CN105087427B - 产琼胶酶的需钠弧菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产琼胶酶的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ‑1及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC M 2015244，保藏日期：2015年4月23日。该菌产生的琼胶酶为胞外酶，分离纯化简单，无需细胞破碎；产酶活性比较高，在优选条件下，未经过纯化的粗酶酶活力达到103U/mL；该菌所产的琼胶酶降解琼胶需要的反应条件温和，专一性好，对环境无污染，可用于大量制备新琼寡糖。

Description

产琼胶酶的需钠弧菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种产琼胶酶的需钠弧菌及其应用。

背景技术

琼胶(agar)是一种从海洋红藻中提取的多糖，在食品、医药、卫生等行业已有悠久的应用历史，但由于其黏度高，水溶性低，不易被吸收，在应用方面受到一定的限制。琼胶寡糖是琼胶经降解得到的聚合度2～10的低聚糖，又称琼胶低聚糖，主要由琼二糖的重复单位连接而成，由于水溶性好，容易被人体吸收，因此其在医药领域具有较高的应用价值。研究表明琼胶寡糖能够抑制血糖升高，提高人体免疫力，抗肿瘤，减少细胞的氧化损伤等，是一种极具开发潜力的低聚糖。

现有技术中制备琼胶寡糖的方法一般为酸降解法、衍生化降解法、氧化还原降解法和酶解法。酸降解法制备琼胶寡糖，所得产物均一性较差，重复性差，反应条件需要高温高压而存在安全隐患，且酸降解法不可避免地破坏糖的结构，导致琼胶寡糖生理生化活性的丧失，此外酸降解法所使用的酸性物质会对周围生态环境造成严重污染；衍生化降解法主要用于多糖的组分结构分析，在用于合成寡糖时，其过程复杂；氧化还原降解法是利用反应中产生的羟基自由基使糖链发生非专一性的断裂，此方法的专一性差，无法重复，不利于琼胶寡糖的制备；酶解法制备琼胶寡糖具有催化效率高、产物专一性好、反应条件温和、产物易控制、无污染等诸多优势，但由于缺乏产酶活力高的菌株，导致琼胶酶产量低下，提高了酶解法的生产成本，限制了该法的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种产琼胶酶的需钠弧菌及其应用。

本发明的具体技术方案如下：

产琼胶酶的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC M2015244，保藏日期：2015年4月23日。

上述产琼胶酶的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1在制备琼胶酶中的应用。具体包括如下步骤：

(1)将所述需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1接种于斜面培养基，于30～35℃下培养24～48h，进行活化；

(2)将活化后的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1接种于种子液体培养基中，于30～35℃下培养8～24h，得到种子液；

(3)将种子液接种于液体产酶培养基中，于30～35℃下培养42-48h，得到含琼胶酶的发酵液；

(4)将上述含琼胶酶的发酵液经离心除去菌体后，经硫酸铵沉淀分离，再透析，最后冻干得琼胶酶粗酶粉末。

在本发明的一个优选实施方案中，所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

在本发明的一个优选实施方案中，所述种子液体培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

在本发明的一个优选实施方案中，所述液体产酶培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

一种以新琼二糖为结构单元的新琼寡糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1接种于斜面培养基，于30～35℃下培养24～48h，进行活化；

(2)将活化后的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1接种于种子液体培养基中，于30～35℃下培养8～24h，得到种子液；

(3)将种子液接种于液体产酶培养基中，于30～35℃下培养42-48h，得到含琼胶酶的发酵液；

(4)将上述含琼胶酶的发酵液经离心除去菌体后，经硫酸铵沉淀分离，再透析，最后冻干得琼胶酶粗酶粉末；

(5)以上述琼胶酶粗酶粉末为催化剂对琼胶进行酶解，酶解体系如下：上述琼胶酶粗酶粉末浓度1～5％，底物浓度0.1～0.5％，酶解缓冲液为pH 7.0～7.5的Tris-HCl缓冲液，酶解温度40～45℃，酶解时间24～36h；

(6)将步骤(5)的酶解产物冷却后，离心过滤除去未被降解的琼胶，制得所述新琼寡糖。

在本发明的一个优选实施方案中，所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

在本发明的一个优选实施方案中，所述种子液体培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

在本发明的一个优选实施方案中，所述液体产酶培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

本发明的有益效果是：

1、本发明的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1经鉴定该菌为Vibrionatriegens，分离自福建省漳州市某紫菜养殖区的紫菜及其附近水域，属于革兰氏阴性菌，好氧生长，最适生长NaCl浓度为20-25g/L，无需碳源加入；该菌生长周期短，培养4h后进入对数生长期中期；

2、本发明的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1产生的琼胶酶为胞外酶，分离纯化简单，无需细胞破碎；

3、本发明的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1的产酶活性比较高，在优选条件下，未经过纯化的粗酶酶活力达到103U/mL；

