胞性炎症，伴随有CD8+毛囊内的浸润。参见Kalish R.S.& GilharA.J Investig Dermatol Symp Proc：8，164(2003)。
[142]研究已显示，头皮皮肤浸润性CD4+或CD8+淋巴细胞表达CLA并且，在患有AA的个体的外周血液中，CLA+CD4+或CD8+淋巴细胞的百分比明显高于正常对照的百分比。此外，患有严重或进行性AA的患者与该疾病痊愈的患者比较，显示出高得多的CLA-阳性，并且CLA+细胞百分比的减少与良好的临床过程一致。参见Yano S等，ActaDerm Venereol：82，82(2002)。因此这些研究表明，CLA+淋巴细胞可能在AA中起重要作用。异种移植模型已证实，活化的T细胞可能在AA的发病机理中起作用。移植在裸小鼠上的、来自AA患者的病患处的头皮再生长了毛发，同时伴随有移植物的浸润性淋巴细胞的消失并且，将活化的病患处的T细胞转移至SCID小鼠可使SCID小鼠上的人头皮移植物毛发脱落。参见Kalish R.S.& Gilhar A.J InvestigDermatol Symp Proc：8，164(2003)。
[143]多种免疫调节疗法是对这种疾病的常见治疗的一部分，可是这些治疗的效力都不一致。参见Tang L等，J Invest Dermatol：120，400(2003)；Tang L等，(2004)，以及Tang L等，J Am Acad Dermatol：49，1013(2003)。然而，它们在有效的动物模型中的使用提供了剖析治疗效果的分子机理的工具。参见Shapiro J等，J Investig DermatolSymp Proc：4，239(1999)；Tang L等，Old wine in new bottles：reviving old therapies for alopecia areata using rodent models(2003)，以及Verma D.D等，Eur J Dermatol：14，332(2004)。
[144]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31，可用于通过抑制、减少、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善斑秃的临床结果。
红斑痤疮(Acne Rosacea)/普通粉刺(Acne vulgaris)
[145]普通粉刺是一种毛囊皮脂腺器障碍，为最常见的***皮肤问题。毛囊角质化异常认为会引起痤疮病患。红斑痤疮通过存在有红色丘疹、脓疱、囊肿和大面积毛细管扩张，但没有粉刺(粟粒疹)来同普通粉刺区分。在普通粉刺的病理生理学中，皮脂腺增加的皮脂分泌是主要因素。其它的皮脂腺功能也与痤疮的发生有关，包括皮脂的促炎症反应脂类；局部产生的不同的细胞因子；腺周围肽和神经肽，例如促肾上腺皮质素释放激素，其通过皮脂细胞(sebocyte)产生；以及P物质，其在痤疮患者看似健康的腺附近的神经末梢中表达。参见Zouboulis C.C.Clin Dermatol：22，360(2004)。
[146]虽然尚未知道普通粉刺和红斑痤疮的病理生理学，但临床观察和组织病理学研究表明，毛皮脂腺囊炎症可能对红斑痤疮和普通粉刺的发病机理来说是重要的。对T细胞亚群浸润红斑痤疮病患处分析的早期研究表明，大多数T细胞表达CD4。参见RufliT.& BuchnerS.A.Dermatologica：169，1(1984)。
[147]CD4+T细胞产生IL-31并且对皮肤的IL-31表达的IHC分析显示，IL-31在皮脂腺和汗腺中表达。IL-31刺激表皮角质细胞诱导了可能导致细胞浸润的趋化因子的表达，表明IL-31可能有助于皮肤中的促炎症反应。参见Dillon S.R等，Nat Immunol：5，752(2004)。从而，IL-31可能有参与红斑痤疮和普通粉刺的病理生理学。
[148]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31，可用于通过抑制、减少、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善普通粉刺的临床结果。
结节性痒疹(Prurigo nodularis)
[149]结节性痒疹是由难治疗的顽固性搔痒症引起的、苔藓化或表皮剥脱的结节的疹。当长期摩擦导致苔藓化，而搔抓导致线状的表皮脱落，在他们发痒的、受刺激的皮肤处挖挤和摩擦的个体易于产生称为痒疹结节的明显增厚的丘疹。虽然结节性痒疹不是特应性皮炎特异性的，但许多具有这些结节的患者也具有特应性反应，其表现为变应性鼻炎、哮喘或食物过敏。T细胞代表了痒疹病患中的大多数浸润细胞，并且这些病患常常代表了特应性患者中的多数搔痒性皮肤病患。
[150]用辣椒碱(capsaicin)对结节性痒疹的局部治疗已证明是一种导致皮肤病患消除的有效且安全的方案，所述辣椒碱是一种在小的感觉皮神经中，通过耗尽神经肽像P物质来干扰对搔痒和疼痛的感觉的抗-搔痒生物碱。参见Stander S等，J Am Acad Dermatol：44，471(2001)。用辣椒碱处理来研究NC/Nga小鼠中的搔痒反应显示，几乎完全阻止了皮炎损伤的自发性发展。而且，血清IgE水平的升高受到明显抑制，并且在辣椒碱治疗的小鼠的受损皮肤中，浸润性嗜酸性细胞和肥大细胞的数量减少。参见Mihara K等，Br J Dermatol：151，335(2004)。对该群体的观察表明，骚抓行为可通过增强多种免疫应答来促进皮炎的发展，从而意味着，阻止搔痒感觉和/或搔痒-相关的搔抓行为可能会是一种对AD的有效治疗。参见Mihara K等，Br JDermatol：151，335(2004)。因此，在这里描述的抗-I1-31抗体将可用于使AD、结节性痒疹和其它搔痒性疾病的影响最小化，因为它们在这里显示能减少NC/Nga小鼠中的搔抓次数。
[151]IL-31的缓慢递送可在小鼠中诱发搔痒症和脱毛症，之后发展类似皮炎的皮肤病患，表明IL-31可能诱发搔痒。参见Dillon S.R等，Nat Immunol：5，752(2004)。IL-31参与诱导搔痒反应可通过两种方法检测：(i)对用IL-31-处理的小鼠进行辣椒碱治疗和(ii)用IL-31处理敲除了Tac 1基因小鼠，其中所述的敲除了Tac 1基因小鼠由于缺乏实施例10中的神经肽的表达而明显减少了伤害性疼痛反应。另外，用IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31在用IL-31处理的小鼠中是否能预防搔痒症和脱毛症已在实施例12中检验。
[152]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31，可用于通过抑制、减少、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善结节性痒疹的临床结果。
与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症
[153]外周血液中的单纯疱疹病毒(HSV)-特异性CD8+T细胞和从疱疹病患处回收的HSV-特异性CD8+T细胞表达高水平的CLA，而非-皮肤向性疱疹病毒-特异性的CD8+T细胞缺少CLA表达。参见KoelleD.M等，JClin Invest：110，537(2002)。HSV-2反应性CD4+T淋巴细胞也表达CLA，但以低于先前观察到的关于CD8+T淋巴细胞的水平表达。参见Gonzalez J.C等，J Infect Dis：191，243(2005)。搔痒症还与疱疹病毒感染有关(参见Hung K.Y等，Blood Purif 16，147(1998))。可是其它病毒病例如HIV也与搔痒性皮肤病患有关。通常与红斑丘疹性(erythematopapular)皮肤病患以及嗜伊红细胞增多症有关的、严重的顽固性搔痒症是一种在一些非特应性、HIV-感染的患者36中观察到的病状。参见Singh F.& Rudikoff D，Am J ClinDermatol；4，177(2003)，以及Milazzo F.，Piconi S等，Allergy：54，266(1999)。
[154]皮肤-向性病毒与搔痒症以及CLA+T细胞之间的关联表明，产生IL-31的T细胞可能涉及病毒感染的病理生理学。
[155]因此，通过在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31，可用于通过抑制、减少、防止或阻断炎症和/或与疾病相关的搔抓行为，来改善与皮肤-向性病毒相关的搔痒症的临床结果。
IL-31牵涉搔痒反应的诱发，并且可以用许多方法测量其通过此处描述的IL-31结合分子产生的减少、阻断、抑制或中和作用。？
方法I(辣椒碱治疗IL-31处理的小鼠)：
[156]将10周大的BALB/c动物(CRL)麻醉，并在皮下注入盐水中10％乙醇+10％吐温-80中的0.25ml4mg/ml的辣椒碱溶液进颈背之前，皮下注入0.1mg/kg的长效止痛剂盐酸丁丙诺啡。让动物在神经毒素治疗之后保持麻醉至少30分钟。48小时后，皮下植入14天渗透泵用于持续递送20μg/天的IL-31，递送14天。采用下列标准：0＝无搔抓行为，动物表现正常；1＝小范围内毛发变稀疏，观察到搔抓行为；2＝不严重的脱毛(一小部分)，搔抓行为；3＝中度脱毛，搔抓行为；以及4＝严重脱毛，过度的搔抓行为，每天监控小鼠的脱毛和搔痒，监控6天。当进行本实验时，结果表明，不用辣椒碱治疗的小鼠在递送IL-313天后显示出2.625的平均的搔抓/脱发打分，而辣椒碱治疗的小鼠显示出显著低的打分1。因此，在IL-31递送之前用辣椒碱处理的小鼠在实验6天中既显示出搔抓行为和脱毛发生的延迟，又显示出较低的搔抓行为和脱毛的强度的打分。这些数据表明，IL-31的确诱导了有助于IL-31诱发的脱毛和搔痒的一些神经元成分。因此，通过IL-31结合分子或IL-31拮抗剂产生的IL-31的中和可以减少患有涉及搔痒的皮肤障碍的患者中搔痒的发生和强度，并从而减少皮炎的发生和强度。
方法II：
[157]Tac1基因纯合无效的小鼠不表达可检测的P物质或神经激肽A。这些小鼠显著减小了对中度至剧烈刺激的伤害性疼痛反应，并因此是用于研究速激肽对疼痛/搔痒处理和炎性疾病状态的作用的有用工具。将12周大的，Tac1敲除的小鼠植入递送1μg/天的IL-31蛋白质的14-天渗透泵，并采用下列标准每天观察脱毛和搔痒：0＝无搔痒行为，动物表现正常；1＝小范围内毛发变稀疏，观察到搔抓行为；2＝不严重的脱毛(小块)，搔抓行为；3＝中度脱毛，搔抓行为；以及4＝严重脱毛，过度的搔抓行为。
[158]该研究结果显示，与野生型对照小鼠比较，Tac1缺陷小鼠不易受IL-31诱发的搔抓/脱毛的影响。100％(10/10)的野生型小鼠在IL-31处理6天后已发生搔抓和脱毛迹象，而只有33.3％(2/6)的Tac1缺陷小鼠在相同的时间点表现出搔抓和脱毛现象。这些数据显示，IL-31诱导了有助于IL-31-处理的小鼠中搔抓/脱毛表现型的神经元成分，并且通过IL-31结合分子或IL-31拮抗剂产生的IL-31的中和可减少有关皮炎中的搔抓行为的发生和强度。
方法III(IL-31中和抗体的施用)：
[159]将约8-12周大的正常雌性BALB/c小鼠(CRL)皮下植入递送1μg/天的mIL-31的14-天渗透泵(Alzet，#2002)。从IL-31递送前1周开始，小鼠组每周两次接受腹膜内(i.p.)注射10mg/kg(200μg/小鼠)的大鼠抗-小鼠IL-31单克隆抗体。小鼠对照组以相同给药方案，接受i.p.注射的载体(PBS/0.1％BSA)。采用下列标准每天给小鼠的脱毛和搔痒打分：0＝无搔痒行为，动物表现正常；1＝小范围内毛发变稀疏，观察到搔抓行为；2＝不严重的脱毛(小块)，搔抓行为；3＝中度脱毛，搔抓行为；以及4＝严重脱毛，过度的搔抓行为。
[160]在所有试验中，用大鼠抗-mIL-31mAb处理的小鼠的症状发作延迟了约5至7天，并具有较低的脱毛和搔痒的总体打分。通过13天的试验，所有mAb处理的小鼠组(不考虑给药频率或浓度)发生了与对照小鼠类似的脱毛和搔痒。这些数据表明，通过IL-31结合分子或IL-31拮抗剂产生的IL-31的中和可延缓由IL-31诱导的搔抓/脱毛反应的发作。IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的作用通过搔抓、搔痒、皮炎的抑制、角质细胞中IL-31RA表达的减少和/或脱毛和搔痒的打分的减少来测量。
[161]此外，炎症是生物体避开侵入物的保护性应答。炎症是涉及许多细胞和体液性介质的级联事件。在一个方面，对炎症应答的抑制可使宿主免疫妥协；然而，如果让其未加抑制，炎症可导致严重的并发症，包括慢性炎性疾病(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠病等)、败血症性休克和多器官衰竭。重要地是，这些不同的疾病状态拥有共同的炎症介质。表征为炎症的全体疾病对人的发病率和死亡率有巨大影响。因此显然，抗-炎性抗体和结合多肽，例如在此描述的抗-IL-31抗体和结合多肽可具有对大量人和动物疾病(从哮喘和***反应到自身免疫和败血症性休克)的重大治疗潜力。因而，在此描述的抗-炎性抗IL-31抗体和结合多肽可在治疗上尤其在疾病例如关节炎、内毒素血症、炎性肠病、银屑病、相关疾病等中，用作在此描述的IL-31拮抗剂。
