CN103965363A - 与pd-1和vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途 - Google Patents
与pd-1和vegf高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种与PD-1和VEGF高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途。具体地，本发明涉及一种分离的融合蛋白，其包含如下肽段：（1）人类PD-L2的胞外区肽段；（2）人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段；以及任选的（3）人类免疫球蛋白的Fc段。本发明的融合蛋白能够抑制肿瘤细胞生长，促进其死亡，抑制T细胞失活，增强杀瘤能力。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种与PD-1和VEGF高效结合的融合蛋白、其编码序列及用途。
背景技术
单克隆抗体靶标明确，临床应用安全性好、疗效明显，目前共有10个肿瘤单克隆抗体经美国FDA批准上市销售，已成为多种类型恶性肿瘤治疗的一线药物。然而一方面，全长抗体分子量大，不易进入实体瘤组织，难以在肿瘤内部达到有效治疗浓度，从而发挥抗肿瘤疗效。另一方面，肿瘤发病机制复杂，细胞内信号通路冗余或交叉，单一靶标的治疗疗效不足且易形成耐药性。而应用多个针对不同靶标的单抗进行联合治疗，疗效虽优于单一靶标治疗，但费用非常昂贵，患者难以承担。因而，非常必要研制分子量小、多靶点的抗体类蛋白药物。
程序性死亡分子1（programmed death-1 receptor，PD-1）是T细胞天然免疫抑制分子，肿瘤细胞可通过过量表达其细胞表面PD-1的配体（PD-L1/PD-L2），作用于T细胞表面PD-1，激活PD-1通路，诱导T细胞凋亡，形成免疫逃逸及耐受。因而，PD-1已成为肿瘤治疗的重要靶标。一项PD-1抗体（BMS-936558或MDX-1106）的I期临床试验（296例患者）表明，PD-1抗体能使四分之一至五分之一的非小细胞肺癌患者，黑色素瘤患者，或肾细胞癌患者产生客观反应（J Clin Oncol.2010;28:3167-75；N Engl J Med.2012;366:2443-54），显示其具有良好的临床应用价值。
VEGF有促进血管生成的作用，肿瘤细胞可大量分泌VEGF，作用于其受体VEGFR1（Vascular endothelial growth factor receptor 1,也称作FLT-1）及VEGFR2（Vascular endothelial growth factor receptor2,也称作KDR），诱导肿瘤组织新生血管的生成，使肿瘤体积快速扩张（Nat Med.1999;5:1359-64）；此外，VEGF可以抑制DC的分化与成熟，抑制机体的抗肿瘤T细胞免疫应答而逃避免疫监视（Blood.2003;101:4878-86）。目前，针对VEGF的单抗Bevacizumab（Avastin）已经由美国FDA批准上市销售，广泛应用于结肠癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、肾癌、神经胶质瘤的治疗，2010年销售额达64.6亿美元。
有意思的是，Flt-1或KDR的胞外区多肽也可在体外阻断VEGF信号通路，抑制血管内皮细胞的生长（Cancer Res.2002;9:633-40）。通过基因工程技术，将Flt-1与KDR胞外区段中的某些特定免疫球蛋白样（Ig样）结构域（如Flt-1的第2Ig样结构域Flt1-D2，KDR的第3Ig样结构域KDR-D3）融合，可有效阻断细胞VEGF信号通路（Proc NatlAcad Sci USA.2002;99:11393-8；Gene Ther.2009;16:10-6）。
因而，如能同时阻断肿瘤细胞VEGF及T细胞PD-1通路，有望有效抑制肿瘤生长，消除免疫耐受，发挥抗肿瘤作用。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种融合蛋白，本发明人惊奇地发现，其能够与PD-1、VEGF高效结合，同时阻断肿瘤细胞VEGF及T细胞PD-1通路，具有显著的抗肿瘤作用，有应用于制备防治恶性肿瘤的药物或基因治疗药物的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分离的融合蛋白，其包含如下肽段：
1）人类PD-L2的胞外区肽段；
2）人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段；以及任选的
3）人类免疫球蛋白的Fc段。
不拘于理论的限制，人类PD-L2的胞外区肽段能够高效地结合PD-1。
不拘于理论的限制，天然状态下，PD-1与PDL1/PDL2均是膜蛋白，其结合涉及肿瘤细胞与免疫细胞的应答，对T细胞起抑制作用。而本发明设计的融合蛋白是游离状态的，与抗体的作用机制类似。虽其也能通过PD-L2的胞外区与PD-1结合，但所起的作用是与肿瘤细胞表面的PDL1/PDL2竞争性的结合T细胞表面的PD-1，封闭T细胞天然免疫分子PD-1的作用，阻止T细胞的凋亡。