4、本发明的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1所产的琼胶酶降解琼胶需要的反应条件温和，专一性好，对环境无污染；

5、本发明的以新琼二糖为结构单元的新琼寡糖的制备方法简单，成本低，可用于新琼寡糖的大量生产。

附图说明

图1为本发明实施例1所筛选出的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1在平板培养基上的菌落形态图；

图2为本发明实施例1所筛选出的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1的扫描电子显微镜下的菌体形态图；

图3为本发明实施例4所制得的新琼寡糖的HPLC色谱图；

图4为新琼寡糖标准品的HPLC色谱图。

图5为本发明实施例2中所鉴定的产琼胶酶与其近缘菌株的16S rDNA亲缘关系图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：产琼胶酶菌株的筛选

(1)将含1‰琼胶的2216E培养基50mL分装于250mL锥形瓶中，取少量有根紫菜和无根紫菜(来自福建省漳州市某紫菜养殖区)剪碎，以无菌水振荡30min，然后将该振荡液混合海水接种到富集培养基中，富集培养2～3代，使得目的菌株的数量增加。

(2)将含15‰琼胶的2216E培养基倒平板，将富集培养的菌液进行10^-1～10^-8逐级稀释，将10^-7、10^-8两个稀释度的菌液涂平板，培养48h后用卢戈氏碘液染色观察(能够产生琼胶酶的菌株能够降解琼胶，琼胶被降解后，不能被卢戈氏碘液染色，因此会产生明显的透明圈)，将能产生透明圈的菌株平板划线分离纯化，留待后续进一步复筛。

(3)用接种环分别挑取步骤(2)得到留待复筛的各个菌株的新鲜菌苔各2环，接入液体产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下发酵培养40h后，将发酵液于10000r/min下离心10min，过滤除菌，测酶活力，筛选出酶活力最高的菌株，保存于-80℃的冰箱中备用，即为需钠弧菌HJPHYXJ-1。

如图1所示，该菌的菌落特征如下：涂布或划线于平板培养基上生长迅速，30℃培养24h后长出周边光滑、湿润、白色、直径约0.5～0.8cm的菌落，并且在固体平板或斜面培养基边缘出现液化；

如图2所示，该菌的菌体特征如下：直杆状，两端钝圆，大小为0.3～0.5×0.8～1.0μm；

该菌的生理生化特征如下：革兰氏染色阴性；硝酸盐、脂酶、乙醇、纤维二糖、D-甘露醇、D-半乳糖、乳糖、L-鼠李糖、蔗糖、甘氨酸、L-脯氨酸阳性；精氨酸双水解酶、明胶酶、L-酪氨酸、D-山梨醇、D-木糖阴性，具体参见下表：

所述的斜面培养基组成为：琼脂15～20g/L，酵母提取物1.0～2.0g，蛋白胨3.0～5.0g，牛肉膏1.0～2.0g，磷酸铁0.01g，溶剂为陈海水或合成海水，调pH＝7.4～7.6。

所述的摇瓶复筛产酶培养基组成为：酵母提取物1.0～2.0g，蛋白胨3.0～5.0g，牛肉膏1.0～2.0g，磷酸铁0.01g，溶剂为陈海水或合成海水，调pH＝7.4～7.6。

上述合成海水配方如下：NaCl 24.00g，MgCl₂·6H₂O 11.00g，Na₂SO₄4.00g，CaCl·6H₂O 2.00g，KCl 0.70g，KBr 0.10g，H₃BO₃0.03g，NaSiO₃·9H₂O 5.00mg，SrCl₂·6H₂O0.04g，NaF 3.00g，NH₄NO₃2.00g，FePO₄·6H₂O 1.00mg，蒸馏水1000mL。

实施例2：产琼胶酶菌株的鉴定

实施例1筛选出的需钠弧菌HJPHYXJ-1的16S rDNA序列分析：使用SK 1201柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提细胞的全基因组，之后采用通用27F/1492R引物(正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(如SEQ ID NO 01所示)；反向引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(如SEQ ID NO 02所示))进行16S rDNA的PCR扩增，PCR扩增条件：98℃5min；94℃35s，55℃35s，72℃90s，35个循环；72℃8min。PCR扩增产物用SK 1131柱式DNA胶试剂盒纯化后，委托北京三博远志生物技术有限公司测序。

所述的需钠弧菌HJPHYXJ-1的16S rDNA的部分脱氧核酸序列如SEQ ID NO 03所示，具体如下：

AGCGGAACGAGTTAACTGAACCTTCGGGGGACGTTAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTTTATGCGTTAATAGCGTATAGATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTTCAGAGATGAATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGT。