1.关节炎
[162]关节炎，包括骨关节炎、类风湿性关节炎、由损伤引起的关节炎性连接(arthritic joint)等，是普通的炎性病症，其将会受益于抗-炎性抗体和结合多肽，例如本发明的抗IL-31抗体和结合多肽的治疗用途。例如，类风湿性关节炎(RA)是影响整个身体的全身性疾病，并且是一种最常见形式的关节炎。它表征为关节处的膜的炎症，其引起疼痛、僵硬、发热(warmth)、发红和肿胀。炎症细胞释放出可消化骨和软骨的酶。作为类风湿性关节炎的结果，发炎的关节衬里(滑膜)可侵入和损伤骨和软骨，导致其它生理效应中的关节变坏和重度疼痛。所涉及的关节可能会丧失它的形状和对准，导致疼痛和丧失运动能力
[163]类风湿性关节炎(RA)是一种免疫-介导的疾病，特别是表征为炎症和随后的组织损伤，导致严重的残疾和增加死亡率。多种细胞因子在患风湿性关节中局部产生。许多研究已证明，IL-1和TNF-α这两种原型的致炎性细胞因子，在涉及滑液炎症和进行性关节破坏的机制中起重要作用。的确，在RA患者中施用TNF-α和IL-1抑制剂已导致炎症的临床和生物学病征显著改善，以及骨质侵蚀和软骨破坏的放射性信号减少。然而，尽管有这些鼓舞人心的结果，但显著比例的患者对这些制剂不响应，表明其它介质也涉及关节炎的病理生理学(Gabay，Expert.ODin.Biol.Ther.2(2)：135-149，2002)，那些介质之一可能是IL-31，并因而结合或抑制IL-31的分子，例如抗IL-31抗体或结合伴侣，可作为有用的治疗剂来减少类风湿性关节炎，以及其它关节炎疾病中的炎症。
[164]在本领域中存在多个已知的类风湿性关节炎的动物模型。例如，在胶原-诱发的关节炎(CIA)模型中，小鼠产生了非常类似于人风湿性关节炎的慢性炎性关节炎。由于CIA具有与RA类似的免疫学和病理学特征，这使得它成为用于筛选潜在的人抗-炎症化合物的理想模型。CIA模型是一种熟知的小鼠模型，其依赖于免疫反应和炎症应答以便发生。免疫应答包括B-细胞和CD4+T-细胞响应作为抗原的胶原的相互作用，并导致抗-胶原抗体的产生。炎症阶段是炎症介质的组织反应的结果，是由于这些抗体中的一些与小鼠的天然胶原交叉-反应并激活了补体级联。利用CIA模型的一个优势是，发病机理的基础机制是已知的。已经鉴定II型胶原上的相关T-细胞和B-细胞表位，并且已确定与免疫-介导的关节炎相关的多种免疫学参数(例如，迟发型超敏反应和抗-胶原抗体)和炎性参数(例如，细胞因子、趋化因子和基质-降解酶)，并因此可用于在CIA模型中评估试验化合物的效力(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3：407-20，1999；Williams等，Immunol.89：9784-788，1992；Myers等，Life Sci.61：1861-78，1997，以及Wang等，Immunol.92：8955-959，1995)。
[165]将含有可溶性IL-31RA的多肽(包括在此描述的异二聚受体和多聚受体)，例如IL-31RA-Fc4或其它IL-31RA可溶蛋白和融合蛋白施用至这些CIA模型小鼠，可用来评估IL-31RA对改善症状和改变病程的用途。作为调节免疫应答和炎症应答的分子，IL-31可诱导涉及类风湿性关节炎发病机理的SAA的产生，IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可减少SAA的体外和体内活性，全身或局部施用IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可潜在地抑制RA中的炎症应答。
2.内毒素血症
[166]内毒素血症是一种通常由传染原(例如细菌以及其它传染性疾病媒介物)、脓毒症、中毒性休克综合征，或者在受机会性感染的免疫妥协的患者等中产生的严重病症。抗-炎症抗体和结合多肽，例如本发明的抗-IL-31抗体和结合多肽的治疗用途可帮助预防和治疗人和动物中的内毒素血症。其它潜在的治疗剂包括本发明的IL-31RA多肽、可溶性异二聚受体多肽和多聚受体多肽，或抗IL-31抗体或结合伴侣等，可作为用于减轻内毒素血症中的炎症和病理学影响的有用治疗剂。
[167]脂多糖(LPS)诱发的内毒素血症涉及许多在传染病中产生病理学效果的促炎介质，并且啮齿类中LPS诱发的内毒素血症是一种广泛使用且可接受的模型，用于研究潜在的致炎剂或免疫调度剂的药理学作用。革兰氏阴性细菌中产生的LPS是败血症性休克的发病机理中主要的致病因子(Glausner等，Lancet 338：732.1991)。通过单次注射LPS进动物中的确可在实验上诱导类似休克的状态。由细胞相应LPS而产生的分子可直接或间接地靶向病原体。虽然这些生物反应可保护宿主对抗侵入的病原体，但它们也可导致伤害。因此，由于严重的革兰氏阴性细菌感染而发生的先天免疫的大量刺激，导致细胞因子和其它分子的过量产生，以及致命性的综合征即败血症性休克综合征的发生，其表征为发热、低血压、播散性血管内凝血和多器官衰竭(Dumitru等，Cell 103：1071-1083，2000)。
[168]LPS的这些毒性作用通常与导致多种炎症介质释放的巨噬细胞活化相关。在这些介质中，TNF显示起了重要作用，如通过施用中和性抗-TNF抗体来预防LPS毒性所说明的(Beutler等，Science229：869，1985)。已很好地确定了，将大肠杆菌的LPS肺部注射进C57B1/6小鼠中将会导致循环IL-6、TNF-α、IL-1以及急性期蛋白质(例如，SAA)在注射约2小时后显著增加。由于对抗这些介质的被动免疫可导致死亡率减小，LPS的毒性显示可通过这些细胞因子调节(Beutler等，Science 229：869，1985)。用于预防和/或治疗败血症性休克的可能的免疫干扰方案包括抗-TNF mAb、IL-1受体拮抗剂、LIF、IL-10和G-CSF。由于LPS诱导可能有助于内毒素血症病理学的促炎因子的产生，通过拮抗IL-31多肽来中和IL-31活性、SAA或其它促炎因子可用于减轻内毒素血症的症状，例如在内毒素性休克中观察到的症状。其它潜在的治疗剂IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。
3 炎性肠病IBD
[169]在美国，有很多人患有炎性肠病(IBD)，其可影响结肠和直肠(溃疡性结肠炎)或两者、小肠和大肠(克隆氏病)。这些疾病的发病机理尚未清楚，但它们伴随有受影响组织的慢性炎症。潜在的治疗剂包括本发明的IL-31RA多肽、可溶性异二聚受体多肽和多聚受体多肽，或抗IL-31抗体或结合伴侣等，可作为用于减轻IBD和相关疾病中的炎症和病理学影响的有用治疗剂。
[170]溃疡性结肠炎(UC)是一种大肠(通常称为结肠)炎性疾病，表征为结肠的粘膜或最内层膜发炎和溃烂。该炎症导致结肠频繁地排空，导致腹泻。症状包括粪便松散以及伴随的腹部绞痛、发热和体重减轻。虽然尚未知道UC的准确原因，但最近的研究显示，身体的自然防御对抗身体认为是外来物的体内蛋白质(“自身免疫反应”)。可能因为它们类似肠内的细菌蛋白质，这些蛋白质可激起或刺激炎性过程，开始破坏结肠内膜。由于结肠的内膜受损，溃疡形成，释放出粘液、脓液和血液。该疾病通常开始于直肠区域并可最终延伸到整个大肠。炎症的反复发作导致具有瘢痕组织的肠和直肠的壁增厚。严重的疾病可发生结肠组织的死亡或脓毒症。溃疡性结肠炎的症状在严重性程度不同，并且它们的发作可以是逐渐发生的或突然发作的。发作可由许多因素引起，包括呼吸道感染或压力。
[171]虽然目前不能获得对UC的治愈，但治疗集中于抑制结肠内膜中的异常炎性过程。包括皮质激素免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、巯嘌呤和甲氨喋呤)和氨基水杨酸盐的治疗剂可用于治疗该疾病。然而，免疫抑制剂例如皮质激素和硫唑嘌呤的长期使用可产生严重的副作用，包括使骨变薄、白内障、感染，以及肝和骨髓效应。在当前治疗不起作用的患者中，手术是一种选择。手术包括整个结肠和直肠的切除。
[172]存在多个可部分模拟慢性溃疡性结肠炎的动物模型。最广泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱发的结肠炎模型，其在结肠内诱导了慢性炎症和溃疡。当将TNBS通过直肠内滴注引入易感小鼠的结场内时，它在结肠粘膜中诱发了T-细胞介导的免疫应答，在该情况中导致大块的粘膜炎症，表征为T-细胞和巨噬细胞的密集浸润整个大肠壁。此外，该组织病理学现象伴随有体重逐渐减轻(消瘦)、血性腹泻、直肠脱出以及大肠壁增厚的临床现象(Neurath等，Intern.Rev.Immunol.19：51-62，2000)。
[173]另一结肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，其可诱导通过血性腹泻、体重减轻、结肠缩短以及有中性粒细胞浸润的粘膜溃疡形成为征候的急性结肠炎。DSS-诱导的结肠炎在组织学上表征为炎症细胞浸润进固有层中，伴随有淋巴样增生、病灶性隐窝损伤和上皮溃疡。这些变化认为是由于DSS对上皮组织的毒性作用，并通过对固有层细胞的吞噬作用以及TNF-α和IFN-γ的产生而发生。尽管它的普遍使用，有关DSS的机制与人疾病的相关性的多个问题仍然未得到解决。DSS被认为是一种T细胞-非依赖性模型，因为它可在T细胞-缺陷的动物例如SCID小鼠中观察到。
[174]将抗-IL-31抗体或结合伴侣、含有可溶性IL-31RA的多肽(包括异二聚受体和多聚受体)，例如IL-31RA-Fc4或其它IL-31RA可溶蛋白和融合蛋白施用至这些TNBS或DSS模型，可用于评估IL-31拮抗剂改善症状并改变胃肠道病症的病程的用途。IL-31可在结肠炎的炎症应答中起作用，并且通过施用IL-31结合分子或IL-31拮抗剂中和IL-31活性是IBD的潜在治疗方法。
4.银屑病
[175]银屑病是一种影响7百万以上的美国人的慢性皮肤病。当新皮肤细胞异常生长，导致在老皮肤还未足够迅速脱落处的皮肤的发炎、肿胀且呈鳞状的斑块时发生银屑病。斑块状银屑病(最常见的形式)的特征是覆盖有银白色鳞片的发炎的皮肤斑块(“损伤”)。银屑病可以限于一些斑块或涉及中度至大面积范围的皮肤，最普遍出现在头皮、膝、肘和躯干上。虽然它是非常明显的，但银屑病不是一种接触性传染病。该疾病的发病机理涉及受影响组织的慢性炎症。本发明的IL-31RA多肽、可溶性异二聚受体多肽和多聚受体多肽，或抗IL-31抗体或结合伴侣等可作为用于减轻银屑病、其它炎性皮肤病、皮肤和粘膜***反应以及相关疾病中的炎症和病理学影响的有用治疗剂。
[176]银屑病是一种T-细胞介导的炎性皮肤障碍，其可以引起相当的不适。它是一种不可治愈且侵袭所有年龄段的人的疾病。银屑病影响了约百分之二的欧洲和美国人口。虽然患有轻度银屑病的个体通常可用局部用药剂来控制他们的疾病，但世界范围内多于一百万的患者需要紫外线或全身性免疫抑制治疗。不幸的是，紫外线照射的不便和风险以及许多疗法的毒性限制了对它们的长期使用。而且，在一些情况下，患者通常会复发银屑病。
[177]从已知具有重要免疫生物学功能以及含有在免疫***中起作用的细胞的组织中分离IL-31。IL-31在CD3+选择的，活化的外周血细胞中表达，并且已显示，IL-31的表达在T细胞活化后增强。此外，在这里的实施例部分描述的实验结果表明，本发明的多肽可影响单核细胞/巨噬细胞、T-细胞、B-细胞、NK细胞和/或分化状态的单核细胞/巨噬细胞、T-细胞、B-细胞、NK细胞或这些细胞的祖细胞的生长/扩张。既刺激造血祖细胞的增殖又活化成熟细胞的因子通常已知，可是，增殖和激活还需要另外的生长因子。例如，研究已显示，IL-7和青灰因子(Steel Factor)(c-kit配体)是NK祖细胞集落形成所需的。IL-15+IL-2与IL-7和青灰因子组合是更有效的(Mrózek等，Blood 87：2632-2640，1996)。然而，未鉴定的细胞因子可能是NK细胞和/或NK祖细胞的特异性亚群的增殖所需的(Robertson等，Blood 76：2451-2438，1990)。同样，IL-31可单独或与其它细胞因子一致或者协同作用，来提高单核细胞/巨噬细胞、T-细胞、B-细胞或NK细胞分化的生长、增殖扩张和修饰。
[178]本发明提供了用于抑制单核细胞/巨噬细胞的活化或分化的方法。单核细胞是不完全分化的细胞，其迁移至它们成熟和变成巨噬细胞的多种组织中。巨噬细胞通过递呈抗原至淋巴细胞来在免疫应答中起重要作用，并且通过分泌许多细胞因子来作为淋巴细胞的辅助细胞而起支持性作用。巨噬细胞可内化细胞外的分子，并且一旦激活就具有增强的杀死细胞内微生物和肿瘤细胞的能力。活化的巨噬细胞还参与刺激急性或局部性炎症。