不拘于理论的限制，VEGF受体FLT-1的胞外区第2个免疫球蛋白样结构域（简称为Flt1-D2）的肽段和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域（简称为KDR-D3）的肽段均能够高效结合VEGF。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述人类PD-L2的胞外区肽段包含或者为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述人类KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，相对于（1）和（2）中所述的肽段，所述Fc段位于融合蛋白的靠近C末端的一侧。
在本发明的一个实施方案中，从融合蛋白的N末端至C末端的连接顺序依次为（1）中所述的多肽、（2）中所述的多肽以及（3）中所述的Fc段。
在本发明的一个实施方案中，从融合蛋白的N末端至C末端的连接顺序依次为（2）中所述的多肽、（1）中所述的多肽以及（3）中所述的Fc段。
在本发明中，所述的人类免疫球蛋白的Fc段，不仅包括天然的Fc段序列，还包括对其进行人工修饰、改造或突变的并且具有Fc段功能的序列。根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，所述Fc段选自人类免疫球蛋白IgG各亚型（例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）、IgM或者IgA的全长Fc段；优选地，所述的Fc段不具有ADCC效应；优选地，所述Fc段为IgG4的全长Fc段。
不拘于理论的限制，本发明的靶标之一是T细胞上的PD-1，只要求阻断T细胞的PD-1通路，防止其凋亡，不能选用具有ADCC效应的IgG Fc。不然，当融合蛋白与T细胞结合后，机体会通过ADCC效应对T细胞进行清除，而IgG4 Fc无ADCC效应，所以是优选的。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，人类PD-L2的胞外区肽段为一个或多个拷贝；具体地，为两个拷贝。
不拘于理论的限制，多拷贝可以增强对靶标的亲和力，但如果拷贝数太多，可能本领域对融合蛋白空间构象的正确折叠，从而影响其功能；具体地，为2个拷贝。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段为一个或多个拷贝；具体地，为两个拷贝。
根据本发明任一项所述的融合蛋白，其中，当为多个拷贝时，
人类PD-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段为同源串联重复或间隔串联重复。
根据本发明任一项所述融合蛋白，其还包含信号肽；优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
不拘于理论的限制，信号肽可以提高融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终要被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，导致融合蛋白失活。因此，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
根据本发明任一项所述融合蛋白，其中，人类PD-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段、Fc段以及任选的信号肽之间为直接相连或通过1个或多个相同或者不同的Linker（接头序列）相连；优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：11或SEQID NO：13所示。
融合蛋白是通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一基因表达框所得的具有多种功能的蛋白质产物。不拘于理论的限制，在构建融合蛋白时，一个关键的问题是两个甚至多个不同来源蛋白间的接头序列(Linker)，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白（肽段）高级结构的折叠，从而相互干扰，使其中一个甚至多个来源蛋白失去活性；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原，而且随着融合蛋白氨基酸序列的延长，其表达难度会随之增加，其整体折叠可能会出现新的问题。因而，具体涉及到每种蛋白时，由于其各自构象的不同，如何使其融合在一起，而不影响每个部分的功能，需具体分析。遗憾的是，尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步，但是对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限，仍无法通过软件准确模拟融合后蛋白的二级结构。这种现状直接导致了目前对于连接肽序列的设计缺乏可靠的选择标准。
不拘于理论的限制，本发明人通过选择合适的信号肽和linker，增大了融合蛋白的表达量，有利于得到空间构象更佳的融合蛋白，从而提高了融合蛋白的活性。
在一个具体的实施方案中，所述融合蛋白的结构示意图如图1所示。它们由PD-L2胞外区、Flt-1、KDR、人IgG4Fc段的编码DNA通过基因工程技术构建获得。其中Sp1、Sp2分别是Linker1与Linker2的简写。所述融合蛋白在本发明中分别命名为PVP1、PVP2、PVP3和PVP4。其中：
PVP1:由PD-L2、Flt1-D2、人IgG4 Fc段依次通过蛋白Linker连接构成。
