PT90959B - Processo para a preparacao de quelantes macrociclicos bifuncionais, de seus complexos e seus conjugados com anticorpos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90 959

REQUERENTE: THE DOW CHEMICAL COMPANY,norte-americana, industrial, com sede em 2030 Dow Center,Abbott Road, Midland, Michigan 48640, Estado Unidos da América do Norte.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE QUELANTES

MACROClCLICOS BIFUNCIONAIS,DE SEUS COMPLEXOS E SEUS CONJUGADOS COM ANTICORPOS”

INVENTORES: Roberta C. Cheng,William A. Fordyce,William

F.Goeckeler, William J. Kruper,Jr.Sharon Bau ghman,Joseph R.Garlich,Garry Kiefer,Kenneth McMillan,Jaime J.Simon, David A.Wilson e Richard Reith Frank.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte,em 24 de Junho de 1988,sob o n^e. 211,496 e em 21 de Junho de 1989 sob ο η®. 370,956.

INPI MOQ 113 RF 1®32

THE DOM CHEMICAL CLur^!AH^v

PROCESSO PARA A FFE-APACaO CE GUELAMTES MACROCíCLICCS BIFUNCIONAIS, DE SEUS COMPLEXOS E SEUS CONJUGADOS COM ANTICORPOS

MEMÓRIA DESCEITIVA .,.¾

D presente invento diz respeito a uni processo pars & preparação de guelantes po 1 iaminocarbo;-; i 1 ato funcionalizado que •formam complexos co® ioes de metal do tipo das terras raras. Os. complsoos podem ser I içados covalentE.nsnte a uni anticorpo ou frequento cie anticorpo e usados pera fins terapêuticos e/ou diagnósticos„

Estes compostos apresentam a fórmula íIA):

-o em que cada 0 é independentemente hidroaénio ou CCHR“) CO_R; cada R w d · (_ benzilo ou C.-C, alcuilo: cada R*‘ i -,· hidrogénio ou ÍCKE~ independentemente é independentemente é

L- ij _ K ; u a Ρ A hidrogénio, hidrcgénío

RAD ORIGINAL ou C.-C,, alquilo; X s 'X são cada um, irdspeno nio ou podem ser tomados em conjunto com um X formar una ligação adicional carbono-carbono;

número inteiro de O a 10 inclusivé; p é 1 ou.

4 ou. 1; k e k sao seleccionadcs de entre entemente, hidrogée Y adjacentes para π i 0 ou 1; m é un

2; r é 0 ou 1 ; w é 0 hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, semicarbasido , tiosemicarbaaido , maleimido, bromoacetamido e carboxilo; Ré seleccionado de entre o grupo consistindo em 2,-C, alcóxi, -0CH_nC0_nH, hidroxi e hidrooénio; de i r z. u um seu sal farmaceuticamente aceitável.

□ processo para a preparação dos referidos queIantes consiste, por exemplo, na reacção de um composto com a fórmula (IIIA):

BrCH_,C0^,R na presença de um solvente orgânico e de una base, a uma temperatura de desde 0^c'C até refluxo.

> •'0 ORIGINAL ου. LDordenadu' d e c é 1 i.a 1 a

έ sabida que quelantes funcionalizados. res bifuncionais são capazes ds ser ligados covalentemente a um a 11 l i c u r ρ o ten u o e e ρ e c i f i _ ι d a d e em rei a ç ã o a o c a n c r o o u s ρ 11 ο ρ o s tunsorais ou antigénios. Os complexos rad ionuc 1 idos· de=se= uunjugadub antiLui· pu/quelante sãu úteis em aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas como um meio para transportar o radionuclido até um cancro ou célula tumoral. Ver, por exemplo, Meares et. al . , Anal. Biochem. 142 _H 66-78, (1984); e Krejcarek et al., Biochsm and Biophys. Res. Comm. 77, 581-535 (1977).

Agentes quelantes de ácido aminocarboxί1ico têm sido conhecidos e estudados desde há muitos anos. Típico dos ácidos aminocarboxί1icos sao ácido nitrilotriacético (NTA), ácido eti 1 ened iaminetetraacético (EDTA), ácido hidra;·: ie ti 1 eti 1 enediaminetriacético (HEDTA), ácido dietilenetriaminepentaacético (DTPA), ácido tra.ns-1,2-diaminocic lohexanetetraacético (CDTA) e ácido

1,4,7,10-tetraazaciclododecanetetraacético (DOTA). Foram propostos e preparados numerosos agentes quelantes bifuncionais tendo :omo base ácidos ami noca.r box ί 1 icos. Foram referidos por exemplo o dianidrido cíclico

DTPA EHnatowich et.. al.

613-615, (1983); Patente dos E.U.A. No. 4.479.9301 _e anidridos carboxicarbonicos de DTPA misturados [Gansow, Patentes dos E.U.A. Nos 4.454.106 e 4.472.509; Krejcarek et al., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-535, (1977)1. Quando os anidridos são ligados a proteínas a ligação realiza-se por meio da formação de uma ligação que desse modo deixa quatro dos cinco grupos originais carboximeti1icos na. cadeia principal dieti lenetria.mina. (DETA) EHnatowich et al . Int. J. Appl. Isot. 33, 327-332 (1982)1. Além disso, as Patentes dos E.U.A. Nos 4.432.907 e 4.352.751 apresentam agentes quelantes bifuncionais para ligar iSes metálicos; a espécies orgânicas tais como moléculas ou anticorpos alvos orgânicos. Tal como anteriormente, a. ligação é obtida por meio de um grupo a.mida através da utilização de dianidridos de ácido

incluem dianidridos de tico e ácido fenileno ente dos E.U.A. No. formados a partir do u t i 1 i z a ção e m v á r i a s diaminotetraacético. Exemplos de anidridos EDTA, CDTA, ácido propilenediaminetetraacé 1,2-diaminetetraacético. Uma Patente rec 4,,647.447 apresenta vários sais complexos anião de um ácido de complsxação paira.

técnicas diagnósticas. έ indicada a conjugação por meio de um grupo carboxilo do ácido de comp 1 exa.ção o qual proporciona uma u.η i ão a t r a vés de uma ligação am i d a.

No J. of Radioana1ytica1 Cbemistry 57(12), 553-564 (1930), F'aik e col. apresentam a utilização de brometo de p-nitrobenzilo numa reacção com uma dietilenetriamina bloqueada, isto é bis-(Σ’-f ta 1 imidoet i 1 ) ami na seguida por processos de desbloqueamento e carboximeti1 ação usando ácido cloroacético, para dar origem a ácido N -p-nitrobenzildietilenetriamina N,N„N,N-tetraacético. De novo, como a ligação é feita através de um azoto, é obtido um derivado de ácido tetraacético» é discutida a conjugação do agente quelante bifuncional e quelação com indio. A substituição no átomo de azoto é também indicada, por Eckelman, et al. no J. of Pharm. Sei. 64(4 ) , 704—706 (1975) fazendo reagir aminas tais como etilenediamina ou dietilenetriamina com o brometo de alquilo apropriado antes da carboximetilação. Os compostos são propostos como potenciais agentes de formação de imagem radiofarmacãuticos„ é também bem documentado na bibliografia uma outra, classe de agentes quelantes bifunoíenais baseados na funcionalidade do ácido aminocarboxί1ico. Assim, Dundberg, Meares, e col. no J,. of Ned , Chem. 17(12), 1304 (1974), apresentam análogos de EDTA bifu.ncionais. Representativos destes compostos são o ácido i-(ρ-aminofenil)-etilenediamiretetraacético e o ácido l-(p-benze— ne-diazonium)-etilenediaminetetraacético. έ discutido o acoplamento a proteínas através do substituinte-para. e a ligação dos

iões de metei radioactivo ao grupa quelante. Os compostos são também apresentados em Biochemical and Biophvsical Research Communications 75(1), 149 (1977), e nas Patentes das E.U.A. Nos 3.994.966 e 4.043.998. é importante notar que a ligação do qrupo aromático à estrutura EDTA é feita, através de um carbono da espinha dorsal da. etilenediamina. São apresentados na Patente dos E.U.A No. 4.622.420 agentes quelantes bifuncionais activos baseados em EDTA, HEDTA e DTPA. Nestes compostos um grupo alquileno liga o grupo aromático (que contem a funcionalidade necessária para ligação á proteína) ao carbono oa poliamina que contem a funcionalidade quelante. Outras referências a tais compostos incluem Brechbiel et al . , Inorq. C-hem. 25, 2772-2781 (1886), Patente dos E.U.A. No. 4.647.447 e Publicação de Patente Internacional No. W0 86/06384.

Mais recentemente, certos agentes quelantes bifuncionaís macrocíc1icos e a cobre para aplicações d tados na Patente dos Inorq. Chem 26 , 34 58ácido aminocarboxílico é feita através de um utilização dos seus conjugados quelatos de iaqnósticas du terapêuticas foram apresen4.678.667 e por Moi et a.].., f uriciDnal idade ao resto da molécula quelante bifuncional carbono do anel da espinha dorsal de

E.U.A. No.

3463 (1987). A ligação da poliamina cíclica. Assim, um agente de ligação, ligado numa das suas extremidades a um anel de carbono da poliamina cíclica, está também ligado na su.a outra extremidade a um grupo funcional capaz de reagir com a proteína.

Uma outra também digna de menç qu.e 1 an te , isto é o ligada através de um do a metade capaz de M i k o 1 a et a 1 . η o no classe de agentes quelantes bifuncionais, ão, consiste em compostos em que a metade ácido aminocarboxilico, da molécula, está azoto ao grupo funcional da molécula contenreagir com a proteína. Como um exemplo, requerimento da patente (Publicação

Α —

Internacional Número WO 8 vCs) apre reacção de com ácida rupo nitro .cado em sentam u.m agente quelante bifuncional preparado por brometo de p—nitrobenzi lo com DETA seguindo-se reacção bromoacético para formar o ácido aminocarboxílico. 0 q é reduzido para dar origem ao correspondente grupo amina sendo então convertido no grupo isotiocianato por reacção com tiofosgénio, Estes compostos são agentes quelantes bifuncionais capazes de quelação de lantanidas que podem ser conjugadas com moléculas bioorgãnicas para, utilização como agentes diagnósticos. Como a ligação da porção que liqa da molécula é feita através de um dos azotos do ácido arainocar bo>; ί 1 ico, en tão um potencial grupo aminocarboxilo é perdido para quelação. Assim, é preparada um quelante bifuncional à base de DETA contendo quatro (não cinco) grupos ácidos. Neste aspecto, esta classe de quelante bifuncional é semelhante aqueles em que a ligação à proteína é feita através de um grupo amida com subsequente perda de um grupo quelante carbo >: i lo.

Recentemente Carney, Roqers, e Johnson apresentaram (3rd. International Conference on Monoclonal Antibodies For Câncer; San Dieqo, Califórnia -- 2/4-6/88) resumos intitulados Absence of Intrinsical ly Hiqher Tissue Uptake from Indium-111

L.abeled Antibodies: Co— administration of Indiu.m—111 and Iodine— -125 Labeled B72.3 in a Nude Mouse Model and Influence of Chelator Denticity on the Biodistribution of Indium-111 Labeled B72.3 Immunoconjugates in Nude Mice. é apresentada, a biodistribuição do indium-111 complexado com um aqente quelante bifuncional EDTA e DTF'A. A ligação do anel aromático às metades EDTA/DTF‘A é feita através de u.m acetato de metileno. Também num meetinq (reunião) recente D.K. Jonhson et al CFlorida Conf. on Chem. in Biotechnology, April 26-28 (1RSS), F'alm Coast, FL3 apresentaram derivados bifuncionais de EDTA e de DTPA onde uma. metade p—iso— tiocianatobenzilo é ligada no carbono do metileno de um dos

carboxiatetilos. Préviamente Hunt et al. nas Patentes dos Ncs 4.068,747 e 4.061.068 (1673) apresentaram agentes tes à base de ácido etilenediaminediacético ÍEDDA) em que a o de um anel aromático à metade EDDA é feita através de eno ou de acetato de metileno. Pensa-se que os compostos úteis como quelatos para o estudo da. função hepatobi 1 iar. 0 grupos E . U , A . que 1 an 1 i g a. ç ã a1qui1 se j am metal preferido é technetium-96m. Pensa-se que indium-111 e indium— 113m sejam radionuclidos úteis para a. produção de imagens.

Consequentemente, será. vantajoso proporcionar um complexo que não se dissocie rápidamente, que apresente uma. clearance corporal total excepto para o tecido desejado, e que se conjugue com um anticorpo para, produzir os resultados desejados.

Nos desenhos que acompanham a presente descrição, as figuras podem ser descritas como se segue:

As Figuras 1-7 e 15-21 indicam a biodistribuição de ^_'Sm quando administrado como um conjugado contendo '''Sm do presente invento. 0 anticorpo, CC. -IqG, foi usado no coniu.qadc 4 8 ' do presente invento. A biodestribuição foi determinada em ratinhos rapados com tumor LS 174-T.

As Figuras 8-14 e 22-28 indicam a biodistribuição de

115*^ ”'Sm quando administrado como um conjugado contendo ^JJSm do presente invento. 0 conjugado do presente invento usou CC^-Fía.b como o fragmento de anticorpo. A biodistribuição foi determinada, em ratinhos rapados com tumor LS 174—T.

As Figuras 26-34 indicam a biodistribuição de ^^z^Lu. como um conjugado contendo * ^z^Lu. (PA-DOTMA) ou ^^zLu (PA-DOTA). 0 conjugado usou CC^Q-IgS como o anticorpo. A biodistribuição foi determinada em ratinhos rapados (Blab/C) com tumor LS 174-T.

Surpreendentemente, os complexos e/ou conjugados do invento são relativamente estáveis (isto é não se dissociam fácilmente) e alguns apresentam unia clearance rápida na total ida— nm & ossos,

D invento inclui o plano e a síntese de novos quelantes bifuncionais, contendo cada um deles uma funcionalidade quelante, e um grupo quimicamente reactivo para ligação covalente a biomoléculas. Fazem também parte do invento métodos para, a preparação de vários complexos coordenadores bifuncionais (BFO-metale para a ligação dos complexos ao anticorpo a fim de preparar o anticorpo e/ou fragmentos marcados com radionuo 1 ido (tal como samariuin-153, lutetium-177 e yttrium-90> apropriados para aplicações diagnóstica as e/ou terapêuticas □ presente invento é dirigido a novos agentes quelantes bifuncionais que formam complexos com iões metálicos, especialmente .iões metálicos radioactivos com características químicas do tipo metal terroso raro. Os iões metálicos do tipo terroso raro incluem La, Ce, Pr, Nd, Fm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Fío, Er, Tm, u J i õe 166 sendo sspecialmente preferidos Sm, Ho, Y e Lu. Os

I 53.

metálicos do tipo terras raras radioactivos incluem bm,

47,-, 142· bc , e Pr,

177,

Ha. ^TOV

14? 15?

r ίΤι, bd ,

14C. 177

La, V b, ;endo especialmente preferidos _10,

166., 90,.

Ho, / e

Lu. Outros iões metálicos radioactivos que podem ter interesse sãc

47,

9'9m ¹⁸~Re, lBS_Re? F7_Rli? 105_Rhj 109 --⁷0a, ⁶⁸GA, ¹¹¹ In, ^íl3mIn, complexos. assim formados

Pd, ^115mIn, podem

197_Px 67 _r r l , bu,

117m._; cova. 1 en temen te ) a um

198

Tc ,

199«

Hl.t , bn, e ---Pb reunidos

12p_h/212p;

Os (1iqados dcorpo ou. seu fragmento' e usados para fins terapêuticos e/ou diagnósticos. Os complexos podem ser formulados para utilização in vivo ou utilização preferida dos conjugados formulados cancro em animais, especialmente humanos.

e/ou conjugados in vitro. Uma é o tratamento de

conjugados deste invento que contêm um metal radioactivo para diagnóstico e/ou tratamento de estados patológicos tais como cancro» Essas utilizações são conhecidas para metais não radioactivos usando frequência de radio para induzir h.ipertermia. (Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 61.158.931) e terapêutica imunoguiada por fluorescência (FIG3) CK. Petterson et a21». Clinicai Chemistry 2?

(1), 60-64 (19S3) e C. meares et al., ficc. Chem. Res. 17, 202-209 (1984)1.

Mais específicamente, o presente invento é dirigido a um composto com a fórmula:

em que:

cada 0 é independentemente hidrogénio ou (CHR'-) CCLR;

Ρ 2 '

Q¹ é hidroqénio ou (CHR⁵) C0„R;

W u '

C3.Q·?. Η ΙΠΟΟΟΟη ΟΟΠΏΟίΤ ί 1 G LÁ ί 1 Ο ' : ΟΠ'ί & C Of; d ί Ç ·=!O d O DS 1 Ο ΠΥ&Π os c

LtóUd JuUUtípc-iiUt

X e Y s2ío cada um deles independentemente hidrogénio tOuOiTi seu u o íTi -3t d o s com urn X s ϊ í.d j acen tss poro 'termo r li o o. licai ordono—oarbono adicional;

n é 0 ou 1 :n é um núrnero inteiro de 0 a 10 inclusive;

_ -j —. . „ p X X- i ί· 0 ou 1 ;

w = 0 ou 1;

j!?i u coridiçSo de n sar apenas 1 quando X e/ou Y formem um igaçáo carbono-carbono adicional , e a so;na de r a w ser ϋ ou 1 ;

grupo qus ta;’ a 1 iqacuo/eee-ace.men t ente ligado, s substitui um átomo de hidrogénio de um dos át< e carbono ao qual está ligado, sendo o referido grupo que fa: xg·3.·~ao/espaçaroen to represen te. d o pe 1 a tòrrou 1 a __¹'0

BAD OBIG'^nW-j

em que:

s é um numero inteiro de 0 ou 1;

• t é um número inteiro de 0 a 20 inclusivé;

R é uma metade electrofί1ica ou nucleofílica que permite uma união covalente a um anticorpo ou seu -fragmento, ou. um agente de ligação que pode ser ligado a um anticorpo oli seu fragmento, ou seu precursor; e

Cyc representa uma metade alifática cíclica, metade aromática, metade heterocíclica alifética, ou metade heterocíclica aromática, cada uma das metades substituída facultativamente com um ou mais grupos que não interferem com ligação a. um anticorpo ou fragmento de anticorpo;

com a condição de quando s, t, m, ren são Θ, então R^ é diferente de carboxilo;

com a condição de quando s á Θ, então R^ não pode ser —OH; ou.

um seu sal farmaceuticamente aceitável

Caracteristicas preferidas dos compostos com a. fórmula (I) são aquelas eni que: R é hidrogénio; R~^J é H ou. metilo; n é 0; (Ti é 0 a 5; r & 0; e L é um composto com a fórmula:

R³

em que:

'“λ l^:2 é seleccionado de entre o grupo que consiste em hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, carboxilo, bromoacetamido e maleimido;

R* é seleccionado de entre o grupo consistindo em C^-C^ alcoxi, -OCH^.CO^H, hidroxi e hidrogénio;

R è seleccionado de entre d grupo consistindo em hidrogénio., nitro, amino., isotiocianato, semicarbazido, tiosemicartiazido,, carboxilo, bromoacetamido e maleimido;

4 com a condição de R e R não poderem ser ambos hidrogénio mas um

4 de entre R e R deverem ser hidrogénio; ou um seu. sal farmacêuticamente aceitável.

Quando é desejado um conjugado do presente invento R^,J' e 4 o 4

R devem ser diferentes de nitro. Quando R ou R é nitro, então estará presente um precursor da metade de liqaçá.o (L). Esta metade precursora pode ser qualquer metade que seja formada para 2 4

R ou R para a preparação dos compostos com a fórmula (I) e que não s.e liga a um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

presente invento é também dirigido a complexos de iSes metálicos do tipo terroso raros, especialmente complexos de ião metálico do tipo terroso raro radioactivamente neutro ou carregado, e a conjugados formados com os complexos e anticorpo ou fragmentos de anticorpo anteriormente referidos. Além disso o presente invento também inclui formulações tendo os conjugados do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável, especialmente formulações em que o veículo farmacãuticamente aceitável é um líquido. 0 invento também inclui um método para o diagnóstico ou tratamento de um estado patológico, especialmente cancro, num mamífero que compreende a administração a um mamífero de uma quantidade eficaz da formulação.

Tal c o m ο usados, e refere á definição ou. R’, as metades electrof i 1 icas incluem, mas não se limitam a, isotiocianato, bromoacetamida, maleimida, imidoester, tiofta 1imida, éster N-hid roxi succ i nimi 1 ico , dissulfureto de piridilo, e azida fenílica; as metades nucleofílicas apropriadas incluem, mas não se limitam a, carboxilo, amino, hidrazida de acilo, semicarbazida, etiosemicarbazida; agentes de ligação sintéticos incluem quaisquer agentes de ligação sintéticos orgânicos ou inorgânicos que são capazes de ser ligados covalentemente a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo, sendo os agentes de ligação sintéticos preferidos agentes de ligação sintéticos biodegradáveis que são estáveis no soro de um doente mas que têm um potencial para clivagem no interior de um orgão de clearance para o radioisótopo, por exemplo peptidos biodegradáveis ou. grupos contendo peptido. De entre as metades electrofílicas o isotiocianato é preferido e de entre as metades nucleofílicas são preferidos amino, semicarbazida e ticsemicarbazida, έ desejável que a natureza e/ou posição de R¹ sejam tais que não interfiram apreciavelmente com a reacção de quelação.

têm .4 ;tes siqnifiçados:

n<

qus sí 3 f Í 1 i c , de

A expressão X-C-Y na fórmula (I) representa a presença facultativa de uma dupla ou tripla ligação entre átomos de carbono adjacentes. As ligações insaturadas podem estar presentes independentemente ao longo da cadeia, de 0 a ly átomos de carbono inclusivé tal como é defenido pela expressão na fórmula (I).

Tal como é aqui usada, a expressão mamífero significa animais que alimentam os seus filhos com leite segregado pelas glandulas mamárias, de preferência mamíferos de sangue quente, com maior preferência humanos. Anticorpo refere—se a qualquer

anticorpo ou heteroanticorpo policlonal, snonoclonsl, de preferência um anticorpo monoclonal; fragmento de inclui fragmentos Fab e fragmentos F(ab e qualquer q u. i mé r i c o , anticorpo porção de um anticorpo tendo especificidade em relação ao desejado epitopo ou epitopos. Quando se usa a expressão conjugado quelato rnetélico/anticorpo ou conjuqado, a porção anticorpo pretende incluir anticorpos totais e/ou fragmentos de anticorpos, incluindo semisintéticos ou suas variantes, produzidas por engenharia genética.

Tal como é aqui usado, complexo refere-se a um composta do invento, por exemplo fórmula (I), complexado com um ião metálico do tipo terroso raro, especialmente um ião metálico da tipa terrosa rara radioactivo, em que pelo menos um átorna metálica é qu.elado ou sequestrado; conjugado quelato de ião metálico radioactivo/anticorpo ou. conjugado de ião metálica radioactivo refere-se a um conjuqado de ião metálico radioactivo que está, ligada cova 1 en temen te a um anticorpo ou fragmenta de anticorpo; radioactivo quando usado em conjunção com a. palavra ião metálico refere-se a um ou mais isótopos dos elementos do tipo tsrr

133 ISA FCf, m, Ho, Y,

142 ’ “F' r; as e:·;p.ressõe

-raros que emitem partículas e/ou fotSes, tais como

149,

40, ⁷lu, ^17lJYb,

Pm, Gd, La, coordenador bifuncional, agente bi.f uncional e quelante funcional izado são usados com tabilida.de e referem—s-e a compostos que têm uma. metade capaz de fazer a quelação ue um ião metálica e uma metade c 5 e quelante intermuquelante ageri te de 1 igação/agente de espaçamento ligada à metade quelante que é servir como um meio para a. ligação cova lente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Tal como é aqui usado, sal farmacêuticamente aceitável significa, qualquer sal de um composto com a fórmula (I) que ê suficioentemente não-tóxico para ser útil em terapêutica ou

d i ag! i S t i c o mamíferos» H'a5ini, us s-S.is s-SO U. tsl.— ÚS SlíjI do UOiTl este invento. Representativos destes sais, que são formados por reacções padronizadas, a partir de fontes orgânicas e inorgânicas incluem-se, por exemplo, os ácidos sulfúrico, clorídrico, fosfórica, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, palmítico, eólico, palmoico, mucico, glutãmico, d-canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, laurico, estérico, salicílico, metanossulfónico, benzenossulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinâmico e outros ácidos apropriados. São também incluídos sais formados por reacçóes padronizadas a partir de fontes orgânicas e inorgânicas tais como iSes metálicos alcalinos, iSes metálicos terrosos alcalinos.

outros iões semelhantes. Particularmente preferidos são os sais dos compostos com a fórmula (I) em que o sal é de potássio, sódio, amónio, ou suas misturas.

Evidentemente, o ácido livre dos compostos com a fórmula (I) pode ser usado, e também a forma protonada dos compostos, por exemplo quando o carboxilato á protonado e/ou os átomos de azoto isto é quando o sal de HC1 é formado.

Compostos preferidos com a fórmula (I) incluem os compostos em que 0^ é hidrogénio e L é representado pela fórmula A tal como é indicado pela fórmula que se segue:

R3

(ch₂)(II) m

em que: cada Q é independentemente hidrogénio ou CHR^JCO„R:

Cada R independemtemente é hidrogénio, benzilo ou C^-C^ alquilo;

com a condição de pelo menos dois dos D deverem ser diferentes de hidrogénio;

m é um número inteiro de 0 a 5 inclusivé;

R^ é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidroqénio, nitro, amino, isotiocianato, semicarbasido, tiosemicarbazido, carboxilo, bromoacetamido e maleimido;

R'^J é seleccionado de entre o grupo consistindo em C^-C^ alcoxi, -OCH^CO^H, hidroxi e hidrogénio;

l-< é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, carboxilo, bromoacetamido e maleimido;

At

Ί Η Α·. Π

.1. α ;;

ifjboS hidroq

ΒΑΟ ΟΒΙΘ'ΝΜV

FH é seleccionsdo ds entre o grupo que nitro, amino, isotiocianato, semicarbasido, tio carboxilo, bromoacetamido e maleimido;

consiste em ξ e m i c a r b a z i. d o , cada R independentemente é hidroqénio ou C -C„ alqui— 14 lo;

ou

u.m seu sal farmacéuticamente aceitável.

Na fórmula (II) quando R é hidrogénio, os composto' ião representados pela fórmula:

em que :

cada Q é independentemente hidrogénio ou CHR^CO^R;

cada R independentemente é hidrogénio, benzilo ou C,

:om a condição ds ρείο menos dois dos u serem diferente;

hidrogén io;

m é um número inteiro de 0 a 5 inclusivé;

R- é seleccionado de entre o qrupo consistindo em C-C, ι 4 alcóxi, -OCH^CO^H. e hidroxi;

. 4

R è seleccionado ue entre o grupo que consiste em nitro, amino, isotiocianato, semicarba:ido, tiosemicarbasido, carboxilo, bromoacetamido, e maleimido;

cada R- independentemente é hidroqénio ou C^-C^ alquium seu sa.l farmacêuticamente aceitável.

Compostos preferidos adicionais com a fórmula (I) incluem os compostos onde pelo menos um Q é hidroqénio e são representados pela fórmula:

Q (V) em que cada □ é independentemente hidrogénio ou CHR’^-C'O,_,R;

f ’ cr

Q é hidrogénio ou (CHR^) C0„R;

w 2 cada R independentemente è hidrogénio, benzi lo ou C.-C alquilo; oom a condição de pelo menos dois da soma de 0 e Π derem ser diferentes de hidroqénio e um dos Q ser hidrogénio;

m é u.m número inteiro de 0 a 5 inclusivé;

w é 0 ou 1

R'^- é seleccionado de entre o grupo que consiste em hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, carboxilo, maleimido e bromoacetamido;

é seleccionado de entre o grupo con is ti rido em C^-C^ alcoxi, -OCH^LB_,H, hidroxi e hidrogénio;

R s seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, somosí-bsoido, tiosemicarbazido, carboxilo, maleimido e broeioaceiamido;

oada E' indeoenden temen te é hidrooénic ou C ,-C , alooi.· I u lo;

luís a uoudição de R e R ' não poderem ser ambos hidroqénio mas um ~ ? 4 de entre R e R dever ser hidroqenio; ou um ssu sai farmacautioamente aceitável.

Uutros compostos oreferidos com ,1 •érmultf 1 ) incluem ompostos onde B* é CU_OK (w=oi e são representodos cela fórmula:

(VI) e <tí q li e :

cada. G é independantefnente hidrcçánio

C Li

CKR^CG^R;

badobiginMca.d-s li lueDSi ií

benc i 1i com a condição de peio menos um 0 dever ser diferente de hidroqé— η ia;

m é um número inteiro de 0 a. 5 inclusivé;

FU é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, samicarbazido, tiosemicarbazido, carboxilo, ma.leimido e bromoaceta.mido j

FU é seleccionado de entre o grupo consistindo em C -C^ alcóxi, -OCH^CO^H, hidroxi e hidrogénio;

. 4

R é seleccionado de entre o grupo consistindo em hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, ssmicarbazido, tiosemicarbazido, carboxilo, maleimido e bromoacatamido;

cr cada FU indepsndentemente é hidrogénio ou C^-C^ alquilo ;

l_ l_l

U E* a condição de R e entre FU e dever «fjR n'áo poderem ser hidrogénio;

er ambo ou hidrogénio ma

UlTi um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Alguns compostos preferidos com a fórmula a. 4 àqueles am que FU e R são ambos hidrogénio, sendo os representados pela fórmula;

(VI) são compostos

(VII) em que:

cada 0 é independentemente hidrogénio ou

CHR⁵C0_oR;

a 1 qui1 o;

cada R independentemente é hidrogénio.

benzilo ou. C -C^ com a condição de pelo menos um 0 ser diferente de hidrogénio;

m é um número inteiro de 0 a 5 inclu

R é seleccionado de entre o grupo consistindo em nitra, amino, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, carboxilo, bromoacetamido e maleimido;

cada independentemente é hidrogénio oú C —C,

4 alquilo;

ou.

um seu sal farmacêiiticamente aceitáve

Outros compostos preferidos com a fórmula (VI) são aqueles em que F;' é hidroqénio e são representados pela fórmula:

(VIII) em que:

cr cada 0 é independentemente hidrogénio ou CHR~CO^R;

cadsi R independentemente é hidrogénio, benzilo ou C^-C^ alquilo;

com a condição de pelo menos um Q ser diferente de hidrogénio;

m é um número inteiro de 0 a 5 inxclusivé;

R é seleccionado de entre o grupo consistindo em C^-C^ alcoxi, -OCH^COH, e hidroxi;

I-< é seleccionado de entre o grupo consistindo em nitro, amino, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, carboxilo, maleimido e bromoacetamido;

η i. ο ou C -C , a 1 qu i 1 *+ ου.

um seu sal farmacêuticamente aceitável,

Os agentes quelantes bifuncionais aqu.i descritos Crepresentados por qualquer uma. das fórmulas (I)- (VIII13 podem ser usados para a quelação ou sequestro dos iSes metálicos da tipo terroso raro, de modo a formarem quelatos de ião metálico (também aqui mencionados como complexos). Os complexos, devido à. presença da metade funcionalizante [representada por R* na fórmula (I)D, podem ser ligados a suportes funcionalizados, tais como suportes poliméricos funcionalizados, ou de preferência, quando um complexo com a fórmula (I) onde L representa, a. fórmula (A) e R e R devem ser diferentes de nitro, podem ser ligados covalentemente a proteínas ou mais específicamente a anticorpos ou fragmentos de anticorpos. Assim os complexos aqui descritos (representados por qualquer uma das fórmulas I—VIII comp1exadas com ioes metálicos do tipo terroso raros, particularmente iSes metálicos do tipo terroso raros radioactivos) podem ser ligados covalentemente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo e são aqui referidos como conjugados.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos que podem ser usados nos conjugados aqui descritos podem ser preparados por técnicas bem conhecidas nesta técnica. Anticorpos monoclonais altamente específicos podem ser produzidos por técnicas de hibridização bem conhecidas nesta técnica, ver por exemplo, Kohler and Nilstein CMature 256, 495-497 (1975); e Eu.r. J , Imrounol . 6, 511-519 (1976)1. Esses anticorpcs tãm normalmente uma reactividade altamente específica. Nos conjugados de iSes metálicos radioactivos, podem ser usados anticorpos dirigidos contra qualquer antigénio ou hapteno. De preferência os anticorpos que são usados nos conjugados de ião metálico radioactivo são anticorpos fflon oc 1 ona i s , ou seus fragmentos tendo uma elevada. especificidade em relação a um (uns) epitopoís) desejado(s). Os anticorpos usados no presente invento podem ser dirigidos contra, por x e m ρ 1 o , tumores, o a u t c r i a. s, T u. 11 q l_<

v i ru.!

