CN104560792B - 一种产淀粉酶的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种产高温淀粉酶的菌株Phaeocystidibacter merougensis G18,保藏编号为:CGMCC No.9861。该菌株分离自红海沉积物,其生产的淀粉酶最适反应条件为70~75℃、pH8.0~8.5,并具有一定的热稳定性及酸碱稳定性。本申请还公开了所述菌株Phaeocystidibacter merougensis G18的培养方法和用途,以及由该菌株生产淀粉酶的方法和淀粉酶。本发明的菌株及其产生的淀粉酶在医药、化工和食品等行业将具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明总地涉及一种新的菌株,更具体地,涉及一种来源于红海沉积物的产淀粉酶的菌株以及其应用。
背景技术
淀粉酶(amylase)是指能水解淀粉,糖原等相关多糖的酶类总称,应用于淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业,是用途最广产量最大的酶制剂之一。微生物是工业淀粉酶的主要来源之一,已知众多细菌及真菌可以产生淀粉酶,且以芽孢杆菌属(Bacillus)中细菌代谢产生淀粉酶的研究报道居多。其中,凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(B.licheninformis)等均能产生高温淀粉酶。
淀粉酶具有广泛的应用领域,如:应用于淀粉加工业制造葡萄糖,麦芽糖等;应用于食品工业制作果汁、香料、味精、面包等;应用于酿造发酵工业制作白酒、啤酒、酱油、醋等;应用于医药领域制备诊断酶、消化药等。然而,如此广泛的应用要求淀粉酶不仅要活力高,还要具备不同酸碱稳定性及热稳定性以适应不同行业的需求。因此,筛选产不同特性淀粉酶的优良菌株仍非常必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的能产淀粉酶的菌株,并提供该菌株的用途和培养方法,以及利用该菌株生产淀粉酶的方法以及所产的淀粉酶。
根据本发明的第一方面,提供一种新的菌株Phaeocystidibacter merougensisG18。该菌株分离自红海沉积物(站位:38°53.8701’,N22°16.9540’),并已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为:CGMCC No.9861。其16S rDNA序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示,以其16S rDNA序列构建的***发育树如说明书附图1所示。该菌株为革兰氏阴性菌,需氧生长,菌体呈棒状(宽约0.3~0.5μm、长约0.5~5.5μm)。菌落呈黄色,表面光滑湿润,中央略凸。最适生长pH和温度分别为6.0~8.0,28~37℃。最适生长NaCl浓度为2~5%(质量体积比)。最适生长Mg2+浓度为:0.005~0.05mol/L,最适生长Ca2+浓度为0.005~0.02mol/L。不能发酵葡萄糖产酸,不能水解酪蛋白、几丁质、吐温80,可水解明胶和淀粉。碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、亮氨酸氨基肽酶、缬氨酸氨基肽酶、胱氨酸氨基肽酶、胰蛋白酶、萘酚磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶阳性,脂肪酶、α-胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶阴性。
本发明人发现该菌株Phaeocystidibacter merougensis G18能够在含有淀粉的培养环境下产生淀粉酶。该淀粉酶的反应条件为pH 8.0~9.5,70~75℃,最适条件为pH8.0,温度为70℃,属一种高温淀粉酶。进一步研究发现,该菌产生的淀粉酶在较为宽泛的pH范围内(4.5~10.5)以及较高温度(如65℃下热处理45分钟)下性质稳定,表现出令人满意的活性,具有广泛的应用前景。
因此,根据本发明的第二方面,提供所述菌株Phaeocystidibacter merougensisG18用于生产淀粉酶的用途。
根据本发明的第三方面,提供一种生产淀粉酶的方法。所述方法包括利用菌株Phaeocystidibacter merougensis G18进行发酵的步骤和提取发酵液中的淀粉酶的步骤。发酵在发酵培养液中pH 6.0~8.0、28~37℃的条件下恒温培养。所述发酵培养液包括以每升海水计,2~10g淀粉,5~15g胰蛋白胨和2~5g酵母粉。
当培养液中的菌浓度达到一定值时可通过离心的方法获得上清液,并通过常规方法提取和纯化上清液中的淀粉酶。这些方法都是本领域技术人员熟知的[1-3],在此不再赘述。
根据本发明的最后一方面,提供通过上述方法获得的淀粉酶。
本发明的菌株Phaeocystidibacter merougensis G18培养基成分简单,培养条件宽松,增值快。在培养基中添加淀粉可诱导产生淀粉酶。所产生的淀粉酶能够在pH8.0~9.5、70~75℃,优选pH8.0、温度为70℃的条件下反应。对温度和pH值有较宽的耐受范围,可在pH 4.5~10.5的范围内以及较高温度(如65℃下热处理45分钟)下保持较高活性。因此,本发明的菌株以及由该菌株生产的淀粉酶在医药、化工和食品等众多的领域和工业,特别是经历pH变化和/或较高加工温度的那些工艺中,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为Phaeocystidibacter merougensis G18的***发育树。