PVP2:由Flt1-D2、PD-L2、人IgG4 Fc段依次通过蛋白Linker连接构成。
PVP3:由PD-L2、KDR-D3、人IgG4 Fc段依次通过蛋白Linker连接构成。
PVP4:由KDR-D3、PD-L2、人IgG4 Fc段依次通过蛋白Linker连接构成。
根据本发明任一项所述融合蛋白，其氨基酸序列包含或者为SEQID NO：15至SEQ ID NO：18所示的序列。
本发明的再一方面涉及一种制备本发明所述的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
a.根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列，合成表达框；
b.将步骤a获得的表达框***合适的载体，转化到合适的宿主细胞中，提取并纯化质粒；
c.将纯化后的质粒转染至合适的细胞，培养扩增转染细胞，收集培养物上清，经纯化获得融合蛋白；
优选地，步骤b中所述的合适的载体选自质粒、重组病毒（例如重组腺病毒或重组腺相关病毒）、噬菌体，优选地，其中所述的质粒为真核表达质粒或原核表达质粒，例如pCDNA3.1、pDC315或pAAV-MCS；
优选地，步骤b中所述的合适的宿主细胞为细菌或真菌，例如E.coli（例如DH5α）；
优选地，步骤c中所述的合适的细胞为真核表达宿主细胞，例如293细胞（胚肾细胞，购自美国典型物保藏中心，ATCC）。
在一个具体的实施例中，该方法具体地包括以下步骤：
a.根据融合蛋白各肽段的氨基酸序列与编码序列，合成表达框；
b.将步骤a获得的表达框***pCDNA3.1（+）载体EcoRI位点，转化到E.coli（DH5α），提取并纯化质粒；
c.将纯化后的质粒转染至293细胞，培养扩增转染细胞，收集培养物上清，经纯化获得融合蛋白。
在一个具体的实施例中，步骤c中是利用Lipofectamine 2000将步骤b获得的质粒转染至293细胞中。
在一个具体的实施例中，步骤c中，转染后，优选转染1～4天后，进一步优选转染2或3天后，将转染后的293细胞转移到具有新霉素的DMEM培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。
在一个具体的实施例中，将上述克隆细胞，经筛选后，建立具有新霉素抗性的稳定转染相应表达载体的细胞株。而后，通过摇瓶培养大量扩增稳定转染细胞，收集培养物上清。优选地，其中所述的筛选，时间为18－24天，优选为19－22天，进一步优选为21天。
在一个具体的实施例中，步骤c中，其中所述的纯化采用凝胶过滤亲和层析法。
本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码本发明任一项所述融合蛋白。
根据本发明任一项所述的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列或其简并性序列。
本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明任一项所述的多核苷酸；具体地，所述载体为质粒、重组腺病毒、重组腺相关病毒或噬菌体；优选地，所述质粒为真核表达质粒或原核表达质粒，例如pCDNA3.1、pDC315、pAAV-MCS。
本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其包含本发明任一项所述的重组载体；具体地，所述宿主细胞为细菌（例如大肠杆菌）、真菌或者真核表达宿主细胞（例如293细胞）。
本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含本发明任一项所述的融合蛋白或者本发明任一项所述的多核苷酸或者本发明任一项所述的重组载体或者本发明任一项所述的重组宿主细胞；可选地，其还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述融合蛋白或本发明任一项所述的多核苷酸或者本发明任一项所述的重组载体或者本发明任一项所述的重组宿主细胞或者本发明任一项所述的组合物在制备抗肿瘤药物或者转基因治疗药物中的用途；具体地，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和***癌中的一种或多种；更具体地，所述肝癌为肝癌移植瘤，所述卵巢癌为卵巢癌移植瘤。
一种治疗和/或预防和/辅助***的方法，包括给予受试者有效量的本发明任一项所述的融合蛋白、多核苷酸、重组载体、重组细胞或者组合物的步骤；具体地，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和***癌中的一种或多种；更具体地，所述肝癌为肝癌移植瘤，所述卵巢癌为卵巢癌移植瘤。
给药剂量取决于许多因素，例如所治疗病况的严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。
下面给出了本发明涉及的部分术语的解释：
术语“PD-1”是指人类程序性死亡因子1(programmed cell death1)，NCBI基因库的官方ID号为5133，对应蛋白序列编号有NP_005009.1。