ϊ a r a s i t a. s , m i c ο ρ I a. s ma, diferenciação ou antigénios de membrana, celular, antigénios.

de superfície patogénica, toxinas.

en s imas ilerqenos, droqas quaisquer moléculas biológicamente activos. Alguns exemplos de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos são CC-íl, CC-46, CC-49, CC-49 Fíab )-_f, CC-S3, CC-83 Fíab e B72.3. CVer D. Colcher et al., Câncer Res, 43, 4597-4603 íAug. 15, 1988) para anticorpos CC-49, CC-83 e 872.3. A linha celular de hibridoma

372.3 está depositada na American Type Culture Collection (ATCC) tendo o número de acesso H'B 8108. Ds vários anticorpos CC são apresentados no requerimento da patente dos Estados Unidos da América No. 7-073.665, registado em 15 de Julho, 1987, que se encontra disponível através de MTIS. Os outros anticorpos monoclonais murinos ligam-se a epitopos de TAG-72, um s.ntigénio associado a tumor.3 Uma lista mais completa ds antigénios pode ser encontrada na Patente dos E.U.A. No. 4.193.983. Os conjugados ds iões metálicos radioactivos do presente invento são particularmente preferidos para o diagnóstico e tratamento de vários cancros.

Os complexos do tipo terroso raro preferidos (lanta.nida ou pseudo—1antanida) do presente invento são representados pela f órmu 1 a.:

CLLnÍBFC)1 ( IX >

como

Er³⁺, como

em que; Ln é um ião metálico terroso raro (lantanida), tal . ·.+

Λ+ ç+

Yb

3+

Sc

Nd e

e La

Lu

3+

Pm' , sm , ou ião tais como

3+

Eu s+

Gd

Tb metálico pseudo-1antanídeo, tal ,,3+

Ho' , Lu o+

3+ iões metálicos especialmente preferidos quelante bifuncional; e C representa um iã carga suficiente para tornar neutra a totalidi m , que são os RFC reprssents um ou grupo de iões com jmp 1 e xo , farmaceuticamente aceitáveis. Se o RFC contiver quatro ou ma:

metades carregadas negatívamente, então C é um catião ou grupo ue _ 2+ ·+ + + +· _ catioes tais como Η , Li , Na , K , Rb , CsK+F, Mg N(C_H_)_⁺ - +

La br !_i

Ba²⁺, NH₄, NÍCH.,)/, ,

E (.C , H_c) _,F'= 3e outras aminas protcnadac •ÍZ* 5-j j' x_ >N(C₄H₉)₄

As ( C, IL. ) . o 5 4

Se o RFC contiver três metades carregadas negativamente, então C não é requerido. Se o RFC contiver duas metades carregadas negativamente, então C é um anião tal como F , Cl , Br , I , CIO. , bF, , H_PO-ZJ. · Í+ Z.

HCQCH_SO, , H_C—C,H—SQύ o o <□ 4 :

PF, , CH_,CD, Ò --¹ *

Os conjugados deste invento, e nalguns casos os complexos deste invento, podem ser utilizados como uma formulação. A formulação compreende um composto com a. fórmula (1) com o anticorpo e/ou ião metálica e um transporatador, excipiente ou veículo para essa finalidade fisiológicamente aceitáveis. Assim, a formulação pode consistir num veiculo fisio1ógicamente aceitável com um complexo (ião metálico + aqente de ligação), conjugado (ião metálica + aqente de ligação ligação mais anticorpo>.Ds métodos çSes são bem conhecidos. A formulação pode apresentar-se sob a forma de uma suspensão, solução injectável ou outra formulação apropriada. Podem ser usados meios de suspensão fisiológicamente aceitáveis,, com ou sem adjuvantes.

+ anticorpo) ou (agente de para preparar estas formulafts formulações do presente inventa apresentam-se sob a forma sólida ou líquida contendo o radionuc1 ido activo complexado com o agente de ligação. Estas formulações podem apresentar-se

sob a forma de estojo de modo a. agente da ligação e metal, comple o o r ρ o e met a 1 ) s e j a m m ;i. s t u r a dos u. t i 1 i ζ ά ç ã o . Q u a n d ο ρ r é - m i s t u r a d a s formulações usualmente requerem que os dois co.mponentes (isto é xo e anticorpo, ou 1ígando/antina altura apropriada antes da ou sob a forma de estojo, as u.m veículo f armaceuticamente 'el

ComposiçHes aceitáveis do presente invento podem apresentar-se sob a forma de ou suspensão ou solução. Na preparação de formulações apropriadas será reconhecido, em qera.l, que a solubilidade do sal na água é maior do que na forma ácida. Na forma em solução o complexo separados) é dissolvido num Esses veículos compreendem um tais como álcool benzílico, (ou quando desejado os componentes veículo fisio1óqicamente aceitável, solvente apropriado, preservativos se necessária, e tampões. Solventes úteis incluem, por exemplo, água,, álcoois aquosos, glicois, e fosfonato ou ésteres carbonato. Essas soluções aquosas não contém mais que? 50 por cento do solvente orgânico em volume.

As suspensões injectáveis são composições do presente invento que requerem um meio de suspensão líquido, com ou sem adjuvantes, como um veículo. 0 meio de suspensão pode ser, por exemplo,, po1ivini1pirro1idona, óleos inertes tais como óleos vegetais ou óleos minerais altamente refinados, ou celulose oarboximetí1ica, Adjuvantes fisiológicamente aceitáveis apropriados, se necessários para manter o complexo em suspensão, podem ser escolhidos de entre agentes de espessamento tais como celulose carboximetí1ica, polivini1pirrolidona, gelatina, e os alginatos, Muitos surfactantes são também úteis como agentes de suspensão, par exempla, lecitina, alqui1fenol, aductos de óxido de polietileno, sulfonatos de naftaleno, sulíonatos de alquilbenze— no, e os ésteres sorbitan de polioxietileno.

tribuem para a hidrofi1icidaactiva do meio de suspensão pen s u e s ΐ. π j e c t a v e i s e m c a. s o s anti—formação de espuma de dos eles agentes de suspensão

Muitas substâncias que con de, densidade, e qualidade tensio líquido podem ajudar a tornar a.s sus individuais, F'or exemplo, agentes silícone, sorbitol e açucares são to ú te is,

Uma quantidade eficaz da formulação é utilizada para terapêutica. A dose variará dependendo da doença, a ser tratada.

Embora diagnósticos in vitro possam ser realizados com as

TormulaçSes deste invento, os diagnósticos in vivo são também contemplados usando formulações deste invento. Os conjugados e formulações deste invento podem também ser usados em cirurgia, guiada por e 1 εmen tos ra.d i oi mun i tá ri í (RIG3>; contudo, outros metais que podem ser usadas para este fim incluem também ^^Tc, ^4n,

13m

In ,

67„ Ó8„ ba e ba.

Outras utilizações de alguns dos quelantes do presente inventa podem incluir formação de imagem por ressonância magnética, por exemplo os complexos com a fórmula I, especialmente complexos com a. fórmula VI, com Gd¹·', ligação a suportes poliméricos para vários fins, por exemplo como agentes diagnósticos, e remoção do metal lantanida ou metal pseudo-1 an tan ida. por meio de extracção selectiva.

D presente invento proporciona quelantes, complexos, e conjugados de anticorpos alguns dos quais são mais estáveis, e/ou apresentam uma biodistribuição melhorada, e/ou têm uma clearance a partir do corpo mais rápida, do que a dos conhecidos nesta técnica. D processo para preparar os quelantes, complexos, e conjugados, de anticorpos deste inventa são também p r d po r c i c>n aci os .

deste

Um acesso razoável e sintético gerai a um quelarite bifunciona 1 , siacrocíclico com doze membros do presente invento tal como é representado pela fórmula (I) envolve a monofuncionalização de um macrociclo com base livre (por exemplo 1,4,7,10-tetraazacic1ododecano) em apenas um dos átomos de azoto com um elemento electrofílico apropriado (por exemplo qualquer éste^ ácido ci—halocarboxí 1 ico substituído apropriadaroenteí . elemento electrofí1ico deve possuir uma metade agente de liga apropriada ou uma metade agente de ligação protegida apropriadamente o que permitiria a ligação covalente do ligando bifuncional a uma proteína, anticorpo ou fragmento de anticorpo.

έ reconhecido neste campo que as técni:

. qui1 ativas para a produção de poliazamacrociclos mono-N-funcionais podem resultar ssn misturas de produtos de dificil separação

Kaden

~..-T ή f

Curr. Chem. 121 , 157-75 (1984)3. Este problema, foi ultrapassar meio da referida utilização de grandes excessos de macrociclos (5-10 equivalentes relativos ao elemento electrof!1i— co) o que favorece a formação do aducto de monoa1qui1ação CN. Studer and T.A. Kaderi, Kelv. Chim. Ac ta 69, 2Θ81-Θ0 (1936); E.

mibu:

et al .

)hem. St mUommun

1153-59 (1936)3

Outras vias para envolvem esquemas longos de tecção CF'. S. F'al lavicini 5139-44 (1937); !Ί. F. Tweed 1 pol iaze.mac roc ic los inono-N-f u.ncionais protecção, funcionalicação e desproe t a 1 . , J. Amer. Chem. Soe. 109, e et al., Eur. F'ub. F'at. Appln, No.

0232-7513. Um relatório recente de uma aminação redutora de ácidos fenil pirúvicos e aminas substituidos foi publicado por Abbott Labs, como um Resumo a partir de um meeting (encontro) recente (D. K. Johnson et al„, Florida Conf. on Chem. in Eiotecchnology, April 26—29 (1938), Palm Coast, FL). Um processo que

prepara poliazamacrociclos mono-N-alquilados usando um elemento electrofílico com entre cerca de um e cinco equivalentes de um macrocicla apropriado num solvente que não vá promover uma transferência protónica é apresentado no Requerimento dos E.U.A. Série No. 28?.163, por W. J. Kruper, registado em 22 de Dezembro, < qop

Vias sintéticas gerais- para os queiatos do presente invento são apresentadas em Synthesis Schemes I-IV aqui referidos a seguir e que envolvem a reacção de um elemento electrofílico apropriado e o poliazamacrociclo a várias estequiometrias, temperaturas e concentrações, num solvente orgânico apropriado. Exemplos de solventes- orgânicos apropriados são quaisquer hidrocarbonetos que suportem solubilidade, tal como acetonitrilo, isopropanol, cloreto de .metileno, tolueno, clorofórmio, n-butanol, tetracloreto de carbono, tetrahidrof urano, 57Í de etanol em clorofórmio, sendo os mais preferidos o clorofórmio, cloreto de metileno, n—butanol, 1.4-dioxano e acetonitrilo. Podem-se utilizar quantidades estequiométricas ou aproximadamente estequioraétricas de macrociclo e de elemento electrofílico podem ser utilizadas e proporcionar □ correspondente produto de mono-N-alquilação num único passo. A tem per aturai da. reacção varia entre cerca de <->°C e mais ou menos a temperatura de refluxo, de preferência entre Θ'Έ e 25'-’C. □ tempo de reaccão até a reacção ficar completa, é cerca de 1 a cerca de 24 horas·.

acesso qeral a ésteres de u-ha1oácidos substituídos é desejável para a viabilidade total dos Esquemas II e IV da Síntese. Uma via apropriada envolve brominação ou clorinação do haleto ácido gerado in situ, por exempla D. N. Karpp et al., 3. Org, Chem, 40, 3420-27 (1975). Esta via permite uma alfa haloge— nação exclusiva dos ácidos alcanoicos que contêm mesmo benzilicos reactivos. Um método geral para haletos grupos ác idos s u b s t i t u i d ο s e η v o 1 v e u e u m icido orqanico com cloreto tionilo ou. cloreto de sulfurilo, por fliTier. Chem. Soo. 70, 3Ó26-27 ( 1944) .

exemplo E. Schwenk et al. híiiijui· os métodos uoiiizam de 'Ir.

o ácido carbo;·;ί 1 ico livre qu.e se encontra frequentemente disponível a partir de fornecedores comerciais.

F'o 1 iazamacrocic los tais como 1 ,4,7,10-tetrsazscic lododecano podem ser preparados por métodos documentados tais como T.J. Atkins et al . , J . Amei- . Chem . Soe . 96 , 2266-70 (1974) e T.J. Richman et al., 01- q . S y n t h e s i s 58 , 86-98 (1978).

A carboximetilação do macrociclo mono-N-funcional pode ser realizada pelo método de Desreux usando derivados do ácido broffioacético e uma base apropriada CJ.F. Desreux, Inorq. Chem. 19, 1319-24 (1980)1.

Todos os materiais de partida requeridos para a preparação de compostos deste invento ou se encontram disponíveis a partir cie fornecedores comerciais ou podem ser produzidos a partir de descrições de referência da bibliografia conhecida.

No Esquema I que se sequ.e, os compostos com a. Fórmula ( T.) são preparados qundo 0^ é hidrogénio. Embora só seja indicado um composto pelos termos indiçados,podem também ser preparadas por este método outras metades semelhantes com a fórmula (I) onde q! é hidroqénio, r = 0 ou 1, n = 0 ou 1, e m = 0 até 10.

Esquema I

cooch₃

( I ) urn por ,-,1

L··’

No Esquema II que se segue, os compostos são preparados sendo Cl¹ hidroqénio. Embora só composto pelos termos indicados, podem também este método outras metades semelhantes com a f cuiii a sej a er p rrnu 1 a f ó r mu 1 a i π d i c a d o eparadas (I) onde é hidrogénio, r - 0 ou 1, n - 0 ou 1 e m - 0 até 10.

Esquema II

No Esqu tos c o m a f ó rmu1e u iTi c o m p o s t o p e 1 o ·= ρ o r e s t e m é t o d o , onde 0¹ é CO^E, i .Sffla III que se segue, são preparados os c (I) onde CjI é CO_,R. Embora seja apenas in· . termos indicados, podem também ser prep. outras metades semelhantes com a fórmul· ncluindo m=0 até 10, n=0 ou 1 e r = O.

omposei içado aradas 3 ( I '!

Esquema III

BrCH₂CO2CH3,

K₂co_3f ch₃cn,

25°C, 17 Hrs

COOCHL„J

COOCHCOOCH-

r

N N COOCHCOOCH-

No Esquema IV que se segue, são preparados os compostos

com a fórmula (I) onde LI* á <UHR^U) UU-,Κ. Embora apenas um composw 2 prepa.fórmuia to seja indicado pelos termos indicados, podem também ser radas por este método outras metades semelhantes com a \ I ) onde Q é (LHR ) CO._,R,, incluindo m⁼q a lo, n⁼u ou 1 e w

No Esquema IV, o reagente apresentado

- +- or-. -I r iod e ser qualquer grupo separável para um «-ácido, i.e, A' ó fenilo ou rc .

A utilização de um agente opticaments activo tem minimizado os diastereomeros e simolifica a síntes um único diastereomero o qual daria origem a único complexo de lantanida fácilmente purificado seria desejável para a radioquelação assim como para conjugação com antibiótico.

um

Esquema IV

COOH

No Esquema V qus se seque, são preparados os- compostos com a. fórmula (I> onde é hidroqénio ou (CHR^D > CO„R e R* é w 2 hidrogénio. Embora só sejam indicados dois compostos pelos termos indicados, podem também ser preparadas por este método outras metades semelhantes com a fórmula (I) onde é hidrogénio ou (CHR^J) CO_,R, Lí é hidrogénio ou (uHR^') CO^R, r = 0 ou 1, n W u p 2 '

1, W = 0 ou 1, m = 0 a 10, ρ = 1 ou 2, L representa fórmula fi 'J ou em que R é definida como anteriormente, R'

R são seleccionados a partir do grupo consistindo em hidrogénio, amino, nitro, isotiocianato, semicarbazido, ticsemicarbazido, maleimido, bromoacetam i d o e car b o :< i 1 o .

Η

CH2COOH CH2C00H

na rmul

Λ r~t lil 'R' prenarsda pior métodos conhecidos nesta técnica bém d o s

pÍJvJ	m ssr	encontrados em A	— r ' ! ~ 1 ’1 Γι ° x Z ·'	272-299		19S4>. Um
proc	esso	que	pode preparar	c onipostos c om a o 4	fórmu1 a	( I	) onde R~
púd Θ	se r	uma	metade isotzo	ciâiiatu (R uu. R ρ	ressntss	•zr.	ct ΰ x —· G u .1O

cianato quando L 0 fórmula A) envolve a reacção do quelato amino ·—Ί ri (R^ ou R igual a amino, presente quando L - fórmula A) com tiofosgénio e apresentado no Requerimento dos E.U.A, da Série No. 289.172, por td. J. Fazio, et al., registado em 23 de Dezembro,

1.933.

Os radionuclidos podem ser produzidos de várias maneiras. Num reactor nuclear um nuclido é bombardeado com neutrSes a fim de se obter um radionuclido, por exemplo

Sm-152 + neutrão -> Sm-153 + gama

Um outro método para obter radionuclidos consiste em bombardear nuclidos com partículas num acelerador linear ou num ciclotrão. Ainda um outro método consiste em isolar o radionuc1i~ do a partir de uma mistura de produtos de cisão. □ método para a obtenção de nuclidos utilizado no presente invento não é assim de importância crítica.

Os conjugados do presente invento podem ser preparados formando primeiro o complexo e em seguida ligando o anticorpo ou fragmento de anticorpo. Assim o processo envolve a preparação ou obtenção do ligando, formando o complexo com o metal e adicionando então o anticorpo, Alternativamente, um processo para produzir conjugados de anticorpo marcados pode envolver primeiro a conjugação do BFC ao anticorpo e a sua subsequente quelação a fim de proporcionar o Ab marcado com radionuc1ido-BFc. Qualquer processo aoropriado que resulte na formação dos conjuqados deste invento situa-se na âmbito deste inventa.

Nos exemplos que se sequem, foram usados os termos e condições que se seguem, a não ser que seja especificado de um modo diferente.

tro

-f •oram ooti .1 .ι n u sspectromesa TSU Finniqan (modo Q MS) ou num sspectrometro de massa de elevada resolução VG 2AB—ME (bombardeamento atómico

... .í _ 4 ,_j ___ : apIOO l.tJiii non, usando ditiotreitolϊdit

Os espectros e ^'C de RMN foram obtidos usando um espectrometro Varian VXR-300, Bruker AF'C 300, IBM/Bruker NR-B0 ou r, Jeol FX4CÔ.

idos os espectros foram obtidos 1, οΰ'-’Ο a não que indicado de um modo diferente. A RMN ^tH foi realizada a

MHz, 30 MHz ou 400 MHz, respectivamente no ser

300 ou IDO uf-t;

equioamento atrás indicado. Os valore;

ispec ti vamen te

no	que se	refere
-c	foi reali	zada a
η o	que se	Γ 5 ΐ Ξ' E‘
a a	RMN sãci	£ VG

ao

SUS / 4_ .ç _y---_r ... A. Λ Λ · ·» ____\ .

'» L-x' L r -tiTltd U X 1 ~· 1 i ct. KJ / tJU.

LiariDD υ.

_ ·-!, __ .· 1 _____ 4_ _ _ __ CT _ , , 1 .£ · _ __.

* .cl -· i i^pteP, Lc'.nIJ~₁J“pUÍ i OU .l· □ o1v ente v e r su s sal de sódio).

Os espectros infravermelhos (IV) foram registado instrumento 5SX FT/IF; de Nicolet.

π um

Para os processos de cromatografia, & maior parte dos solventes eram materiais para OLEP de Fisher. 0 acetato de amónio foi adquirido a Aldrich. A água foi purificada usando um sistema de filtração de água Barnstead NANOpure

TM

A cromatografia

preparativa des compostos orqãnicos foi realizada ou. por cr orna tografia de gravidade normal usando técnicas padronizadas ou. por cromatografia luminosa tal como foi descrito por C.W. St.i.11 et al . J. Qrq. Chem. 43, 2923—24 (1978), Foram usados os sistemas solventes que se sequem:

'i ΙΖΛ !·> Τ· Ο·:

?HC1 ,;CH__rOHí-onc . NH₄CH : u.; .ι

'., t . ι ι . y

CHC!___r:£H,3H:conc. WH^DH

V : V : V

CHCl,:CH,QH;conc. WH,QH /· s ó: 4:1

V: V: V

CHCl^sCH^OHsconc- MH^OH 4 : 2 ; 1

V; V: V

CHC1-, sOuQHs conc. NH„3H . i. i .

2HC1 -,; CH-, OH s o ar . T - 1

V ; V ; V solução salina (d

MH - OH

WaCl sm água destilada) :conc. ΝΗ,_χΟΗ 4: 1

t. d « V

CHC1-,: CH-rOH : conc . NH„OH <

: 4 : 1 so1ventes

Os valores são referidos usando estes ξ que se encontram comercia, lmente disponíveis que se sistemas f a.se li ca CíjHLF normal, placas de cromatofrafia de placa delgada de sí

250 microns, finaltech Inc. ou Merck Kiesel qel 6OF_,_„3. A croma2o4 tografia de coluna preparativa foi realizada usando grau Merck: 60, qel de sílica de 60 angstroms.

Todas as percentagens são indicadas em peso a não ser que indicado difersntemente.

Alguns sólidos, foram secos usando um evaporador rotativo (Buchi 461) e/ou um forno de vácuo a uma temperatura de cerca de 55--60*C durante várias horas. Além disso foi usado para a remoção do solvente um secador por congelação automático 10-010 TN modelo Virtis ou um concentrador Speed Vac

Samarium-153 e lutetium-177 foram produzidos pelo Research Reactor, University of Missouri (Columbia, M0). Yttrium—90 foi comprado a Oakí Ridge National Laboratory.

Acido 1-(4-isotiocianatobenzi1 ) dietiler.etriaminepentaacético (SMC-Bs-DTPA) foi preparado por meio de uma modificação do processo de M. W. Brechbiel, et al., Inorq .___Chem 25, 2772J o 11 a, CA) ; Scienti fic ; de amónio, em CLE.F' de permuta aniónica (B-Sepharose') . Alquns dos produtos químicos usados foram obtidos a partir de fontes indicadas: ácido Ν-2-hidroxieti 1 piperazina-M -2-etanessu.l fónico (HEPES), ácido livre e sal de sódio foram comprados a Behring Diagnostics (La citrato de sódio (certificado) foi comprado a Fisher tiofosqénio foi comprado a Aldrich Chemicals; acetato acetato de sódio, ácido etilenediaminetetraacético (EDTA) e solu.çao salina tampnada com fosfato (F'BS) foram comprados a Sigma Diagnostics.

As colunas cie CLEF' usadas foram; Hand-packed 0—SepharoTM /Pharmacia) ou com 1,5 cm ;< 25 cm

TM

Instrument

Vydac

TM (trademark the Separ m 2,5 c m c m ) d e i on e G cm; e Du Pont up, Hesperia, CA) proteína C-4 (Hesperia, CA); e Mono-Q (4,6

TM mm x 2t e SF' — Sephade:

cm) d t TM tí e p a r a t i. o n G r o u p (Nome ds

Marca de

Pharmacia Biotecchnology Products) de Pharmacia. Sep-Pak

TM!

(Nome de Marca de Waters carga C-ltí foi comprado a Waters

Associates (Milford, MA), colunas descartáveis de Sephade;·;

TM (2,2 ml) de Isola·

TM

Inc. (Akron, OH), e Centricon -30 (Nome de

Marca de Amicon Division, W, R. Grace & Co., Danvers, MA) microconcentradores de Amicon.

Foram usados cinco sistemas de CLEF' para análise e separações de amostras:

D Sistema I consistiu em bomba LKB 2150, e controlador 2152, um detector de UV- LKB 2233 UV Cord, um Monitor de Radioactivida.de de CLEF' Berthold LB 506 A (do International Berthold Group) e um colector de Gilson Fraction 201-202 (Gilson International, Micldleton, WI ) ;

Sistema II foi equipado com um auto-verificador de amostras, WISP 710 B, duas bombas (modelo 510) e um controlador de gradiente automático (de Waters Associates), um detector espectrofotoroétrico de Rerkin—Elmer LC-75, um Detector de Radioisótopo Beckman modelo 170, e um colector de fracção (Frac-100 de Pharmacia);

Sistema III consistiu em duas bombas Waters M-óOOOA com um Programador de solvente Waters 660, um Detector de Comprimento de Onda Variável Waters Modelo 481, e um Módulo de Dados

Waters, sendo também usado preparativamente um colector de F rac oa.o ISCO;

óis tema

IV consistiu em Sistems Dione;

BioLC

TM um detector UV do comprimento da onda variável

Sistema V consistiu em Bomba Wa.ters Modelo 590 cora um programador de gradiente ISCO Modelo 2360 a um detector de comprimento de onda variável Dionex.

Para centrifugação e concentração, foi usado um Sorvai 1 RT 6000B (centrífuga refrigerada de Du Pont). Feri utilizado um concentrador Speed Vac (Savant Instruments Inc., Hicksville, N.Y.) para remoção de solventes voláteis. As medições de ra.dioa.c-tividade foram

Tisadas num ilibrador de Radioisotopo iapintec

TM (Marca Regi;

Capintec Inc.) CRC-1.2, ou por cintilação líquida em Beckman LS 930© (Beckman Instruments, Inc., Irvine, CA) ou num analisador com múltiplos canais Canberra 35⁺ tendo uma interface com um cristal pol.(7,6 cm) arrastado com tálio.

fonte de iodeto de sódio de

Mos exemplas que se referem à formação de complexo, a determinação de percentagem de complexo foi realizada pelo método geral que se segue quando indicado.

Numa, coluna de plástico de 10 ml ml de resina C-25 Sepha.dex-SP™ ^{3 quaI Ύαι} água em excesso foi removida aplicando pres introduziram—se la 2 dilatada em ãgua. A são ao topo da coluna.

A solução do teste (15 '^:'l ) foi adicionada ao topo da resina.

sendo então usados como um eluente 2 ml de solução salina isotóriicazNH^OH conc. 4:1 (V:V). 0 eluente foi recolhido num tubo de contagem. Foram usados 2 ml adicionais de eluente. Após- colheita do eluente para um segundo tubo de contagem, aplicou-se pressão de ar ao topo da resina para a levar até à secura. A resina seca foi transferida para um terceira tubo de contagem. A actividade de cada tubo de contagem foi medida com um contador com fonte de Nal acoplada a um analisador com múltiplos canais Canberra. A quantidade do metal como um complexo foi ciada como a percentagem da actividade total que foi encontrada no eluente. A quantidade de metal no estado livre não complexado foi dado como a percentagem do metal total que permanece na resina.

de Metal por F'!

rmut;

iomc a

Numa coluna de plástico de 10 ml introduziu-se 0,5 ml TM de resina C—25 Sephadex— SP dilatada em água. □ excesso de águ.a foi removido por centrifugação da coluna a 3.000 rpm durante 4 minutos. Um volume de solução do complexo de 200-500 μι 1 foi colocado no topo da resina e o tubo foi de novo centrifugado durante 4 minutos a 3.000 rpm. 0 metal não complexado permaneceu ria coluna e o metal complexado foi eluido com o solvente.

Preparação do Complexo de Yttrium

Foram produzidos complexos preparando uma solução de -4 yttrium 3 1 <_> M em água (YC1 &H_0, 3o3.2í> q/mole; ou Y(0Ac)_», 12,1X H-Ci). A solução de Y' radioactivo (Qakridqe National Laboratories) foi adicionada para dar origem ao nível desejado de radioactivida.de. Foram adicionados dez μΐ de solução de ligando

-f· (a 0,0311) a 990μ1 da solução de Y , dando origem a uma relação de 1 igandosmetal 1:1. Usou—se dez vezes a quantidade de solução de ligando para uma taxa ligando para metal de 10:1. 0 pH foi ajustado para 7,4 usando quantidades de microlitros de HC1 ou de NaOH. A solução foi então testada quanto à quantidade de yttrium complexado usando o método de permuta catiónica atrás referido.

Preç ção de Come? 1 e;·;o de 8amariuni:

Pis

£ H O.

anterior mente descrito pare. os complexos de yttriu.ni exceptuando o . -4

IO 'M por dissolução de .do sob a forma facto de se ter preparado samarium 3 x ' Π f i LJ ~r ' ·—' ‘T O j / de uma. solução cerca de x 10 M em HC1 Θ,ΙΓΙ a partir de University of Missouri Research Reactor, Coluaibia, Missouri.

As definições que se seguem são proporcionadas para alguns termos que são usados ao longo deste texto.

Ulossário:

Cone, significa concentrado;

-□Ac significa a metade acetato.