[179]给定细胞因子的受体的组织分布为该细胞因子的可能作用位点提供了强的指示。IL-31RA的表达可在单核细胞和B-细胞中观察到，一旦激活CD3+、CD4+和CD8+T-细胞，表达就会显著增加。另外，两种单核细胞系，THP-1(Tsuchiya等，Int.J.Cancer 26：171-176，1980)和U937(Sundstrom等，Int.J.Cancer 17：565-577，1976)也对IL-31RA表达呈阳性。
[180]据报道OSMR的表达是非常广泛的(Mosley等，JBC271：32635-32643，1996)。IL-31RA和OSM受体的这种分布支持IL-31在免疫应答，尤其是T-细胞在激活时的扩张中的作用，或者支持它在免疫***的单核细胞/巨噬细胞武装中的作用。
[181]因此，本发明特别的实施方涉及IL-31结合分子或IL-31拮抗剂在炎性和免疫性疾病或病症，例如胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病(Graves Disease)、炎性肠病(IBD)、克隆氏病、结肠癌和肠癌、憩室病、自身免疫性疾病、脓毒症、器官或骨髓移植、由损伤、手术或感染引起的炎症、淀粉样变性病、脾大、移植物抗宿主病中用作拮抗剂；并且其中抑制炎症、抑制免疫、减少造血细胞、免疫细胞、炎症细胞或淋巴细胞、巨噬细胞、T-细胞(包括Th1和Th2细胞，CD4+和CD8+细胞)的增殖，抑制病原体或抗原的免疫应答的用途。此外，IL-31RA表达在活化的免疫细胞例如活化的CD4+和CD19+细胞中的存在说明，IL-31RA受体可能参与对抗外来侵入物：例如微生物和细胞碎片的身体免疫防御反应，并且能够在炎症和癌症形成中的免疫应答中起作用。这样，对抗或拮抗IL-31RA受体功能的本发明抗体和结合伴侣，例如IL-31可用于调节免疫应答和炎症。
[182]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂还可在用于检测循环的IL-31水平的诊断***中使用。在相关的实施方案中，特异性结合IL-31多肽的抗体或其它制剂可用来检测循环的IL-31多肽。升高或降低水平的配体多肽可指示病理状态，包括癌。IL-31多肽可能有助于病理过程，并可作为潜在疾病的间接标记。
[183]在动脉粥样硬化病患中，异常之一是单核细胞/巨噬细胞定位于上皮细胞。这些病患可以通过利用IL-31拮抗剂预防。IL-31结合分子或IL-31拮抗剂也可用作IL-31的拮抗剂。此外，单核母细胞白血病与多种临床异常有关，所述的临床异常反应了巨噬细胞的生物产物的释放，实例包括血清和尿液中高水平的溶菌酶以及高热。而且，这种白血病表现出单核细胞的异常增加。这些效应可能可通过IL-31拮抗剂，例如在此描述的IL-31拮抗剂预防。此外，如在此描述的，抗IL-31可与分子例如毒性部分和细胞因子缀合，来引导杀死白血病的单核细胞。
[184]由于IL-31以T-细胞、巨噬细胞和单核细胞-特异性的方式表达，并且这些疾病涉及单核细胞异常，例如细胞增殖、功能、定位和激活，本发明的多核苷酸、多肽和抗体可用作诊断剂来检测这种单核细胞的异常，并指示疾病的存在。该方法包括从患者中提取生物样品，例如血液、唾液或活组织检查，并将其与正常的对照样品比较。组织学方法、细胞学方法、流式细胞计数方法、生物化学方法和其它方法可用于测定与正常对照比较的患者样品中IL-31，或表达IL-31的细胞即单核细胞的相应水平或位置。与对照比较，IL-31表达水平的变化(增加或减少)或单核细胞的数量或位置的变化(例如，单核细胞在它们通常不存在的组织中增加或浸润)将指示疾病。这种诊断方法还可包括使用连接至本发明的多聚核苷酸、多肽或抗体的放射性标记、荧光标记以及比色标记。这些方法是本领域熟知的并在这里公开。
[185]已经显示IL-31在活化的单核细胞中表达，并且可能参与调节炎症。这样，可以检测和利用本发明的多肽调节炎症的能力，或可用作炎症标记。用于测定IL-31的促炎症反应和抗炎性质的方法是本领域已知的，并在此讨论。此外，它可参与上调急性期反应物，例如血清淀粉样蛋白A(SAA)、α1-抗糜蛋白酶和结合珠蛋白的产生，而且一旦体内注入参与炎症应答的脂多糖(LPS)，IL-31RA受体配体的表达可增加(Dumoutier，L等，Proc.Nat′l.Acad.Sci. 97：10144-10149，2000)。急性期蛋白质例如SAA的产生被认为是其中炎症是有利的短期幸存机制；然而，急性期蛋白质保持更长时间促进慢性炎症并对人健康有害。综述可参见Uhlar，CM和Whitehead，AS，Eur.J.Biochem.265：501-523，1999，以及Baumann H.和Gauldie，J.Immunology Today 15：74-80，1994。此外，急性期蛋白质SAA涉及几种慢性炎性疾病的发病机理，涉及动脉粥样硬化和类风湿性关节炎，并且是淀粉样变性病中沉积的淀粉样A蛋白的前体(Uhlar，CM和Whitehead，同上)。因此，如果配体例如IL-31用作促炎分子并诱发SAA的产生，拮抗剂可用于治疗与由该配体诱导的急性期反应蛋白质相关的炎性疾病和其它疾病。这种拮抗剂由本发明提供。例如，减轻炎症的方法包括，施用给患有炎症的哺乳动物足以减轻炎症的量的IL-31，或抗-IL-31抗体(例如中和抗体)的组合物。此外，抑制患有炎症的哺乳动物中的炎症应答的方法可包括：(1)测定血清淀粉样A蛋白的水平；(2)施用可药用载体中的含有如在此描述的IL-31多肽或抗-IL-31抗体的组合物；(3)测定施用后的血清淀粉样A蛋白水平；(4)将步骤(1)中的血清淀粉样A蛋白水平与步骤(3)中的血清淀粉样A蛋白水平比较，其中血清淀粉样A蛋白水平未增加或减少表明抑制了炎症应答。
[186]对应其IL-31RA受体eDNA的mRNA的组织分布显示，mRNA水平在单核细胞和***细胞中最高，并且在活化的单核细胞，以及活化的CD4+、活化的CD8+，和活化的CD3+细胞中升高。因此，IL-31RA受体还涉及诱导炎症应答和免疫应答。因此，本发明特定的实施方案指向于IL-31结合分子和IL-31拮抗剂在炎性和免疫性疾病或病症，例如胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病(GravesDisease)、炎性肠病(IBD)、克隆氏病、结肠癌和肠癌、憩室病、自身免疫性疾病、脓毒症、器官或骨髓移植、由损伤、手术或感染引起的炎症、淀粉样变性病、脾大、移植物抗宿主病中用作拮抗剂；并且其中抑制炎症、抑制免疫、减少造血细胞、免疫细胞、炎症细胞或淋巴细胞、巨噬细胞、T-细胞(包括Th1和Th2细胞，CD4+和CD8+细胞)的增殖，抑制病原体或抗原的免疫应答。此外，IL-31RA受体和IL-31表达在活化的免疫细胞例如活化的CD3+、单核细胞、CD4+和CD19+细胞中的存在说明，IL-31RA受体可参与对抗外来侵入物：例如微生物和细胞碎片的身体免疫防御反应，并且能够在炎症和癌形成过程中的免疫应答中起作用。这样，对抗或拮抗IL-31RA受体功能的本发明IL-31和IL-31-抗体可用于调节免疫应答和炎症。
[187]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可用于：
[188]1)在治疗急性炎、由创伤、组织损伤、手术、脓毒症或感染引发的炎症，以及慢性炎性疾病例如哮喘、炎性肠病(IBD)、慢性结肠炎、脾大、类风湿性关节炎、复发性急性炎性发作(例如结核病)，以及治疗淀粉样变性病和动脉粥样硬化、卡斯尔曼氏病、哮喘，以及其它与诱导急性期反应相关的疾病中，对抗或阻断经由含有IL-31RA的受体的信号传导。
[189]2)在治疗自身免疫性疾病例如IDDM、多发性硬化症(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎和IBD中，对抗或阻断经由IL-31RA受体受体的信号传导预防或抑制免疫细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、白细胞)中经由IL-31RA受体受体的信号传导(Hughes C等，J.Immunol 153：3319-3325，1994)。备选地，抗体例如IL-31的单克隆抗体(MAb)也可用作拮抗剂来消灭不希望有的免疫细胞，用以治疗自身免疫性疾病。哮喘、***反应和其它特应性疾病可用对抗IL-31的MAb，例如抗IL-31抗体、可溶性IL-31RA受体或IL-31RA/CRF2-4异二聚体治疗，来抑制免疫应答或清空攻击性细胞。使用本发明的多肽和抗体阻断或抑制经由IL-31RA的信号传导，也可有益于胰腺、肾、垂体和神经细胞的疾病。IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌可能受益。IL-31RA可用作癌的MAb治疗的靶标，其中对抗性MAb抑制了癌生长并靶向免疫-介导杀死。(HolligerP.和Hoogenboom，H：Nature Biotech.16：1015-1016，1998)。可溶性IL-31RA受体单体、同型二聚体、异二聚体和多聚体的Mab也可用于治疗肾病，例如肾小球硬化症、膜性神经病变(membranousneuropathy)、淀粉样变性病(其在其它组织中也影响肾)、肾动脉硬化症、多种起因的肾小球炎、肾的纤维增生性疾病，以及与SLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)、肾肿瘤和其它疾病相关的肾机能障碍。
[190]3)在治疗自身免疫性疾病例如IDDM、MS、SLE、重症肌无力、类风湿性关节炎和IBD中，激动或激发经由IL-31RA受体的信号传导。IL-31可传递信号给淋巴细胞或其它免疫细胞进行分化、改变增殖或改变改善自身免疫的细胞因子或细胞表面蛋白的生产。特别是，调节T-辅助细胞对改变模式的细胞因子分泌的响应可以偏离自身免疫应答，来改善疾病(Smith JA等，J.Immunol.160：4841-4849，1998)。同样，IL-31可用来传递信号、排除和偏离涉及哮喘、***反应和特应性疾病的免疫细胞。经由IL-31RA受体的信号传导也可有益于胰腺、肾、垂体和神经细胞疾病。IDDM、NIDDM、胰腺炎和胰腺癌可能受益。IL-31RA可以用作胰腺癌的MAb治疗的靶标，其中信号MAb抑制了癌生长并靶向免疫-介导的杀伤(Tutt，AL等，J Immunol 161：3175-3185，1998)。同样，T-细胞特异性的白血病、淋巴瘤、浆细胞恶性增生(例如多发性骨髓瘤)以及癌瘤可用本发明的含有IL-31RA的可溶性受体的单克隆抗体(例如，中和抗体)治疗。
[191]通常，施用的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的剂量将会不同，其取决于这些因素：患者的年龄、体重、身高、性别、一般的医学状态和既往病史。通常，期望提供给受试者约1pg/kg至10mg/kg(剂量/患者的体重)范围的IL-31多肽剂量，但也可按详情所指示的施用更低或更高的剂量。本领域中的技术人员可采用本领域已知的方法，容易地确定这种剂量以及对它的调整。
[192]施用IL-31结合分子或IL-31拮抗剂给受试者可以是局部、吸入、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、通过局部导管灌注，或通过直接病患处注射。当通过注射施用治疗用蛋白质时，施用可以是通过连续输注或通过单次或多次推注。
[193]另外的施用途径包括经口、经粘膜、经肺和经皮。经口递送适合于聚酯微球、玉米醇溶蛋白微球、类蛋白微球体、聚腈基丙烯酸酯微球，以及基于脂质的***(参见，例如DiBase和Morrel，“OralDelivery of Microencapsulated Proteins，”in Protein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 255-288(Plenum Press 1997))。鼻内递送的可行性通过胰岛素施用的这样一种模式来举例说明(参见，例如Hinchcliffe和Illum，Adv.Drug Deliv.Rev 35：199(1999))。可制备含右TL-31的干的或流体颗粒并借助于干粉分散剂、液体烟雾发生器或喷雾器吸入(例如Pettit和Gombotz，TIBTECH 16：343(1998)；Patton等，Adv.Drug Deliv. Rev.35：235(1999))。这种方法可通过AERX糖尿病治疗***来举例说明，其为递送雾化的胰岛素进入肺中的手持电动吸入器。研究已显示，48000kDa大小的蛋白质已借助于低频率的超声以治疗用浓度递送穿过皮肤，这说明了经皮施用的可行性(Mitragotri等，Science 269：850(1995))。采用电穿孔的经皮服递送提供了另一种施用具有IL-31结合活性的分子的方法(Potts等，Pharm.Biotechnol.10：213(1997))。