术语“VEGF”是指人类血管生长因子A(vascular endothelialgrowth factor A)，NCBI官方简称为VEGFA，gene ID号为7422，对应蛋白编号有NP_001020537.2、NP_003367.4、NP_001020538.2、NP_001020539.2、NP_001020540.2、NP_001020541.2、NP_001028928.1、NP_001165093.1、NP_001165094.1、NP_001165095.1、NP_001165096.1、NP_001165097.1、NP_001165098.1、NP_001165099.1、NP_001165100.1、NP_001165101.1、NP_001191313.1、NP_001191314.1。
术语“Flt-1”是指人类血管生长因子受体1，NCBI官方全称为fms-related tyrosine kinase 1(vascular endothelial growthfactor/vascular permeability factor receptor),又简称为VEGFR1，基因ID号为2321，对应蛋白编号有NP_002010.2、NP_001153392.1、NP_001153502.1、NP_001153503.1。
术语“胞外区”是指膜蛋白位于细胞外的区段。
术语“结构域”是指蛋白质生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100－400个之间，最小的结构域只有40－50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。
术语“免疫球蛋白样结构域”是指该结构域可形成类似于免疫球蛋白的空间结构。
术语“同源串联重复”是指以一种氨基酸残基多肽为单元重复1次以上。
术语“间隔串联重复”是指一种氨基酸残基多肽后连接另一种氨基酸残基多肽，或以此为单元重复1次以上。
术语“Linker”是指一段多肽，其作用是使两段相邻的肽段序列在空间结构上互不干扰。
术语“简并性”是指，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。
本发明所述的“高效结合PD-1、VEGF”是指亲和力常数Kd小于9.9×10-7mol/L。
本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。
术语“组合物”，其还可以是指药物组合物，可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、小鼠、狗、猴、牛、马等。
发明的有益效果
本发明将具有高效结合PD-1能力的多肽，与具有高效结合VEGF能力的多肽融合，使融合蛋白能同时与PD-1、VEGF结合，同时封闭肿瘤细胞过活化的VEGF和T细胞活化的PD-1两条通路，抑制肿瘤细胞生长，促进其死亡，抑制T细胞失活，增强杀瘤能力。同时融合了抗体Fc肽段，有助于延长融合蛋白的体内半衰期，增加抗体的“抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用”(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)，提高融合蛋白的抗肿瘤效果。
相应地，由于肿瘤细胞PD-L1/PD-L2与VEGF过表达，利用相似的策略，将高效结合PD1配体的多肽（PD-1蛋白结合其配体的肽段，如PD1胞外区），与具有高效结合VEGF能力的多肽（Flt-1第2结构域肽段或KDR第3结构域肽段），以及人IgG1 Fc段融合，可作用于肿瘤细胞，封闭肿瘤细胞VEGF与PD-L1/PD-L2通路，抑制肿瘤新生血管生成与免疫耐受，发挥抗肿瘤作用。
附图说明
图1：融合蛋白PVP1、PVP2、PVP3、PVP4的结构示意图。它们由PD-L2、Flt1-D2、KDR-D3、人IgG4 Fc段的编码DNA通过基因工程技术构建获得。L1、L2分别是Linker1与Linker2的简写。
图2：融合蛋白PVP1与PD-1胞外区的亲和力常数测定。从上至下分别是重组人PD-1为1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、0nM的测定曲线。
图3：融合蛋白PVP1与VEGF的亲和力常数测定。从上至下分别是重组人VEGF蛋白为1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM以及0nM的测定曲线。
图4：融合蛋白PVP1与活化的T细胞的亲和力测定。A,抗PD-1抗体（阳性对照）；B,PVP1;C,抗CD3抗体（T细胞标记）;D,空白对照。
图5：携带融合蛋白（PVP1、PVP3）编码序列的质粒用于治疗小鼠体内肝癌Hep3B移植瘤的疗效统计结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：融合蛋白表达框的设计、合成与表达载体的构建
根据融合蛋白各组分的氨基酸序列与编码序列，拼接成整个融合的氨基酸序列与编码DNA表达框，其中:
PD-L2胞外区的氨基酸残基序列为：
LFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTW(SEQ ID NO：1)
PD-L2胞外区的编码序列为：