•UCOCHCPD significa, cromatografia de placa, delgada;

DI Η^,α significa água NANOpiura Água N A N D p u r a. Τ M

T!^v!

desionizada;

è água pura obtida a partir de um c e r c a. d e

TM sistema de filtração de équa. Barnstead NAHOpure ; Temperatura ambiente significa temperatura do local :0 a. cerca de 25*C ;

ou

Durante a. noite significa de cerca. de 9 a cerca de 18

CL significa, cromatograf ia líquida.;

NBS significa N-bromosuccinimida;

ME8 significa, ácido 2-<N—morfol ino>etanessu1 fónico;

CLEP significa cromatograf ia líquida de elevada, perforΓΠ cl Π ·_ €? íj ão salina taaiponada com fosfato de

KC1 2,7 mM e tampão fosfato 10 mM,

Ρ Β tí s i q π i f i c a s o 1 u contendo NaCl 120 mM, pH 7,4;

_ TM

Resina C-25 SP-tíephadex è catiónica tendo funcionalidade de ácido uma re su1fón i n a d e p e r m u t a co, vendida por i-'harma<_ia, I ns_ . ;

rpm = rotações por minuto;

pD significa pH quando o hidrogénio é deuterado;

DOTA = ácido 1,4,7,10-tetraazacicIododecano-1,4,7,10-tetraacético;

HEPES - ácido N—2—hidroxieti1piperazina—N -2—etanessu1f ón ico;

BFC - quelante bifuncional;

Cycleri = 1,4,7,10-tetraazaciclododecano;

PA-DOTA = ácido a-C2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7,lõ-tetraacético;

PA-DOTMA = ácido a-C2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano—1—acético—4,7,10—tris(meti lacético);

BA-DQTA - Ácida a-(4-aminofeni1)-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético;

OMe-BA-DQTA = a- \ 5-amino-2-metoxif eni 1 ) -1,4,7,10-tetraa ξ ac i c 1 od od ec an o-1 ,4,7 ,

1Θ-tetraacético;

EA-D03A = ácido 1-C2—(4—aminofenil)etil3—1,4,7,10—tetra— azaciclododecano-4,7,lõ-triacétíco;

DTPA = ácido dietilenetriaminepentaacético;

SCN-Bz-DTPA = ácido 1-(4-isotiocianatobenzi1)-dietilene triaminepentaacético;

EDTA — ácido etilenediaminetetraacético; quelante é equivalente a ligando; Complexo é equivalente a quelato;

conjugado significa

u.m juelsnte ou complexo ligado

são indicados aqui a seguir, está depositada em American covalentemente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e anticorpos significam CC-49, CC-S3 e B72.3 e os seus fragmentos tais como Fab e F(ab )^.,.Outros anticorpos possíveis A linha celular de hibridoma B72.3 Type Culture Collection, tendo o número de acesso ATCC HB 8103, e a outra com o nome de anticorpos monoclonais murinos ligados a epitopos de TAG-72, um antigénio associada a tumor.

invento serâ ainda clarificado por uma consideraçãc dos exemplos que se seguem, que pretendem ser puramente exemplificativos da utilização do invento.

Preparação de Materiais de Partida

Exemplo A

Preparação de ácido d , l-2-broiTio-4- ( 4-nitrof eni 1 ) butanoico, éster metílico.

A uma solução de 5 ml de tetracloreto de carbono e 15 ml (0,2 mole) de cloreto de tionilo adicionaram-se 10,46 q (0,05 mole) de ácido 4—(4-nitrofeni1)butanoico sob uma atmosfera de azoto. A solução foi levada a refluxo durante 1 hora com libertação inicial de gás ds ácido clorídrico e de gás de dióxido de enxofre. Adic.ionaram-se ã solução quente 11,0 g (0,06 mole) de M-bromosuccinimida em 25 ml de tetracloreto de carbono e três gotas de catalisador ácido bromídrico aquoso a. 48 por cento. A libertação de gás bromo foi notada. A solução vermelho escuro foi submetida a refluxo durante 35 minutos. A solução foi arrefecida e mergulhada em 100 ml de metanol com agitação. A análise por CPD (60:40 acetato de et.i 1 o: hexano v:v) indicou um novo produto (R^ 54

0,69, plauSs de siliua) .0 sul vente em «xlsísso fui removidu pur evaporação rotativa e o óleo vermelho escuro foi filtrado através de uma camada de gel de sílica, flash <1 polegada 5 polegadas) (2,5 cm x 12,5 cm) usando cloreto de metileno como o eluente. A evaporação do solvente deu origem a um óleo transparente, rendimento de 15,43 q, o qual era constituído por uma mistura 85:15 do produto do títu1 o:derivado de éster metilico do ácido butanoico de partida, D produto do título foi caracterizado por:

RMN ^!H (CDC1_T>

8,16(d), 7,38( d), 4,20(DD), 3,79(s), 2,88(m),2,38(m) ; RMN ^l'~’C (CDC1-,, 75 MHz )

169,6, 147,5, 129,3, 123,7, 53,O, 44,4, 35,5, 33,0;

Exemolo Et

Preparação de ácido ct-£2-C 4-ni trof eni 1 )et i 1 3-1,4,7,10— - tetraa.zac ic 1 ododecano-1 -acético , éster 1-metílico.

de ácido (preparado

A uma solução agitada de 1,72 q (10,0 mole) de

1,4,7,10-tetraazaciclododecano em 17 ml de clorofórmio estabilizado em perttena adicionaram-se 2,07 q (5,82 mmole) d,1-2-bromo-4-(4-ni trofen i1)butanoico, éster metílico pelo processo do Exemplo A) durante cinco minutos sob uma. atmosfera de azoto com agitação. A mistura da reacção foi agitada durante 48 horas a cerca de 25°C. CRD (usando Sistema Solvente 2, em placas de gel de sílica Analtech) indicou a formação do produto do título (R^ = 0,73). A solução de clorofórmio amarela foi aplicada a uma coluna de gel de sílica flash com 1 polegada x 16 polegadas (2,5 cm x 40 cm) (pré—eluida _ com clorofórmio metanólico a 5 por cento), eluida com 250 ml de metanólico a 5 por cento, seguindo-se eluição

Solvente 2. As fracções contendo o produto do título puro foram e

c1orofórmio com Sistema evaporadas para, proporcionarem 2,15 q (5,46 mmole, 94 por cento) do do título sob a forma de um produto vítreo amarelo claro. A trituração de uma solução em clorofórmio deste produto vítreo com éter dietilico resultou em precipitação de um pó branco (P.F. =

159-59'-'C. ) de pureza analítica e caracterizado por:

RMN ¹H (CDC1-.) □,14(d), 7,39(d), 3,71(s), 3,39(dd), 2,5-3,0(m),

2,09(m), 2,01(m);

RMN (CDCl-,, 75 MHz)

172,7, 149,3, 149,4, 129,2, 123,ó.

47,2, 45,9, 45,4, 32,9, 30,9.

Exemplo C

Uma mistura de ácido p—nitrofeni1acético (25,0 g, 0,14 mole) e cloreto de· tionilo (15,1 ml, 0,21 mole) em benzeno seco (100 ml) foi agitada, sob refluxo sob uma camada de N durante três horas. A mistura foi então evaporada até á. secura in vacuo. 0 resíduo foi dissolvido em tetracloreto de carbono e agitado sob refluxo sob uma camada, de azoto. Adicionou.-se bromo (7,2 ml, 0,14 mole) em pequenas porçSes durante um período de tempo de três dias à mistura sob refluxo. A mistura da reacção foi. deixada irretecer e cloreto ácido foi arrefecido bruscamente com metanol (50 ml, adicionados lentamente). 0 bromoéster resultante por cento) foi recuperado sob a fohm-a de um óleo amarelo por destilação sob pressão reduzida (P.E. = ló8’^:,C a 1,1 mm ) iravés de uma coluna com seis polegadas de hélices de vidro.

A estrutura, do produto do título foi confirmada, por:

RIMN H (CDC1-.) θ ,, 25 (d) , 7, SI (d) ;ι (s)

Exem pio D

Preparação de ácido o-(4-nitrofeni1)-1,4,7,1O-tetrazaciclododecano-l-a.cético, éster 1-meti lico.

A 529 mg (2,068 mmole) de ácido 2-bromo-2-i4-nitrofeni1)etanoíco, éster metílico (preparado pelo processo do Exemplo C) em 20 ml de acetonitrilo adicionou-se de uma só vez uma solução de 354 mg (2,063 mmole) de 1,4,7,1O-tetraazacic1ododecano Sm 20 ml de acetonitrilo contendo metanol justamente suficiente para efectuar uma solução completa. A resultante solução púrpura foi agitada durante 1,5 horas sendo então concentrada in vacuo a 35'^:'C até um volume pequeno. Esta monoestertetraamina foi purificada pior cromatografia em gel de sílica fazendo-se a eluição com 20 por cento (p/v) de NH .0Ac/CH_0H. A monoestertetraamina assim isolada sob a forma de sal triacetato foi então convertida na amina livre. Assim, 270 mg em 3 ml de água foram tratados a õ-'C com K_OCQ_. aquoso (10 por cento p/p) a um pH de 11. A solução básica foi então extraída com 10 ml de clorofórmio, cinco vezes, a as camadas de clorofórmio foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio e concentradas para dar origem a 160 mg (42 por cento de rendimento) da monoestertetraamina desejada, caracterizada por R!MN e por espectrometria de massa por bombardeamento atómico rápido ( CM-i-H j⁺=3óó ) e por:

RIMN (CDC1_)

B,12(d), 7, ,44 (d), 4,75(s), 3,7ó(s), 2,67-2,44 ( m) ;

RIMN (CDC1

171,5, 147,ó, 144,0, 130,0, 124,0, 67,0, 49,B, 47,9,

46,9, 46,0

Ε X ίζ'ΐΤί j ί ¹ j Ε

Preparação de Ν- (2-metoxi—5—nitroberizi 1 ) — 1 ,4,7,10— tetra a z ac ic 1 od od ec an o .

A uma solução de clorofórmio agitada (20 ml) contendo 2,9 g de 1,4,7,10-tetraazaciclododecano (ló,8 mmole) adicionou-se uma solução de clorofórmio (20 ml) contendo 2,1 g de brometo de

2-metoxi-5-nitrohenzilo (3,5 mmole) numa porção. Após agitação à temperatura ambiente durante três horas a. mistura da reacção foi filtrada e o filtrada foi concentrado (in vacuo) para dar origem a um resíduo que foi cromatoqrafado (sílica. Sistema Solvente 3). O produ.to monoa1qui1ado foi isolado com um rendimento de 79 por cento (P.F. = 154-156*0, e carac teri zado por:

,)

3, 127,92, 125,49, 124,53, 109,91, 55,88, ,45, 45,29.

RMN ^'C (CDCl

162,47, 140,6:

cr t ncr c· ,···, O /i /1-7 1 Γ) λ cr

J-j | q / -J «i 4/ , lu , *t i_J

Exemplo P

Preparação de traazaciclododecano.

A uma solução azaciclododecano (2,3 q

N-(2-hidroxi-5-ηitrobenzi1)-l,4,7,10-te~ de 1,4-dioxano (20 m.l) de 1,4,7,10-tetra14 mmole) adicionou-se uma solução de dioxano (15 ml) de brometo de 2~hidroxi-5-ηitrobenzi1 d (1,2 g, 7 mmole) numa porção com agitação constante. Após vários minutos adicionou-se K^CO, (1 g) e a agitação foi mantida durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura da reacção foi então filtrada e o filtrado foi concentrado in vacuo para. dar origem a um semí-só1 ido amarelo o qual foi cromatografado em gel de sílica (coluna) fazendo—se a eluição com Sistema Solvente 5. 0 produto mono-a1qui1ado desejado foi isolado a partir do último 1/3 do eluents amarelo brilhante o qual também continha amina não reagida. Após concentração, o óleo amarelo foi triturado com laterial de partida amina itão isolado sob uma forma

_ í 100 mi) e	filtrado para, remove
.vel em CHC1T.	0 produto final foi
: como um só,l	ido amarelo (1,2 g
145':'C) e foi	iormert a rar
-f Ό'
Á-'C (D„0>
‘4 , 25,28 , 2	ó , 83 , 31,80 , 36', 54

cento);

(P.F. 111,30, 115,20, 159,99.

Exemclo G

Preparação de 1-C2-(4-n.itrof eni 1 > eti 1 3-1,4,7 , lô-tetraasacic 1 ododeca.no.

A uma de 3,5-C mmole) de i , 4,7,1.0-tetraazacic 1 ododecano em 50 ml de clorofórmio estabiliri Γ:

em penteno foram adicionados got;

iurantí um per í od;

de cinco minutos com agitação vigorosa sob unia atmosfera, de azoto 4,,00 q (17,4 mmole) de 1-(2-bromoeti1>-4-niirchenoeno.

spu	s o que cristais	_J__ ut±
tir	da. solução. A total i-
a.	uma coluna de gel	de
as)	(2,5 cm x 45 cm)	que

A agitação foi mantida. durante cerca. de 13 horas à temperatura ambiente (cerca de 25'^:’C: bromohidreto de amina precipitaram a f dade da mistura da reacção foi aplica sílica, flash (1 polegada :·: 13 poleç tinha sido pré—eluida com 5 por cento de metanol -am clorofórmio; 200 ml desta solução foram aplicados como um eluente, seguindo—se eluição com Sistema Solvente 3. A partir do produto desejado foram separados 1,45 g (9,7 mmole) de p-nitrostireno (R^ = 0,98;

j ado

Sιbtma. Si_) 1 vente foi isolado sob 7,06 mmole, 40,6

1). 0 produto do titulo monofuncional dese forma de um óleo amarelo-alaranjado (2,27 g, por cento) o qual solidificou após repouso (0,73, Sistema Solvente 1).

Uma amostra do produto do título foi recristalizada a partir de CHCl_,/cic lohexano e revelou as carac terísticas qu.e se seguem: P.F. = 146,5-143,5*C;

RMN b-l (CDC1-.)

8,135(d, m), 7,395(d , m), 2,91(t), 2,77(t), 2,72(t), 2,50(t), 2,60(5);

RMN ^1:,C (CDCl^, 75 MHz)

148,5, 146,7, 129,6, 123,4,

45,9, 45,1, 33,7,

Ti Λ t 1

Preparação de 1-(4-nitrobenzi1)~1-4-7-lõ-tetraazaciclododecano.

Em 50 ml de clorofórmio foram adicionados 3,5 g (20,3 mmole) de 1,4,7,10-tetraazacic1ododecano e 1,7 g (7,97 mmole) de brometo de p-nitrobenzi1 o e a mistura foi submetida a refluxo sob azoto durante 24 horas a 25*C. A pasta com clorofórmio do sal bromohidreto foi então aplicada a uma coluna de ' gel de sílica luminosa com 1 polegada x 17 polegadas (Sistema Solvente 3). Obtiveram—se 2,13 g (6,93 mmole) do produto do título sob a forma de um sólido amarela claro com pureza analítica em 88 par cento

de rendimento (R = 0,53, Sistema Solvente e posteriormente caracterizado por:

RMN *H (CDCU)

S,19(d), 7,49(d), 3,69(5), 2,S2(t), 2,70(t), 2,59<m)

RMN *C (CDCl^, 75 MHz )

147,2, 123,4, 123,S.

(Sem Exemplo I; para evitar confu; biológicos posteriores).

com números de exemplos

Exemplo J

Preparação de 1-(4-aminobenzi1)-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano.

Em 10 ml ds metanol foram dissolvidos 690 mg (2,25 mmo 1 e) de 1-(4-n.i troben z i 1 ) --1,4,7,10-tetraazacic 1 ododecano (preparado pelo processo do Exemplo H), Adicionaram-se à solução 350 mg de catalisador paládio sobre carbono a 10 por cento. 0 hidrogénio em excesso foi expurgado através da solução a 25^,:,C. Ao fim de 45 minutos a. CPD indicou que estava preparado o pjroduto do titulo (R = 0,33, Sistema Solvente 3). A purificação cromatográfica do produto do título formado foi conduzida sobre uma coluna de sílica luminosa com 1 polegada x 16 polegadas (Sistema Solvente 3) e proporcionou 480 mg (77 por cento) do produto do título sob a forma de um óleo transparente, amarelo claro.

θ!

D mmole) produto do título sob a forma, de base livre foi convertido no sal clorohidreto fazendo (103 mg, borbulhar cloreto de hidrogénio anidro através de soluções de etanol da

base livre. 0 sal tetrac1crohidreto

-f==i i l do produto do título, após lavagem com etanol frio e secagem ir> vacu.o, foi obtido com um rendimento de 147 mg (0,347 mmole), P.F. = 255—2óÕ'-’C ( dec ) , e foi posteriormente caracterizado por:

H (D_o0, _PD = 1,9)

7,56(d) 3,09<t)

7,47( d), ;S(t), 3,23(t),

T.

RMN C (0.-,0, pD = 75 MHz )

133,3, 134,2, 132,2, 126,0, 58,5, 50,3, 46,7, 44,6, 44,3.

Exemplo K

Preparação de 2-metoxi-5-ηitrobenzi1nitri1 o,

g. 101,6 mmole) em etanol então submetida a refluxo

A uma solução de cianeto de sódio (6 q, 121,9 mmole) em água (5,3 ml) a 7O’’’C adicionou-se em pequenas porções com agitação uma solução quente de brometo de 2-metoxi-5-ηitrobenzi1o (25 (15 ml). A mistura da reacção foi durante 1,5 horas, arrefecida, e filtrada. A massa filtrada foi lavada com acetonitrilo e o filtrado foi evaporado in vacuo para proporcionar 2-metoxi-5-ni~ trobenz i 1 ni tr i 1 o (19,5 q., 100 par cento) sob a. forma de um sólida escuro. 0 produto foi caracterizado por:

RMN 13

C (CDC1_)

161,4, 141,0, 125,7, 124,6, 119,8, 116,5, 110,2, 56,3.

Q Q ιο,α iixempl O L ‘reparação ds ácido 2-metoxi-5-niti

L ,’*·. 4- T

11;. t rado enquan to e ac idi f .ic ad a com

Uma pasta de 2-metoxi~5-nitrohensilinitrilo (19,5 g) (preparada pelo processo do Exemplo K) em HC1 conc. (20 ml) foi submetida a refluxo durante três horas. Após arrefecimento, o produto crú. foi recuperado por filtração e lavado com água. 0 sólido foi vertido para hidróxido de sódio aquoso quente e A solução cor de laranja foi arrefecida precipitado foi filtrado, lavado com água, e seco para proporcionar ácido 2-metoxi-5-nitrofenilacético sob a forma de um sólido branco (15 q, 70 por cento). □ produto foi caracterizado por:

juente. HC1. 0

RMN 'C (CDC1^-CD_OD)

126,2, 124,1, 109,7, 5 imolo M tico,

Preparação de ácido «-bromo-í2-metoxi-5~nitrofeni1)acééster metílico.

UÍTic pasta de ácido

2-metox i

-nitrofeni1acético (2,266 g, 10,74 mmole) (preparada pelo processo do Exemplo L) em benzeno seco (50 ml) adicionou—se cloreto de tionilo (40,0 ml, 54,8 mmole). Um tubo de secagem e condensador foram colocados no frasco e a mistura foi submetida a refluxo durante 2 horas. A solução amarela resultante foi concentrada in vacuo até se obter volume e vertida em tetracloreto de carbono seco.

Adicionou-ss bromo (0,6 ml, 11,6 mmole) e a solução foi submetida.

refluxo durante dois dias com exclusão da humidade

atiTiQuférica. h mistura da reacção fui concentrada até se obter um pequeno volume e adicionou-se metanol (50 ml). Após evaporaçao do metanol em excesso in vacuo o óleo resultante foi purificado cromatográficamente (gel de sílica, cloreto de meti leno:hexano 4:1). 0 produto do título (2,399 g„, 74 por cento) foi obtido sob a forma de um óleo amarelo. 0 produto foi caracterizado por:

RMN ¹H (CDC1..)

S,45(dd), 8,15(cld), ó,95(d), 5,75(s), 3,99(s), 3,7B(s).

Exemplo N

Preparação de A-(2-metoxi-5-nitrofeni1)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano, ácido 1-acético, éster metílico.

Uma solução de α-bromo(2-metoxi-5-ηitrofeni1)—acético (2,399 g, 7,89 mmole) (preparado pelo processo do Exemplo M) em clorofórmio (10 ml) foi adicionada a uma solução agitada de

1,4,7,10-tetraazaciclododecano (2,72 g, 15,79 mmole) em clorofórmio (50 ml). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura turva foi então concentrada até um volume pequeno in vacuo à temperatura ambiente. 0 produto crú foi purificado por cromatografia (gel de sílica. Sistema Solvente 3). □ composto do título foi recuperado sob a forma de um sólido amarelo (2,60 g, 33 por cento) e caracterizado por:

RMN ¹''C (CDC1-.)

170,7, 161,0, 139,9, 125,0, 124,5, 124,2, 110,2,

55,5, 50,5, 48,0, 47,3, 45,6, 44,3, 43,5.

txemr

p r q p & r .3. r 3 o d E á. O í d O te r i so p ro ρ ί1i c o.

d,l-2-bromo-4-(4-nitrofeni1)—buta—

Adicicnou-se ácido 0,10 mole) a uma solução de cloreto de tionilo (30 ml, 0 usando o processo de Harpp et al.,J. Org i— ( 4—ni trof en.i 1 ) bu.tanoico (21 ,0 g

oreto de	carbono	( 1 0	m 1 ) e
sob uma	atmosfer	a de	azoto
, J. Orq.	Unem.		340-27
:o durante	1 hora	com	1iber-
ico e de	dióxido	de en	:·; o f re .
. i n. i m i d a (	CO Ú rí j—j— ,, - Mn	0,12	mole)

sob a forma sendo adicionadas 8 gotas de catalisador ácido bromídrico aquoso a 48/. à solução quente altura em que se verificou a libertação de bromo. A solução vermelho escuro foi submetida a refluxo durante minutos adicionais isopropanol (400 ml) metileno, placas de (R =0,73). 0 so1vente escuro foi filtrado flash (3 polegadas

A solução foi arrefecida e vertida para com agitação. A análise por CF‘D (cloreto de

gel de	sí1ica)	revelou ι	.im novo	produto
em E-CES	,5η	f o i	r emo vido e	0l o 1 EC1	verme1ho
a tr avés	de	uma	camada de	gel de	sílica
x ó pol	egadas)	,7,5 cm :	; 1 ó c m )	usando

e1uen te (J solvente foi removido in de metileno como um vacuo e o óleo amarela claro foi aplicado a uma coluna de gel de sílica luminosa (3 polegadas x 1B polegadas) fazendo-se a eluição com cloreto de metileno para proporcionar 25,0 g (0,076 mole) do produto bromoester do título sob a forma de um óleo transparente com um rendimento de 75'/'. sob a forma de um solvato de isopropanol que continha menos de 5X do éster não brominado e caracterizado por:

RMN Ld (CDC1,)

8,16(d, 2H> , 7,38(d, 2Η), 5,05(septet, 1Η>, 4,14(dd,

4.Η) , 2,38(m, 4Η), l,29(d, 6Η>;

RMN

13,(mr.i_)

168,7

147,· .-7 C. » :ΐ,5, 21

F’repa raç ão de ác ido '.7— C 3— ( 4—n i t ref en i 1 ) prop i 1 3 — 1 , 4 , / , IC-tetraaz aciclododeoano-1-acético, éster l-metí1ico„

A uma solução agitada de 3,137 g (18,2 mmoles) de base livre cicleno em 30 ml de clorofórmio estabilizado em penteno adicionaram-se 4,81 g (14,6 mmoles corrigidos) de ácido d,1—2— -bromo-4-(4-nitrofeni1)-butanoico, éster propílico (preparado peio processo do E?:emplo 0) durante um período de 5 minutos sob uma atmosfera de azoto com agitação. A solução da reacção foi agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. Análise por CF'D ;ema Solvente 2) '1- 1 ULi :onver ío produto de monoalquilação do título (R^-0,78 detecção com ninhidrina, iodo, e actividade UV). A solução de clorofórmio amarela foi aplicada a uma coluna de gel de sílica “flash de 1 polegada X 17 polegadas (2,5 cm :·; 42,5 cm) que tinha sido pré-eluida com clorofórmio metanólico a 57. A eluíção com 3Θ0 ml deste sistema solvente foi seguida por eluíção com Sistema çSes contendo produto do título evaporadas proporcionando 4,85 q produto do título sob a forma de um óleo claro com um rendimento

Solvente 2 e proporcionou fracpuro que foram combibinadas e (5,46 mmoles) da base livre do de 797 e posteriormente caracterizado pc

RMN ^!H <CDC1_) a,15(d, 2H >, 7,40 ( d,

1,07( ρ, 1Η> , 3,35(dd, 1Η), , íj5-3 , Ο (ίιι, 13Η) , 2,5-2,64 ί m 4Η) , 2,14 ( m , 1Η) , 2, ΟΟ (m, 1Η) l,23(dd, 6H);

RMN ^{* 1}''C (CDC1.

171,6, 149,5, 146,5, 129,2, 123,6, 68,1, 62,7, 49,2,

Δ.~7 s âS Q το α τ ί π ο ο -t ο ο ,···,1 t q ''—ί q ι JJ t ( / -_J , i i, X- 4 / q ·_ X q *_' <1 *— n J. η ol. 2— q ·-' η

IV (CDCU) cm

3231(N-H), 2973, 2933, 1721 (éster carboni1ico), 1601,

1512, 1453, 1345, 1107;

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido, m/e 422 (M+H)l+, 403, 392.

Reparação de Produtos Finais ~ Liqanci:

xemplo 1

Preparação de ácido a-(4-nitrofeni1)-ί,4,7,1O-tetraasacic1ododecano-1,4,7,1O-tetraacético, éster monometílico, trietí1 i c o ..

Em 46 ml de acetonitrilo contendo 4,6 q (33,3 mmole) de carbonato de potássio anidro recenteraente reduzido a pó dissolve— ram-se 700 mg (1,91 mmole) de ácido a-(4-nitrofeni1)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l-acético, éster 1-metílico (preparado pelo processo do Exemplo D). A esta suspensão adicionou—se de um só vez 1,022 g (6,12 mmole) de bromoacetato de etilo. Após quatro horas, de agitação à temperatura, ambiente, a suspensão foi filtrada sob vácuo, a massa filtrada. foi lavada com 15 ml de acetonitrilo, duas vezes, e o filtracfo foi evaporado in vacuo a. 38-‘C

pars dar oriqem ao tetraester do título crú sob a forma de um sólida púrpura. 0 tetraestsr foi então purificado por cromatografia em gel de silica fazendo—se a eluição com 5 por cento de C^Hc-DH/CHC 1 e em seguida com o Sistema Solvente 3, para. dar origem a o2o mg k o , —'óõ m mole, 52 por cento) do produto desejado. Este produto foi caracterizado por espectrometria de massa por bombardeamento atómico rápido ( CM+H1 ^=624) e posteriormente caracterizado por:

RMN H (CDC1.J

8,24(d), 7,45(d), 4,95(5), 4,35-4,10(0), 3,79(s),

3,75-1,34(m), 1,34-1,22(m);

RMN ^'C (CDCl^)

	174,3, .	173	,8,	173,6,	171,5, 147,6,	138,9, 131,5, :	123	,4,
64,3,	61,5, 61,4,	60	Jl ?	cr cr λ , '4 ,	cr ter ..-i cr τ -t cr ή —> S U «| —1 -2' <| X R zí <,	9, 52,7, 52,4,	51	,9,
51,7,	43,B, 43,3,	44	c? 1 ' H	19,1,	14,1.

Exemplo 2

Preparação de (eido u—( 4-n i t rof en i 1 ) — 1,4,7,1C tetraazac iclododecano-1,4,7,10-tetraacético.

Em 30 mmole) de ácido

-í,4,7,10-tetraacético, éster pelo processo do Exemplo 1) e durante a noite. Na fim deste e π t ã o c o n c e n t. r a d a i.n vacuo a amarelo. Este sólido foi disso ml de HC1 6N foram dissolvidos 300 mq (0,476 u- ( 4-n i trofen i. 1 ) -1,4,7,10-tetraazac ic1 ododeesnoo filtrado foi evaporado para dar monometílico, trietílico (preparado a mistura foi aquecida sob refluxo período de refluxo, a solução foi 70*C para dar origem a um sólido lvido em 3 ml de água, filtrado, e origem a 253 mg (0,378 mmule, por ο meio de cento de ter i e n t o ) d ο ρ r o d u t o c r CF'D preparativa Cqel NH „ OAc /CH_,OH ( p/ v ) 3 ρo r bomfaa. rdeamen to a ainda por:

ú. Este produto foi purificado par de sílica, desenvolvido em 20 por e caracterizada por espectrometria tómico rápido (ÍM+H3 =526) e carac—

RMN H (D^D) ,42(d), 4,83(5)

RMN

C RMN (D^D)

l./o,0, l/o,3, 1/1,6, 13/ , O , 133,3, 143,9, 1 o 8 , ο , 1 ·ζΌ , 1 , 123,0, 62,2, 54,0, 53,0, 52,2, 50,4, 97,3, 46,8, 44,8, 42,8,

Exemplo 3

Preparação de a-(4-aminofeni1)-1,4,7,10-tetrazaciclododecano- 1,4,7,10-tetraazacic 1 ododeca.no-1,4,7,10-tetraacético :

< BA-DuTA)

Método A:

A hidrogenação catalítica do grupo nitro do tetra.ácido (preparado pelo processa do Exempla 2) foi realizada usando catalisador de Adams (PtD_?! e hidrogénio com um rendimento essencialmente quantitativo para dar origem sd produto do título.

Este produto foi caracterizado por bombardeamentoatómico rápido

-t- _ _ yj»] ( CM+H3 =496) e permuta aniónica ULEF' (sobre Lt-Sepharose ) e caracterizado posteriormente por:

RMN (D^O)

3,12(d), 7,36íd ‘ _η ’*/1 (rn ) “ <ΜΝ Η? (D._0)

141,1, 123,9, 120, 9 , 112,:

49,7, 49,5, 49,3, 45,7, 45,4, 44,9, 44,6,

41,4,

Método Β:

IJm outro método para sintetizar este composto consistiu em converter o composto monoéster de tetramina do Exemplo D rio composto monoácido ds tetraamina (HC1 6N, refluxo durante a noite), seguindo-se alquilação aquosa usando ácido bromoacético, ern seguida redução do grupo nitro no grupo amina (catalisador F’tO-,) para dar origem a um produto idêntico ao que foi anteriormente descrito.

dcUfjJd

Preparação de ácido u—(4—nitrofeni1) — 1,4,7,1u—tetraazaciclododecano-1,4,7—triacético.

Em 60 ml de HC1 6N foram dissolvidos 2,0 g (5,4B mmole) do composta monoéster de tetraamina (preparado pelo processo do Exemplo D). A mistura foi aquecida, até 95°C durante a noite (cerca de 10 horas) após o que foi concentrada in vacuo a 75'^;,C para, dar origem: a 2,53 g (5,11 mmole, 96 por cento) do tetrahidrocloreto de tetraamina monoácido sob a forma de um sólido amare 1 o.

J tetrahidroclciretQ de tetraamina monoá.cido anterior ente referido (0,5 g.

mmole)

οι d;

isolvido e ajustado até pH 9 com MaUH. Foi preparada uma solução

Ir? E? Γ) :J. Γ £.1 Cl ·£?.

de ácido bromoacético (0,71 q mmole) quç foi ac .cionada uma solução eni água do monoácido de tetraamina. U pH da solução foi ajustada de novo para 9 e mantido :om pH durante a reacção por pequenas ad.içSes de NaOH l,0N. Enquanto a reacção era agitada, foram removidas porções aliquotas em diferentes pontos do tempo e a evolução da alquilação foi monitorizada por meio de OLEF' de permuta aniónica. Quando a quantidade do produto de dialquilação (total de três grupos acetato presentes) tinha alcançada um máximo, a totalidade da mistura da reacção foi liofilizada para dar erigem a um sólido escuro. Esta mistura crua dos produtos alquilados foi então purificada por cromatografia em gel de sílica (fazendo-se a eluição com Sistema Solvente 1), se,guindo-se cromatografia de permuta aniónica preparativa (fazendo-se a eluição com um gradiente de 0-100 por cento de NH^DAc

1M) em seguida com placas para CFD preparativas (desenvolvid.