[194]含有具有IL-31结合活性的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的药物组合物可根据制备可药用组合物的已知方法配制，从而将治疗用蛋白质与可药用载体组合进混合物中。如果组合物的施用是受试患者耐受的，则该组合物称为“可药用载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是可药用载体的一个实例。其它合适的载体是本领域技术人员熟知的。参见，例如Gennaro(ed.)，Remington’s PharmaceuticalSciences，第19版(Mack Publishing Company 1995)。
[195]为治疗目的，将具有IL-31结合活性的分子和可药用载体以治疗有效量施用给患者。如果施用的剂量是生理学上有效的，则具有IL-31结合活性的蛋白质、多肽或肽以及可药用载体的组合称为以“治疗有效量”施用。如果制剂的存在导致受试患者的生理发生可检测的变化，则该制剂是生理学上有效的。例如，如果用于治疗炎症的制剂的存在缓和了至少一部分炎症应答，则该制剂是生理学有效的。
[196]含有IL-31(或IL-31类似物或融合蛋白)的药物组合物可以流体形式、气溶胶或固体形式提供。流体形式通过可注射溶液、气溶胶、小滴、局部溶液剂(topological solution)和口服混悬剂来举例说明。示例性的固体形式包括胶囊剂、片剂和控释剂型。后面的形式通过微渗透泵(miniosmotic pump)和埋植剂举例说明(Bremer等，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants inDrug Delivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade and Hollinger(eds.)，pages 95-123(CRC Press 1995)；Bremer等，“ProteinDelivery with Infusion Pumps，”in Protein Delivery：PhysicalSystems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 239-254(Plenum Press1997)；Yewey等，“Delivery of Proteins from a ControlledRelease Injectable Implant，”in Protein Delivery：PhysicalSystems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 93-117(Plenum Press1997))。其它固体形式包括乳剂、糊剂、其它局部用敷贴剂(topological applications)等。
[197]在此公开的抗IL-31结合分子或IL-31拮抗剂还可制备成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可通过本领域已知的方法，例如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)、Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)，以及美国专利4 485 045和4 544 545中描述的方法制备。具有延长的循环时间的脂质体在美国专利5 013 556中公开。
[198]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的治疗用制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干制剂或含水溶液剂形式制备用于储存(Remington’sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))。所采用的量和浓度的可接受载体、赋形剂或稳定剂是对受试者无毒性的，并且包括缓冲剂例如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、烷基对羟苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TweenTM、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
[199]根据接受治疗的特殊适应症的需要，这里的制剂还可包含多于一种的活性化合物，优选具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性化合物。例如，在一种制剂中另外提供结合IL-31的抗体可能是期望的。备选地，或此外，组合物可含有化学治疗剂或细胞因子。该分子适合以有效用于期望目的的量组合。
[200]也可将活性成分圈闭(entrap)于分别通过，例如凝聚技术或通过界面缩聚法制备的微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚合(甲基丙烯酸甲脂)微胶囊中，或圈闭于胶质药物递送***(如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒和纳米胶囊)中或***液中。这类技术在Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)中公开。
[201]用于体内施用的制剂必须是无菌的。这容易通过滤过无菌滤膜完成。
[202]可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括，含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成形的商品形式，例如薄膜或微胶囊剂。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号：3773919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够使分子释放超过100天，而某些水凝胶在较短时间段内释放蛋白质。当胶囊包封的抗体长时间保留在体内时，它们由于暴露于37℃的潮湿中而可能变性或聚集，导致生物活性丧失并可能使免疫原性改变。取决于所涉及的机理，可设计合理的策略来稳定。例如，如果发现聚集机理是通过硫-二硫化物互换而形成分子间的S--S键，则稳定可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中低压冻干、控制湿度、采用合适的添加剂，以及研发出特殊的聚合物基质组合物来实现。
[203]具有IL-31结合活性的多肽可用蛋白质微胶囊化的标准技术包被于脂质体中(参见，例如Anderson等，Infect.Immun.31：1099(1981)、Anderson等，Cancer Res.50：1853(1990)，以及Cohen等，Biochim.Biophys.Acta 1063：95(1991)、Alving等，“Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies，”in Liposome Technology，第2版，第3卷，Gregoriadis(ed.)，page317(CRC Press 1993)、Wassef等，Meth.Enzymol.149：124(1987))。如上提到的，在治疗上有用的脂质体可含有多种成分。例如，脂质体可含有聚(乙二醇)的脂质衍生物(Allen等，Biochim. Biophys.Acta 1150：9(1993))。
[204]已经设计了可降解的聚合物微球来保持高***性水平的治疗性蛋白质。微球从可降解的聚合物例如聚乙丙交酯(PLG)、聚酐、聚(原酸酯)、非生物可降解的乙基乙烯基醋酸酯聚合物制备，其中蛋白质被圈闭干聚合物中(Gombotz和Pettit，Bioconjugate Chem. 6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymers in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems，Ranade和Hollinger(eds.)，pages51-93(CRC Press 1995)；Roskos和Maskiewicz，“DegradableControlled Release Systems Useful for Protein Delivery，”inProtein Delivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，pages 45-92(Plenum Press 1997)；Bartus等，Science 281：1161(1998)；Putney和Burke，Nature Biotechnology 16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)-包被的毫微球还可提供用于静脉内施用治疗用蛋白质的载体(参见，例如Gref等，Pharm.Biotechnol 10：167(1997))。
[205]其它剂型可由本领域的那些技术人员设计，如例如由Ansel和Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，第5版(Lea & Febiger 1990)，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company1995)，以及由Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(CRCPress 1996)所显示的。
[206]作为一个示例性说明，药物组合物可作为试剂盒提供，所述试剂盒包括含有IL-31多肽或IL-31拮抗剂(例如结合IL-31多肽的抗体或抗体片段)的容器。治疗用多肽可以单次剂量或倍剂量的可注射溶液剂的形式提供，或作为将在注射前重构的无菌粉剂提供。备选地，这种试剂盒可包含用于施用治疗用多肽的干粉扩散器、液体烟雾发生器或喷雾器。
[207]在一个方面，本发明涉及结合人IL31的分离的抗体，其中所述抗体是人源化抗体，其来源于由美国典型菌种保藏中心保藏的具有选自下列ATCC专利保藏名称的杂交瘤产生的单克隆抗体：a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、c)ATCC专利保藏名称PTA-6829、d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、e)ATCC专利保藏名称PTA-6831、f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、g)ATCC专利保藏名称PTA-6872、h)ATCC专利保藏名称PTA-6875，以及i)ATCC专利保藏名称PTA-6873；并且其中所述抗体包含重链免疫球蛋白恒定结构域，所述抗体为人IgG4的。在一个实施方案中，人IgG4恒定结构域是在溶液中稳定的突变形式，其具有少量或无补体激活活性。在特别的实施方案中，重链免疫球蛋白恒定区结构域是在位置241(Kabat编号)上具有Ser至Pro突变的人IgG4恒定结构域。
[208]在另一个方面，这些抗体用于治疗疾病包括特应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮，如此处所讨论的。
[209]在另一个方面，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中免疫球蛋白轻链恒定区结构域选自κ或λ人免疫球蛋白轻链。优选，所述免疫球蛋白轻链恒定区结构域是κ人免疫球蛋白轻链的恒定区。
[210]在一个方面，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中重链可变结构域和轻链可变结构域包含克隆292.12.3.1、292.84.1.6、292.63.5.3、294.144.3.5、292.39.5.3、292.51.5.2、292.64.6.5.5、292.105.4.1、292.109.4.4、292.118.6.4和292.72.3.1的CDR序列。所述CDR序列示于下面的图和表3中。