CTCTTTACTGTGACCGTGCCAAAAGAACTGTATATCATTGAGCACGGGTCCAATGTGACCCTCGAATGTAACTTTGACACCGGCAGCCACGTTAACCTGGGGGCCATCACTGCCAGCTTGCAAAAAGTTGAAAACGACACTTCACCTCACCGGGAGAGGGCAACCCTCTTGGAGGAGCAACTGCCATTGGGGAAGGCCTCCTTTCATATCCCTCAGGTGCAGGTTCGGGATGAGGGACAGTACCAGTGCATTATTATCTACGGCGTGGCTTGGGATTACAAGTATCTGACCCTGAAGGTGAAAGCGTCCTATCGGAAAATTAACACTCACATTCTTAAGGTGCCAGAGACGGACGAGGTGGAACTGACATGCCAAGCCACCGGCTACCCGTTGGCAGAGGTCAGCTGGCCCAACGTGAGCGTACCTGCTAACACTTCTCATTCTAGGACACCCGAGGGCCTCTACCAGGTTACATCCGTGCTCCGCCTCAAACCGCCCCCAGGCCGGAATTTTAGTTGCGTGTTTTGGAATACCCACGTGCGAGAGCTGACTCTTGCATCTATTGATCTGCAGTCCCAGATGGAGCCACGGACTCATCCAACTTGG(SEQ ID NO：2)
Flt1-D2的氨基酸残基序列为：
GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT(SEQ ID NO：3)
Flt1-D2的编码序列为:
GGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACC(SE Q ID NO：4)
KDR-D3的氨基酸残基序列为:
SVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVH(SEQ ID NO：5)
KDR-D3的编码序列为:
TCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCAT(SEQID NO：6)
人IgG4 Fc的氨基酸残基序列为：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：7)
人IgG4 Fc的编码序列为：
GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGATAA(SEQ IDNO：8)
信号肽的氨基酸残基序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：9)
信号肽编码序列为：
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO：10)
Linker1的氨基酸残基序列为：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：11)
Linker1编码序列为：
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCG(SEQ ID NO：12)
Linker2的氨基酸残基序列为：
GGGGGGGGG(SEQ ID NO：13)
Linker2编码序列为:
GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT(SEQ ID NO：14)
融合蛋白PVP1依次由信号肽-PD-L2胞外区-Linker1-Flt1D2-Linker2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCLFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWGGGGSGGGGSGGGGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGGGGGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：15)
融合蛋白PVP2依次由信号肽-Flt1D2-Linker1-PD-L2胞外区-Linker2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGSGGGGSGGGGSLFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWGGGGGGGGGASTKGPSVFPLAPC SRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：16)
融合蛋白PVP3依次由信号肽-PD-L2胞外区-Linker1-KDR-D3-Linker2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCLFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWGGGGSGGGGSGGGGSSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGGGGGGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO：17)
融合蛋白PVP4依次由信号肽-KDR-D3-Linker1-PD-L2胞外区-Linker2-Fc融合构成，其氨基酸序列为：
MEFWLSWVFLVAILKGVQCSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGSGGGGSGGGGSLFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWGGGGGGGGGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO：18)