上述需钠弧菌HJPHYXJ-1的16S rDNA部分脱氧核酸序列与美国国立生物中心(National Center for Biotechnology Information USA,NCBI)的基因库中的16S rDNA序列比对，其序列与弧菌属的一些菌株，如Vibrio diabolicus strain WYJ-4959(ACCESSION：KJ094034)、Vibrio atypicus strain 5-4-6(ACCESSION：JX867739)，Vibriovulnificus strain NTi(ACCESSION：KM406320)有99％的同源性，且该菌与Vibrionatriegens CMMB VN1(ACCESSION：FR846237)具有最高的同源性，遂鉴定该菌为Vibrionatriegens，该菌与其近缘菌株的16S rDNA亲缘关系如图5所示：

实施例3：需钠弧菌发酵制备琼胶酶

(1)将需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1菌种于斜面培养基，于30～35℃下培养24～48h，得到活化后的需钠弧菌菌种；所述的斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

(2)将步骤(1)活化培养后的需钠弧菌(Vibrio natriegens)HJPHYXJ-1菌种接种至种子液体培养基中，于30～35℃、150～200r/min下振荡培养8～24h，得到种子液；所述的种子液体培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

(3)将步骤(2)种子液以种子液以6％～15％体积比的接种量移种到液体培养基中，于30～35℃、150～200r/min振荡下培养42～48h，得到含琼胶酶的发酵液；所述液体产酶培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

(4)将步骤(3)含琼胶酶的发酵液离心(8000～15000r/min，10～15min)、过滤(0.22μm)分离除去菌体，所得酶液即为琼胶酶粗酶液。

(5)上述步骤(4)得到的琼胶酶粗酶液采用硫酸铵沉淀，沉淀物经透析冻干后获得琼胶酶粗酶粉末，经检测该琼胶酶粗酶粉末的酶活力达到103U/mL。

上述合成海水配方如下：NaCl 24.00g，MgCl₂·6H₂O 11.00g，Na₂SO₄4.00g，CaCl·6H₂O 2.00g，KCl 0.70g，KBr 0.10g，H₃BO₃0.03g，NaSiO₃·9H₂O 5.00mg，SrCl₂·6H₂O0.04g，NaF 3.00g，NH₄NO₃2.00g，FePO₄·6H₂O 1.00mg，蒸馏水1000mL。

实施例4：新琼寡糖的制备

以实施例3制得的琼胶酶粗酶粉末为催化剂对琼胶进行酶解，酶解体系如下：上述琼胶酶粗酶粉末浓度1～5％，底物浓度0.1～0.5％，酶解缓冲液为pH 7.0～7.5的Tris-HCl缓冲液，酶解温度40～45℃，酶解时间24h；将所得酶解产物冷却后，离心过滤除去未被降解的琼胶，制得所述新琼寡糖，该制得的新琼寡糖与新琼寡糖标准品的HPLC色谱图分别如图3和图4所示。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种需钠弧菌的应用，所述需钠弧菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCCM2015244，保藏日期：2015年4月23日，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将所述需钠弧菌(Vibrionatriegens)HJPHYXJ-1接种于斜面培养基，于30～35℃下培养24～48h，进行活化；

(2)将活化后的需钠弧菌(Vibrionatriegens)HJPHYXJ-1接种于种子液体培养基中，于30～35℃下培养8～24h，得到种子液；

(3)将种子液接种于液体产酶培养基中，于30～35℃下培养42-48h，得到含琼胶酶的发酵液；

(4)将上述含琼胶酶的发酵液经离心除去菌体后，经硫酸铵沉淀分离，再透析，最后冻干得琼胶酶粗酶粉末。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述种子液体培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述液体产酶培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

5.一种以新琼二糖为结构单元的新琼寡糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将所述需钠弧菌(Vibrionatriegens)HJPHYXJ-1接种于斜面培养基，于30～35℃下培养24～48h，进行活化；

(2)将活化后的需钠弧菌(Vibrionatriegens)HJPHYXJ-1接种于种子液体培养基中，于30～35℃下培养8～24h，得到种子液；

(3)将种子液接种于液体产酶培养基中，于30～35℃下培养42-48h，得到含琼胶酶的发酵液；

(4)将上述含琼胶酶的发酵液经离心除去菌体后，经硫酸铵沉淀分离，再透析，最后冻干得琼胶酶粗酶粉末；

(5)以上述琼胶酶粗酶粉末为催化剂对琼胶进行酶解，酶解体系如下：上述琼胶酶粗酶粉末浓度1～5％，底物浓度0.1～0.5％，酶解缓冲液为pH7.0～7.5的Tris-HCl缓冲液，酶解温度40～45℃，酶解时间24～36h；

(6)将步骤(5)的酶解产物冷却后，离心过滤除去未被降解的琼胶，制得所述新琼寡糖。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述种子液体培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述液体产酶培养基的配方为：酵母提取物1.0～2.0g/L，蛋白胨3.0～5.0g/L，牛肉膏1.0～2.0g/L，磷酸铁0.01g/L，溶剂为陈海水或合成海水，pH＝7.4～7.6。