[211]在一个方面，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：57组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：53组成的第三CDR序列；和b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：54组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：55组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：56组成的第三CDR序列。在一个实施方案中，抗体用于治疗疾病包括应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮，如此处所讨论的。在另一个实施方案中，测量趋化因子例如TARC或MDC。
[212]在一个实施方案中，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：58组成的第二CDR序列，以及由SEQ IDNO：59组成的第三CDR序列；和b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：60组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：61组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：62组成的第三CDR序列。在一个实施方案中，抗体用于治疗疾病包括应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮，如此处所讨论的。在另一个实施方案中，测量趋化因子例如TARC或MDC。
[213]在一个实施方案中，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：63组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：64组成的第二CDR序列，以及由SEQ IDNO：65组成的第三CDR序列；和b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：66组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：67组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：68组成的第三CDR序列。在一个实施方案中，抗体用于治疗疾病包括应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮，如此处所讨论的。在另一个实施方案中，测量趋化因子例如TARC或MDC。
[214]在一个实施方案中，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：69组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：71组成的第三CDR序列；和b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：72组成的第一CDR序列、由SEQ IDNO：73组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：74组成的第三CDR序列。在一个实施方案中，抗体用于治疗疾病包括应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮，如此处所讨论的。在另一个实施方案中，测量趋化因子例如TARC或MDC。
[215]在一个实施方案中，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：75组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：76组成的第二CDR序列，以及由SEQ IDNO：65组成的第三CDR序列；和b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：77组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：78组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：68组成的第三CDR序列。在一个实施方案中，抗体用于治疗疾病包括应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮，如此处所讨论的。在另一个实施方案中，测量趋化因子例如TARC或MDC。
[216]在一个实施方案中，本发明涉及此处公开的分离的抗体，其中a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：80组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：81组成的第二CDR序列，以及由SEQ IDNO：82组成的第三CDR序列；和b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：83组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：84组成的第二CDR序列，以及由SEQ ID NO：85组成的第三CDR序列。在一个实施方案中，抗体用于治疗疾病包括应性皮炎、接触性皮炎、药物诱发的变应性反应、与皮肤向性病毒和病毒相关的搔痒症、白癜风、皮肤T细胞淋巴瘤、斑秃、红斑痤疮、普通粉刺、结节性痒疹以及大疱性类天疱疮，如此处所讨论的。在另一个实施方案中，测量趋化因子例如TARC或MDC。
[217]在一个方面，本发明提供了竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；h)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；以及i)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区，其中所述单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc抗体结合使用。在一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段抑制、阻断或中和IL-31(SEQID NO：2)与IL-31RA(SEQ ID NO：5)的相互作用。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段选自：(a)鼠单克隆抗体或抗体片段；(b)人源化抗体或抗体片段或抗体片段；以及(c)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体还包括PEG化。
[218]在另一个方面，本发明提供了包含轻链可变区和重链可变区的单克隆抗体或抗体片段，所述单克隆抗体或抗体片段选自：a)竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：i)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和ii)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区；和b)竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；和ii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；iii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列的重链可变区；iv)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；v)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；vi)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；vii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；以及vii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区，以及其中所述单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc抗体结合使用。在一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段抑制、阻断或中和IL-31(SEQ ID NO：2)与IL-31RA(SEQ ID NO：5)的相互作用。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区；以及其中所述单克隆抗体或抗体片段与人IgG4 Fc抗体结合使用。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体选自(a)鼠单克隆抗体或抗体片段；(b)人源化抗体或抗体片段或抗体片段；以及(c)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体还包含PEG化。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；和h)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体选自：(a)鼠单克隆抗体或抗体片段；(b)人源化抗体或抗体片段或抗体片段；以及(c)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体还包括PEG化。
[219]在另一个方面，本发明提供了用于减少、阻断、抑制或中和哺乳动物的炎症的方法，所述方法包括对哺乳动物施用抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；和h)包含SEQ IDNO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；以及j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区，其中单克隆抗体或抗体片段与人IgG4 Fc分子结合使用。在一个实施方案中，对哺乳动物施用抗体减少、阻断、抑制或中和致炎性趋化因子。在另一个实施方案中，致炎性趋化因子是TARC或MDC。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区，其中单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；和h)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区。
[220]在另一个方面，本发明提供了用于减少、阻断、抑制或中和哺乳动物的搔痒症的方法，所述方法包括对哺乳动物施用单克隆抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；和h)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；以及j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区，其中单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。在一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27氨基酸序列的重链可变区，其中单克隆抗体或抗体片段与人IgG4 Fc分子结合使用。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ IDNO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ IDNO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；和h)包含SEQ IDNO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段的施用减少、阻断、抑制或中和哺乳动物的皮炎的方法。在另外的实施方案中，皮炎是特应性皮炎或结节性痒疹。