分别按PVP1的DNA编码序列(SEQ ID NO：19)，PVP2的DNA编码序列(SEQ ID NO：20)，委托捷锐生物工程（上海）有限公司合成其整个表达框，***pCDNA3.1（+）载体（Invitrogen）EcoRI位点（按照说明书进行），转化到E.coli（DH5α），经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。各融合蛋白编码序列如下：
PVP1编码序列:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCTCTTTACTGTGACCGTGCCAAAAGAACTGTATATCATTGAGCACGGGTCCAATGTGACCCTCGAATGTAACTTTGACACCGGCAGCCACGTTAACCTGGGGGCCATCACTGCCAGCTTGCAAAAAGTTGAAAACGACACTTCACCTCACCGGGAGAGGGCAACCCTCTTGGAGGAGCAACTGCCATTGGGGAAGGCCTCCTTTCATATCCCTCAGGTGCAGGTTCGGGATGAGGGACAGTACCAGTGCATTATTATCTACGGCGTGGCTTGGGATTACAAGTATCTGACCCTGAAGGTGAAAGCGTCCTATCGGAAAATTAACACTCACATTCTTAAGGTGCCAGAGACGGACGAGGTGGAACTGACATGCCAAGCCACCGGCTACCCGTTGGCAGAGGTCAGCTGGCCCAACGTGAGCGTACCTGCTAACACTTCTCATTCTAGGACACCCGAGGGCCTCTACCAGGTTACATCCGTGCTCCGCCTCAAACCGCCCCCAGGCCGGAATTTTAGTTGCGTGTTTTGGAATACCCACGTGCGAGAGCTGACTCTTGCATCTATTGATCTGCAGTCCCAGATGGAGCCACGGACTCATCCAACTTGGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGATAA(SEQ ID NO：19)
PVP2编码序列:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCTCTTTACTGTGACCGTGCCAAAAGAACTGTATATCATTGAGCACGGGTCCAATGTGACCCTCGAATGTAACTTTGACACCGGCAGCCACGTTAACCTGGGGGCCATCACTGCCAGCTTGCAAAAAGTTGAAAACGACACTTCACCTCACCGGGAGAGGGCAACCCTCTTGGAGGAGCAACTGCCATTGGGGAAGGCCTCCTTTCATATCCCTCAGGTGCAGGTTCGGGATGAGGGACAGTACCAGTGCATTATTATCTACGGCGTGGCTTGGGATTACAAGTATCTGACCCTGAAGGTGAAAGCGTCCTATCGGAAAATTAACACTCACATTCTTAAGGTGCCAGAGACGGACGAGGTGGAACTGACATGCCAAGCCACCGGCTACCCGTTGGCAGAGGTCAGCTGGCCCAACGTGAGCGTACCTGCTAACACTTCTCATTCTAGGACACCCGAGGGCCTCTACCAGGTTACATCCGTGCTCCGCCTCAAACCGCCCCCAGGCCGGAATTTTAGTTGCGTGTTTTGGAATACCCACGTGCGAGAGCTGACTCTTGCATCTATTGATCTGCAGTCCCAGATGGAGCCACGGACTCATCCAACTTGGGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGATAA(SEQ ID NO：20)
PVP3编码序列:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCTCTTTACTGTGACCGTGCCAAAAGAACTGTATATCATTGAGCACGGGTCCAATGTGACCCTCGAATGTAACTTTGACACCGGCAGCCACGTTAACCTGGGGGCCATCACTGCCAGCTTGCAAAAAGTTGAAAACGACACTTCACCTCACCGGGAGAGGGCAACCCTCTTGGAGGAGCAACTGCCATTGGGGAAGGCCTCCTTTCATATCCCTCAGGTGCAGGTTCGGGATGAGGGACAGTACCAGTGCATTATTATCTACGGCGTGGCTTGGGATTACAAGTATCTGACCCTGAAGGTGAAAGCGTCCTATCGGAAAATTAACACTCACATTCTTAAGGTGCCAGAGACGGACGAGGTGGAACTGACATGCCAAGCCACCGGCTACCCGTTGGCAGAGGTCAGCTGGCCCAACGTGAGCGTACCTGCTAACACTTCTCATTCTAGGACACCCGAGGGCCTCTACCAGGTTACATCCGTGCTCCGCCTCAAACCGCCCCCAGGCCGGAATTTTAGTTGCGTGTTTTGGAATACCCACGTGCGAGAGCTGACTCTTGCATCTATTGATCTGCAGTCCCAGATGGAGCCACGGACTCATCCAACTTGGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGTCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGATAA(SEQ ID NO：21)