E^jm Sistema Solvente 4) e finalmente sílica (fazendo-se a eluição com Sistema Solvente processo de purificação extensiva deu origem, sob a forma de sólido amarelo, a 30 mg (0,06 mmole, 6,0 por cento) do produto do de de >r cromatografia em gel de Este um título.. Esta produto foi caracterizado por espectrometria + massa por bombardeamento atómica rápido (CM+H1 =463), CLEF' permuta aniónica. e foi posteriormente caracterizado por:

RMN ^!H (DJj)

B,12(bs), 7,35(bs), 4,76(s), 3,57-3,44(m), 2,97-1,83(m),

RMN

C (D„0)

1S1,7'.

12ο z> j·, atí , 4s 'í 8õ cr o -7 ·q f *·- π

179 (·<'-> 17=; -5-7 147 7 η 141 77 — · - 4 -· q A .· <—¹ q —¹ t q -i. T : q .· ·..· q A A q j_ , .7 O f Λ O ·—_S|—

A_ q C* *·_' q Ή' T q / i_/ q 4 / q A 7

133„03. 45,36.

44,26, 42,73, 42,25, 23,72.

Exemplo 5

Preparação de pentaclorohidreto de ácido u-(4-aminofen i 1 ) — 1,4,7,10-teraazacic 1 ododecano—1,4,7—triacéticoe de pen taci orohidreto de ácido a- ( 4-aminofeni 1 ) -1 ,4,7,10-tetraazacic 1 ododecano-1,4,1O-triacéíico.

Uma ínietura crua de produtos alquilados foi preparada pelo processo descrito no Exemplo 4. Esta mistura crua foi cromatográfada sobra uma coluna de gel de sílica fazendo-se a eluição com 20 por cento de NK 0Ac/CH,0H (p:v). As fracções apropriadas a partir desta coluna foram combinadas e evaporadas até à secura. □ produto crú, tendo quantidades substanciais de

NH^OAc, foi dissolvido em 30 ml se água MANOpura^ e liofilizado a fim de proporcionar um sólido castanho claro. Este sólido foi TM dissolvido em 2o ml de água NANOpura , agitado com catalisador PtO,-, sob uma atmosfera de até cessar a libertação de hidrogénio. 0 catalisador foi separado por filtração sob vácuo, e o filtrado foi liofilizado a fim de dar origem a um sólido amarelo. 0 sólido foi dissolvido em 3 ml de Sistema Solvente 4 e cromatografado sobre gel de sílica usando 0 Sistema Solvente 4. As fracções reunidas foram então purificadas in__v a c. u o e 1 iof i 1 izadas a fim de proporcionar 779,ó mg de sólido amarelo claro. RMN ^”'C e RMN de protões sugerem que este produto é uma mistura 50/50 de dois isómeros geométricos possíveis. A mistura isomérica foi feita contactar com excesso de HC1 e liofilizada para proporcionar 548,4 mq (rendimento de 61 por cento) dos produtos do título. R . E . >270^c’S . A cromatografia de permuta aniónica (Sistema CLEP III) revelou, u.m pico maior 094 por cento de pureza); o espectro cie massa por bombardeamento atómico rápido indicou os isómeros + geométricos EM+H3

433.

Preparação de ácido a-E2-(4-nitrofeni1)eti13-1,4,7,1Θ-tetraazacic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético, éster 1,4,7,lõ-tetrametí1ico.

A uma solução de 1,43 g (3,63 mole) de ácido a-E2-(4-nitrofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano-1-acético, éster

1-metílico (preparada pela processo da Exempla B) em acetonitrilo expurgado com arção adicionaram-se 1,71 mmole) de carbonato de potássio anidro com agitação

Adicionaram-se à mistura da eacçúo

1,73 g (11,61

4Θ ml de g (12,34 V Ϊ y □ Γ O 5 5. .. mmole) de u oe meiiiu a a mxsiura aa reacçao wi agiosoa a cerca de 25'^:'C durante 48 horas. A análise por CF'D indicou, a formação de um novo produtr o (R

¢),62, Sistema •Ivente 2) di cionou-se past;

g de gel de sílica luminosa e removeu-se o acetonitrilo num evaporador rotativo. □ material resultante foi aplicado a uma coluna de sílica com 1 polegada x 16 polegadas (2,5 cm x 40 cm) que tinha sido qré-eluida com 5 por cento de clorofórmio me ariólico. Ut.i 1 i z aramss :erca de para sluir várias impurezas não polares e agente de alquilação não reagido. Aplicou-se então o Sistema Solvente 2, sendo reco 1hidas,combinadas e evaporadas fracções contendo produto (R = 0,62), a fim de proporcionar 2,1 g (3,44 mmole, 95 por cento) do produto do títu.lo sob a claro. A RMN indicou que forma dê

ΟΌ +· I produto vítreo amarelo uma mistura rol = V-1. _de isómeros conformacionais ou aeométrioos.

RMN \H (CDC1_, 50-’C)

8,1-37 (d), B,12S(d), 7,398(d), 7,385(d), >,75<s), 3,74<s), 3,68(s), 1,5-3,52(m);

3,82(s), ú , 7 6 ( ±>)

123,ó,

51,1,

RMN □ <CDC1_>, 50 *C, 75 MHz)

17;

174

174,1, 174,0, 149,0, H , ·_ι·_ι •_j, 1 ,

5, 129,3 52,0, 51,;

3,0, 49,1, 48,8, 47,5, 45,2, 34,2,

Ee i~Ti u I u /

Preparação de ácido u—E2—(4—aminofeni1)eti11 — 1,4,7,10— - te traazac ic lododecano-1. ,4,7,10-te traacético , éster 1,4,7,10- tet r a m e t ί 1 i c o .

Em 25 ml de metanol contendo 400 mg de catalisador paládio sobre carbono a 10 por cento sob uma atmosfera de azoto dissolveram-se 1,41 g (2,31 mole) de ácido ct-C2-(4-nitrof enil Ιο ti 11-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético, éster

1 4,7,10- te tramet	í 1 i c o	(preparado pelo processo	do Exemplo	ó)	. 0
hidrogénio em ex	- pcçq,r)	foi expurgado através d	a solução	Ή	UfTicl·.
c». T. Γϋ Ο Ξ 11? f·” d LJ. Γ c*. Π tl· E'	t r 'é' 5	horas. A CF'D indicou a	formação	de	um
material fortemen	te pos	itivo em relação a ninhidrina. (R. = - t	()	.’ 62 ,
Sistema Solvente	2) .	A pasta de catalisador	metanólico	foi

ltrada através de celite e a evaporaçãi solvente proporcionou. o produto do título, 1,21 g (2,03 mmole, 91 por cento), sob a. forma de um produto vítreo sólido branco (sob a forma de uma mistura 2:1 de isómeros conformacionais). 0 isómero conformacional ou. geométrico menor foi separado do isómero maior por cromatografia luminosa usando 10 por cento de clorofórmio matanólico a fim de proporcionar o produto do título sob a forma de um pó esbranquiçado (P.F. = 89-95'^;,C) e foi caracterizado por:

RMN H (CDC1.

'^:'C)

Δ ΟΛ / Η ) X. ίΟΟ ,' U ··, i. Ζ_Ο ί η ', ./.

•’ζ 74íc) 7 “77 ί} 7 77/<=)

·..' J, , Τ ·. _♦ .· 4 5 ·_' ·. Ο t τ -_ «, / J_ X __- / J, l(s), l,5-3,80(s),

1,5-3,5 ( m) ;

RMN^C (CDC1.

Ο '-'C ,

ΜΗ:

1/6,1, 174,0, 173,9, 172,2, 170’, 4, 169,ά>, 144,2, 144,1

130,6, 130,5, 129,5, 129,1, 115,9, 115,8, 62,6,

U J. 4 ‘—ί I) 1,/, i *t‘ — — i CT Λ -T

UU , 1 _? U-4 , ·_< , =>n 7 «=;a õ

X-Z --- if -Λ— q x-f 'a 4 >|

47,3, 44,7, 32,8, 3í,tí, 30,O,

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido, m/e 601

EM + Na 1, 613 EM+K 3

E624 M+2Na⁺-H⁺3⁺

Exemplo 8

Preparação de ácido u-C2- ( 4-aminof en i 1 ) et i 1 3 — 1 , 4,7,10- te traazac ic 1 ododecano-1,4,7,10-te tre. a cá t ic o; (F’A~ DOTA) .

Em 50 ml de ácido clorídrico conc. foram dissolvidos 1,5 g (2,59 mmole) de ácido U-E2--(4-amino f eni 1 ) eti 1 3-1,4,7 , ÍO-tetraazac ic 1 ododecano--1,4,7,1 0- te t raac et ico , éster 1,4,7,1 0-tet rametílico (tal como a mistura crua 2:1 preparada pelo processa do Exemplo 7). A mistura da reacção foi submetida a refluxo a. cerca de 105’^:’C durante seis horas. A CFD (Sistema Solvente 1) indicou, conversão do éster (R. = 0,88) no produto do título sob a forma de sal clorohidreto (R^ = 0,43). 0 solvente em excesso foi removido num evaporador rotativo e o sólido branco resultante foi seco. 0 produto do título como sal clorohidreto fúi obtido com um rendimento de 1,6 q e caracterízado por:

¹H (D0, pu = 1,0.,

RMN

9O‘^:’C

*43 lj 'ί 7 ZL7 ί H i O ’—f — /1 ,Tj '.* 9“\ f >Tj ’i '.·' f iTj ) “ —( ' CJ ! η / q t Jk_ -. U , 4 x_ n ‘~f « J ·_? ·. I 11 .· ^ x— lt x— ·—· ·. 11 i / ·{ J— R ·_·_’ 'v Π J i» f í D_Q, μ D — 1,0, 9 o ‘-’C, /5 MHz)

17A 4 17Δ q 171 ·*· , 7 s I W X- ‘ I '1 ‘ « X. / X t o 1 -τ,Λ j. i r“=5

Π X. ·__'χ_ H V_' !, .u 4 11} .1. X~. If

61,7, 56,8, 56,õ

C7T —T ·_' _·· - / , “;“T 1 crj Δ. Π~7 · -7· T“7 Δ •O _‘ } x. ( di j O, *r / , Ύ 5 -.»*T f ' ·-' / y O ,

Ε1Ί+Η1 massa por bombardeamento atómico rápido m/e EM-t-Na⁴’}⁴’, 568 EM+2Na⁴'-H⁺3 ⁺ .

Usando cromatograf ia luminosa. e Sistema Solvente 1, quaisquer vestígios de impurezas do éster foram produto do título sob a forma do sal c1orohidreto„ removidos do A uma coluna.

de gel de sílica flash com 1 polegada 23 polegadas C

57,5 cm) ag;licou.se 1,10 q do produto do título, sob a forma de sal c1orohidreto. FracçSes contendo apenas o produto do título, tal como sal de potássio e amónio misturados foram combinados para proporcionar 580 mg„

A análise por i_:LEP indicou que o material apresentava uma área de pureza maior do qus cento a e a ja nm,

Espectro de massa por bombardeamento atómico

x.Ot.-⁺_U^{+ +} m/e 562 (M+K) ' , 584 [H+K^T+Na^T-H⁺], óõõ ΕΜ+ΣΚ^-Ι-Γ)

txemoio V

-tetrsazaciclodDdecano-i,4,10-triacético, sal de amónio, potássio

U rn a. s o 1 u cão c r u. a c o n t e n d o a m b o s dos tetra e tri (2,05 g) (preparada pela processo da Exemplo S) foi disso 1vida numa quantidade mínima de Sistema Solvente 1 e aplicada a uma coluna de gel de sílica flash com 12 polegadas 3 polegadas (3Θ cm ;< 7,5 cm) a qual tinha sido pré-eluida com este solvente. A eluição das fracções contendo o produto do título (R = 0,63 em Sistema Solvente 1) foram colhidas e proporcionaram 200 mq de ácido u-L 2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano-1,4,10-triacético, sa.l de amónio, potássio misturados. A análise por RMN

H e ^_'C sugeriram que este triácido era o isómero simétrico (isómero posicionai 1,4,1Θ-triácido):

com

RMN ^-‘C (D_0„

0,5, T = 90*C>

170,1, 170,2, 140,0, 132,7, 131,1, 12ó,l, 57,6,

5ó,l, 54,9, 53,2, 51,5, 51,2, 31,2.

Espestro de massa por bombardeamento atómico rápido,

4-,+

LAACM+H 3 .+ .4-4-.

488 i M+Na 3 , 504C Μ+K 3 , 52Ó L M+K +Na -H 3

542CM+2K-H) 3 .4- , +

Exemplo 10

Preparação de ácido a~C.

-merox:

O -í J— 1 1—1 s-| 1—1 dodeca.no-1,4,7 , 10-tetraaci

-5—ni trofen i1) — 1,4,7,1õ— éster tetrametí1i-

potá	ssio pulverizad	o (1,15	3 ?
ml ) ,	A mistura da	reacção	foi
dura	nte 2 horas. A	mistura	foi
conc	entrado a tá se	obter um	ó

Bromoacetato de emtilo (565 pi, 5,F nado a uma mistura agitada de u-( 2-meto:x i-5-η i trof en i 1 ) -1,4,7,10-tetraazacic1ododecano, ácido 1-acético, éster metílico (580 mg, 1,47 mmole) (preparado pelo processo do Exemplo N) e carbonato de

8,32 mmole) em acetonitrilo (20 agitada á temperatura ambiente então filtrada e o filtrado foi Leo in vácuo. 0 produto cru foi purificado por cromatografia < çj e> 1 de sílica, 8 por cento de metanol em cloreto de metileno). 0 produto do título foi obtido sob a forma de um sólido amarelo (469 mq, por cento), CF'D R

0,4 (gel de sílica, 107. de CH-.UH em L'HC1_), a posteriormente c a r ac t e r i. z a d o por :

RMN

C (CDCU)

j.

57,0, 55,ó,

Exemplo 11

110,7, ,5, 52,6, 51,3, 50,8, 46,8, 46,0, 44,0.

Preparação de ácido ec-(2-metox i--5-ni trof eni 1 ) - 1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7, IQ-tetraacético.

Uma solução de ácido u-(2-metoxi-5-nitrofeni1)—1,4,7,10 - te traazac ioc 1 ododecano-1,4,7,10- te traac ático éster tetrametí 1 .ico (preparado pelo processo do Exemplo 10) em HC1 concentrado (5 rol,

- 7Q J„T, Baker ULTREX)foi submetida a refluxo sob uma atmosfera. de azoto durante 5 horas. A solução foi então concentrada até à secura in vacuo para dar origem a. um resíduo sólido. Este foi pu. rificado por Lruniãi

a íqel de silica, óistema Solvente 6) para, proporcionar o produto do título sob a forma de um sólido esbranquiçado (209 mg). Este material foi convertido no sal tetraclorohidreto e foi caracterizado cor:

RMM C (D^D-DCl, 8Ο'^:'Π)

171,0, 166,9, 161,2, 139,0, 121 , 7 , 51,0, 49,2, 4 V , (.), 46,3 , 42,9 ,

119,3, 110,7, 56,6,

Exemplo 12

Preparação de ácido u-(2-metoxi-5-aminofeni1)-1,4,7,10-tetraazacic 1 ododecano— 1,4,7 , 10-tetra.acético, sal de tetra.amó — π i a »

A uma. solução de ácido <a-(2-meto.<i-5-ni trofeni 1 )-1 ,4,7,10- tetraazacic1ododecano-1,4,7, 10-tetraacético (157 mg) (preparado pelo processo do Exemplo 11) em á.qu.a (20 ml) foi adicionado óxido de platina (20 mg). Esta mistura foi. hidrogenada (1 atmosfera de hidrogénio) durante 1 hora. à temperatura ambiente. Após filtração, α material foi posteriormente purificado por cromatografia (gel de sílica, Sistema Solvente 5) para proporcionar o composto do título (141 mg) sob a forma de um sólido esbranquiçado, e caracterizado por:

9MN

13,

C (D^O)-DCl)

175,5, 172,6, 172,3, 159,9, 126,6, 127,5, 124,6, 123,6,

115,5, 61,2, 53,1, 57,3, 55,7, 53,4, 51,6, 49,6, 47,4.

Preparação de ácido 1—(4—amin a z ac j. c 1 od o d ec ano—4—7—1 O—t r i ac é t i c o , és te r ben z i1)-1 4,7,10 t r

4,7,lú-tetrametílico.

A 4 ml de acetonitrilo expurgado por argão com agitação adicionaram-se 100 mg (0,236 mmole) de 1 - ( 4-aminobenzi 1 ) -1 .4.7 ,. 10-tetraazaciclododecano, sal tetrac 1 orohidretc* (preparado pelo processo do Exemplo J), 260 mg (1,83 mmole) de carbonato de potássio, e 103 mg (0,703 mmole) de bromoacetato de metilo. A mistura foi agitada durante 43 horas a 25 *C. A solução contendo o sal foi aplicada a uma coluna de gel de sílica luminosa com 1 cm x 4 cm e foi eluida com acetonitrilo. FracçSss contendo o produto desejado foram combinadas e o solvente foi removido por evaporação rotativa a fim de mg (0,132 mmole, 56 por cento) do produto do título o qual foi posteriormente caracterizado por:

RMN MH <CDC1_.)

7,29 (u), 6,75 (d), 4,62 (s>, 4,20 (s amplo), 3,70 (s), 3,69 (s>, 3,64 (s), 3,62 (t), 3,27 (s), 3,06 (t), 2,82 (t amplo), 2,7? (t amplo);

RMN ¹'t (CDC1„, 75 MHz)

171,4, 171,0, 143,4, 132,3, 117,5, 115,0, 55,9, 55,3,

54,7, 53,1, 51,7, 51,4, 50,6, 50,5,

47,4.

-31 14

Preparaçao

Η ρ-.

Kminobenzi 1)-1,4,7,10-tetraasacic1ododecano—4—7—1 <5—iriacético , sal c. lorobidreto .

Em 2 ml de ácido clorídrico 6N, 42 mg Íõ,õtí5 mmole) de ácido 1 — (4—amin o ben z i 1 ) — 1 — 4—7— 1 0— te t r a a z ac i c 1 ododec a.n o—4 — 7— 10—

2.4. f ct d u j_f t

L_ cr !H ρ A L.¹ A ·_' / I U± C*. Lj L^!. tL «_ .

vários produtos íR._f ·Sistema Solvente 1). ι produto do título crú

até	tíO ':’C	durante 2 hor
60	p ct ct	o produto do
moç	à' t j d o	solvente prop

lítulo desejado, -cionou 41 mg dc

Preparação de ácido 1-12- (4-ni trofeni 1 )eti 11-1 ,4,7,10— -tetraazacic1ododecano-4,7,10-triacé tico, éster 4,7,1Θ-trimetílico .

oi Lição de 2,24 g mmole) de 1 — 12—(4—nitro— fen i1)eti1j-1,4,7,1ô-tetraazacic1ododecano (preparado pe1o processo do Exemplo S) em 75 ml de acetonitrilo expurgado com arqão adicionaram-se com vigorosa agitação 3,17 g de carbonato de potássio anidro. A esta mistura da reacção adicionou—se gota a gota durante um período de cinco minutos 3,20 g (20,3 mmoles) de bromoacetato de metilo. A mistura da reacção foi agitada durante 17 horas sob atmosfera de argão.A análise por CRD revelou conversão do material de partida SR.^ - 0,73, Sistema Solvente 1) até se obter um novo produto (R^ - 0,46, Sistema Solvente 1). À solução adicionaram-se 70 ml de clorofórmio e a solução com o sal suspenso foi aplicada a uma coluna de sílica flash com 1 polegada x cm), 0 metanol em do produto x 7 polegadas (2,5 cm x 17,5 usando 10 por cento de proporcionar 2,35 g produto

TOl c1orofórmio do título eluido para sob

s. forma de um óleo âmbar o qual formou um produto vítreo friável s.pós secagem pelo vácuo (793). O produto do título foi caracteri:ado oor;

RMN b-l (CDC1-.)

9,17 <m„m>, 7,4-7,66 ( m ) , 2,38-3,95 (m)

RMN ^‘C (CDCU, 75 MH;·:)

171,5, 171,2, 146,7, 144,5, 130,3, 123,9, 56,0,

3,5, 53,4, 52,6, 51,9, 51,9, 50,6, 49,1, 29,5.

txemplQ 16

Preparação de ácido 1-C2-(4-aminofeni1)eti1J-l,4,7,10-tyetraazacic1ododecano-4,7,10- triacétíco, éster 4,7,10- trimet í 1 i C C!

Em 50 ml de metanol foram dissolvidos 2,8 g (5,16 mmole) de ácido 1 — C2— ( 4—n i trof eni 1 ) eti 1 1 — 1 , 1:4,7,10-tetraazacic lododecano-4—7—10— triacétíco, éster 4,7,10—trimetí1ico (preparado pelo processo do Exemplo 15) Λ solução agitada que foi expurgada com azoto adicionaram-se 10 por cento de catalisador paládio sobre carbono (600 mg). A soluçãpo foi mantida sob uma atmosfera de azoto, sendo então o hidrogénio (1 atro, 20—25°C) expurgado através de solução agitada durante 2,5 horas. A solução foi então expurgada durante vários minutos com azoto e o catalisador foi removido por filtração através de uma camada estreita cie celite,, A análise por CF'D (10 por cento de metanol em clorofórmio) revelou. o produto do tít.uo (F< - 0,14). □ produto do título foi eluido com clorafórmio a partir de gel de sílica para

U.I7!

proporcionar 2,2 g produto vítreo branco caracterizado po.

RMN (CDC1-)

7,03 /□'·,m), 6,63 (d), 3,4-3,6 <<m), 2,7-3,2 (m)

ΕΜΝ'-'-'ϋ <CDC1_», 75 MHz) tspertro dc masse. por bombarde^ento atómico rápido, m/e 506 i:m+h⁺3 ⁺ .

Exemplo 17

Preparação de ácido 1-L2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazaciclododeoano-4,7,10-triacético, sal c1orohidreto; (EA--D03A).

Em 30 ml de? HC1 conc. foram dissolvidos b’50 mg (1,69 mmole) de ácido 1-C2-(4-aminofeni1)eti11-1,4,7,10-tetraazacic1o(preparado a 70-80*C ag i tação horas. 0 reduzida dodecano-4-7-ÍÕ-triacét.ico, éster 4,7,1Õ-trimetí1ico pelo processo do Exemplo 16). A solução foi agitada durante 2,5 horas e a solução foi deixada arrefecer com até 25^,?C e a agitação foi mantida durante cerca de 18 solvente foi removido num evaporador rotativo a pressão (10 mm, 75’-’C>. 0 solvato e o excesso de ácido clorídrico foram removidos do óleo transparente resultante por secagem sob vácuo (10 1 mm, 45*0» 0 produto do títu.lo foi proporcionado sob a

Torma de um io branco, com um rendimento de 890 mg·

0,46, Sistema Solvente 2) e pósteriormente caracterizado por;

RMN H (D„0, pD = 1,9, T = 90*C . 50(d), 7,41 (d), 4,26( s), 3,43-3,68 (m > , 3,0-3,3 (m>

RMN ^-‘C (D^D, pD 0 1,9, T - 9<

176,7, 170,9, i x_;

í_J / 4 ι ;7,i

55,4, 54,4, 52,7, 51,0, 50,6, 31,3:

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido.

m/e 466 (M+H⁺), 4S3 EM+Na⁺3, 510 EM-t-2Na-H⁺3⁺,

A análise por CLEP indicou uma área de pureza superior a 92 por cento (254 mm) usando uma coluna de fase reversa com 10 cm F'art.isil-5 0D53 RAC II. 0 eluente foi constituído por 10 porcento de acetonitrilo em solução de fosfato de potássio 0,05M pH

E:-: (.--'trip 1 o 1_3

Preparação de ácido 1-E2- ( 4-isotioc ia.natof eni 1 let i 1 3-1,4,7,10-tetraazaciclododecano- 4,7,10-triacético; (SCN-EA-D03A)

Ácido 1-L 2-(4-aminofenil)etil3-l,4,7,l0-tetraazaciclododecano-4,7,10-triacético, sal do Exemplo 17, 106 mg, clorohidreto (preparado pelo 0,21 mmole) foi dissolvido em 2 ml de água sob uma atmosfera de azoto com agitação. Bicarbonato de sódio (105,6

1,26 mmole) foi adicionado lentamente para evitar a formação de espuma a partir da libertação de dióxido de carbono (pi-i resultante = 3,0). Adicionou-se tiofosgénio (16,3 μΐ , 'pn

mmole) e a dós uma hora de agitação vigoro 20 por cento da água era acetonitrilo) ind , a análise por ou conversão do material de partida <R_ — τ s o1vente f o i remov ido a rotativa a fim de proporc continha cloreto de sódio, (pílula de KBr) confirmou 0 2150 cm 1.

0.1 v) no nrortuto do títmn (R = 0,26).

’ ' ......f partir do produto crú por evaporaçao ionar 130 mg do produto do título que A análise infravermelha deste material a presença da metade isotiocianato (SCN

Preparação de ácido 1-E2-(4-nitrofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano—4,7,10-triacético, éster trietílico.

A 5 ml de uma solução de acetonitrilo agitada contendo 385 mg (1,12 mmole) de 1-C2-(4-nitrofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazac ic lododeca.no ( preparado pelo processo do Exemplo G) e 1,5 g (11 mmole) de K^CO_ adicionarma-se 486 μι 1 (4,5 mmole) de bromacetato de etilo numa porção. Após aquecimento a 68*C sob uma atmosfera de N_, durante uma hora, a suspensão resultante foi filtrada. A massa filtrada foi lavada com CH_.CN (2 x 10 ml). 0 filtrado foi então concentrado para dar origem ao produto crú sob «>. iorna de um óleo viscoso, triturado com 30 ml de éter dietílico, e concentrado para dar origem a 650 mg (rendimento de 1007.) de ácido 1-E2-(4-nitrofeni 1)eti 13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7,1O-triacético , éster trietílico e caracterizado por:

RMN S-l (CDC1_)

3,2(d), 7,6(d), 4,3(q), 2,6-3,3(m), 1,55(t);

Espectro de massa por bombardeamento rápido CM+H3

szacic1ododecano-4,7,1O-triacé

A uma suspensão de 200 mq (0,35 mmole) de ácido 1—E2—(4 -n i trofen i1) eti 13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7,10-triacéti éster trietílico (preparado peli

l· ct l. ώ	t i-
19)
	H
c dr	OE

mistu.ra foi agitada a B0‘‘C durante 6 horas. A soluçã laranja homogénea resultante foi então arrefecida até à temperatura ambiente e seca por congelação para proporcionar um sólido TM castanho o qual foi purificado por CLEP (Sepharose-Q , Sistema CLEP III) usando u.ra gradiente linear de HOAc aquoso a 0-10% durante 60 minutos para proporcionar (507.) do produto hidrolisado ácido 1-C2-(4-nitrofeni1)eti13-4,7,10-triacético, e caracterizado

RMN H (D,

8,22(d), 7,55(d), 3,60-3,90(m),

10-3,40(m)

Exemplo 21

Preparação de ácido l-E2-(4-aminofenil)etil3-l,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7,10-triacético; (EA-D03A).

Num hidrogenador de Rarr foram colocados 50 ml de uma solução aquosa de 214 mg (0,43 mmole) de ácido 1-E2-(4-nitrofen i1)eti13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7,1õ—triacético ( preparada pela processo do Exemplo 20) e 40 mg de Pd/C a 107.. A suspensão foi agitada até cessar a libertação de hidrogénio. Após filtração, a solução aquosa foi seca por congelação

a forma cb-_^j proporcionando 197 mg (987), sob a forma de u.m sólido ác ido l-t2-(4-aminofenil)etil3-l,4,7,10-tetraazacii

-4,7,10-triacético, e caracterizado por:

:anoRMN Ή (D„0>

7,35 (d ) , 7,20 ( d ) , 3,1 ϋ—3,70 ( m ) ;

RMN (Eu.0)

173,35, 172,5õ, 137,90, 131,90, 130,22, 121

15,14, 54,42, 50,12, 49,65, 49,31, 31,00,

Preparação de ácido 1-(2-metoxi-5-ηitroben2i1)—1,4,7,10-tetraazaciclododecano-4,7,10-triacético, éster 4,7,10-trimetí1ic o.

-se uma

A uma solução de acetonitrilo agitada (20 g de 1-(2-metoxi-5-ηitroben2i1)-1,4,7,10-tetraa 3 mmole) (preparado pelo processo do Exemplo E) 1,6 g de bromoacetato de metilo (11 mmole) numa hora adicionou-se carbonato de potássio (0,3 q) ml) contendo adicionaramporção. Após e a agitação foi mantida ã temperatura ambiente durante doze horas. A mistura da reacção foi então filtrada e o filtrado foi concentrado (in vacuo). 0 resíduo resultante foi cromatografado em coluna (sílica, CH_.CN/CH_.0H,, 9:1, V:'v) proporcionando o triester sob a forma, de um sólido branco com um rendimento de 63 por cento após concentração, e foi ainda caracterizado por:

RMN b-H.CDC-U)

, 19 ( d ) , 8,14 ( s ) , 7,1 a (d ) , 2,53-3,99 < m /

RMN C (CDC1_ '>

	1	/3	,53, 172,83, 16	4,59,	t jl? 1 X 1 ‘_Z «j J.		EC 4 UJ. ,	1 J , U> Ύ ,	126,49,
112,30	, 57,	·“. cc XU	, 56,90, 55,03,	54,	21, 53,06,	cr ,_j ··*	, 09,	52,00,	51,54,
50,68,	50 q 3	?	45,05, 4 5 ,	19 = . z ,-_J	1, 49,00,	I :~ί	í, Q , z ,	4b,37,	4 ο , O i_í,
47,70,	47,3	m
Exempl	o 23

Preparação de ácido 1-(2-metoxi-5—nitrobenzi1)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-4,7,10-triaoético.

Uma. solução de ácido clorídrico óM (3 ml) contendo 0,25 q de ácido 1-(2-metoxi-5-πitrobenzi1)-1,4,7,10-tetraazaciclododeoa.no-4,7,10-á.cido triacético, éster 4,7,10—trimetí1ico (0,4í rnraala) (preparado pelo processo do Exemplo aquecida a foi aqitada e até à

100 *8 durante 24 horas temperatura ambiente, adicionaram-se 5 ml de água e a solução aquosa foi seca por congelação pa.ra dar origem a um sólido escuro, A seguir à cromatografia em coluna (sílica. Sistema Solvente 5) o triácido foi isolado com um rendimento de 60 por cento sob a forma de um sólido esbranquiçado, P.F, = 228-230’^:’C (dec), e posteriormente foi

Após arrefecimento

RMN O (D^D)

B,18(d), 8,09(=), 7,12(d), 3,87(=), 2,10-3,60<m);

RMN ^-'C (D_o0) .1 ί 80 ,

.. 91

23,60, 126,1 48,84.