[221]在一个方面，本发明提供了用于减少、阻断、抑制或中和哺乳动物的搔抓的方法，所述方法包括对哺乳动物施用单克隆抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；：b)包含SEQID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；和h)包含SEQ IDNO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；以及j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区，其中单克隆抗体或抗体片段与人IgG4 Fc分子结合使用。在一个实施方案中，所述单克隆抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和b)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27氨基酸序列的重链可变区，其中单克隆抗体或抗体片段与人IgG4 Fc分子结合使用。在另一个实施方案中，所述抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；d)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；f)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；g)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；和h)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区。
[222]在另一方面，本发明提供了用于用一种组合物来抑制IL-31-诱导的造血细胞及造血细胞祖细胞(包括培养的骨髓细胞或外周血细胞)的增殖和分化的方法，其中所述的组合物含有一定量的如在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂，与缺少可溶性细胞因子受体时培养的骨髓细胞或外周血细胞比较，所述抗体足以减少骨髓细胞或外周血细胞中造血细胞的增殖或分化。在一个实施方案中，用于抑制IL-31-诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞的增殖或分化的方法是如上面公开的，其中所述的造血细胞和造血细胞祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，用于抑制IL-31-诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞的增殖或分化的方法是如上面公开的，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
[223]在另一方面，本发明提供了减轻IL-31-诱导的炎症的方法，该方法包括施用给患有炎症的哺乳动物足以减轻炎症的量的如在此公开的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的组合物。
[224]在另一方面，本发明提供了抑制患有炎症的哺乳动物中的炎症应答的方法，该方法包括：(1)测定炎性分子的水平；(2)施用含有在可药用载体中的如在此公开的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的组合物；(3)测定施用后的炎性分子的水平；(4)将步骤(1)中的炎性分子水平与步骤(3)中的炎性分子水平比较，其中炎性分子水平没有增加或炎性分子水平减小指示抑制了炎症应答。在一个实施方案中，抗体是如上面公开的，其中所述抗体另外含有放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
[225]在另一方面，本发明提供了用于用一种组合物来抑制IL-31-诱导的造血细胞及造血细胞祖细胞(包括培养的骨髓细胞或外周血细胞)的增殖或分化的方法，所述的组合物含有一定量的如在此公开的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂，与缺少可溶性细胞因子受体时培养的骨髓细胞或外周血细胞比较，所述的抗体足以减少骨髓细胞或外周血细胞中造血细胞的增殖或分化。在一个实施方案中，用于抑制IL-31-诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞的增殖或分化的方法是如上面公开的，其中造血细胞和造血细胞祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，用于抑制IL-31-诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞的增殖或分化的方法是如上面公开的，其中淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
[226]在另一方面，本发明提供了减轻IL-31-诱导的炎症的方法，该方法包括施用给患有炎症的哺乳动物足以减轻炎症的量的如在此公开的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的组合物。
[227]在另一方面，本发明提供了抑制患有炎症的哺乳动物中的炎症应答的方法，该方法包括：(1)测定炎性分子的水平；(2)施用含有可接受的药物载体中的此处公开的抗体IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的组合物；(3)测定施用后的炎性分子的水平；(4)将步骤(1)中的炎性分子水平与步骤(3)中的炎性分子水平比较，其中炎性分子水平没有增加或炎性分子水平减小指示抑制了炎症应答。
[228]在另一方面，本发明提供了治疗受其中IL-31起作用的炎性疾病折磨的哺乳动物的方法，所述的方法包括：施用IL-31拮抗剂给哺乳动物，这样炎症得以减轻，其中所述的拮抗剂选自特异性结合IL-31(SEQ ID NO：2)的多肽或多肽片段的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂。在一个实施方案中，治疗受炎性疾病折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的，其中所述的疾病是慢性炎性疾病。在另一个实施方案中，治疗受炎性疾病折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的，其中所述的疾病选自：炎性肠病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、特应性皮炎、湿疹和银屑病的慢性炎性疾病。在另一个实施方案中，治疗受炎性疾病折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的，其中所述的疾病是急性炎性疾病。在另一个实施方案中，治疗受炎性疾病折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的，其中该疾病选自：内毒素血症、败血病、中毒性休克综合征和传染性疾病的急性炎性疾病。在另一实施方案中，治疗受炎性疾病折磨的哺乳动物的方法是如上面公开的，其中所述抗体另外含有放射性核素、酶、底物、辅助因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或毒素。
[229]在另一方面，本发明提供了用于检测患者中的炎症的方法，该方法包括：从患者体内获取组织或生物样品；在其中IL-31结合分子或IL-31拮抗剂可结合组织或生物样品中它的互补性多肽的条件下，将该组织或生物样品与如在此公开的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂一起孵育；显影组织或生物样品中结合的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂；以及将来自患者的组织或生物样品中结合的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的水平与正常对照组织或生物样品中结合的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的水平比较，其中相对于正常的对照组织或生物样品，结合患者的组织或生物样品的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂水平增加指示患者中的炎症。
[230]本发明进一步通过下面的非限制性实例来说明。
实施例
实施例1
可变区的确定
[231]以下列方法测定轻链和重链可变区的序列：
RNA的提取/5’RACE Ready cDNA的产生：
[232]在1X PBS中清洗后通过离心收集杂交瘤细胞系(大约4.5x 106个细胞)。按照厂商说明书，使用Qiagen’s RNeasy minipurification试剂盒纯化RNA。将所得的RNA展示在1.2％ E-凝胶上以进行验证。使用提供5’RACE Ready cDNA的BD Biosciences BDSMART RACE cDNA Amplification试剂盒进行第一链cDNA的合成。
轻链和重链可变区序列的扩增：
[233]5’RACE ready cDNA用作用于BD Biosciences BD SMARTRACE cDNA Amplification试剂盒中所述的PCR的模板。重链和轻链PCR扩增都使用由试剂盒以5’PCR寡核苷酸形式提供的10X UPM(通用引物混合物)。3’PCR寡核苷酸如下；
小鼠κ(zc54289：5’-CGACTGAGCCACCTCCAGATGTTAACTGCTCAC-3’SEQ ID NO：28)
小鼠IgG1(zc54983：5’-CAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGGGGG-3’SEQID NO：29)
小鼠IgG2a(zc55640：5’-CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGG-3’SEQID NO：30)
[234]使用GE Healthcare illustra GFX tm PCR DNA和Gel BandPurification试剂对轻链和重链可变区序列的PCR产生进行纯化，然后通过Invitrogen TOPO TA Cloning试剂盒进行克隆。通过使用M13R和M13F试剂盒引物的集落PCR筛选每可变区每杂交瘤8个单个的集落，然后将其进行测序。使用ABI PRISM BigDye Terminator v3.0 CycleSequencing试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行测序。使用EdgeBioSystems Centriflex Gel Filtration Cartridges(Gaithersburg，MD)纯化测序反应物，然后在ABI PRISM 377 DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)是进行测序。使用Sequencher v4.1软件(GeneCodes Corporation，Ann Arbor，MI.)拼接和编辑所得的序列数据。
[235]表1显示可变区的序列的SEQ ID NO：，其进一步描述于图1至4。
Figure A200780036666D00921
[237]杂交瘤292.12.3.1和292.84.1.6表达相互之间共有广泛的序列同一性的轻链和重链。292.12.3.1和292.84.1.6的轻链和重链可变区的氨基酸序列比对示于图2中。高度的共有序列同一性表明轻链可变区来源于相同的轻链可变区胚系基因，同时重链可变区也来源于相同的重链可变区胚系基因。此外，在整个轻链和重链CDR3以及FR4上的同一性表明相同JL在轻链上的使用以及相同JH和D区以及N和P核苷酸的添加在重链CDR3的使用。两种杂交瘤292.12.3.1和292.84.1.6都表达κ轻链，但292.12.3.1表达IgG1重链而292.84.1.6表达IgG2a重链。这两种杂交瘤似乎都是相同初始B细胞免疫球蛋白基因座重排事件的衍生物，292.84.1.6似乎是随后至IgG2a重链的类别转换的结果。在类别转换之前或之后，292.12.3.1和292.84.1.6的差异在于包含另外的体细胞突变，所述体细胞突变导致轻链中的单个氨酸相异和重链中的4个氨基酸相异。
实施例2
氨基末端蛋白质序列的测定