PVP4编码序列:
ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTTCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCTCTTTACTGTGACCGTGCCAAAAGAACTGTATATCATTGAGCACGGGTCCAATGTGACCCTCGAATGTAACTTTGACACCGGCAGCCACGTTAACCTGGGGGCCATCACTGCCAGCTTGCAAAAAGTTGAAAACGACACTTCACCTCACCGGGAGAGGGCAACCCTCTTGGAGGAGCAACTGCCATTGGGGAAGGCCTCCTTTCATATCCCTCAGGTGCAGGTTCGGGATGAGGGACAGTACCAGTGCATTATTATCTACGGCGTGGCTTGGGATTACAAGTATCTGACCCTGAAGGTGAAAGCGTCCTATCGGAAAATTAACACTCACATTCTTAAGGTGCCAGAGACGGACGAGGTGGAACTGACATGCCAAGCCACCGGCTACCCGTTGGCAGAGGTCAGCTGGCCCAACGTGAGCGTACCTGCTAACACTTCTCATTCTAGGACACCCGAGGGCCTCTACCAGGTTACATCCGTGCTCCGCCTCAAACCGCCCCCAGGCCGGAATTTTAGTTGCGTGTTTTGGAATACCCACGTGCGAGAGCTGACTCTTGCATCTATTGATCTGCAGTCCCAGATGGAGCCACGGACTCATCCAACTTGGGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGATAA(SEQ ID NO：22)。
实施例2：融合蛋白的表达与纯化
将实施例1中构建并纯化获得的各重组表达载体的高品质质粒，利用Lipofectamine2000（Invitrogen）转染至293细胞（胚肾细胞，购自美国典型物保藏中心，ATCC）。2天后，将转染后的293细胞转移到具有新霉素的DMEM培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。经21天的筛选，建立具有新霉素抗性的稳定转染相应表达载体的细胞株。而后，通过摇瓶培养大量扩增稳定转染细胞，收集培养物上清，经凝胶过滤亲和层析法纯化各融合蛋白。PVP1、PVP2、PVP3、PVP4的分子量分别为73.3KD、73.3KD、72.7KD、72.7KD，纯化好的融合蛋白经ELISA方法确定浓度。
实施例3：融合蛋白与PD-1、VEGF的亲和力常数测定
实施例2制备的融合蛋白PVP1分别加入96孔板中（10μg/ml，200μl）中，然后负载至抗人IgG Fc捕获生物传感器上(Anti-HumanIgG Fc Capture biosensor，Octet)，再应用生物大分子相互作用仪（Octet Red96）分别测定其与不同浓度（1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、0nM）的重组人PD-1、VEGF蛋白（200μl，SinoBiological lnc.）的亲和力，测得PVP1与PD-1、VEGF的亲和力常数Kd分别为97.3nM（见图2）和30.2nM（见图3）。本领域人员知悉，一般Kd小于10-7（也即100nM，越小代表亲和力越高），就表示两个蛋白能高效结合了。当然，这个亲和力相对于抗体与抗原的亲和力，还是显得较低，但是考虑到是天然受体与配体间的结合，已经足够高了。
实施例4：融合蛋白PVP1与活化的T细胞的亲和力
取健康人外周血单个核细胞（1×106个/ml，加入10％胎牛血清(美国HyQ公司)，1640培养基（GiBCo公司）中，第1天加γIFN（美国Phmingen）1000U/ml，培养24h后加抗人CD3单抗（美国Phmingen）20μg/L，IL-1（R&D公司）500U/ml，rhlL-2（北京四环制药厂）1000U/ml，培养每3天换液，同时加rhlL-21000U/ml，14天后获得活化的CIK细胞。
取600μl活化的CIK细胞，总共为1×106个cell；2000r/min，离心4min，弃上清，用200μl PBS洗2遍；融合蛋白PVP1以及对照抗体（抗PD1抗体，抗CD3抗体，购自R&D公司）与10%BSA以1：100混合，100μl/孔，孵育70min；2000r/min，离心4min，弃上清，用200μl PBS洗2遍；鼠抗人IgG4，FITC抗体与10%BSA以1：100混合，100ul/孔，孵育45min；在每孔中加入400μl生理盐水，上流式仪检测荧光。结果见图4A－D。
结果显示，培养的CIK细胞绝大部分表达T细胞标记CD3（90.3%,见图4C）。与空白对照（0%，见图4D）相比，融合蛋白PVP1能与CIK细胞有效结合（37.1%，见图4B），尽管检出率比阳性对照（抗PD-1抗体，82.7%，见图4B）低一些。
实施例5：携带融合蛋白编码序列的质粒用于治疗小鼠体内肝癌
Hep3B移植瘤