Εχ.ίχ'ίΤίρ 1 u 24

Preparação de ácido 1-(2-metoxi-5-aminobenζi1)-1,4,7,10 — te traa ζ ac ic 1od odec an ο—4,7,1 o—tr i acé t ico .

A uma solução de azoto expurgada aquosa (50 ml) contendo 50 mg de PtO^, adicionarara-se 50 mg de ácido 1-(2-metoxi-5-nitrobenzi1)-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4, 7 ,10-triacético (preparado pelo processa do Exemplo 23). Após hidrogenação numa bomba de F'arr durante uma hora, a solução foi filtrada e o filtrado aquoso foi seco por congelação para dar origem a um derivado da anilina sob a forma de um sólido escuro (rendimento de 95 por cento), P.F.>240*C dec, sendo posteriormente caracterizado por:

RMN ^XH (D_n0)

7,54(bs), 7,21(d), 7,09(d), 7,05(s), 6,83(s), 3,34(s), ,78(s), 2,85-3,56(m);

RMN <D„0)

180,59, 179,77, 153,38, 124,16, 124,03, 122,82, 120,18, r cr o ' c τ ~7 j j , /0 , J·.· , O /

49.,04, 48,32.

de ácido 1-(2-hidroxi-5-nitrobenzi1)-l .4

txemplo 25

-tetraazaciclododecano—4,7,10~triacêtico.

A uma solução aquosa (1 ml) de l-(2-hidro::i-5-nitrobenzi1-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (200 mg, 0,62 mmole) (preparado pelo processo do Exemplo E) adicionou-se ácido bromoacético (309 mq, 2,2 mmole, e NaOH 3,5 ml, ~1M) com agitação à temperatura ambiente» A evolução da reacção foi monitorizada por LC

YM (permuta aniónica, Sepharose-Q ) e o pH foi mantido a cerca de 8 por meio da adição de NaOH na medida do necessário. Após 12 horas a solução foi seca por congelação e o resíduo sólido foi cromatografado (coluna) sobre gel de sílica fazendo-se a eluição com Sistema Solvente 5,. A fracção amarela principal foi concentrada, dissolvida em H_,0 e seca por congelação para dar origem ao produto desejado sob a forma de um pó amarelo brilhante (150 mg, 49 por cento); P.F. - 230-235’^:‘C (dec), sendo pósteriormente c a r a c. t e r i z s. d a p o r ;

RMN (D_0)

166,41, 165,60, 100,00, 119,91, 116,02, 113,85, 111,71,

104,59, 45,20, 44,50, 43,96, 36,43.

Exemplo 26

Preparação de ácido 1-(2—hidroxi~5-aminobenzi1)-1,4,7,10 -tetre.aza.c ic 1 ododecano~4,7 , 10-triacético.

uma solução aquosa, expurgada com argão (25 ml) de ácido

IV-

iidroxi-5-nitrobenzi1)-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7 fiifiC alo p;

h.;: e!!; □ 1 o V Ç, '> a. d ί C .1 OΠ O U. — S e de H._, ( hidroqenador de amarela, a solução foi e; aquosa foi então seca por sob a. forma de um sólido

PtO^ (130 mg) seguindo-se a introdução Parr). Após desaparição total da cor purgada com arção e filtrada. A solução congelação para dar origem ao produto escuro (146 mg, 73 por cento),

Exemolo 2/

Preparação de ácido a-C2-(4-nitrofenil)etil3-l,4,7,10— — te t.raa z sc i c 1 od od ec ano ~ 1 — (R , S) — acé tico—4,7,10—t r is— ( R—me t ϊ 1 acético) , éster 1-isopropi1-4,7,10—trimetí1ico; (éster PN-DOTMA trimeti1isopropi1ico).

A uma. solução de 1,00 q (2,37 mmole) de ácido «-E3-(4-n i trofeni1)propi13-1,4,7,1Θ-tetraazac ic1ododecano-1-acético, éster 1-metílico (preparado pelo processo do Exemplo R) em 35 ml de acetonitrilo seco adicionaram-se 1,15 g (3,32 mmoles) de carbonato de potássio anidro com agitação vigorosa sob azoto. Foi adicionada «-benzeno sulfonato ópticamenta activo de éster metílico de ácido láctico (1,79 ç, 7,36 mmoles S:R.-9S,2) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 60 horas. A análise por CRD indicou a formação de novos produtos (R =0,71, Sistema Solvente 2 pare, tetraésteres do título e R^=0,S9 para triéster). A solução resultante com sais de carbonato suspensos foi vertida para 4Θ ml de clorofórmio e os sais inorgânicos precipitados foram filtrados. D solvente foi removido deste filtrado e o óleo côr de laranja crú foi i— roma t og r af ad o duas vezes numa coluna gel de sílica flash com 1 polegada cm) usando Sistema Solvente .2 como o produto do título sob a forma de diastereomeros tetraesteres x 16 polegadas (2,5 cm x eluente para proporcionar uma. mistura não separada.

1,47 mmo1e, 627 <1,00 g , de □

df?

di?

s espectros de RMN desce material não se 30 *C em c 1 orof6rm i o:

ÓO*C) , 7,2-7,4ím, 2H), 5,06(.71, 1K), 3,4-4,0(m, 0--1,7( m, 15H) ;

25, 1710 (éster carboni1ico), 1590, 1510, rendimento/ gue se rε*vs 1 re,iti livres de produtus alqu.il.ados i n f e r i o r m ente.

A análise por RMN ' H deste material revelou, que ele continha aproximadamente 0,5 equivalentes de derivado benzeno sulfonato não reagido. 0 iίi Us r a r aiTi uua 1 esL κΓι l£s a,

RMN ¹H (CDC1,,

9-3, 1 (m, 2H)

9H), l,7~3,4(m, 20H), 1,

IV (CDC1K cm^_

2980, 2340, 17

1440, 1340;

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido, m/e 702 EM+Na.⁺3 ⁺ , 637.

Exemplo 23

Preparação de ácido a-C2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10— C tet.raazacic lododecano-l- (R, S) -a.cético-4,7,10-tris- (R-meti 1 acético), éster 1-isopropi1-4,7,10-trimeti1ico; (éster F'A-DOTMA trimeti1isopropi1ico 5 .

Acido u-E2-(4-ni trofeni1 )eti 1 3- 1,4,7,10-E tetraazacic 1 ododecano-1 - ( R , 3) -acético-4, 7 ,10-tris-( R-meti. 1 acético ) , éster

1-isopropi1-4,7,10-trimeti1ico (950 mg, 1,40 mmoles não corrigidos) (preparados pelo processo do Exemplo 27), que continha ácido u-E3-(4—nitrofeni1)propi13-1,4,7,10-tetraazaciclododeV3 —

cano-l-acético não reagido, éster 1-meti 1ico, foi dissolvido em IO ml de metanol aquoso a 30?. contendo 1,00 q de catalisador ;nio em exce foi expurgado através· da solução durante οι-'u revelou a t<

n i n h i d r i n a um (6:^.=0,62 Sistema i

A pasta cataiisahoras. Neste ponto, a mspecção da material fortemente positivo em Solvente 2, R₊=,71 para o material de partida)

I dora metanólica foi filtrada através de celite e a evaporação do solvente proporcionou 800 mg do produto do título crú. sob a forma que continha ácido benzeno sulfónico de um óleo t r a n s ρ a ren te (R_f=Ã,0 .stema Solvente 25 a partir da hidrogenolise concomibenzeno sulfonati

U óleo

U c r orna t og r a f a d □ sobre uma poleqadas coluna de gel de sílica flash” de 1 polegada S (2,5 cm x 20 cm) com 107, de metanol em clorcfcrmio que rea1i zou desabi tad a eluição de uma faixa amarelo claro no volume . Foi então aplicado o Sistema Solvente 2 para realizar a eluição do produto do título (480 mg) oom um rendimento de 527.

sob a forma de uma mistura de diasterec-meros e isómeros geométricos não separados. Foram observados três quartets ab na 1 região aromática da RMN ‘H:

RMN 7H (CDC1_, 30'

6,63-8,0(m (quartets', 4H), 5,07(m, 1H, isopropil metina H), 3,53-3,9(m, 13 H com quatro singlets a 3,85, 3,73,

3,69 e 3,56), 3,46(m, 1H), 3,25(t amplo, 3H), 2-3,Km, 14H), 1,0-2,0(m, 15H);

RMN ¹³C (CDC1_, 30°C) “7“7 f *7 L Λ f ~7 nf f «J .1 / U-* q I ) Á ζ η ₍

7â

170,6, 1 77 5

57.4 ..

145.3, 144,9, 130,8, 129,7, 129,3, 129,1, 128,8, 128,4,

126.3, 115,2, 115,1, 114,9, 69,Ô, 68,4, 67,3, 61,6, 57,8,

56,7, 56,5, 56,4, 52,9, 52,7, 52,1, 50,8, 50,7, 50,6, 47,3, 47,1,

O Í5 i ·~ Λ ' “Τ /1 i_ 1 Λ fi Ο ri Λ ΕΓ .Ί η “Τ 7 '1 f τ ·-> Ο

I / « *1''—5 q U q ι 0 q ·—’ q '7 ^!—¹ «, X «. ^,-t* *» λ V—ί q *+ 'Τ , \_ί η · q -_' q ·—' q X q ·_’ q / fi “4 fi 1 T·*? i-ή F' 1 fi *7’1 A 1 -, fi 14 Q

-4 q J— Γ q L_‘ q j— 4_ q J— q J— *- q X q J— q ’- q j— -u q ’— q J— — q q 1 ·—· q V_' q a Γ q

7.4. 7.1

IV (LDCl,) ern

2960, 2840, 1720, 1510, 1450, 1375;

Espectro de (nassa per bombardeamento atómico rápido, (Ti / e ó / 2 C M+Na 1 , 636«

Exeãiolc 29

Preparação de ácido a~C2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1 - (R, S) — acético-4,7,10-tris- (R-meti 1 acético); (PA-DDTMA).

A mistura diastereomérica de ácido .a-C2-(4-amiriofenil )etill-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1 - ( R, S>-acético-4,7,1õtri s-(R-aieti 1 acético) , éster 1 — isopropi 1 — 4,7,10-trimeti 1 ico (400 mg , 0,59 mmoles) (preparada pelo processo do Exemplo 28 > foi dissolvida em 5õ ml de ácido clorídrico concentrado 6N e submetida a refluxo durante 30 horas. A análise por CPD (Sistema Solvente .1 ) indicou conversão de éster (R ^.=0,39 tema Solvente 1) em !U5^: novas manchas (R,=0,6, diastereomero elevado e R,-0.

Τ ' τ diastereinferior Si;

ma Solvente 1, ambas as manchas UV, ninhidr;

na e iodo positivos). 0 solvente em excesso foi removido num evaporador rotativo e após a secagem, obteve-se uma mistura de diastereomeros criis do produto do título (403 mg) sob a forma rie sal clorohidreto. A separação preparativa dos dois diastereomeros do produto cio título foi realizada aplicando 290 mg (0,51 mmole) do sa 1 u a uma coluna de qel de sílica fias!

qual foi eluida com Sistema Solvente 8. 0 diastereomero de R^ e1 evado (119 mg, 0,21 mmole) fo.i obtido sob uma forma mais pura do que o diastereomero com R.

t diastereomero com Rff inferior (90 mg, 0,16 mmole) visto que o elevado foi eluido em primeiro lugar da

Rí’!N *H para o diastsreomero com R . elevado:

RMN H (0..,0, 90 °C, pD=7,5)

7,12(d, 2H) , 6,80(d, 2H), 3,66(m, 1H), 3,57(t amplo,

3H), 2-3,4(m, 19H), 1,89(m, 1H), l,37(m, 1H), 1,15( d, 3H)

1,10(d, 3H), 1,06(d, 3H);

ΫΜΝ ¹’’C (DJ3, 90 °C, pD=7,5)

184,4, 184,2, 184,0, 183,3, 135,9, 132,6, 131,7, 119,1, 78,2, 69,0, 61,7, 61,5, 61,1, 57,4, 54,1, 49,7, 49,6, 43,2, 47,7, 47 2 , 34 , B, 33 , 3, 9,6, 9,1, 9,0;

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido.

m/e 566 Ct!+H⁺V , ·+ ~r Ί*

642 ΓΜ + 2Κ -Id 1 ..

CSd+Na⁺V, 604 lM+K⁺]⁺, 626 CM+K⁺+Na⁺-H⁺3⁺,

Preparação dos Produtos Finais — Complexos

Complexos de ligandos metálicos foram preparados por vários métodos tal como é indicado a seguir, 0s métodos incluíram mistura de metal e de ligando em solução aquosa e ajustamento do pH até ao valor desejado, A coiuplexação foi realizada em soluções contendo sais e/ou tampSes assim como água. Por vezes verificou—se que soluções aquecidas davam oriqem a rendimentos de complexo mais elevados do que quando a complexação era realizada ás temperaturas ambientes. A manipulação usada na síntese de RFC também revelou efectuar a complexação.

Preparação de ácido a-(4-aminofenil ) —1 ,4,7, l€»-tetraazacic1ododecano-1,4,7,í0-tetraacético, sal de amónio, complexo de samarium (III); Sm(BA-DOTA).

Uma pequena amostra, 53 mg, (0,094 mmole) de ácido o: - ( 4-aminof eni 1)-1,4,7,1 <3- tet raazac ic 1 ododecano-1 ,4,7,10- tetraacético (preparado pelo processo do Exemplo 3) foi dissolvida em 100 μ 1 de água e tratada com 3 ml de solução de Sm(OAc)_. 0,043M

0,123 mmole) com pH 6—7. Esta, solução foi. aquecida até omplexação foi determinado por CLEP de permuta

Quando a complexação ficou completa por cromatografia (43,3 mg,

100'^:'C e o grau d; aniónica de permuta iónica, CLEP Sistema III, ;o 1 uçãc compl ex o

T oi arrefecida até á. temperatura ambiente (cerca de 25*0 e seca por congelação. □ complexo de samarium foi purificado por cromatoqrafia em gel de sílica (fazendo-se a eluição com Sistema Solvente 1). Este processo deu origem ao produto do título com um rendimento de 32 por cento. Este complexo foi caracterizado por CPD, aspectrometria de bombardeamento atómico rápi aniónica, e catacterizado ainda por:

)LEP sermuta

H (DO) (T

3,94, 7,31, 7,21, 6,97, 6,80, 5,63, 5,01, 4,58, 4,01, ;,56, 1,7.3, 1,53, 1,24, 1,10, 0,77, -2,80, -2,95, -3,21, -3,91;

RMN ¹³C (D„D)

190,3, 184,9, 131,4, 146,8, 134,3, 122,7, 116,4, :,6, 64,2, 57,2, 55,8, 54,7, 53,4, 51,5, 49.7, 45,5, 43,5, bt·' <| O i

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido, [m+H ] =645 (padrão do isótopo de Sm)

E x e m ο 1 ο 31 ris (4-aminofeni1>-1 ciclododecano-1,4,7,10-acético, complexo de samarium lO— tbtrãâZS— < 111 > .

IJma so 1 u ç ã o de μΐ de SmCl-;. (3 a solução de Sm—15:

e 600 nando

150μ1 de Sm—153 (3 10 ' M, em HC1 O,1N) ’M) em HCl O,1N foi preparada adicio3 à solução de SmCl-.. Adicionou—se então μΐ de NaOAc 2,0M seguindo-se 45 μΐ de ligando 50 mM (preparado pelo processo do Exemplo 3) em tampão HEPES. 0 pH da solução foi ajustado para 7 com 275 μΐ de HEPES 0,5M. Esta solução foi dividida em duas fracções de 500 pis cada, e uma fracção foi aquecida durante 1 hora a 100^,;'C.

As soluções foram feitas passar através de resina de TM permuta catiónica Sephadex-SP . A percentagem do metal como um complexo foi determinada usando o processo descrito préviamente. 0s resultadas revelaram 99,63 do metal como um complexo para a amostra aquecida e 96,63 para a amostra não aquecida.

E s tabi1idad b d os Qu e1 a t por Perfil do pH

A estabilidade? dos complexos de ligando metálico foi medida su.bmetendo-os a vários valores de pH e analisando d complexo em solução. Com um pH baixo, a protonação do ligando pode provocar a libertação do metal. Com um pH elevado, os hidróxidos de metal fazem competição à formação de quelatos. Assim, ao observar quelatos inertes, um quelato inerte desejável permanecerá como um quelato quando exposto a valores de pH e I e v a d o s o u b a i χ o s .

Os perfis quanto á inércia com vários valores de pH para alguns dos quelatos deste inventa foram produzidos usando métodos descritos nos exemplas que ss sequem, Nalguns essas a metal não quela.de foi removido fazendo passar a solução através

de	uma resina	de permuta catiónica.	Foram	usad	os o hidróxido
3 ó d	i o d i 1 u i d o	e as seduções de ácido	cloríd	r i c o	p a r a a. i u. s t a. r o
d 3.3	so1uçSes	do complexo entre cer	— -i —1 —> L. 3. >.J '3	1 e	u -·· Γ l. ct u 3 1 τ ,

percentagem do metal come um complexo foi então determinada pelos métodos descritos préviamente.

De um modo dos de quelatos bifur 6. A quantidade de determinada por CLEP dos são indicados no semelhante, foram preparados vários conjugacionais que foram submetidos a pH 2,3, 4 &

conjugado que permaneceu em solução foi usando um detector radicmétrico. Os resultaExemplo XX na secção biológica.

Estabilidade em relação ao -1,4,7,1Ô-tetraazaciclododecano-1,4, de samarium (III).

pH do ácido u—(4—aminofeni1) ,IO-tetraacético, complexo

As amostras aquecid foram cada, uma delas dividida Lma porçáo aliquoma ds u50 μ origem ao pH representado no

porção aliquota foi	aj ustada	com
desejado valor de	pH. Uma	vez
removida uma porção	alíquota	de

.s s não aquecidas do Exemplo 30 em porpSes aliquotas 2 x 250 ul. foi ajustada ccm HC1 para dar quadro que se segue. A segunda quantidades de μΐ de NaOH até ao alcançado o pH desejado, foi μΐ s a percentagem de metal como complexo foi determinada tal como foi anteriormente descrito. Os resultados são os sequintes:

PH	% Complexo
Aqueci- do	Não- -Aquecic
1	98.9	92.7
3	99.6	93-3
5	99.6	92.9
7	99.6	95.7
i 9	99.9	95.8
11	99.6	95.7
13	99.6	9M.5

Esta tabela mostra a estabilidade para esta amostra, quando aquecida ou não e sem olhar ao pH testado.

Preparação de ácido u—(4-aminofeni1)-l,4,7,10-tetraaza— cic1ododecano-1,4,7,17-tetraacético, complexo de yttrium (III).

Dez μΐ de uma solução contendo 1,4 mg/177 μΐ de ácido u-(4-aminof en i 1 ) -1,4,7,1Ô-tetraazacic1adodecano-1,4,7,10-tetraacético (preparado pelo processo do Exemplo 3) foram adicionados a 107 μΐ de Y(OAc)^· (0,00314) guarnecido com Y-90. Adicionaram-se a esta solução 577 μΐ de água seguindo—se 125 μΐ de NaOAc (9,514) . Adicionou—se água (265 μΐ) à solução para levar o volume total até 1 ml. Esta solução foi dividida em duas porções aliquotas. Uma porção aliquota foi aquecida até 100'^:'C durante 1 hora. As amostras tanto aquecidas como não aquecidas foram testadas a fim de determinar a percentagem de metal sob a forma de complexo usando o processo de permuta catiónica anteriormente descrito. 0s

00

r e s u11ad as reve1 aram r e s; ρ e c t i v a m en te par a

847 e 47 do metal sob a a a m o s t r a a cj u e c i d a e forma de um complexo para a amostra não aqu.ec ida.

Exemplo 54

Prepara de ácido a-(4-aminofeni1)-l,4,7,10-tetraazacic lododecano-1,4,7,10-tetraacético , complexo de lu.tetiu.m (III).

Uma solução de ácido a-(4-aminofeni1)-1,4,7,10-tetraazacic1ododecana-1,4,7,1O—tetraacético (preparado pelo processo do Exemplo 3) foi dissolvida em água destilada para proporcionar uma concentração de 1,63 mg/ml.

Uma solução de cloreto de lutetium foi preparada dissolvendo cloreto de lutetium em HC1 Õ,1N para resultar numa concentração de 3,9 mg/ml (0,01M). 0 lutetium-177 (0,3 mmolar) foi usado como um marcador.

de ou

μ.1 de solução de lutetium 0,011*1 foi adicionado a Ξ μ1 de solução de Lu—177. Foi adicionada a quantitampão ctade apropriada de ligando HEPES (0,lM, pH ml. As soluções atrás referida e adicionou.-s, = 7,6) para dar origem a. um volume total de 1,0 resultantes foram 0,3 mmolar em ligando e lutetium. A solução foi então aquecida até 1ÕO-'C durante u.ma hora e a piercentagem de Lu como u.m complexo foi determinada como tendo o valor de 867 pelo método de permuta catiónica anteriormente descrito.

ido cí— ( 4—i sot i oc i ana to fen i 1 ) — 1 ,4,7,1 0— ,7,10-tetra.acético, complexo de sama-

Exemplo 55

Preparação de ^- te t r a a z a. c ic 1 o d o d e o a η o — 1 riu.m (III).

Uma amostra, 7 mg, (10,8 pmols) de ácido a-(4-aminofenil)—1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético, complexo de samarium (III) (preparado pelo processo do Exemplo 30) foi dissolvida em 400 μΐ de áqua, Adicionou-se tiofosgénio em excesso (50 pl>, seguindo-se 400 μΐ de CHC1-, e a reacção em duas fases foi agitada vigorosamente durante 30 minutos. No fim deste período de tempo, a camada de água foi extraída com 500 μΐ de CHCl.. quatro vezes, e a camada de água foi então liofilizada para dar origem ao produto do título desejado com um rendimento quantitativo

Os L)V revelaram que este composto tem u.ma faixa a 272 e

232 nm. A CPD,

V: V, deu origem a R ~ 0,33. 0 material de partidj.

0,19. IV revelou alongamento de -SCN a 2100 cm ;

gel de sílica desenvolvida por 0Η_.0Ν:Η^0, 75:25 tem um Rff espectro de

ÓS7.

m;

;sa por bombardeamento atómico rápido CM+H 1

Exemplo 56

Preparação de ácido «-(4-aminofeni1)-l,4,7,10—tetraazacic lododeca.no-1,4,7,10-t.etraacético , sal de amónio, complexo de yttrium (III).

Uma amostra, 90 mg (160 mmole), de ácido a-(4-aminofe— ni1) — 1,4,7,10-tetraazac icIododecano—1,4,7,10—tetraacético (preparado pelo processo do Exemplo 3) foi dissolvida em 1 ml de água. A esta solução adicionaram-se 3 ml de água contendo 51 mg (192 mmole) de Y(OAc)-.. A mistura da reacção, pH = ó a 7, foi então

aquecida até 1OO'^:'C durar!te duas heras enteio feita passar através de lã de vi origem a 126 mq de sólido amarelo. 0 sobre gel de sílica (Sistema Solvente (76 por cento! do produto complexo des . A solução resultante foi dro e liofilizada para dar s61id o foi c roma togr a f ado 1! para proporcionar 71 mg ejado. Análise por permuta aniónica revslou o mesmo tempo de retenção que se tinha verifica do para o complexo de Sm análogo. 0 produto do título foi carac terizado por:

RMN ^-'C ÍD„D)

SO , S , 1 Su , 5 , 179, 9, 146,1, 133,4 , 122,9 , 116,1 , 74,9,

66,3, 56,3, 55,8, 55,4, 55,1, 54,3, 52,2, 46,0, 44,0, 23,6;

RMN Ul (E> 01

6,9õ(d), 6,70<d), 4,40(s), 3,45-3,06(m), 2,71-2,10<m),

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido, CM

-+*-+ __ ·+ H 1 = 532.

Exemolo 37

Preparação de ácido «-(4-isotiocianatofeni1)-1,4,7,10- te traazac ic 1 ododecano-1 , 4,7,10- te traacético, sal de sódio,, complexo de yttrium (111).

Uma amostra de ácido .q-( 4-aminof eni 1 )-Ί , 4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético, complexo de yttrium (preparada pelo processo do Exemplo 36) (10 mg, 17 pmole) foi dissolvida em 400 μ 1 H-,0. Adicionaram-se a esta solução 64 μΐ de tiofosgénio (excesso) e 400 μΐ CHC1_ e a mistura resultante foi

agitada vigorosamente durante 40 minutas. Durante este período de tempo foram feitas várias pequenas adições- de NaHCO^ sólido para manter o pH a cerca de 8. No final da reacção, a camada de áqua foi separada e extraída com 1 ml de CHC1-., quatro vezes, e liofilizada. 0 produto do título foi caracterizado por CRD e por espectroscopia UV.

E ;·; e m ρ 1 o 5 S

Preparação de ácido a-L2-(4-aminofeni1)eti13-ί,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7,10-tetraacêtico, complexo de yttrium (III), sal de amónio; NHJY(PA-DOTA)1.

ÓL □ ligando, ácido <a-E2-(4-aminof traazacic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético so do Exemplo 8) foi convertido no sal misturado por cromatografia numa resina en il)etil3-l,4,7,l0-te(preparado pelo procesde amónio protonatado de permuta catiónica forte (Sephadex-SF'™ C-25 sob uma forma protonatada solução aquosa concentrad seguindo-se lavagem da. col eluida a partir d-a coluna até à seacura.

, Pharmacia).

e foi lavada a do ligando

A coluna com água foi a ρ1i c c O fu com

NH OH áqua destilada.

0,5N. D eluent apresentava-se desti1ada. Uma ada á coluna, ligando foi e ídí reduzido

Uma solução de Y (OAc ) _. 4H,_?0 (0,0728 g, 0,215 mmole) em 5 ml de água destilada foi adicionada a uma solução quente do ligando sal de amónio-protonatado misturada (0,120 g, 0,215 mmole) em 5 ml de áqua. A solução foi levada a refluxo a o pH foi ajustado até cerca de 7,0 com NH^OH 0, IM. Após 1 hora sob refluxo, a solução foi arrefecida e reduzida até à secura. 0 NH^DAc em excesso foi removido aquecendo o sólido branca num banho de óleo a cerca de 1O5'^:'C sob vácuo. D produto do título ( que continha ί 04 cerca de um equivalente de acetato de amónio) teve um rendimento cie 0,142 q (94 por cento) e foi caracterizado por:

RMN C (D.-U,, títí'-'C , 75 MHz) “'T O i_ T cr λ ΔΟ À “c⁷ /*·] L Q cr“7 ή í_ cr “7

X'..' q X> I( J.·- / q UJ q ·_*'_) q V q i z q O q '—J ·—) q ·-· q Ut.¹ q X. q i—ι'-J η / q -_J / q JL q x_» q Z q

63,0, 121,7, 63,0, 121,7, 132,6, 13tí,S, 130,7, 181,4, 132,0, i .} i q

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido.

m/e 610 (ião positivo, CM +2H 3 ), 603 (ião negativo, M )

Exemplo 5?

Preparação de ácido u-C2-(4-aminofeni1)eti I3-1,4,7,10- te traazac ic 1 ododecano-1,4,7,10-te traacé tico , complexo de sarnariumi (III), sal de amónio; NH . C Sm ( Pft—BOTA ) 1 .

Quando se repetiu o processo do Exemplo 33, usando Sm ( CAc )... 3H-,0 (0,032 g, 0,215 mmole) em vez de Y ( OAc ) * 4Ή—_0, o produto do título 3 que continha cerca de um equivalente de acetato de amónio) foi preparado com um rendimento de 0,155 g (94 por cento) e foi caracterizada por:

RMM C (D_,D, SS'^:’C, 75MHz )

71,5, 122,:

cr ~ v ~ cr ' cr cr vJ q X. z q X, q v—1 q C¹ q — q i_J q

133,0, 139,7, 131,2, cr λ cr cr i. cr-7 . cr “7 o i_Ji q q q >_* q x_J / q X. q f q Z .

133,4, 189,3, 190,9;

O cr / 7 q a-J .

Espectro de massa por m/e 673 (ião positivo, CM +2H⁺3⁺ (ião negativo, M , padrão isótopo bombardeamento atómico rápido, padrão isótopo Sm), m/e 671

Sm) ..

Preparação de ácido α—C2—(4—isotiocianatofeni1)eti13-

Ρνοϋ-πΐ .-.

-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano- 1,4,7,10-te traaoético, de samarium (III), sal de amónio; 1ΜΗ_Δ C Sm ( SCN-PA-DOTA) 3 .

— eni ρ I e x lj

Soluções de Sm(0Ac ) _,«3H^0 (.27,9 mg, 361,56 g/mole, 73,í pmole) em 10 ml de água destilada e 42 mg de PA-DOTA, sal de amónio-potássio misturados (632,97 g/mole, 66,4 pmole) (preparado pelo processo do Exemplo 6) em 10 ml de água destilada foram

Γ t? <9. C L, éd 13 p õ'. 1 :A	f ormar C Sm (PA-
de term inado	por CLEP usando
solução foi	reagida com uma
g/mo1e, 395	pmole) em 20 ml
de separação	. A reacção fic

misturadas e aquecidas num banho de vapor, Após 30 minutos, a.

)TA)3 ficou completa tal como foi ) método descrito no Exemplo 41. h :<lu.ção de 45,4 mg de CSC1_, <114,96 ? clorofórmio por agitação num fu.nil ι completa após cerca de um minuto tal como foi determinada por CLEP e pela ausência de um teste positivo com ninhidrina (0,2% em etanol) quando a solução aquosa foi reconhecida numa placa para CPD de gel de sílica (o quelato cie partida, CSm(PA-DOTA) 3 , testado positivo). A camada de clorofórmio foi removida, e a. camada aqu.osa foi lavada com duas porções de 20 rn 1 de clorofórmio. A camada aquosa foi reduzida. até à pela, adição de lOOml de acetonitrilo e evaporada à te?mpe~ secura ratura ambiente sob uma corrente 56 mq do oroduto do título.

de azoto a fim de proporcionar

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido, m/e 715 (ião positivo, CM +2H 3 , padrão isótop po bm.

m/e '13 (ião negativo, Μ , padrão de isótopo Sm) mgΙο 41

Análise uor CLEF da ftp quelação de

A taxa de quelação com PA-DOTA com Y^-’' foi estudada mo uma função da manipulação usada na síntese de PA-DOTA. 0 grau de quelação foi monitorizadc fi’!

por lLEP usando um co1 una

Alltech Econosphere' C18 100 mm. 0 gradiente usado foi: A) de pH 6,0, tampão NaUAc 0,05M : CH-.CN.

Na0Ac 0,05M: CH_0N ι, μ p;

B em 'ima an!