[238]N-末端蛋白质测序用于测定重链和轻链抗体序列。使用或不使用吡咯(型)谷氨酸氨基肽酶(PGAP)处理来处理抗体。未处理的样品通过加入100皮摩(pmol)蛋白质和水来进行处理。PGAP处理的样品通过加入100pmol蛋白质、水、0.03％ SDS、5X PGAP缓冲液(TakaraBio Inc.，Japan)和1X PGAP缓冲液中的PGAP酶(1mU)来进行处理。将PGAP反应在95℃下进行10分钟。该酶促处理除去N末端封闭吡咯谷氨酸基团。向未处理的和PGAP处理的样品中加入还原性SDS PAGE缓冲液，然后将样品在沸水浴中加热5分钟。将样品在SDS PAGE梯度凝胶上跑胶。将凝胶转移至PVDF膜并且用考马斯蓝染色。对于每一个样品观察到具有明显的的50kDa和25kDa的SDS PAGE分子量的两条可见条带。切取每一条带并且将其经历N末端蛋白质测序。进行20个序列循环以测定序列。
实施例3
通过使用腺病毒STAT/SRE报告基因的瞬时转染对人转化上皮细胞系 进行的荧光素酶测定法
[239]可通过荧光素酶测定法测量IL-31活性的抑制、减少和/或中和。例如，可将人转化细胞系以10,000个细胞/孔于对于各细胞类型指明的常规培养基中接种在96孔平底板中。第二天，用腺病毒报告构建体KZ136以5000的复合感染来感染细胞。KZ136报告基因除了血清应答元件外还包含STAT元件。使用含有2mM L-谷氨酰胺(GibcoBRL)、1mM丙酮酸钠(GibcoBRL)和1x胰岛素-转铁蛋白-硒补充物(GibcoBRL)的DMEM(在下文中称为无血清培养基)，总体积为100ul/孔。将细胞培养过夜。
[240]第二天，取出培养基，然后用100μl诱导培养替换。诱导培养基是以100ng/ml，50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml和1.56ng/ml在无血清培养基中稀释的人IL-31。20％ FBS的阳性对照用于验证测定和确保通过腺病毒的感染是成功的。诱导细胞，进行5小时，此时吸出培养基。然后在50μl/孔PBS中清洗细胞，然后在30μl/孔的1X细胞裂解缓冲液(Promega)中对细胞进行裂解。在室湿下温育10分钟后，将25μl/孔的裂解物转移至不透明的白色96孔板中。然后通过使用5秒的与40μl/孔的注射的荧光素酶底物(Promega)的混合，在发光计上读板。
实施例4
IL-31的生物学检定
[241]将使用hzCYTOR17(IL-31RA)、hOSMRB和KZ134转染的BAF3细胞培养至5 x 105和1 x 106个细胞/mL。将细胞用测定培养基(RPMI 1640、10％ FBS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和Pen/Strep(全都来自Gibco))清洗并且以3 x 105个细胞/mL重悬浮于测定缓冲液中。在96孔不透明板中，通过100μL/孔，1:2系列稀释以一式两份重复从测定培养基中的600pg/mL至9.38pg/mL滴定hIL-31标准。以一式两份以100μL中350pg/mL和35pg/mL向板中加入质量控制标准。受试样品通常以1:2或1:4进行稀释，并且以一式两份加入样品孔。以3 x 104个细胞/孔的终浓度向各孔中加入100μL清洗过的BAF3细胞。将板在+37℃下在5％ CO2的温箱中温育16至24小时。以1200RPM将板离心5分钟，弹掉培养基，向各孔中加入25μL/孔裂解缓冲液(Promega)。10分钟后，在光度计(Berthold)上读板。光度计加入40μL/孔的荧光素酶底物混合物(Promega)并且混合发光物，？进行4秒的时间。将发光值输出至表格程序，在该表达程序中对其进行分析和将其转化成IL-31的皮克/106个细胞/mL体积。
实施例5
IL-31参与体内起始和维持接触性过敏反应
方法I
[242]采用吸管操纵器，用溶解于丙酮:橄榄油(4:1)溶液中的25μL 0.5％的DNFB(2，4，二硝基-氟-苯，Sigma，St.Louis MO)涂于BALB/c小鼠的剃了毛的背部中部。载体对照组只接受25μL的丙酮:橄榄油。5天后，将小鼠在吸入室中用异氟烷(isofluorane)麻醉，并用工程测微计(Mitutoyo)测量实验动物和对照动物两侧耳廓以获得基线测量值。然后，通过施用丙酮:橄榄油(4:1)中10μL0.25％的DNFB至所有小鼠每只耳朵的两侧来攻击小鼠。在24小时和48小时后测量接触性过敏反应作为右耳(受刺激)和左耳(未受刺激)之间的不同。所有的测量用工程测微计完成。通过首次接受试验的小鼠的受攻击和未受攻击的耳之间的耳肿胀的不同来测定背景值。
[243]用于FACS和/或ELISA分析的全部血液和血清在处死小鼠之前采集并且采集耳用于组织学。
方法II(诱导Th2应答)
[244]在第1、2天和第8天，用吸管操纵器将1:1丙酮/酞酸丁酯(MSDS可获得)溶液中的100μL 0.5％的FITC(异硫氰酸荧光素)涂于BALB/c小鼠的剃了毛的背部中部。在第13天，将小鼠在吸入室中用异氟烷麻醉，并用工程测微计(Mitutoyo)测量实验动物和对照动物的两个耳廓以获得基线测量值。通过施用25μL 0.5％的FITC(在1:1的丙酮/酞酸二丁酯中)至每只耳朵的背侧来攻击小鼠。在24小时和48小时后测量接触性过敏反应作为右耳(受刺激)和左耳(未受刺激)之间的不同。所有的测量用工程测微计完成。通过首次接受试验的小鼠的受刺激和未受刺激的耳之间的耳肿胀的不同来测定背景值。用于FACS和/或ELISA分析的全部血液和血清在处死小鼠之前采集并且采集耳用于组织学。
方法III(诱发Th1应答)
[245]用吸管操纵器将25μL 2％的oxazalone(在4:1的丙酮/橄榄油中)涂于BALB/c小鼠的剃了毛的背部中部。在第7天，将小鼠在吸入室中用异氟烷麻醉，并用工程测微计(Mitutoyo)测量实验动物和对照动物的两边耳廓以获得基线测量值。通过施用8μLoxazalone至每只耳朵的背侧来攻击小鼠。在24小时和48小时后测量接触性过敏反应作为右耳(受刺激)和左耳(未受刺激)之间的不同。所有的测量用工程测微计完成。通过首次接受试验的小鼠的受攻击和未受攻击的耳之间的耳肿胀的不同来测定背景值。用于FACS和/或ELISA分析的全部血液和血清在处死小鼠之前采集并且采集耳用于组织学。
[246]在实验的致敏阶段和攻击阶段，用在此描述的IL-31结合分子或IL-31拮抗剂检测了起始和永存化接触性过敏反应中IL-31的参与。
实施例6
体内特应性皮炎中IL-31的参与
方法I(NC/Nga小鼠的致敏)
[247]将4周大的雄性NC/Nga小鼠(CRL，Japan)在SPF检疫条件下圈养4周以适应新环境。在抗原致敏开始时小鼠约10-11周大。将小鼠用异氟烷麻醉并用电动剪给背部剃毛。在5至6周内，每周3次在颈部背面皮内注射约10μg的屋尘螨(Dp)(IndoorBiotechnologies，特别订购)提取物直到小鼠发生了皮肤病患。对照动物每周接受10μL PBS皮内注入3次。所述Dp提取物根据Matsuoka及其同事(Matsuoka H.，等，Allergy：58，139(2003))的方法制备。简而言之，将595mg低压冻干的Dp耗尽培养提取物(spent cultureextract)溶解于12mL的无菌PBS(Gibco)中。将Dp在振荡器上的50mL Falcon试管中混合30分钟。将该提取物2000rpm离心10分钟，收集上清液并等分进1mL的冷冻管中并在-20℃下保存。
[248]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的作用通过搔抓、搔痒和/或皮炎的抑制来测量。
方法II(DO11.10小鼠的致敏)
[249]DO11.10转基因小鼠由室内群体繁殖并在抗原致敏开始时为9.5至14周大。在表皮致敏前24小时，将小鼠用异氟烷麻醉并用电动剪给小鼠的整个躯干(背部和腹部)剃毛。然后用Elastin外科带(Johnson和Johnson)在小鼠的背部进行胶带剥脱。将1cm2无菌纱布片用500μg卵清蛋白(Calbiochem 32467)或无菌PBS(Gibco)弄湿，并用DuoDerm Extra Thin敷料(ConvaTec 187932)将其粘贴在小鼠的背部左侧。然后，让布片和敷料覆盖于Elastin外科带的躯体包裹中以便小鼠不会移动或破坏该布片。让布片粘贴7天并除去。让小鼠在进行另一轮表皮致敏之前休息2周。小鼠受到总共为三次一周的致敏。
[250]IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的作用通过搔抓、搔痒和/或皮炎的抑制和/或表皮角质细胞中IL-31RA的表达的减少在来测量。
实施例7
在AD小鼠模型中TARC和MDC响应抗IL-31抗体的减少
方法I
[251]将6周大的雄性NC/Nga小鼠(CRL Japan)每周三次用50μg粉尘螨提取物(D.pteronyssinus，Indoor Biotechnologies)在背部通过皮内致敏，并对类似AD病患打分。在致敏5周后，对小鼠实施安乐死，并且切离右耳并置于补充有RPMI+2％ FBS(GIBCOInvitrogen)的48孔培养皿(Corning)的单个孔中。将平板置于5％CO2的湿度控制保温箱中。在24小时后收集上清液并在-20℃下冷冻直到进一步分析。
方法II
[252]将12周大的雌性NC/Nga小鼠(CRL Japan)每周3次用10μg SEB(Toxin Technology)在耳内和背上通过皮内致敏。对小鼠类似AD的病患打分。在致敏5周后，让小鼠安乐死，并从每只小鼠接受注射的耳朵取出6mm活检穿孔器提取物并置于补充有RPMI+2％FBS的48孔培养皿的单个孔中。将平板置于5％ CO2的湿度控制保温箱中。在24小时后收集上清液并在-20℃下冷冻直到进一步分析。
[253]在1至2周的致敏作用后开始，每周两次用IL-31结合分子或IL-31拮抗剂腹膜内处理两个研究中的小鼠组。
[254]24-小时上清液样品中的TARC和MDC浓度通过常规的ELISA(R&D Systems)测量。
实施例8
IL-31中和抗体的施用
[255]将约8-12周大的正常雌性BALB/c小鼠(CRL)皮下植入递送1μg/天的mIL-31的14-天渗透泵(Alzet，#2002)。从IL-31递送前1周开始，数组小鼠每周两次接受腹膜内(i.p.)注射10mg/kg(200μg/小鼠)的大鼠抗-小鼠IL-31单克隆抗体。小鼠对照组以相同给药方案，接受i.p.注射的载体(PBS/0.1％ BSA)。采用下列标准每天给小鼠的脱毛和搔痒打分：0＝无搔痒行为，动物表现正常；1＝小范围内毛发变稀疏，观察到搔抓行为；2＝不严重的脱毛(小块)，搔抓行为；3＝中度脱毛，搔抓行为；以及4＝严重脱毛，过度的搔抓行为。
[256]通过大约5至7天的症状的延迟发生以及脱毛和搔痒的更低的总体打分来测量IL-31结合分子或IL-31拮抗剂的作用。
实施例9
重组嵌合抗人IL-31单克隆抗体的表达
[257]通过PCR获得来自两个独立的小鼠抗人IL31单克隆抗体292.12.3.1和292.63.5.3的重链和轻链可变区序列。测定DNA序列，使用人恒定区DNA序列产生表达构建体。
[258]轻链表达构建体由指导融合至人免疫球蛋白κ恒定区的嵌合小鼠抗人IL31可变区的表达的杂种MPSV/CMV启动子/增强子组成。
[259]重链表达构建体由指导融合至人免疫球蛋白IgG4的恒定区(在铰链区具有氨基酸置换，丝氨酸228转变成脯氨酸)的嵌合小鼠抗人IL31可变区的表达的杂种MPSV/CMV启动子/增强子组成。
[260]将编码来自各杂交瘤的嵌合轻链和重链的轻链和重链表达构建体共转染入HEK 293F细胞。在4天后收获条件化培养基。蛋白印迹分析在非还原SDS-PAGE上显示预期大小的完整嵌合抗体。
[261]嵌合抗体的抗原结合能力通过基于ELISA的方案，测量表观EC50(在固定浓度上，结合50％的抗原的有效浓度)来进行测定。测定版式使用固定的山羊抗人Fc以从未处理的细胞培养物条件化培养基中捕获人单克隆抗体的固定的山羊抗人Fc固定。生物素化的IL31的稀释系列检测导致以ng/mL或nM的IL31表示的表观kd(或EC50)的4-参数拟合的“C”参数。测定的灵敏性高至足以可评估稀释的单克隆抗体或嵌合抗体细胞培养物条件化的培养基。通过该方法测定的Kd通常接近对使用Biacore测量的纯化的、均一的单克隆抗体测量的Kd。两种嵌合抗-IL31抗体显示与表3中显示的对照“亲本”小鼠杂交瘤单克隆抗体292.63.5.3相比，相似的EC50值。
表3
来自HEK 293F瞬时转染的条件化培养基的EC50的测定
 
样品 EC50(ng/mL)a EC50(nM)a
嵌合292.63.5.3 1.3 0.08
嵌合292.12.3.1 2.0 0.12
未转染的HEK293F对照培养基      无结合 无结合
292.63.5.3(LotE9289)对照单克隆抗体 4.3 0.26
a来自一式两份重复测量的平均数
[262]根据上述内容，将理解，尽管本发明的特定实施方案在此描述仅为了举例说明，但可进行多种修饰而背离本发明的精神和范围。因此，本发明除了由所述的权利要求限制外，不受其他限制。
序列表
<110>Siadak，Anthony W.