应用EntransterTM–in vivo转染试剂盒（Engreen Biosystem Co,Ltd），制备包裹实施例1获得的融合蛋白PVP1、PVP3表达质粒pCDNA3.1-PVP1、pCDNA3.1-PVP3，以及空载体pCDNA3.1的纳米颗粒溶液（按说明书步骤），最终150μl的纳米颗粒溶液中含有质粒50μg。
将4-5周龄的裸鼠皮下接种肝癌Hep3B（购自ATCC）细胞株1×107。三周后，一次性给予荷瘤小鼠尾静脉注射包裹pCDNA3.1-PVP1、pCDNA3.1-PVP3的纳米-质粒DNA溶液（各150μl），对照组注射相同体积的包裹pCDNA3.1的纳米-质粒DNA，统计肿瘤体积的随时间的变化情况。结果发现，其对照组3周后肿瘤体积增加4倍以上，而治疗组肿瘤的大小无明显变化（见图5）。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种分离的融合蛋白，其包含如下肽段：
1）人类PD-L2的胞外区肽段；
2）人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段或/和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段；以及任选的
3）人类免疫球蛋白的Fc段。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于如下的（1）－（10）中的任一项或者多项：
（1）所述人类PD-L2的胞外区肽段包含或者为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
（2）所述人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
（3）所述人类KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段包含或者为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
（4）所述人类免疫球蛋白Fc段选自人类免疫球蛋白IgG各亚型（例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）、IgM或者IgA的全长Fc段；优选地，Fc段为IgG4的全长Fc段；
（5）相对于1）和2）中所述的肽段，所述Fc段位于融合蛋白的靠近C末端的一侧；
（6）所述人类PD-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段分别独立地为一个或多个拷贝；具体地，为两个拷贝；
（7）当为多个拷贝时，所述人类PD-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段和KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段为同源串联重复或间隔串联重复；
（8）所述融合蛋白还包含信号肽；优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
（9）所述人类PD-L2的胞外区肽段、人类FLT-1胞外区第2个免疫球蛋白样结构域的肽段和/或KDR胞外区第3个免疫球蛋白样结构域的肽段、人类免疫球蛋白的Fc段以及任选的信号肽之间为直接相连或通过1个或多个相同或者不同的Linker相连；优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示；
（10）所述融合蛋白的氨基酸序列包含或者为SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：18所示的序列。
3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1或2所述融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列或其简并性序列。
5.一种重组载体，其含有权利要求3或4所述的多核苷酸；具体地，所述载体为质粒、重组腺病毒、重组腺相关病毒或噬菌体；优选地，所述质粒为真核表达质粒或原核表达质粒，例如pCDNA3.1、pDC315或pAAV-MCS。
6.一种重组宿主细胞，其包含权利要求5所述的重组载体；具体地，所述宿主细胞为细菌（例如大肠杆菌）、真菌或者真核表达宿主细胞（例如293细胞）。
7.一种组合物，其包含权利要求1或2所述的融合蛋白或者权利要求3或4所述的多核苷酸或者权利要求5所述的重组载体或者权利要求6所述的重组宿主细胞；可选地，其还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
8.权利要求1或2所述融合蛋白或者权利要求3或4所述的多核苷酸或者权利要求5所述的重组载体或者权利要求6所述的重组宿主细胞或者权利要求7所述的组合物在制备抗肿瘤药物或者转基因治疗药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述肿瘤为选自肺癌、肝癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌和***癌中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述肝癌为肝癌移植瘤，所述卵巢癌为卵巢癌移植瘤。
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