301UÇ50 ι tampão PA-DOTA, sal hidroulursto (tempo da retenção - 1,31 minutos) e de sal de amónio-potássio misturado com PA-DOTA (tempo da retenção = 4,55 minutos), ambos preparados pelo processo do Exemplo 8, foram preparados como tampão NaOAc 0,5M pH 6,0, 1,6 mM. Um ml (1,6 pmols) de cada uma das duas soluções foi feito reagir com 0,2 ml (8 pmole) de solução de Y (OAc ) · 4H^0 (40 mM em pH 6,0 tampão NaOac 0,5M). A formação de quelato foi determinada pela aparição de um pico de tempo de retenção - 3,96 minutos (confirmado por comparação comi uma amostra do Exemplo 38) . 0s resultados da. formação de quelato foram os que se seguem.

Sal PA-DOTA	% Complexo	Tempo (min)/Temp.
PA-DOTA»nHCl	>90	< 1 /temp.ambiente
PA-DOTA misturada com	<10	15/
sal de amónio-potássio	>85	10/ 90°C

107

C1aramente, α método de purificação do BFC tem um efeito sobre a taxa, de quelacã.o.

Exemolo 42

Preparação de ácido u-E2-(4-aminofeni1)eti1j-1,4,7,1Θ-tetraazacic1ododecano-1-(R,S)- acético-4,7,10-tr ia(meti 1acético), complexo de samarium (III), sal de amónio;

-DOTMA)1.

NH „ E Em 'PA4

Uma solução de Sm (OAc) 3H^0 (13,2 mq em 2 ml de água destilada) foi adicionada a uma solução de ácido O.-E2-(4-aminofεπί 1 )eti13 —1,4,7,1õ—tetraazacic1ododecano—1-(R,S)—acético—4,7,10-tris-(metilacético) (30 mg em 2 ml de água destilada), (preparada pelo processo do Exemplo 29, diastereomero com R^. elevado). A solução com pH 6,5 foi aquecida num banho de vapor ε a reacção foi monitorizada por CLEP. Após 30 minutos ds aquecimento a solução foi reduzida até á. secura num evaporador rotativo e seca num forno de vácuo.

massa por .+- +

Espectro de m/e 713 (ião positivo, ΕΜ+2Ή 4· positivo, EM+H + Na j , padrão de isótopo (M ), padrão de isótopo Sm).

bombardeamento atómico rápido.

padrão de isótopo Sm), 737 (ião Sm) 713(iã.o negativo.

Nos exemplos que se seguem as soluçSes do complexo foram feitas passar através de uma coluna de permuta iónica para remover qualquer excesso de metal livre ua solução. Sistemas lábeis voltariam ao equilíbrio e quantidades semelhantes do metal livre estariam em solução. Os sistemas inertes não se equilibrariam e a. quantidade de metal não quelado diminuiria. Assim apesar de poder ser formado um complexa com baixo rendimento, uma purificação por sua passagem através de uma resina de permuta i ón ica

103 resultaria num complexo estável utilizável sem metal não complexa d o .

Exemplo 45

Preparação de ácido a-(2-metoxi-5-aminofeni1)-l,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7, 10-tetraacético, complexo de samarium (III),

Uma solução de 3 x 10 ‘M de ácido a-(2-metoxi-5-aminofen11)-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano-1,4,7, 10-tetraacético (preparada pelo processo do Exempla 12! foi preparada dissolvendo TM

5,3 mg em 325 μΐ de água NAMOpura , Uma porção alíquota de 10 pl -4 desta solução foi adicionada a 990 μΐ de SmCl_ 3 x 10 M (em HCl

0,lN) guarnecido com Sm-153. 0 pH foi então levado a 7,0 com

NaOH, Esta solução foi dividida em duas fracçSes de 500 01 cada, e uma fracção foi aquecida durante 1 hora a Íõõ-C. Ambas as amostras tanto aquecida como não aquecida foram testadas para determinar a percentagem de metal sob a forma de um complexo pela método de permuta catiónica anteriormente descrito. A solução foi TM então feita passar através de resina Sephadex-SP . A complexação foi determinada de novo sob a forma de amostras purificadas. Os resultados são indicados no quadro que se seque

	Aquecido	Não-Aquecido
Purificado	Não Purificado	Purificado	Não-Purificado
% Complexo	96	95	97	89

Exemolo 44

Estabilidade em relação ao pH rio ácido A-(2-metoxi-5-aminofeni1> ~1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7, 10-tetraacético, complexo de samarium (III).

As amostras purificadas aquecida e não aquecida do Exemplo 43 foram cada uma delas separada em porçSes aliquotas 2 x 250 G1 . Uma. porção aliqu.ota foi ajustada com HC1 e a outra com NaOH para dar origem aos pH representados no quadro que se segue. Depois de se ter atingido o pH desejado a amostra foi deixada repousar durante 10 minutos e a quantidade de metal sob a forma de complexo foi determinada pelo método de permuta catiónica descrito anteriormente. Os resultados são indicados no quadro que se segue.

pH	% Complexo
Aquecido	Não Aquecido
2	95	94
3	97	95
5	98	97
7	96	97
9	98	96
1 1	97	98
13	100	99

Preparação de ácido s-(2-3ietú::i-P-f — tetraazaciclododecano-1,4,7, 10 — te traacdtic samarium (III)»

Uma solução 3 x lo “M de ácido a-(2-meto;<i-5-nitrofen i I ) -1,4,7,10- tetraazacic 1 ododeoa.no-1,4,7, 10- tetraacético (preparado pelo processo do Exemplo 11) foi preparada dissolvendo ,9 mg em 464 μΐ de água NANUpura . Uma desta solução foi adicionada a 950 ql de Smtl, 3 x 1'.

aliquota de lo μΐ 4

O,1N). guarnecido com Sm3 pH ;em mlι

7,0 com

NaCiH. Esta sol· ! Γ' At n foi dividida em duas fraccões de 500μ1 cada, e

I* U 1. ct 4 U cd U 1 Ú c». Ú U.!' ct ΓΓ

ÍOO*C. As amostras tanto aquecida como não aquecida foram testadas para, determinar a percentaqem de metal sob a forma de complexo usando o método de ______

BAD õR'G'NÁLJ

1 1

permuta catiónica descrito anteriormente. As soluções foram feitas passar através de resina Sephe.de:·:—SP¹ . A complexação foi então determinada nas amostras purificadas usando o processe geral aqui anteriormente descrito. Os resultados são indicados no quadro que se sequ.e.

	Aquecido	Não-Aquecido
Purificado	Não Purificqdo	Purificado	Não Purificado
% complexo	100	72	100	46

Ex e m μ 1 i.j 4 6

Estabilidade? em relação ao pH do ácido «- (2-metox i-5—π i tro ten i 1 ) — 1,4,7,10— te t. r aazac í c 1 ododec ano—1,4,7, 10—te traacé ti — co, complexo de Sm(III).

As amostras purificadas aquecida e não aquecida do Exemplo 45 foram cada uma delas dividida em duas porções aliquo— tas. Uma porção aliquota foi ajustada com HC1 diluído e a outra com NaOH para dar origem aos pH representados no quadro que se segue. Depois de se ter alcançado d pH desejado' a amostra foi deixada repousar durante 10 minutos e a. quantidade de metal sob a? forma de um complexo foi determinada pelo método de permutai catiónica anteriormente descrito. Os resultados são indicados quadro que se segue:

no

pH	Purificado
Aqueci- do	Não- Aquecido
2	99	99
4	100	100
5	100	100
7	100	100
9	100	100
11	100	100
13	100	100

Exemplo 47

Preparação de ácido .3-(4-nitrofsn.il)-l,4,7,10-tetraa2ac.ic lododecano-l , 4,7-triacético, complexo de samário (III). ti.na solução 0,0219í4 (100 μ 1 , 2,195 mmole) de ácido a~ t 4—nitrcsf enil )—1,4.,7,10~tetraazaci.ciododecaRo-l , 4,7 — triacético '.preparado pelo processo do Exemplo 4) foi feita contactar com uma solução =,043 ΙΊ (25 μΐ , 1,075 mmole) de Sm(OAc)^. A mistura da reacção foi submetida a CLEP de permuta aniónica (coluna de Sonharose-R™^{1 cm 25 Cin}’ ^taxa fluxo - 2 ml/min, fazendo-se a eluição com gradiente NH^OAc 0-1M durante 30 minutos) . Após uma. hora, o complexo (tempo de retenção = 11,1 minutos) tinha-se formado com um rendimento de 77 por cento (percentagem da área) e foi completamente dividido do pico do ligando (tempo de retenção = 15,5 min). Obtev—se uma evidência adicional de que o complexo do titulo se tinha formado am CPD sobre ael ds silica (Sistema.

Solvente 4) em que o R. = 0,00.

ndo tem um R^ = 0,59

Ljffiμ 1 S Xu lEuTí LliTi

Ti. o

Preparação de ácido a c ic1ododecano-1,4,7-triacético, ác ido a- ( 4-aminof en i 1 ) -1,4,7,10-tetra· o, complexo de samário (III).

(4-aminofeni1)—1,4,7,10—tetraazacoraplexa de samário (III) e de azaciclododecano-1,4,1y-triacéticUma solução, u-(4-aminofeni1)-1,4,7 (preparado pelo proces

0,022M (100 μ1, 2, 10-tetraazacic1ododec o do Exemplo 5) foi μ,mole), de ácido ano-1,4,7—triacético contactada com uma solução cie Sm(UAc)^ 0,043M (6,4 μΐ, 0,275 pmole). A mistura da 7M reacção foi submetida a CLEF’ de permuta aniónica (Sepharoee-Q , 1 cm x 25 cm, taxa de fluxo = 2 ml/min., fazendo-se a. eluição com gradiente 0-0.25 M de MH^OAc durante 30 minutos). Após quarenta minutos, o complexo (tempo de retenção = 9,0 min) tinha-se formado com um rendimento de 66 por cento (percentagem da área) e ficou completamente dividido a partir do pico do ligando (tempo de retenção = 13,5 min).

Exemplo 49

Preparação de ácido a-(4-aminofeni1)-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7-triacético, complexo de samário -153 e ácido a-(4-aminofen i1)-1,4,7,10-tetraazac ic1ododec ano-1,4,10-triacético, complexo de samário -153.

_

Uma solução 3 x 10 -M de ácido a-<4-aminofeni1)-1,4,7,10 — te traa z a.c i c 1 ododecano— 1 , 4,7—tr iacé tico pentac lorohidreto e ácido a-(4-aminofen i1)-1,4,7,1Θ-tetraazacic1ododecano-1,4,10-triacético pentacloreto (preparado pelo processo do Exemplo 5) foi preparado dissolvendo 4,2 mg em 300 μΐ de água NANOpura³^. Uma porção aliquota de 10 μΐ desta solução foi adicionada a 15 μΐ de 2 x

1 rj -pf' ’	f·. Sun	H C1 0,1 Ny u	a rn =c i dm ~i~' SN—1 03 .	LJ V D i Lí.jlí -Ξ-	foi
levado até 1 ml	po	r adição de	água. 0 pH foi então	Ι e V A CÍ O	7,0
com NaOH. Esta	SC! I	u. ç ã o f o i d i v	idida em duas fracç:	□es cie 500	μΐ

cada, e uma fracção foi aquecida durante 1 hora a 100*C.

As amostras tanto a quecida como a. não aquecida foram testadas para determinar a percentagem de metal sob a forma de um complexo pelo método de permuta catiónica descrito anteriormente. Os resultados indicaram 89% e 96% do metal como um complexo respectivamente para as amostras aquecidas e não aquecidas.

E x e íii ρ 1 o 5 o

Estabilidade em relação ao pH de um ácido a-(4-aminofeni1)-ί,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético, complexo de samário (III), e um ácido a-(4-aminQfenil)-l,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,10-triacético, complexo de samarium (III).

A amostra aquecida do Exemplo 49 e a amostra não aquecida foram cada uma delas dividida em duas porções aliquotas. Uma porção aliquota foi ajustada com HC1 e a outra com NaOH para dar origem aos pH represemtados no quadra que se segue. Uma vez alcançados os pH desejados, as amostras foram deixadas repousar durante 10 minutas e a percentagem de metal como complexo foi determinada pelo método de permuta, catiónica descrito anteriormente. Os resultados são indicados no quadro que se segue:

115

pH	% Complexo
Aquecido	Não-Aque eido
1	86	83
3	99	99
5	99	99
7	89	96
9	99	98
1 1	96	89
13	97	97

TSQ .

Preparação de ácido u-(4-nitrofeni1)-1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7-triacético, complexo de samarium (III).

Treze microl i troe de solução 2 ;; 10 M de ácido v- ( 4-n i t r of eni 1)-1,4,7,10- tetraazac ic 1 ododeca.no- 1,4,7, tri acético (preparado pelo processo do Exemplo 4) 15 μΐ de SmCl_. (0,0214 HC1

Q,1N) e 2 μΐ de Sm-153, tiveram o seu volume completado para 1 ml TM com agua NANOpura . O pH foi ajustado para 7,0 com NaOH» Esta solução foi dividida, em duas fracções de 500 μΐ cada, e uma fracção foi aquecida durante 1 hora a 100°C. Ambas as amostras a aquecida e a não aquecida foram testadas a fim de determinar a. percentagem de metal sob a forma de um complexo usandD o processo de permuta catiónica descrito anteriormente, Ds resultados

116 revelaram 74/( e 42% do metal sob a. forma de um complexo para as amostras tanto aquecida como não aquecida, respectivamente.

E em o 1 o 52

Estabilidade em relação ao pH do ácido o:-( 4-n i trofeni 1 ) -1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-l,4,7-triacético, complexo de samarium (III).

A amostra, aquecida do Exemplo 51 foi dividida em duas porções aliquotas. Uma porção aliquota foi ajustada, com HCl e a outra com NaOH para, dar oriqem a.os valores do pH representados no quadra que se seque. Depois de se ter alcançado o pH desejada a amostra foi deixada repousar durante 10 minutos e a. quantidade de metal sob a forma de um complexo foi determinada pelo método de permuta ca.tiónica. anteriormente descrito. Os resultados. são indicados no quadro que se seque.

2H	% Complexo
1	67
2	70
4	70
5	72
7	74
9	76
10	76
12	75
13	76

-li .1 i Li Ji

F'reparação de ácido l-E2-(4-am. •t2traâzaciclododscsno-4-7-10-triacéticQ, 117.

processo do i 4. p f hí ρ ca l· ci i_> cl Lí 11 ί A

Exemplo 17) dis

S=· 1 _J χ uí. ci U so1 vendo

24-7034 (realizada pelo :-ól.idc? snt âqua, 4 concsn^-

Ό1

Uma solução de cloreto d< dissolvendo cloreto de lutetium en HCl resultante foi de 3,9 mq/ml de cloreto de u t e t iom foi preparaoa lutetium-177 foi usado com u Ll ilí ffj 3. S'^-t_ <3. u u i' _;

BAD ORIGINALj

Um volume de 30 μΐ de solução da a 2 μΐ de solução de Lu—177. Adicion de ligando adiLiunuuum volume total de 1,0 1 i. g an do e 1 u. te t i um .

•e tampão HEPES ( ml. A solução r

Lu 0,011*! foi adiciona-

~ S e Lí ΓΠ V Ο I Li iTí e	de 30	μΐ
1 Μ η pi-1 ” / , ó z	pa ra	d a r
lí 1 tante foi	0,3 mM	em

A Quantidade determinada como sendo de Lu sob a forma de um complexo foi ue 93 por cento pelo método de permuta catiónica anteriormente desc rito.

Lxfíiig 1 u_54

Preparação de ácido 1-t2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10— te t raa z ac i c 1 od o d eo an o—4,7,10—triacético, com pi e x o de y 11 r i u m (III); EY(EA-D03A)3 ligando, ácido 1-I2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazac ic 1 ododecano~4 , 7 , 1 0~ triacético (preparado pelo processo do

Exemplo 17) foi convertido no sal de amónio protonatado misturado por cromatografia numa resina de permuta catiónica forte TM ' 5ephadex-SP ' C-25, Pharmacia). A coluna encontrava-se na forma protonatada e foi lavada com água destilada. Uma solução aquosa concentrada do ligando- foi aplicada Λ coluna, seguindo—se lavagem de coluna com água destilada. □ ligando foi eluido a partir da coluna com NH_n0H 0,51*1. 0 produto eluido foi reduzido até à secura num evaporador rotativo e seco num forno de vácuo.

Uma solução de Y (OAc ) _, · 4H_,0 (0,203 q, 333,101 g/mole,

0,600 mmole) em 10 ml de água destilada foi adicionada a uma solução do ligando sal de amónio protonatado misturado (0,300 g, 499,615 g/mole, 0,600 mmole) em 10 ml de água destilada. A solução foi levada a refluxo e o pH foi ajustado até cerca de 7,0 com NH^DH 0,11*1. Após 15 minutos sob refluxo, a solução foi

a r r	ef çr	ida e reduz	i d a. a. t -à c- p r»ι r	a num	ev	aparador rotativo.	H
ace	tato	d e a m 6 n i o	em excesso foi	remo	vide	por aquecimento	do
sói	ido	branco num	banho de 61εo a	cerc-	a d e	105°C sob vacuo,.	□
j.» 1 t-‘	í j Li t O	do título	(que continha	c e r c a	_J__ U f	lí m e q u i v a 1 e n t e	dS
x r- g.	tato	de amónio)	foi proporcionad	o co/n	ij ,Tt	r ε r ί c! iment o cl e ..? 3	iiig
Γ Q O	ρ o r	cento) e foi caracterizado	por:

RMN ¹-'C; <8S*C, D._,0, 75 MHz)

24.,4, 28,4, 51,2, 56,5, 57,2 (20

120,5, 132,3, 135,2, 182,1, 182,5, 3.83,0;

Espectro de massa por bombardeamento atómico rápido, _ +·+· m/e 552 (ião positivo, CM+H 3 ), m/e 610 (ião negativo,

Eid+aftc^-!^-).

Exemplo 55

Preparação de ácido 1-E2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10- tetraazac ic 1 ododecano-4,7,10-triacético , complexo de samarium; ESm(EA~D03A)3.

Quando o processo do Exemplo 54 foi repetido, usando Sm (OAc ) __r · 3H^(3 (0,229 g, 331,531 g/mole, 0,600 mmole) em vez do Y (OAc )_.· 4H_?0, o produto do título (que continha cerca de u.m equivalente de acetato dl·? amónio) foi preparado com um rendimento de 408 mg (99 por cento) e foi caracterizado por:

RMN

C (88'^:’C, D„D), 75 MHz)

23,8, 27,9, 51,4, 57,5, 58,1 (30, 68,7, 73,4, 120,3,

132,2, 134,7, 185,0, 186,8, 192,1;

120

Espectro de massa por

Hm/e 615 (ião positivo CM+H] bumba:· d e a: 11 e n t o a tóm ic o r á. ρ i d o , ρ a d r 3. o d e i. s 6 fc ο ρ o 6 m ) , m / e 6 7 3 ¹ ã,-, negativo, CM+UAc j , padrão de isótopo Sm).

b, ;·; e m pio 56

Preparação de ácido 1-E2-(4-nitrofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7,10-triacético, complexo de samarium (III).

Dez microlitros de 1,46 mq/100 μ1 de solução (0,03M) de ácido 1-C2~(4-ni trofeni1)eti13-1,4,7,10-te traazac ic 1 ododecano-4,7,10-tetraacético (preparado pelo processo do Exemplo 20) foram adicionados a 15 μΐ de solução de SmCl-, (0,0214 em HCI O,1N) e foram guarnecidos com Sm-153. □ volume foi completado até 1 ml TM com água NANOpura .. Esta solução foi dividida em duas fracções de 500 μΐ, e uma fracção foi aquecida durante 1 hora a 100*C. Ambas as amostras a aquecida e a não aquecida foram testadas para determinar a percentagem de metal sob a forma de um complexo usando o processo de permuta catióriica aqui anteriormente descrito. Os resultados indicaram 317. e 437. do metal sob a forma de um complexo para as amostras aquecida e não aquecida, respectivamenf e .

Exemplo 57

Estabilidade em relação ao pH de ácido 1-C2-(4-nitrofenil)etil3-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7,10-triacético, complexo de samarium (III).

A amostra aquecida do Exemplo 56 foi dividida em duas porçSes aliquotas. Uma. porção aliquota foi ajustada com HCI e a

dos no quadro que o a amostra foi n t i d a. de de m e t a 1 método de permuta são indicados no outra com NaUH para dar origem aos pH repteíanta ss segue» Depois cie s-e conseguir o pt—i ds^ajdd deixada a descansar durante 10 minutos e a qua sob a torma de um complexo toi determinaua peie catiónica anteriormente descrito. Os resultados quadro que se segue.

PH	% Complexo
1	20
2	37
4	49
5	58
7	81
9	Γ 62
10	64
12	64
13	54

Exemplo 53

Preparação de ácido 1-C2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10— tetraazacic lododecarto—4,7,10—triacético , complexo de samarium (III).

Três μΐ de 4,65 mg/100 ml de solução de ácido 1-L2-C4—amino fen il )etil 3 — 1,4,7,10—te traazacic 1 ododecano—4,7,1 ()-tr iacéti— co (preparado pelo processo do Exemplo 20) foram adicionados a ixí-iNupu. ra so 1 liç 3 o a 1 i quota aquecida

ção de 15 μΐ	de SmCl-.
da com Sm~153.	0 volume
ih„ 0 pH da so	lução foi
foi d ί V i d i u a	em duas
foi aquecida	a 1 õõ ’-’C ι

não aquecida oi completado atê 1 ml com agua instado para 7,3 usando NaOH. A •ções aliquotas, e uma porção •ante 1 hora, Ambas as amostras am testadas para determinar a percentagem de metal sob a forma de um complexo pelo método de permuta catiónica descrita anteriormente. Os resultados revelaram 9ó7 e 937 do metal sob a forma, de um complexo para as amostras aquecida a não aquecida, respectivamente.

Exemplo

Estabilidade em relação ao pH do ácido 1-C2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,1O-tetraazacic1ododecano-4,7,1O-triacético, complexo de samarium (III).

As amostras aquecida e não aquecida, do Exemplo 58 foram cada uma delas dividida em duas porções aliquotas. Uma porção aliquota de cada amostra, foi ajustada com HC1 e a outra com NaOH para dar origem aos pH indicados no quadro que se segue. Depois; de se conseguir o pH desejado, a amostra foi deixada a repousar durante 10 minutos e a quantidade de metal sob a forma de um complexo foi determinada pelo método de permuta catiónica descrita anteriormente, Os resultadas são indicados no quadra que se seque.

resultadas são indicados

PH	% Complexo
Aquecido	Não Aquecido
1	44	13
3	50	42
5	73	55
7	96	93
9	98	98
1 1	89	90
13	28	37

’ ϊ 3. L ! Lj ^!.cd i .

<.cic 1 ododecano-4,7 , 10-tri<

mip 1 l - < z-metox i-ο-ηι trooen·. ?. ι — 1 , , / , 1 o-- tetreszscic iododêc an o-4, 7 ,1 o^— t r i ac é t i c o ( ρ r e p a. rado pela processo do Exempla 25) foi preparada dissolvendo 3,9 mg em 2&y μ: ds água NANOpura . Uma porção aiíquota de 10 μΐ desta solução foi adicionada a 15 μΐ de SmCl-, 2 10^-<η (em HJ3) guarnecido com 10 μΐ de Sm-153 em HC1 O,1N (3 >: 10~“γ1). 0 volume foi completado até um mililitro por adição de 965 μΐ de DI H_D. 0 pH fui então levado até 7,0 com NaOH. Esta.

em duas tracçóes de 500 μΐ cada., e uma fracção d i v i d i d a aquecida durante 1 hura a 1OO‘-‘C. Ambas as amostras aquecida, e não aqueci

BAD ORIGINAL^

124 foram testadas a fim de determinar a percentagem de metal sob a forma de um complexo pelo método de permuta catiónica descrito anteriormente. Os resultados indicaram 71 por cento e 74 por cento do metal sob a forma de um complexo para as amostras a q u ec i d a e n3o aq uec ida, res ρec t ivamen te.

E x err! ρ 1 c> 6 1

Estabilidade em relação ao pf-1 de ácido 1 -(2-hidrox i-5—n i trobenzil)-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7, 10-triacético, complexo de samarium (III).

As amostras aquecida e não aquecida do Exemplo 60 foram cada uma delas dividida em duas porçSes aliquotas de 250μ1. urna porção aliquota foi ajustada, com HC1 e- a outra com NaOH para dar origem ao pH representado no quadra que se segue. Após se ter conseguido o pH desejado a. amostra foi deixada a repousar durante 10 minutos e a quantidade de matai sob a forma ue um complexo foi determinada, pelo método de permuta, catiónica descrito anteriormente. Os resultados são indicados no quadro que se segue.

PH	% Complexo
Aquecido	Não Aque eido
1	65	51
3	98	93
5	99	99
7	100	100
9	100	99
11	100	96
13	100	98

Exemplo 62

Prepararão de ácido 1-(2-hidroxi-5—aminobenzi1)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-4,7, 10-triacètico, complexo de samarium (III).

_7

Uma solução 3 x 10 M de ácido 1--(2-hidroxi--5-aminoben~

z.i.1 )-l ,4,7,10-tetraazacic1ododecano-4,7, 10-triacético (preparado pelo processo do Exemplo 26) foi preparada dissolvendo 3,2 mg em V*f

ΙΟΟμ.1 de água NANOpura . Uma porção aliquota desta solução (diluida até 20 μΐ ) foi adicionada a 15μ1 de SmCl_, 2 x 10 (em

14^0) guarnecido com Sm-153. 0 volume foi completado até 1 ml pela adição de 950 μ.1 de DI H,_,0 e 20 μΐ de NaOH U, IN. Esta solução foi dividida em duas fracções de 500 μΐ cada, e uma fracção foi aquecida durante 1 hora, a 100*C. Ambas as amostras aquecida e não aquecida, foram testadas para determinar a percentagem de metal um sob a forma de descrito an ter iormen t s. Duan d o cento do metal, a solução foi T M

Sephs.de:·::—SP . A percentagem de foi determinada de novo. Os re que se segu.e .

método de atava compl feita pass metal sob a ultados 53 permuta s 5 J u m e n u s ar através forma de um o indicados c a t i c'.' n i c a de 95 por de resina c om ρ 1 e :·: o no quadro

E; <amjj

Estabilidade em relação ao pid do ácido 1-(2-hidro;:i-5-aminoben zi1)-1,4,7,10-tetraazac iclododecano-4,7, 10-triacético, complexo de samarium (III).

As amostras purificadas por cromatografia aquecida e não aquecida do Exemplo 62 foram cada uma delas divididas em duas porçSes aliquotas de 250μ1 . Uma porção aliquota de 250 μΐ foi. ajustada com HC1 e a outra com NaDH para. dar' origem aos pH representados no quadro que se segue. Uma vez conseguido o pH desejado, as amostras foram deixadas a descansar durante 10 minutos e a percentagem do metal sob a forma de complexo foi determinada pelo método de permuta catiónica de mente. Ds resultados são indicados no quadro que se?çu. s?:

PH	% Complexo
Aquecidc	Não Aquecido
1	60	56
2	TM	76
3	8M	87
5	97	98
7	99	99
9	99	98
1 1	99	99
13	99	99

Métodos para Utilização em Biologia

Du.elantes bifuncionais tendo na mesma molécula um grupo quelante metálico tal como DTPA e um agente de ligação reactivo (a amina arilo) sao conhecidos como sendo capazes de ser covalentemente a várias bicmoleculas dirigidas a

1iqados alvos tendo especificidade em relação ao cancro ou epitopos de células tumorais ou antigénios. Os complexos radionuc1 idos destes conjugados são úteis em aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas como meio de conduzir o radionuclido até um cancro ou célula tumoral. [Referência, Meares et al., Anal. Biochem. 142. óB-76 (1984); ver também discussão nas pags 215-216 do J. Protein Chem., 3(2) (1984) por Meares and Goodwin, sendo as referências mais recentes de Meares, Patente dos E.U.A. Ho. 4.6/3.677, publicada em 7 de

Julho, 1987, Warshawskv et al. Patente dos E.U.A. Ho. 4.652.518, publicada em 24 de Março, 1837 e Brechbiel, st al., Inorq

Chem, . , 28, 2772-2781 <1886)3. Efuma maneira concebível, c to, uti

:ando metais radioactivos ou 1uminescentes, podem produtambém ser usados para imunoensaios in v i t ro.

Informação de Base

A utilidade dos anticorpos marcados depende de um determinado número de do anticorpo, 2) a factores, por exempla: 1) a especificidade inércia ou estabiI idade do complexo nas condições de utilização (isto é, estabilidade do soro), e 3) integridade do anticorpo, i.e. ímunoreactividade do anticorpo, não marcacão.

a especificidade e afectada pelo processo a

3.

A estabilidade cu inércia do complexi da maior e a dissocia· importância para a eficácia do conjugado radionuclido-antícorpo como um agente diagnóstico e/ou terapêutica. A labilidade cinética pode levar a instabi1 idade, por exemplo no soro, ção do radionuclido do complexo, diagnóstica e terapêutica. Além disso pode criar um maior poten:or radiação nos tecidos normais. CCole et al., J . Nue 1 , Med. . , 23, '33-90 (1987)3

-igapão

-po

A ligação do radionuclido ao anticorpo pode ser realizada ou por ligação do BFC ao anticorpo por meio -de processos bem conhecidos nesta técnica, seguindo—se a. quelação do radionuclido compatíveis com o anticorpo, ou al ternativaaiente, conjugação do anticorpo com o metal pré-formado (temperatura

ambiente uu tltvada) — uumρIe;·;o EíFC _________ _____

Res » 17 , 2Θ2—2Õ9 (1984)3, São proporcionados exemples para ests· ú 111 m o.

Exemolo ZA (Cornearative)

Conjugação dt

1-íâisociOLianatc oenzi1)-dietri1 — enetriaminepentaacético, complexo samarium-153 com IoG e Fíab )_, 153, fragmento C ^J’'SmSCN-Bzde CC-49; [ SmíSCN-Bz-DTPA)j-IqG e

-DTPA) l-Fía.b )„.

□ ácido 1-(4-isotiocianatobenzi1)dietilenetriaminepen1 CJ Tf taacético, complexo samarium—153 C Sm ( SCN-Bz-B7F‘A ) 1 foi preparado misturando 150 μΐ de ⁱ'^J''Sm em HC1 O,1N com 9 μΐ de ácido 1-(4-isotiocianatobenzi1'dieti 1enetriaminepentaacético ao qual se adicionou tampão HEPES (0,514 pH 8,9, aproximadamente 30 μΐ ) para -9 levar o pH até cerca de ó. Para conjugar, 22,5 x 1Θ moles de ' —4

IqG ou de Fiat; )de CC-49 (concentração de cerca de 1 x lõ M de proteína, em 5Õ mmole de HEPES, pH 8,5) foram misturados com o complexo 'Sm, e o pH foi ajustado para 8,9 pela adição de uma de carbonato de sódio ( 1,0!4, 12-15 μΐ) conj ugação foi.

realizada à temperatura ambiente (cerca de 3 horas, 0 IgG ou Fíab )_o marcado com isolado e caracterizado de um modo semelhante ao descrito Exemplo XII.