     Bilsborough，Janine
     Rene，Shirley
<120>IL-31单克隆抗体的可变区序列和使用方法
<130>06-38PC
<150>60/824,403
<151>2006-09-01
<150>60/890,792
<151>2007-02-20
<160>85
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>904
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<212>PRT
<213>小鼠
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<212>PRT
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<213>人工序列
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<213>小鼠
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<221>VARIANT
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<223>Xaa＝任何氨基酸
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
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Figure A200780036666D01151
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<213>小鼠
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>16
Figure A200780036666D01153
Figure A200780036666D01161
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<212>PRT
<213>小鼠
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<212>PRT
<213>小鼠
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<212>PRT
<213>小鼠
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Figure A200780036666D01172
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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Figure A200780036666D01182
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<212>PRT
<213>小鼠
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<212>PRT
<213>小鼠
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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Figure A200780036666D01211
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<213>小鼠
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<212>PRT
<213>小鼠
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<213>小鼠
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<211>28
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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Figure A200780036666D01241
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
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Figure A200780036666D01261
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
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Figure A200780036666D01262
Figure A200780036666D01271
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<212>PRT
<213>小鼠
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Figure A200780036666D01272
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
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Figure A200780036666D01281
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
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Figure A200780036666D01291
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
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Figure A200780036666D01292
Figure A200780036666D01301
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<212>PRT
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Figure A200780036666D01302
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<212>PRT
<213>小鼠
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Figure A200780036666D01303
Figure A200780036666D01311
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<211>133
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
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Figure A200780036666D01312
Figure A200780036666D01321
<210>44
<211>139
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
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Figure A200780036666D01322
<210>45
<211>133
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)...(20)
<400>45
Figure A200780036666D01331
<210>46
<211>139
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)...(19)
<400>46
Figure A200780036666D01332
Figure A200780036666D01341
<210>47
<211>133
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)...(20)
<400>47
Figure A200780036666D01342
<210>48
<211>139
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)...(19)
<400>48
Figure A200780036666D01351
<210>49
<211>127
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)...(20)
<400>49
Figure A200780036666D01352
Figure A200780036666D01361
<210>50
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<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)...(19)
<400>50
Figure A200780036666D01362
<210>51
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>51
Figure A200780036666D01363
Figure A200780036666D01371
<210>52
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>52
Figure A200780036666D01372
<210>53
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>53
Figure A200780036666D01373
<210>54
<211>11
<212>PRT
<213>小鼠
<400>54
Figure A200780036666D01374
<210>55
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>55
Figure A200780036666D01375
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>56
Figure A200780036666D01381
<210>57
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>57
Figure A200780036666D01382
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<213>小鼠
<400>58
Figure A200780036666D01383
<210>59
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<213>小鼠
<400>59
Figure A200780036666D01384
<210>60
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(212>PRT
<213>小鼠
<400>60
Figure A200780036666D01391
<210>61
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>61
Figure A200780036666D01392
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>62
Figure A200780036666D01393
<210>63
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>63
<210>64
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>64
Figure A200780036666D01401
<210>65
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>65
Figure A200780036666D01402
<210>66
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>66
Figure A200780036666D01403
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>67
<210>68
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<213>小鼠
<400>68
Figure A200780036666D01411
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>69
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<212>PRT
<213>小鼠
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Figure A200780036666D01413
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>71
Figure A200780036666D01414
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<213>小鼠
<400>72
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<213>小鼠
<400>73
Figure A200780036666D01422
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>74
Figure A200780036666D01423
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<213>小鼠
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Figure A200780036666D01424
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<212>PRT
<213>小鼠
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Figure A200780036666D01425
Figure A200780036666D01431
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>77
Figure A200780036666D01432
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>78
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<213>小鼠
<400>79
Figure A200780036666D01434
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>80
Figure A200780036666D01441
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<213>小鼠
<400>81
Figure A200780036666D01442
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<213>小鼠
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Figure A200780036666D01443
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<213>小鼠
<400>83
Figure A200780036666D01444
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>84
Figure A200780036666D01445
Figure A200780036666D01451
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>85

Claims (26)

1.竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；
b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；
c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；
d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；
e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；
f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；
h)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；
i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；和
j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区
以及其中将单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。
2.用于减少、阻断、抑制或中和哺乳动物的炎症的方法，所述方法包括对哺乳动物施用单克隆抗体或抗体片段，所述单克隆抗体或抗体片段争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；
b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；
c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；
d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；
e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；
f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；
h)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；
i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；和
j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区
并且其中将单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。
3.权利要求2的方法，其中对哺乳动物施用抗体减少、阻断、抑制或中和促炎趋化因子的产生。
4.权利要求2的方法，其中促炎趋化因子是TARC或MDC。
5.用于减少、阻断、抑制或中和哺乳动物的搔痒症的方法，所述方法包括对哺乳动物施用单克隆抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；
b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；
c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；
d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；
e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；
f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；
h)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；
i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；和
j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区
并且其中将单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。
6.权利要求5的方法，其中施用单克隆抗体或抗体片段减少、阻断、抑制或中和皮炎。
7.权利要求5的方法，其中皮炎是特应性皮炎或结节性痒疹。
8.用于减少、阻断、抑制或中和哺乳动物的搔抓的方法，所述方法包括对哺乳动物施用单克隆抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；
b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；
c)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；
d)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；
e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；
f)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
g)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；
h)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；
i)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；和
j)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区
并且其中将单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。
9.权利要求1的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段抑制、阻断或中和IL-31(SEQ ID NO：2)与IL-31RA(SEQ IDNO：5)的相互作用。
10.权利要求2、5或8的方法，其中所述单克隆抗体或抗体片段抑制、阻断或中和IL-31(SEQ ID NO：2)与IL-31RA(SEQ ID NO：5)的相互作用。
11.权利要求1的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段选自：
(a)鼠单克隆抗体或抗体片段；
(b)人源化抗体或抗体片段；和
(c)人单克隆抗体。
12.权利要求2、5或8的方法，其中所述单克隆抗体或抗体片段选自：
(a)鼠单克隆抗体或抗体片段；
(b)人源化抗体或抗体片段；和
(c)人单克隆抗体。
13.权利要求1的单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体还包括PEG化。
14.权利要求2、5或8的方法，其中所述抗体还包括PEG化。
15.权利要求1的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述单克隆抗体或抗体片段选自：
a)竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
i)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和
ii)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区；和
b)竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；
ii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；
iii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；
iv)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；
v)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
vi)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；
vii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；和
vii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区
并且其中将单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。
16.权利要求2、5或8的方法，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含轻链可变区和重链可变区，其中所述单克隆抗体或抗体片段选自：
a)竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
i)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和
ii)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区；和
b)竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合的单克隆抗体或抗体片段，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；
ii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；
iii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；
iv)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；
v)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
vi)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；
vii)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；和
vii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区
并且其中将单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。
17.权利要求15或16的单克隆抗体或方法，其中所述单克隆抗体或抗体片段竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区；和
b)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链可变区。
18.权利要求15或16的单克隆抗体或方法，其中所述单克隆抗体或抗体片段竞争对包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的特异性结合，其中所述单克隆抗体或抗体片段包含选自下列区域的轻链可变区和重链可变区：
a)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链可变区；
b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区；
c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链可变区；
d)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链可变区；
e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链可变区；
f)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的重链可变区；
g)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的重链可变区；和
h)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变区；
并且其中将单克隆抗体或抗体片段与人IgG4Fc分子结合使用。
19.结合人IL31的分离的抗体，其中所述抗体是来源于由美国典型菌种保藏中心保藏的具有选自下列ATCC专利保藏名称的杂交瘤产生的单克隆抗体的人源化抗体：
a)ATCC专利保藏名称PTA-6815、
b)ATCC专利保藏名称PTA-6816、
c)ATCC专利保藏名称PTA-6829、
d)ATCC专利保藏名称PTA-6830、
e)ATCC专利保藏名称PTA-6831、
f)ATCC专利保藏名称PTA-6871、
g)ATCC专利保藏名称PTA-6872、
h)ATCC专利保藏名称PTA-6875，和
i)ATCC专利保藏名称PTA-6873，
并且其中所述抗体包含重链免疫球蛋白恒定结构域，所述抗体为人IgG4。在一个实施方案中，人IgG4恒定结构域是在溶液中稳定的突变形式，其具有少量或无补体激活活性。在特别的实施方案中，重链免疫球蛋白恒定区结构域是在位置241(Kabat编号)上具有Ser至Pro突变的人IgG4恒定结构域。
20.权利要求19的分离的抗体，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区结构域选自κ或λ人免疫球蛋白轻链的恒定区。
21.此处公开的分离的抗体，其中
a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：57组成的第二CDR序列、以及由SEQ ID NO：53组成的第三CDR序列；和
b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：54组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：55组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：56组成的第三CDR序列。
22.此处公开的分离的抗体，其中
a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：58组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：59组成的第三CDR序列；和
b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：60组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：61组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：62组成的第三CDR序列。
23.此处公开的分离的抗体，其中
a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：63组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：64组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：65组成的第三CDR序列；和
b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：66组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：67组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：68组成的第三CDR序列。
24.此处公开的分离的抗体，其中
a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：69组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79组成的第二CDR序列、以及由SEQ ID NO：71组成的第三CDR序列；和
b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：72组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：73组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：74组成的第三CDR序列。
25.此处公开的分离的抗体，其中
a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：75组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：76组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：65组成的第三CDR序列；和
b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：77组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：78组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：68组成的第三CDR序列。
26.此处公开的分离的抗体，其中
a)重链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：80组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：81组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：82组成的第三CDR序列；和
b)轻链可变结构域包含由氨基酸序列SEQ ID NO：83组成的第一CDR序列、由SEQ ID NO：84组成的第二CDR序列、以及由SEQID NO：85组成的第三CDR序列。
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