25'‘O durante cerca de o c o m plexo 15 3 •n z>m foi no

E x per i men tação Bi o1óq ica

Exemplos I, & II e Exemplos Comparativos A-D CONTROLO IN UIVO DOS QUELATOS BI FUNCIONA IS

A estabilidade de certos quelatos de terras raras foi examinada por testes in vivo em animais. Por exemplo, Rosc.tff, et

139 al. eni International Journal of Aoolied Radiation and Isotopes e quelatos de aminocarbox ί1icos.

14, 129-135 (1963) referem-se à distribuição terras raras em ratinhos piara certos ácidos :OU-S5 PUB 1 :oBipeti câo o agente quelantí os constituintes do corpo (inorgânicos e orgânicos) em relação ao ião de terras raras, determina a sua deposição e excreção. Pensa-se que os quelatos de terras raras fortes deste invento se dissociam muito pouco e são excretadas, enquanto que os quelatos fracos e de força. intermediária conhecidos nesta técnica se dissociam mais rápidamente sendo desse modo depositados em orgãos tais como o fígado. Contudo, a concentração do radionuclido no fígado não se deve sempre à formação de complexo fraco, mas nalguns casos deve-se à afinidade que o quelato metálico tem em relação ao fígado. Os quelatos foram, com efeito, preparados e utilizados piara a avaliação da função hepática EFritzberg, Alan

R, Radiopharmaceu i-Togress

Clinicai Rerspectives

Vol. 1, 1986; Patentes dos E.U.A. Nos 4.733.74)

4.791.0333.

Dioaisiriouiçao cos queiaios os ytirium e ce samario do Exemplo 3, um exemplo de um quelato de terras foi determinada e a dose percentual no fígado foi um processo de avaliação in vivo osra avaliar do composto rar a s Cor tε, usada como qualitativamente a estabilidade dos quelatos. Os quelatos de NTA e de EDTA são incluídos para comparação, 0 samarium também foi injectado como cloreto ds samarium numa forma não quelada como contro1 o.

Foram comprados a Charles River Laboratories ratos Spraque-Dawley pesando de 150 a 299 g. Estes animais foram colocados em gaiolas sendo-lhes fornecido água e alimento ad 1 ibitum. Ds artimais foram aclimatados du.rante pelo menos cinco dias antes da utilização. Antes da injecção do complexo, os animais foram colocados sob uma lampa de calor (15 a 39 minutos) a fim de dilatar a veia caudal. □ animal foi então colocado numa gaiola de controlo, sendo a cauda limpa com um esguicho de álcool,, sendo o animal injectado (50 a 200 μΐ ) pela veia caudal. Apos a injecção, o animal foi colocado numa, outra, gaiola. durante duas iior as e apos esse perxodo d.e tempo o animal foi sacrificado por meio de luxação cervical . 0 animal foi então dissecado, as pszif uea foram lavadas com Η^,υ desionizada, sacais por batimentos ligeiros, e pesadas num recipiente para contagem com tara. Foram preparados e contados com os tecidos animais pelo menos três padross do mesmo material que ιοί injectado.A percentagem da dose - o numero de contagens no orgão dividido pelo número de conta— g-aHii no padrão multiplicado por 1OO (ver o Quadro que se segue) .

Exemplo No.	Ligando do Ex. *	Metal	1 % Dose Injectada no fígado
I	3	Y	0.17
II	3	Sm	0.29
(A)	EDTA	Sm	8.4
(B)	EDTA	Sm	4.4
(C)	NTA	Sm	8.6
(D)	SmCl3	Sm	39

fOs complexos foram preparados com taxas 1 igando/meta1 de 1:1 para os Exemplos I e II; de 5:1 para o Exemplo A; e a cerca de 300:1 para Exemplos B e C.

Íxgniplos III e E.

Os complexos líl de	yttrium	(gc	iârnecidos c o m u m a
.idade marcadora de ' Y> com	o ligando	do	Exemplo 3, o qual é

riA-DuTA, e EDTA (Qompafativo E) foram preparados por métodos descritos anteriormente. Várias porçSes aliquotas de 100 μΐ foram então transferidas para tubc?s de centrifuqação separados. Adicio— που-se um excesso de YíIII) de modo a que a alteração no volume total fosse minimizada e o tempo foi registado. Meia hora depois da adição do metal, a percentagem do complexo foi determinada pelo método de permuta catiónica descrito anteriormente e esta foi comparada com a quantidade inicial de complexo. A percentagem do complexo versus metal adicionado dá. uma indicarão quanto li 1 abi1 idade do complexo ligando—metal. Os resultados são indicados no Quadro.

Quadro

Estudo Complexo

Relação Molar Metal/Ligando	% Complexo
BA-DOTA	EDTA
1	80	98
10	—	86
100	—	78
250	88	48
500	80	16

Preparação de ácido 1-C2-( 4-isotioc ie.ne.tof eni 1 ) eti 1 3-

:emolo IV

-1,4,7,10-tetraaz a· no4,7,10-triac ético.

:oiT;ple;;o de •s a m a r íum-1 di;

153

Sm<SCN-EA-D03A)3

A 100 pt 1 de '“''Sni em HCl 0,ÍM adicionaram—se 5 μι 1 de SCN-EA-D03A (5mM em HEPES 50 mM, pH 8,2) (preparado no Exemplo 18). Este foi misturado num misturador vórtice, adicionando-se gradualmente tampão HEPES (0,5M, pH 8,9) (um total de cerca de 25 μΐ) para ajustar o pH à volta de 7. A evolução da quelação foi monitorizada por CLEP numa coluna BF-250 (CLEP Sistema I). Foram obtidos rendimentos ã volta de 50X.

Exem o ir? V

Preparação de ácido u-E2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetra.aza.cic 1 ododecano-1,4,7,10-tetraacético, complexo de samarium-153; complexa C

Sm(FA-DOTA)3

A 150 microlitros (μΐ) de solução de 'Sm em HCl 0,1N (aproximadamente 4,6 mCi) foram adicionados 1 μιΐ de acetato de sódio (2,0M) e 9 μΐ de ácido a-C2-(4-aminofenil)etil]-l,4,7,10- tetraa.zac ic 1 ododecano-1,4,7,10-tetraacético misturado com sal de potássio, amónia (5 mmoles em 50 mmoles de HEPES, μ;Η 8,5, preparado pelo processo do Exemplo 9), A mistura foi agitada mecanicamente e titulada gradualmente com um tampão HEPES (0,5 M, pH 8,9;

aproximadamente 31 μΐ adicionados) até . Este foi então aquecido a 98*C num banho de areia durante 1 hora. Ao terminar, foram usados 5 μΐ da mistura para análise sobre uma coluna

Mono-D™ num Sistema CLEP II, fazendo-se a eluição com um sistema solvente em gradiente (0-15 minutos, de 0 a 100X8:; onde A = água, e E = acetato de amónio 1,0M e EDTA 0,1 mmole). Foram obtidos

Sm. 0 ácido a-l2-(4-amicano-1,4,7, í0-tetraacét.iparado foi caracterizado ctiva idêntica, pelo seu sobre colunas hono-B^' e nen ΐϊ nafenil> eti13-1,4,7,10-tetraazac ic1odode co, coiiiplsxo ds sarna ri um-153 assim pre por comparação com a amostrá não rádios, respectivo comportamento cromatográfico

GF-250, Evidencia posterior da presença do complexo radioactivo foi determinada pela conversão no derivado isotiocianato e sua.

subsequente conjugação com o anticorpo. □ complexo foi também preparado sem aquecimento (ã. temperatura ambiente) por incubação durante ά a 13 horas para resultar num rendimento de 70-3071.

Exemplo VI

Preparação de ácido a-12-( 4-isotioc.ianatof eni 1 ) eti 1 3-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano- 1,4,7,10-tetraacético, complexo 153 de samar.ium-153; complexo t* Sm(SCN-PA-DOTA)3 .

Adicionaram-se =t mistura da reacção obtida no Exemplo V 2 μΐ de tampão HEPES (0,5M, pH 3,9), 2 μΐ de tiofosgénio e 0,2 ml de clorofórmio. A mistura foi agitada mecanicamente, vigorosamente, 2 ou 3 vezes; durante alguns segundos de cada vez. A camada ds: clorofórmio foi. eliminada e a camada aquosa, que continha principalmente o produto desejado foi retida e posteriormente purificada. 0 rendimento do ácido a-E2-(4—isotiocianatofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano- 1,4,7,10-tetraacético, complexo de samarium-153, tendo como base a actividade de ^'Sm medida por CLEF' sobre uma coluna GF-250 usando o CLEF' Sistema I , foi de

35-90’Z. Para purificação.

camada aqu.osa foi feita passar

TM atra' de uma carga de Sep-Pack C-18 fazendo-sé a elu.içãc com

907 de acetonitrilo em áqua primeiros 300 μΐ do efluente foram eliminados.

o derivado—SCN qi resu1tou seguintes foi. caracterizado por CLEF' sobre SF-250, A dos 900 μ. 1 recuperação da actividade de foi superior a 907.

A massa do solvente

153,

Exemplu ν'I I

Preparação de ácido a-(4-aminC'fenil)-l,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10—tetraacético, complexo de samarium-153;

j cr 7 complexo C ''Sm (BA-DDTA)l.

j ^3

A 200 μΐ de solução de ‘''Sm em HC1 O,1N foram adicionados 1 μΐ de acetato de sódio (2,0M) e 12 μΐ de cí-(4-aminof eni 1 ) -1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético (5 mmo1es em 50 mmoles de HEF'ES, pH 8,5) (preparado pelo processe de Exempla 3). A mistura foi agitada mecânicamente e titulada gra.du.a 1 mente com um tampão HEF'ES (0,5M, pH 8,9; aproximadamente 38μ1 adicionados) até pH 7. Esta foi então aquecida a 98*C num banho de areia durante 1 hora. Ao terminar, foram usados 5 μΐ da TM miseura para análise numa coluna Mono-0 (CLEh Sistema II, fazendo—se a eluição com u.m sistema solvente com gradiente:0-15 minutos, de 0 a 1007, B; onde A - água, e B = acetato de amónio l,0M e 0,1 mmole de EDTA). Em geral, foram obtidos rendimentos de

CZ“T

85-957 tendo como base '“'Sm. 0 complexo foi. também preparado por incubação da mistura á temperatura ambiente durante 12—18 horas o que resultou num rendimento do produto do título de 80-907. 0 ác ido u- (4-a.minof eni 1)-1,4,7,10-tetraazac ic 1 ododecano-1,4,7,10-tetraacético, complexo de samarium 153 assim preparado foi caracterizado por comparação com uma amestra, autentica pelo seu TM comportamento cromatográfico numa coluna Mono-0 , conversão no derivado isotiocianato e sua subsequente conjugação com o anticorpo .

136 óxemel ο VIII

Preparação ds -tetraazaciclododecano-1,4,7,10 samarium-153; comolexo E^iJ''

ácido σ-(4-isotioc ianatofeni1)-1,4,7,1 ΟΙ e r a a c é t i c o, c o m ρ I e o d s

Sm(SCN-BA-DOT A) 3 .

Λ mistura da reacção obtida no Exemplo VII foram adicionados 2 μΐ de tampão HEPE3 (0,5M, pH 3,9), 2 μΐ de tiofosgénio e 0,2 ml de clorofórmio. Foi agitada mecSnicamente, vigorosamente, 2 ou 3 vezes durante alguns segundos de cada vez, A camada de clorofórmio foi eliminaria e a camada aquosa que continha principalmente o produto desejado foi retida e posteriormente purificada. 0 rendimento do ácido u-í4—isotiocianatofeni1)— -1,4,7,10-te traazacic 1 ododecano-1,4,7, 10-tetraacético , comp) 1 exo cie samarium-153, tal cí GF-250 tendo como foi analisado por CLEP numa cr“T base a actividade de '“'Sm usando coxuna o CLEP

Sistema I foi superior a 90%. Para purificação, a camada aquosa TM foi feita passar através de uma carça de Sep-Pak C-1S fazendo-se a eluição com 90 por cento de acetonitrilo em água. Os primeiros 0,3 ml do efluente foram desejado separou-sí il seguin·¹ liminados, e o produto com uma recuperação de

Ot)—!

periouo massa do solvente foi então evaporada durante um □ de cerca de 2 horas e o resíduo foi usado para conjugação com anticorpo.

Exemplo IX

Conjugação de ácido 1-E2-(4-isotiocianatofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraaza.cic iododecano- 4,7,10-triacético, complexo de 157 samarium-153 com anticorpo; conjugado E ” Sm ( SCN-LA-DE33A ) 3 -1 qG anticorpo usado foi CC-49, um IgG monoclonal murino que se liga a um epitopo de TAG-72, um antigénio associada a

137 tumor. Para conjugar, 187 μΐ da solução de anticorpo (1,20 x

-4 -8

KJ H em HEPES 50 mH, pH S,5) foram misturados com 4,5 x 1(J moles de Sm(SCM-EA-D03A) preparado tal como foi descrito no Exemplo IV seguindo-se a adição de uma solução de carbonato de sódio (1,OM) para fazer subir o pH até 3,9. Deixou-se a reacção continuar durante 2 horas ã. temperatura ambiente. Ao terminar, o IgG marcado com '^J'‘Sm foi isolada per filtração em gel centrifugado sobre colunas descartáveis Sephadex G-25 posteriormente purificada por CLEP sobre coluna GF-250,

-se a eluição com um tampão citrato (0,25M, pH 7,4). As (2,2 m 1 ) , serido faz en d o— f raccões contendo a IgG marcada foram reunidas, concentradas e permutadas ΤΓΊ (3x) com PBS per utilização de concentradores Centricon . A 157 actividade específica de IgG marcada com

Sm assim preparada foi de cerca de 0,16 pL'i/pg de proteina.. A integridade da prepa1 ração de C '“'Sm í EA-D03A) 3-IgG foi verificada por CLEP S.I., BioChrom. Kl), 42-48 (1936)3 e por processos padronizados, por exemplo electroforese em dodecil (Sivakoff, bioquímicos sulfato de sódiccgel poliacrilamida e autoradiografia , e radioimunoensaio de fase sólida (RIA). [Ver David Colcher et al., Câncer Res. 43, 736-742 (1933)3.

ES;em ρ 1 o__X

Conjugação de ácido l-C2-(4-isotiocianatofenil)etil3-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano- 4,7,10-triacético, complexo de * j samarium-153 com Fragmento F(ab )_, de CC-49; E 'Sm(SCN-EA-D03A) 3-Fragmento F(ab )^, de CC-49.

□ fragmento F(ab enzimática de acordo com

Nisonoff EE. Lamoyi and A .235-243 (1983)3, (225 μΐ de foi misturado com :,9 ) _, de CC-49, preparado por digestão o processo descrito por Lamoyi and Nisonoff, J. Immuncl. Methods, 56, x 10^-4M em 50 mM de HEPES, pH 8,5) IO^-3 moles de ¹⁵~'Sm(SCN-EA-D03A) ρ r e ρ a r a. d o t a. 1 como d ascrito η o emplo IV.

Haicionau-se carbonata de sódio (1,0!*!, cerca e a. reacção foi mantida, durante , . . 153,_ o fragmento marcado com bm como foi descrito no Exemplo IX, de 5 Gl) para levar o pH até 3,9, oe foi .isoladc ,5 horas. Ao terminar.

e caracterizadí ta 1

Exemplo XI (A e B)

Localização in vive» de

E^Í5''Sm(EA-D03A) 3-IqG e

C¹Sm(EA-D03A> 3-F < ab )„.

A utilidade de IgS (do xemplo IX) e F (ab )_r, de CC-49 (do Exemplo X) marcados com

1OJ

Sm (EA-D03A) foi demonstrada pela ^:ixaçã.o dos materiais marcados pelo xenoenxerto de tumor em ratinhos atímicos. Assim ratinhos atímico;

femeas

CDlbásico) foram inoculados ejetn) com a linha celular de humano (Nu/Nu, m 1 / o r i (aproxim ad amente 1

10' subcutãneamente (S.C.) (0,1 carcinoma de colori humano, LS-174 T cé1u1as/animal). Aproximadamente 2 semanas após a inoculação, cada animal foi injectado pela veia caudal com cerca de 2' pCi 153,

-30 p.q ) de anticorpo marcadc com 'Sm em PBS. Os ratinhos foram sacrificados com vários intervalos de tempo. Após sangramento, o tumor e tecidos se 1eccionados foram retirados e pesados, sendo a

153, medida num contador gama. As contagens por minuto (CPN) de “Sm em cada, tecido foram determinadas e expressas como CFM por grama de tecido por dose injectada multiplicada por 100 (7. dose injectada/grama). Os resultados são indicados nas Figuras 1-14 e Quadros IA e IB. A IgG e F(ab )^, de CC-49 (do Exemplo ZA) marcados com l ^J Sm ( SCN-Bz-DTF'A) foram incluídos no estudo para- comparação . Os resultados são indicados no Quadro IC e ID.

Exemplo XII

Conjugação do ácido a-E2-(4-isotiocianatofeni 1 )eti 1 3-1,4,7-1O-tetraazacic1ododecano- 1,4,7,10--te traacético, comp1exo • ama ri um—15' com nticorpo; conjugado ím ( SCN-PA-DOT A ) 1 · □ anticorpo usado foi CC—49, uma IgG monoclonal murina que se liga a um epitopo de TAG-72, um antigénio associado a tumor. Para conjugar, 178 μΐ da solução de anticorpo (1,26 x

moles de ácido u-E2-(4-isotiocianatofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano- 1,4,7,10—tetraacético, complexo de samarium (preparado tal como foi descrito no Exemplo VI), seguindo—se a adição de uma solução μ1) para elevar o pH prosseguir durante 2 terminada, a IgG marcada com de carbonata de sódio até cerca, de 8,9. A horas à temperatura

153, (l,0N, cerca de 17 reacção foi deixada ambiente. Uma vez

Sm foi isolada por filtração de

TM gel centrifugado sobre colunas descartáveis de Sephadex (2,,2 ml), e posteriormente purificada por GS--250, fazendo-se a eluição com um tampão

G-25

CLEF' numa coluna i trato (0,25M, pH

7,4). As frac que continham a IgG marcada, foram reunidas, concentradas e permutadas ( TM vezes) para ΡΒΞ por utilização de concentradores Centricon'. A actividade específica da IgG marcada com ^''Sm assim preparada foi de cerca de 0,16 pci/pg de proteína. A homogeneidade e a integridade do ácido u-E2-(4-isotiocianatofen i1)-eti11-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano-1,4,7,10-tetraacético, preparação complexo samarium-153-IgG foram verificadas por CLEF' e processos bioquímicos padronizados como do Exemplo IX.

□ Exemplo que se segue constitui uma alternativa para a produção de conjugados de anticorpo marcado , que envolve primeira a conjugação do BFC com o anticorpo, e a subsequent quelação para proporcionar Ab marcado com radionucI ido—BFC.

Preparação de ácido a-E2-(4-aminofeni1)eti13-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,lO-fetraacético - conjuqado A (IgG CC^,_,~F'A~DUTA) ‘armar anticorpo marcado com a subsequente quelação 153 ' v-, m f ί — ί -, l ’ J com

Sm ^CC49 para

Sm (IyG 00_ΔΟ-PA—DOTA·

153

153_r □ anticorpo marcado com Sm (PA—DOTA) pode ser preparado acoplando primeiro o E^FC, por exemplo ácido a-E2- (4-isotioc ianatofeni1)eti13-1,4,7,10—tetraazacic1ododecano- 1,4,7,1Q—tetraacético (SCN-PA-DOTA), a um anticorpo com pH 8-9, seguindo—se

153 quelação com Sm com pH 6 á temperatura ambiente durante várias horas.

Nuaia experiência típica, IgG CC-49 -foi concentrado e permutado três vezes para um tampão carbonato (50 mM, pH 9,1) num

Concentrador Amicon (grau de admissão peso molecular 30 K ;· para dar origem a uma solução com uma concentração de anticorpo — Δ

1,5 superior a solução com -4 'M. Para formar o conjugado lóí, μ 1 da solução de anticorpo contendo moles de IgG CC-49, foram misturados :om 5 pl do SCN-PA-DOTA (concentração 5mM no mesmo tampão carbonato, preparado pelo processo do Exemplo IS). A mistura foi deixada repousar à temperatura ambiente durante 5 horas, e terminou por filtração através de memoraria 30 K no Concentrador Centricon TM a 5.000 rpm na centrífuga Sorvai I RT„ D conjuqado de anticorpo foi depois lavado com 2 ml de uma solução de DTF‘A 0,25M em PBS com pH 7,4 e cinco vezes (2 nnl de cada vez) com tampão MES (20 mM, pH 5,8); centrifugado durante 30 minutos em cada lavagem. No final, o conjugado PA-DOTA-IqG foi concentrado até um volume mínimo (cerca de 100 μ1) e a sua integridade foi

141 testada por análise ULEP numa colun 1 puritiuado adicionou-se uma mistura ds

SI-—200. Ao conjugado m em HC1 O, IN (50 μΐ) e 20 μΐ de um tampão flES ( 1 , ÕM, pH è) , misturados num misturador de vórtice, e deixados repousar à temperatura ambiente durante a noite, Ao terminar, por filtração de gel centrífuga, a quantidade cr tf de Sm incorporada, avaliada por análise CLEP, foi de 0,22

EiFC-Sm/an ticorpo, Bue ¹''Sm estava associado com o anticorpo através da quelação com o EíFC, o qual foi ligado cova1entemente ao anticorpo, e não devido a ligação não—específica foi demonstrada por comparação com os resultados da experiência de controlo. Na experiência de controlo, a. solução de Ig6 CC-49 foi misturada com mistura 153_ em condições idênticas. 0 anticorpo sm isolada de uma maneira semelhante, não tinha qualquer quantidade apreciável de 1 53_c a ele associado. Deste modo, indicou que a. ligação específica de Sm ' pelo anticorpo não tinha tomado lugar sob estas condiçSes.

Exemο I□ XIII

Conjugação de ácido α-I2-(4-isotiocianatofeni1)eti13-1,4,7,1 O-tetraazacic1ododecano- 1,4,7,10-te traacético, complexo de sarna ri um-153 com fragmento F (ab )de CC-49; fragmento de C ¹ '‘'Sm<SCN-PA-DOTA) 3~F(at- ) _ .

fragmento F(ab )de CC-49 [preparado pela digestão enzimática de acordo com o processo descrito por (E. Lamoyi et al., J. Immunol, Methods 56, 235—243 (1983)3, μΐ de 1 lõ em; 50 mmoles de ΗΕΡΈ3, pH 8,5) foi misturado com 2,9 x 10 moles de ácido <;(- L2- ( 4-isotiociana tofen i 1 ) eti 1 3-1,4,7,10-te traazacic1ododecano- 1,4,7,10-tetraacético, complexo de samarium—153 preparado tal como foi descrito no Exemplo VI. Adicionou-se carbonato de sódio (1,0M, cerca de 9μ1) para levar o pH até cerca mantida durante cerca de 2,5 horas. 0 de 8,9 a reacção foi fragmenta marcado com ''Sm foi isolado e caracterizado tal como foi descrito no Exemplo IX. A actividade específica andou è. volta de 0,4 pCi/pg.

142

XIV (A

Localização in vivo do conjuqado de ácido α—12—(4—iso— tiocianatofen il)etil3-l,4,7,10-tetraazacic1ododecano- 1,4,7,10-tetraacéíico, IgG marcada com complexo de samarium-153

E(ab )

153

Sm(SCN-PA-DOTA3-IqG ¹⁵ ‘'Sm ( SCN-PA-DOTA ) 3-F(ab

A utilidade do conjuqado de ácido a-C2-(4-isotiocianatofen i1> eti 13-1,4,7,1v-tetraazac ic1ododecano- 1,4,7,10-tetrascético, IgG e F(ab )_n de CC-49 (do Exemplo XII e XIII) marcados com complexo samarium—153 foi demonstrada pela fixação dos materiais marcados pelo xenoenxerto de tumor humano em ratinhos atímicos. A biolocalização foi determinada usando o processo descrito no Exemplo XI. Os resultados são indicados nas Figuras 1 a 7 para IgG e Figuras 9 a 14 para F(ab )^, também Quadros IIA e IIB.

□ conjugado de ⁱ'^J''Sm (SCN-Bz-BTPA) com IgG e materiais marcados com F(ab )_o (preparados a partir do Exemplo ZA) foram incluídos no estudo para comparação. (Ver Quadros IC e ID).

Exemplo XV

Conjugação de ácido u—(4—isoti oc ia.natof en i 1 ) — 1,4,7,10— -tetraazaciclodouecano-1,4,7,10-tetraacético, complexo de samarium-153 com Anticorpo; C ^J‘’‘Sm ( SCN-BA-DOTA ) 3-1 gG .

A totalidade de IgG de CC-49 (174 pl de 1,2 x 10 ^14 em HEPES 0,2514, pH 3,7) foi misturada com 2,0 x 10 ^B‘moles de ácido a- (. 4-isot ioc ia.natof eni 1)-1,4,7,10- tetraazacicl ododecano—1,4,7,10-tetraacético, samarium-153 (2,3 mCi) preparado pelo Exemplo VIII, seguindo-se a adição de uma solução de carbonato de sódio (1,014, cerca de 2 pl ) para manter o pH em cerca de 3,7. A reacção

foi deixada continuar durante fio terminar, a. IqG marcada com ,5 horas è. temoeratura ambiente.

ÍCT T ^'-'Síii foi isolada por filtração em gel centrifupatío sobre colunas descartáveis de? Sechadex 11-25 \2,2ml), s posteriormsnta purificada por CLEF' sm coluna GF-250, fazendo-se a eluição com u.m tampão citrato (,o25M, pH 7,4). As fracções que continham a IqG marcada foram reunidas, concentradas e permutadas (3 vezes) com F'BS pela utilização de? concentradores TM

Centricon .A homogeneidade e a integridade da preparação de IqG marcada com samarium-153 foi verificada por CLEP e processos bioquímicos padronizados tal como foram descritos no Exemplo IX.

Conjugação de ácido a-(4-isotiocianatofenil)-l,4,7,10-tetraazacic1 ododecana-l ,4,7,10-tetracéti

-153 com Fragmento F(ab to Fiat de CC-49.

uo, compiexu samariumde CC-49; C ~ ^J'Sm ( SCM-BA-DOTA) 3-f ragmen

-;Ç_,ap ,· !

d, pH 3,7), preparado ,4 ;; 10 Vi em tampão 'o enzimática de acordo com o processo descri to por Lamoyi et al . , foi misturado com 2,1 — P, ~ moles de ácido u-í 4-isotiocianatof eni 1 )-1,4,7,10-tetraaze.c iciododecano-1 ,4,7 , lú-tetraacético, complexo de samarium--153 (preparado pelo processo do Exemplo VIII). Adicionou-se carbonato de sódio (1,0M, cerca de 2 μΐ ) para, levar o pH até 3,7, e a reacção foi mantida durante cerca de 2 horas. Ao terminar, o fragmento marcado com ~Sm fcõ isolado e caracterizado tal como foi descrita no Exemplo

144 — __ί — v t · τ τ ,·- jk _ r-, \

u.*. ;·; ,17 u j. u λ v x i \ m e b /

LOC 8.1 iz ec ec . n vivo de ácido a— ( 4 — isotioc ianatofeni 1 ) — I d 0 (Exempla XV) e F(ab )_, (Exempla XVI) marcadas com complexa de sansarium-153; C '^'‘Sm (BA__DOTA ) 3-I qG e C * “~‘Sm ( BA-DOTA1 -F < ab )^.

estudo in vivo foi realizado de acordo com o protocono . = ,.1 + = ri-_: =

Finuras 1 a 14 e Liusilros II IA e IIIB, amplos XVIII (A s 5)

Localização in vivo de ácido u—Γ2—(4—isotiocianatofe— ni1)eti13-1,4,7,10-tetraazac ic1ododecano- 1,4,7,10-tetraacético

IqS e F (ab ) _, marcados com co . 177, amplexo lu;

177

Lu í F’A_DOTA ) 1 -1 qG e

177

Lu (PA—DOTA) 3-F ( ab ).

Os- compostos do título foram preoarados e estudos in vivo foram realizados Exemplos V, VI, XII e Quadros IVA e IVB.

acordo ι_ι_·;τ u pr >co lo descrito nos

XIII e os resultados são indicados nas

Exema1ο

Β)

Loc a1i zacao nil )etil 3-1,4,7, 110-te

I :a b s F í a b ) _ z marcados e C Y (PA-DOTA) 3-F ( ab

in vivo dt? Λ eido traazaciclododecano-1,4, com complexo ytírium—90

4-i so t ioci ana tofe, 10-tetra.acético,

Γ ^{T 0} Y (F A - D 0 T A ) 3 - .1 g G (3s compostos do vivo foram conduzidos de título foram preparados e estudos acorda com a protocolo descrito in no

Exemplo VI, com a excepção de que os tecidos foram digeridos e contados por cintilação líquida e os resultados são indicados nos Quadros VA e VB.

?mo i o

Estabilidade in vitro em relação ao pH de E -CC-49-IgG e E Lu(BFC)3-CC-49-IgG.

1535m ( BFC·) 3 E ^lboSm(BFC) 3-CC-49-IgG ou. E ¹⁷⁷UJ í BFC ) 3 -CC-49-1 gG foi deixada repousar num tampão NaOAc 0,2M com pH 6,, õ, 4,0 e 2,8, •mperatu ra ;nte, e com uma concentração de proteína de cerca

M com cerca de 0,0 compiexo/anticorpo. Foram retiradas amostras em certos intevalos de tempo que foram analisadas por _ 15η;

CLEP (coluna. Gi—250) para a dissociação da actividade de Sm ou

-» -7-7 de ''Lu a partir da proteína. Em geral, o estudo foi realizado durante cinco dias cu até 907. dos radioisótopos se terem tornada dissociados. Ds resultados são expressos como a taxa inicial de perda do r-adioisótopo por dia. Qs resultados ’Sm (PA-DOTA) ,

153_c estabi1 idade superioí 1 wJ ·><

de

Sm(PA-DOTMA) demonstra ram 177, •'Sm ( BA-DOTA ) , iparação com

Os resultados são indicados no quadro que se segue.

Lu(PA-DOT A), Sm(ONe-BA-DOTA) em

1_ oraparação com o complexo padrão E ’Sm (Bz-DTPA) 3 com pH acídico.

corre151 u e

Esta maior estabilidade dos co 1aciona bem com a clearance mais rápid· partir do orqanismo e de tecidos que n exemplo rim, fígado): ver Fig» 1—34.

cone t ci iiibém se m e ds ¹' Lu buem a1vos (ρo f

BFC	Isotopo	% Perda de Isotopo/Dia pH
6.0	4.0	2.8
Bz-DTPA	^Sm	<2	35	35
PA-DOTA		<2	<2	<2
BA-DOTA		<2	<2	<2
PA-DOTA	177Lu	<2	<2	<2
MeOBA-DOTA	153Sm	<2	<2	<2
EA-DO3A		<2	90	95
PA-DOTMA	1 b JSm	< 2	< 2

Ε X g m ρ I ο X X I (A e R V

Localização in vivo de ácido

-1,4,7,10-tetraazacic1ododecano-1,4,7,

F(ab )^ marcados com complexo samarium ^155

-IgG e C 'Sm<MeO-BA-DOTA)3-E(ab )^.

Os compostos do título foram preparados de acorda com os processos descritos nos Exemplos V, VI, XII. e XIII, e os estudos i 11 vivo foram realizados por processos do Exemplo XI . Os resultados são indicados nos Quadros VIA e VIB.

•k- (2—metcx i-5-aminofeni 1 ) lO-tetraacético, IgG c -153 C ¹'^J''Sm<MeO-BA-DOTA) 3147 como 1 e>

153,-.

ím (PA-uOTMA ) .

, Θ1N; com Fí

153

A 100 microlitros <μ1) de bm (0,0 x mCi) foram adicionados 6 μΐ de ΡΑ-ΕΈ'ΤΜΑ ίο preparado pelo processo do Exemplo -.TM

-M em HC1 (d i as tereomero

TilM em água Milli-Q ), 20 μΐ de um tampão ME3 (i,0M, pH ó) e 1 μΐ de um tampão ΗΕΡΕΞ (0,5M, pH 8,7). Esta solução foi misturada num misturador de vórtice e o pH final da mistura foi de cerca de Após aquecimento da mistura a 90 °C durante 30 minutos, ela analisada por CLEF' numa coluna GF-250 em relação ao qrau o .

foi de por complexação, e foram geralmente obtidos rendimentos de 9<cento ou superiores. A caracterização do complexo Sm-PA-DDTMA foi proporcionada por comparação comi o complexo Sm-não radioactivo, o qual tinha sido sintetizado e caracterizado independentemente no Exemplo 42.

V V τ τ T

Λ j. j. 1 r reparaç/to

153,

... J· V-‘-'r'· ,Τ,Ε' Λ_!~i TM Λ — v- ... _ - -q ... r- _ Γ- . . ... V V Τ T — _r% ÍJ ,_ηηΓ K L/CJ i 5 Η-l |θΓΰ?ράι ci >_iΠ O C. X ιχ’ΓΓ.1 O Λ Λ j. 1 Z?

tendo sido arrefecida durante 20 minutos à temperatura ambiente adicionaram-se Ι0μ1 de uma solução de tiofosqénio a 1 por cento em 90 por cento de meio acetonitrilo-água. A mistura foi misturada vigorosamen' num misturado temperatura ambiente entre cerca de sa1izou-se instantaneamente facto vórtice, e deixada repousar à 5 e 20 minutos, A reacção que foi monitorizado 1 por a.c ti vado, análise por CLEP. Para a purificação do complexo _---bm este foi extraído 3 vezes (200 μΐ de cada vez) com clorofórmio e a camada aquosa foi feita passar através de uma carga de F'F:P . TM (carga rXP = carga Mini-clean de Mlltech Associates, Deerfield,

148

IL) ρ r	(i —	tratada	com 5	ml	de metanol e		mi de tampau	HLS (	20	lilM ,
r~. Í—j '“g f·’1 ·_< ;) ·_·		Bepois	de ser		lavado com 5 íf	1 1	do tampão ME	3 θ 5	ml	da.
é.QtJ.e. M	£ 1	I i-Q™,	f (j £	t r	aido com 90õ μ	I	de acetonitri	Io a	Ç10	nrtr i---
cen to	•a	f i m d e	recuper	a r	a p r o :·: ima d a m e n	i-	e 90 por cento	d a	ac t	1VI. ”

dade de ¹⁵³Sm

.... i, i primeiros x. D y ρ x i ± πι ι π cid j evaporada, até à secura sob pressão reduzida inferiores a 4õ-’C, s o resíduo que continha produto do títu.lo foi usado para conjugação com o anticorpo,.

A mistura foi teme? e r a. t u. r a. -a prinoipa1mente o

Exemplo XXIV ÍA e B)

Con j ugação de

153, >m(SCN-PA-DOTMA) com IqG e F(ab ),

CC

Em geral, o anticorpo foi concentrado e permutado :om um tampão carbonato ( pH 9,1 ou 9,5, 50 mM) num concentrador

Centricon

TM (grau de admissão peso molecular 30 K) para resultar numa, concentração de proteína de 1,5 κ 10 M ou superior. Para conjugar, um pequeno volume do tampão carbonato, que é requerido -Δ para levar a concentração final de proteína até 1,5 10 ‘M, é '“i adicionado ao derivado isotiocianato de ''*’Sm < PA-DOTMA) ípreparao anticorpo concentrado, ‘Sm. A mistura foi mistu— reagir à temperatura . . 153„ :ento do sm do no Exemplo X.X I I I ) , seguindo—se equ. imola, r em relação ao complexo BFC— rada num misturador vórtice e deixada ambiente durante 1 hora ou até 49 a 59 ρ ligado ao anticorpo, tal como é indicado por análise com CLEF' numa coluna de GF—259. 0 anticorpo marcada foi isolado por meio de duas filtrações consecutivas em gel cen tr í f uqa.do em colunas Sephade;·: G—20 (2,2 ml). A homogeneidade, inteqridade e imunoreactividade do anticorpo marcado foram analisadas .por análise com CLEF’ e por técnicas bioquímicas padronizadas descritas anterior— men te.

149

Exemolo XXV (A e B)

Istudoí marc a dos :om Sm ( F‘A—UOTMA ) .

Biodistribuicão

IqG

CC

Us estudos foram realizados de um modo semelhante ao descrito no Exemplo XI. Cs resultados são indicados nos QuadrosVI IA e VI IB. Ver Figuras 15-23.

Exemplo XXVI i ~7~f

Preparação de complexo ' Lu (PA-DQTMA).

A 39 μI de ^1/zLu (6 x 10~'³ M em HC1 1,1N; 4 mCi ) adicionaram-se 36 μΐ de PA-DOTMA (preparado pelo processo do _TM txeaplo 29); solução 5mM em água milli-Q ). A solução misturada num misturador vórtice, e adicionaram-se 115 μΐ de MF3 (1.9M. pH 6,9) para neutralizar a solução até pH ι Ol um de c e r c a d e a 6. Esta foi aquecida a 99 *C durante 30 minutos

-λ Γ cí vj	ar ori	Qêcfííi 5	u í n a g u s 1 a u. a o super i o r a	90% . Al	mistura foi
f e i t a	passar	atrav	és de uma carga de F'F'P pré-	tratada	com 5 ml de
metano	I e 5	m 1 d e	tampão MEó (29 mM, pH 5.,6) „	Foi lã'	v a c! a c o m 5 m 1
de águ	a Mi 11	TM i-Q 1 .	D complexo extraído em 1	.909 μΐ	de acetoni-

trilo a 907. contribuiu em 737, para a actividade inicial de ¹⁷'Lu (eliminando os primeiros 100 μΐ do extracto).

Ε ;< Ç?fR D 1 (	ν γ 1.1 τ τ Λ. /·. Vil
	Preparação da	' ' Lu (SCN-FA-L>0	Τη A)
		» -? -τ
	A o c: o m ω 1 e x o	* ‘ ' Lu(PA-OOTMA>
obtido	no Exemplo XXVI	ad ι c i on a r a m—s e	ó μΐ
1 07 em	acetonitrilo a 90	7. Esta so1uç ão	foi
r a d o r \	-'órtice, e após 20	minutos, foi a	ΓΪ ct 1 i

acetonitrilo a. 907 dg tun ticfDsqsnio a do derivado isotiocianato por CLEF', A reacção é, em geral, quantitativa. A remoção do solvente e do excesso de tiofosgénio foi realizada por evaporação sob oressão reduzida a temperaturas inferiores a 40'^;'L durante 1 a 2 horas conjugação com o anticorpo.

íi usado par

Conjugação ds

17(

Lu(PA-DOTMA) com IgG GC49.

anticorpo IgG CC49 num tampão carbonato (50 mM, pH ··.

iisturado com uma quantidad;

squimclar do derivaof isotiocianato (preoarado oelo processo do Exemplo XXVII) no mesmo t ;A Γ7:

arapáo. A reacção foi mantida durar ação de anticorpo de 1,5 ;

.Tiinuios com uma concen o anticorpo marcado foi .isolado e caracterizadc; de acordo com processos descritos no Exemplo IX.

71,

E x em ρ 1 o__X_X_I_X

Estudos de Biodistribuição

77 1 ~7~

Marcada com ' Lu(PA—DOTMA) a com ' ' a Longo Prazo de IgG Lu(PA-DOTA) ..

149 teste animal a longo prazo foi realizado com o *7“7 anticorpo marcado com ^iZ/Lu, beneficiando da sua longa meia vida r

BAD ORIGINAL

(161 horas). Foi realizado am ratinhos talidc d.noxnts am ' ·' tris; semanas.. de acordo som protocolos :z.: .r:s no XI, Os resultados são inri içados no Ouadro VII IA. Ver ρ e z' ί o d c?

E ;:s.Tiõi o

-0:0 ra s

Mas Figuras, que registam os dados dos. quadros que sequem, os símbolos usados foram:

BAD ORIGINAL

152 -

Conjugados	Símbolo	Quadro	íguras	Exemplo Bio.
[ J^Sm(EA-DO3A)]-IgG-CC-49	Δ	IA	1-7	IX
[153Sm(EA-DO3A)]-F(ab'2)-CC-49	Δ	IB	8-14	X
[]53sra(Bz-DTPA)]-IgG-CC-49	0	IC	1-7	ZA
[153sm(Bz-DTPA)]-F(ab'2)-CC~49	0	ID	8-14	ZA
[ ^smíPA-DOTA)]-IgG-CC-49	□	IIA	1-7	XII
[153sm(PA-DOTA) ]-F(ab’2)-CC-49	□	IIB	8-14	XIII
íÍÊoSm(BA-DOTA^~IeG-cc-49		IIIA	1-7	XV
[ 153sm ( BA-DOTA )]-F( ab ’ 2)-CC-49		IIIB	8-14	XVI
['53sm(PA-DOTMA)]-IgG-CC-49	V	VIIA	15-21	XXIV
[153Sm(PA-DOTMA)]-F(ab’2)-CC-49	V	VIIB	22-28	XXV
[ 177Lu(PA-DOTMA)]-IgG-CC-49	•	VIIIA	29-34	XXIX
[ 77Lu(PA-DOTMA )]-IgG-CC-49	►	VIIIA	29-34	XXIX

Nas figuras que acompanham esta descrição os dados representam o seguinte:

FIGURa	Orgão	TÍTULO
1	Sangue	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-lgG*
2	Fígado	Biodistribuição de15^^m-BFCCC49-lgG*
3	Baço	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-lgG*
4	Rim	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-lgG*
5	Tumor	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-lgG*
6	Femur	Biodistribuição de15^Sm-BFCCt49-lgG*
7	Retenção Corporal Dota]	Biodistribuição dei53Sm-BFCCC49-lgG*
8	Sangue	Biodistribuição de l53Sm-BFCCC49-F(ab')2*
9	Fígado	Biodistribuição del53Sm-BFCCC49-F(ab')2*
10	Rim	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-F(ab')2*
11	Baço	Biodistribuição del53Sm-BFCCC49-F(ab')2*
12	Tumor	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-F(ab')2*
13	Femur	Biodistribuição de FSSSm-BFC- CC49-F(ab')2*
14	Retenção Corporal Total	Biodistribuição de !53Sm-BFCCC49-F(ab')2*
15	Sangue	Biodistribuição (C49-lgG*
16 •r	Fígado	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-lgG*

em ratinhos rapados com tumor LS174-T em ratinhos balb/C

154

FIGURA	Orgão	Titulo
17	Baço	Biodistribuição de'53Sm-BFCCC49-lgG*
18	Rim	Biodistribuição de 153Sm-BFCCC49-lgG*
19	Tumor	Biodistribuição de l53Sm-BFCCC49-lgG*
20	Fémur	Biodistribuição del53Sm-BFCCC49*lgG*
21	Retenção Corporal Total	Biodistribuição de 153Srn-BFCCC49-lgG*
22	Sangue	Biodistribuição de i53Srn-BFCCC49-F(ab')2*
23	Fígado	Biodistribuição de153Sm-BFCCC49-F(ab')2*
24	Baço	Biodistribuição de'53Sm-BFCCC49-F(ab')2*
25	Rim	Biodistribuição de 153Srn-BFCCC49-F(ab')2*
26	Tumor	Biodistribuição de 153Sm-BFCCC49-F(ab')2*
27	Femur	Biodistribuição de l53Srn-BFCCC49-F(ab')2*
28	Retenção Corporal Total	Biodistribuição de i53Sm-BFCCC49-F(ab')2*
29	Sangue	Biodistribuição de 177i_u-BFCCC49-lgG**
30	Fígado	Biodistribuição de 177|_u-BFCCC49-lgG**
31	Baço	Biodistribuição de- 177Lu-BFCCC49-lgG**
32	Rim	Biodistribuição de i77Lu-BFCCC49-lgG**

^V em ratinhos rapados com tumor LS174-T ** em ratinhos balb/C

FIGURA	ORGAN	TITULO
33	Femur	Biodistribuição de 177Lu-BFCCC49-lgG**
34	Retenção Corporal Ibtal	Biodistribuição de 177|_u-BFCCC49-lgG**

em ratinhos rapados com tumor LS174-T * em ratinhos balb/C

CPi •U·

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Ξ C Π Ξ- Í d E 'f~ E Ç S O apresou tsda, considerados sos··'.’·:;: como õxempbos, seudo; o verdadeiro tubi irvarto indicados pelas reivindicações que se segues,

BAD ORlGWAL

174

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES;

   lâ. - Processo para a preparação de um composto com a fórmula

   Q¹ f

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   H

   Q (IA) em que:

   cada Q é independentemente hidrogénio ou (CHR^) CO^R;

   O* é hidrogénio ou (CHR^J) CO^R;

   w 2 cada R independentemente é hidrogénio, benzilo ou C^-C^ alquilo;

   com a condição de que pelo menos dois do total de Q e de devem ser diferentes de hidrogénio;

   cada

   Ff independentemente é hidrogénio ou C^-C^ a1quilo;

   X e Y são cada um, independentemente, hidrogénio ou podem ser tomados em conjunto com um X e Y adjacentes para formar uma ligação adicional carbono-carbono;

   n é O ou 1;

   m é um número inteiro de 0 a 10 inclusivé; ρ = 1 ou 2;

   r = 0 ou 1;

   w = 0 ou 1;

   com a condição de que n é apenas 1 quando X e/ou Y formam uma ligação adicional carbono-carbono, e a soma de r e w é

   0 ou 1 ;

   F;^ é hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, maleimido, bromoacetamido ou carboxilo;

   R'-' é C^-C^ alcóxi, —OCH^CO^H, hidroxi ou hidrogénio;

   R^ é hidrogénio, nitro, amino, isotiocianato, semicarbazido, tiosemicarbazido, maleimido, bromoacetamido ou carboxilo;

   176 com a condição de hidrogénio mas um de entre R que R* e o⁴ a e R deve

   R não podem ser ser hidrogénio;

   ambos com a condição de que ser diferente de hidrogénio; ou quando pi é hidrogénio, R' deve de um seu sal farmaceuticamente aceitável;

   caracterizado por compreender qualquer um dos que se sequem:

   passas (A) reacção de um composto com a fórmula

   H (VA) em que

   Q¹ é (CHR⁵) CO^R;

   177 cada R independentemente é benzilo ou C^-C^ alquilo;

   cada R^J independentemente è hidroqénio ou C^-C^ alquila;

   Xe Y são cada um, independentemente, hidrogénio ou podem ser tomadas em conjunta com um X e Y adjacentes para formar

   uma. 1iqação adicional carbono-carbono; n é Ô ou 1; rn é um númer o inteiro de 0 a 19 inclusivé; r = 0 ou 1; w = 0 ou 1 ; com a condiç ão de que a soma de r e w é O ou 1 ; com um éster de ácido α-halocarboxí1ico com a fórmula

   BrCH_QCO-,R onde cada R independentemente é benzilo ou Cj— alquilo;

   na presença de um solvente orgânico e de uma base, a uma temperatura de desde 0°C até refluxo,

   178 para proporcionar os compostos com a fórmula (I.A) em que;

   X, Y, q\ m, n, r são definidos como anteriormente;

   5 4 5

   R-, R , R são hidrogénio;

   R é C-^-4 alquil^{0 ou} benzilo; e

   R- é nitro; ou (B) reacção do produto do passo (A) com um aqente de hidrogenação, tal como F‘d/C com hidrogénio, em condiçSes de reacção padrão, para proporcionar os compostos com a fórmula (IA) em que:

   X, Y, Cp, m, n, r são definidos como anteriormente;

   5 4 5

   R^-,, R , R são hidrogénio;

   R é alquilo ou benzilo; e ^/-Ί

   R·' é amino; ou

   179 (C) reacção da produto do passo (B) com um agente de desesterificação, tal como um ácido forte, para proporcionar os compostos com a fórmula (IA) em que:

   X, Y, m, n, r são definidos como anteriormente;

   5 4 5

   R-, R , R são hidrogénio;

   R é hidrogénio; e

   R é amino; ou (D) reacção de um composto com a fórmula (VA) tal como foi definido anteriormente com um «-benzeno-sulfonato ópticamente activo com a fórmula em que R e Rr5 são definidos como anteriormente.

   para proporcionar os compostos com a fórmula (IA) em que:

   X, Y, R⁷, m, n, r são definidos como anteriormente;

   .j, Xj.

   R e R são hidroqénio;

   R é alquilo ou benzilo; e

   R^- é nitro; ou

   (E) reacção do produto do passo (D) com um agente de hidrogenação, tal como Pd/C com hidrogénio, em condições de reacção padrão , para proporcionar os compostos com a fórmula (IA)

   em que:

   1 y

   X, Y, Q , R' ,, m, η, r são definidos como anteriormente;

   3 4

   R e R são hidrogénio;

   R é Cj_4 alquilo ou benzilo; e

   R^ é amino; ou

   1Β1 (F) reacção do produto do passo (E) com um agente de desesterif icação, tal como um ácido forte, para, proporcionar os compostos com a fórmula (IA) em que:

   1 é*⁷'

   X, Y, Q , R^J, m, n, r são definidos como anteriormente;

   5 4

   R , R e R são hidrogénio; e

   R- é amino; ou (G) reacção de um composto com a fórmula (IVA) em que:

   Xe Y são cada um, independentemente, hidrogénio ou podem ser tomados em conjunta com um X e Y adjacentes para formar uma ligação adicional carbono-carbono;

   182

   3 . . .

   R ' é C -C₄ alcóxi, -OCH₂CC>₂H ou hidroxi;

   n é 0 ou 1;

   m é um número inteiro de 0 a 10 inclusivé;

   r = 0 ou 1;

   com a condição de n ser apenas 1 quando X e/ou Y formam uma ligação adicional carbono-carbono;

   com um ácido α-halocarboxílico com a fórmula

   BrCH₂CO₂H na presença de um solvente orgânico e de uma base, a uma temperatura de desde 0°C até refluxo, para proporcionar os compostos com a fórmula (IA) em que:

   X, Y, m, n, r são definidos como anteriormente;

   12_.

   Q e R sao hidrogénio; e

   R⁴ é nitro; ou (H) reacção do produto do passo (G) com um agente de hidrogenação, tal como Pd/C com hidrogénio, em condições de

   - 183 re em cção padrão para proporcionar os compostos com a fórmula (IA) que:

   X, Y, m, n, r são definidos como anteriormente;

   1 2 5

   Q , R, R^-1 e R são hidrogénio; e o

   R é amino; ou (I) reacção de um composto com a fórmula em (VIIIA)

   X e Y são cada, independentemente, hidroqénio ou podem ser tomados em conjunto com um X e Y adjacentes para formar ligação adicional carbono—carbono;

   uma

   184

   Q¹ é CH^CO^R;

   R é benzilo ou alquilo;

   n ê O ou 1;

   m é um número inteiro de 0 a 10 inclusivé;

   r = O ou 1;

   com a condição de n ser apenas 1 quando X e/ou Y formam uma ligação adicional carbono-carbono;

   com um ácido u-halocarboxí1ico com a fórmula

   BrCH^CO^R onde R é definido como anteriormente;

   na presença de um solvente orgânico e de uma base, a uma temperatura de desde 0°C até refluxo, para proporcionar os compostos com a fórmula (IA) em que:

   X, Y, qI, Q, m, η, r bSd definidos como anteriormente;

   R¹ é hidrogénio; e nitro;

   QU (J) reacção do produto do passo (I) com um agente de desesterificação, tal como ácido forte, seguido de um agente de hidrogenação, tal como Rd/C com hidrogénio, em condições de reacção padrão para proporcionar os compostos com a fórmula (IA) em que:

   X, Y, Q, m, n, r são definidos como anteriormente;

   R, R e R são hidrogénio; e

   R é amino; ou (K> reacção do produto do passo (B), (F), (H) ou (J)

   O com tiofosgénio para fornecer o composta correspondente ent que R~ 4 ou R é isotiocianato.
2. 2é, - Processo de acordo com a Reivindicação 1, para a preparação de um sal farmaceutlcamente aceitável do composto de fórmula (IA), caracterizado compreender a reacção do composto de fórmula (IA) com um reagente adequado, por métodos conhecidos, de modo a obter adutos de potássio, sódio, lítio, amónio, cálciD, magnésio e cloreto de hidrogénio, como sal farmaceuticamente aceitável.

   186
3. 3é. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(K), para a preparação do ácido 1-C2-(4-isotiocianatofeni1)eti13-1,4,7,10-tetra-azaciclodecano—4,7,10-triacético, caracterizado por compreender a reacção do sal hldrocloreto do ácido 1-E2-(4-aminofenil)eti!3-l,4,7,10-tetra-azaciclodecano-4,7,10-triacético com fosgénio.
4. 4â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(Η), para a preparação do ácido í-(2-metoxi-5-aminobenzi1)-1,4,7,10-tetraazacic1odecano-4,7,10—triacético, caracterizado por compreender a reacção do ácido 1-(2-metoxi-5~nitrofeni1))-l,4,7,10-tetra-azacic1odecano-4,7,10-triacéticD com hidrogénio numa bomba de Rarr.
5. 5â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(H), para a preparação do ácido 1-(2-hidrox.i-5-aminobenzi 1 )-1,4,7,10-tetraazaciclodecano-4,7,10triacético, caracterizado por compreender a reacção do ácido N-(2-hidroxi-5-nitrofeni1))-1,4,7,10-tetraazaciclodecano-4,7, lOtriacético com hidrogénio e F'tO^.

   óé. - Processa de acordo com a Reivindicação 1(E>, para a preparação de éster 1-isopropí1ico-4,7,10-trimetί1ico do ácido a-C2-(4-aminofeni1)etil3—1,4,7,10-tetra-azacic1odecano-1-(R,S)-acéti.co-4,7,10-tris-(R-meti 1 acético) , caracterizado por compreender a reacção do éster 1—isopropí1ico—4,7,10—trimetí1ico do ácido c(-E2- (4-ni trof eni 1 )eti!3-l,4,7,l 0-tetra-azaciclodecano-1- (R , S) -a167 cético-4,7,Ιθ-tris-(R-meti1 acético) com hidrogénio e paládio sobre carbono.
6. 7â. - Processo de acordo corri a Reivindicação 1(F), para a preparação do ácido a-E2-(4-amiriofenil)etill-l,4,7,10-tetra-azaciclodecano-1-(R, S)-acético-4, 7,Ιθ-tris-(R-meti1 acético), caracterizado por compreender a reacção do éster

   1-ísopropí1ico-4,7,1Θ—trimeti1ico do ácido «-E2—(4-aminoferiil>etill-1,4,7,Ιθ-tetra-azaciclodecano-1-(R, S) -acé tico-4,7,10--tris(R~metilacético) CDm ácido clorídrico.
7. 8é. - Processo de acordo com a Reivindicação Í(K>, para a preparação do ácido o-E2-(4-isotiocianatofeni1)eti13-1,4,7,1Θ-tetra-azaciclodecano-1(R,S)-acético-4,7,Ιθ-tris-(R-meti1acético), caracterizado por compreender a reacção do ãcido ó<-E2-(4aminofenil>etill-l,4,7,1O-tetra-azaciclodecano-1-(R,S)-acético-4,7,1θ-tris-(R-meti1acético) com tiofosgéniD.
8. 9â. - Processa de acordo com a Reivindicação 1(53), para a preparação do ácido ct-( 4-aminof eni 1 )-1,4,7, 1 θ-tetra-azac icl odecano-1,4,7-triacético, caracterizado por compreender a reacção do ácido a-(4-nitrofenil)-l,4,7,Ιθ-tetra-azaciclodecano-1,4,7—triacético com hidrogénio e F'tO_?.

   IBS
9. 10â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(B), para a preparação do ácido a-(4-aminofeni1)-1,4,7,10-tetra-azacίο 1adecano-1,4,10-triacético, caracterízado por compreender a reacção do ácido ci-(4-nitrofeni 1 )-l ,4,7,10—tetra-azacic lodecano—

   -1,4,10-triacético com hidrogénio e PtO,-,.

   llé. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(B), para a preparação do ácido a-(4-aminofeni1)-1,4,7,10-tetra-azacίο lodecano-1,4,7, 10-tet.ra-acé tico , caracterizado por compreender a reacção do ácido a-(4-nitrofeni1)-1,4,7,10-tetra-azaciclodecano1,4,7,10-tetra-acético com hidrogénio e PtO_Q.
10. 12â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(10, para a preparação do ácido q-(4-isotiocianatofenil)-i,4,7,10-tetra-azaciclodecano-1,4,7,10-tetra-acético, caracterizado por compreender a reacção do ácido a-(4-aminofenil)-l,4,7,10~tetra-azacic lodecano-1,4,7,10-tet.ra-acética com hidrogénio e PtO^,.
11. 13ê. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(A), para a preparação de éster 1,4,7,10-tetrameti1ico do ácido a-C2- ( 4-nit.rof eni 1 )etil3-l,4,7, 10-te tra-azacic lodecano-1,4,7,10— tetra-acético, caracterizado por compreender a reacção do éster

    1-metílico do ácido c<-C2-(4-ni trof eni 1 ) eti 1 3-1,4,7,10-tet.ra-azaciclodecano-l-acático com bromoacetato de metilo.

    189
12. 14à. - ProcessD de acordo com a Reivindicação 1(B), parra a preparação de éster 1 ,4,7,10-tetrametí lico do ácido a-C2-(4-aminofeni1> eti11-1,4,7,10-tetra-azaciclodecano-1,4,7,IO— tetra-acético, caracterizado por compreender a reacção do éster

    1,4,7,10-tetrametílico do ácido «2-(4-nitrofenil>etil3-1,4,7,10tetra-azacic1odecano-1,4,7,1Otetra—acético com hidrogénio e paládio sobre carbono.
13. 15ê. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(0, para a preparação do ácido «-C2-(4-amiriof eni 1 )etil 1-1,4,7,10-tetra-azaciclodecano-1,4,7,10-tetra-acético, caracterizado por compreender a reacção do éster 1,4,7,1O-tetrametí1ico do ácido c<~ E2- (4-amino feni 1 )eti13-1 ,4,7, 10-tetra-azacic1 odecano-1,4,7,10— tetra-acético com ácido clorídrico.

    lóâ. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(K>, para a preparação do ácido a~C2-(4-.isotiocianatofenil)etill-1,4,7,10—tetra—azacic1odecano—1,4,7,10—tetra-acético, caracterizado por compreender a reacção do ácido a-C2-(4-aminofeni1)eti11-1,4,7,10-tetra-azacic1odecano-1,4,7,10-tetra-acéticD com tiofosqénio.
14. 17ê. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(J>, para a preparação do ácido a-(2-metoxi-5—nitrofenil)-l,4,7,10-tetra-azaciclodecano-1,4,7,lOtetra-acético, ' ' caracterizado por

    190 compreender a reacção do éster tetrametí1ico do ácido a-(2~metoxi-5-nitrofenil)etili-l,4,7,10-tetra~azac iclodecano-1,4,7,10tetra-acético com ácido clorídrico.
15. 18é. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(J), para a preparação de sal tetra-amónio do ácido «-(2—metoxi-5-aminofeni1)-1,4,7,10-tetra-azaciclodecano-1,4,7,10tetra-acético, caracterizado por compreender a reacção do ácido u-(2-metoxi-5nitrofenil)-1,4,7,10—tetra—azac iclodecano-1,4,7,10tetra—acético com hidrogénio e PtO_,, z.
16. 19é. - Processo de acordo com a Reivindicação 1(K), para a preparação de sal tetra-amónio da ácido <a-(2-metoxi-5-isc>tiocianatofenil) eti13-1,4,7,10-tetra-azacic1cdecano-1,4,7,10tetra-acético, caracterizado por compreender a reacção do ácido ci- (2-metoxi-5-aminofeni l)etil3-l,4,7,10-tetraazaciclodecano-l,4,7,10-tetra-acético com tiofosqénio.
17. 20é. - Processo para a preparação de um complexo de um composto de acordo com qualquer das Reivindicações 1 a 19 com um metal seleccionado a partir de La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Sd , Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y e Sc, caracterizado por compreender a reacção do composto com d ião do metal.

    191
18. 21*. - Processo de acordo com a reivindicação 20

    149_r , . . . . 153„ 166_u 90_v caracterizado por o ião do metal ser Sm, Ho, Y,

    Gd,

    La,

    177, 175_v.

    Lu, Vb,

    47„ 142_n

    Sc ou Pr,

    Processo de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por o ião do metal ser

    153

    177, 90_v

    Lu ou Y.
19. 23*. - Processa de acordo com qualquer das Reivindicações 20 a 22, caracterizado por a reacção ser realizada quente.
20. 24*. - Processo para a preparação de um conjugada contendo um complexo de u.m composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações la 19 complexado com um ião de um metal seleccionado a partir de La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Y e Sc, caracterizado por se ligar covalentemente o complexo a um anticorpo ou fragmento de anticorpo.
21. 25*. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o ião do metal ser

    153

    166,, 90,, 149.-,

    Ho, Y, Pm, ^15SIGd, ^14yLa, ¹⁷⁷Lu, ¹⁷⁵Yb,

    Sc ou

    142_p

    Pr.
22. 26*. - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por o ião do metal ser ^⁷⁷Lu ou ^7<^Y.
23. 27â. - Conjugado de acordo com qualquer uma das Reivindicações 24 a 2ó, caracterizado por o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser um anticorpo monoclonal om um seu fragmento.
24. 28â. - Conjugado de acordo com a Reivindicação 27, caracterizado por o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser CC-49, CC-49 F(ab')^, CC-83, CC-83 F(ab'>^ ou B72.3.
25. 29é. - Processo para a preparação de de um conjugado contendo um composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 19 ligado covalentemente a um anticorpo du fragmento de anticorpo, caracterizado por compreender a reacção do composto com um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

    3ôâ. - Conjugado de acordo com a Reivindicação 29, caracterizado por o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser um anticorpo monoclonal om um seu fragmento.
26. 31â. - Conjugado de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por o anticorpo ou fragmento de anticorpo ser CC-49, CC-49 F(ab')₇, CC-83, CC-83 F(ab')_P ou B72.3.

    Lisboa, 23 de Junho de 1989