图2为菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶在不同温度下的相对活性变化曲线图。
图3为以不同温度处理菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶对其活性的影响曲线图。
图4为菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶在不同pH条件下相对活性变化曲线图。
图5为在不同pH条件处理菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶对其活性的影响曲线图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,但本发明不限于下述实施例。
以下实施例中淀粉酶活性测定及表征方法如下:
利用DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid,3,5-二硝基水杨酸)法测定淀粉酶活性。在碱性条件下,二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应,生成的3-氨基-5-硝基水杨酸在煮沸条件下显棕红色,且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系,可用比色法测定还原糖含量。
1个酶活单位(U)定义为:在70℃、pH8.0条件下,1min内酶解淀粉生成1μg还原糖(以葡萄糖为标准)所需的酶量。
DNS试剂的配制:取适量去离子水煮沸10min后冷却至室温,用于DNS试剂配制。称取6.3g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中,加入21.0g氢氧化钠充分溶解于约500mL水中,再依次溶解182.0g酒石酸钠,5.0g苯酚,5.0g亚硫酸钠,定容1L后储存棕色瓶中放置于4℃保存、备用。
葡萄糖标准曲线的制作:无菌去离子水分别配制0.1、0.25、0.5、0.75、1和1.25μg/μL的葡萄糖溶液。以无菌去离子水为空白对照,各设3个平行,分别取250μL上述溶液与450μL DNS溶液混合后置沸水浴中5min,冷却至室温,取50μL反应液于384孔板中测定540nm处吸光度(Eon微孔板分光光度计,美国Bio Tek公司)。以葡萄糖质量为纵坐标,以吸光度为横坐标,绘制标准曲线。
实施例1:Phaeocystidibacter merougensis G18的分离鉴定
取5g红海沉积物样品(站位:38°53.8701’,N 22°16.9540’),放入装有100mL 3%(质量体积分数)无菌氯化钠溶液及玻璃珠的250mL三角瓶中,置于200rpm摇床震荡30min,使土样均匀分散后静置10min。10倍稀释法,涂布静置后的上清于培养基MA(5g胰蛋白胨,2g酵母粉,10g琼脂,1L海水)固体平板,置于37℃培养48h。挑取不同类型单菌落反复划线于MA固体平板,置于37℃培养48h。重复三次得到纯培养的菌株并对其进行16S rDNA测序鉴定。具体方法可参考文献[4]。
纯化得到的所述菌株G18经16S rDNA序列比对,与Phaeocystidibacter luteusPG2S01有最高的相似性(为94.8%),命名为Phaeocystidibacter merougensis G18。该菌株的16S rDNA请见序列表[序列编号No.1]。
菌株G18的碳源利用类型通过美国Biolog GEN III碳源自动分析鉴定***测定,生理生化特征利用法国梅里埃公司(bioMe′rieux)API试剂盒(包括API ZYM,API 20NE,API20E和API 50CH)测定,以上试剂盒均有详细操作说明且其使用方法为本领域技术人员所熟知,不再赘述。最适生长温度、pH、NaCl浓度、Mg2+浓度、Ca2+浓度,以及酪蛋白、几丁质、吐温80和淀粉水解特性检测方法,可参考文献[5]。经检测,该菌株为革兰氏阴性菌,需氧生长,菌体呈棒状(宽约0.3~0.5μm、长约0.5~5.5μm)。菌落呈黄色,表面光滑湿润,中央略凸。最适生长pH和温度分别为6.0~8.0,28~37℃。最适生长NaCl浓度为2~5%(质量体积比)。最适生长Mg2+浓度为:0.005~0.05mol/L,最适生长Ca2+浓度为0.005~0.02mol/L。不能发酵葡萄糖产酸,不能水解酪蛋白、几丁质、吐温80,可水解明胶和淀粉。碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、亮氨酸氨基肽酶、缬氨酸氨基肽酶、胱氨酸氨基肽酶、胰蛋白酶、萘酚磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶阳性,脂肪酶、α-胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶阴性。
挑取Phaeocystidibacter luteus G18单菌落接入装有4mL MA(5g胰蛋白胨,2g酵母粉,1L海水)液体培养基试管中,37℃,200rpm/min摇床培养24h,以2%的接种量接种到培养基MB(5g可溶性淀粉,5g胰蛋白胨,2g酵母粉,1L海水)发酵培养基中,37℃,200r/min摇床恒温培养48h,发酵液在10000g条件下离心5min,获得的培养液上清作为粗酶液置-20℃保存,用于淀粉酶活测定。
实施例2:Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶最适反应温度及其热稳定性
1)pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制0.5%可溶性淀粉溶液。取0.5%可溶性淀粉溶液225μL置于1.5mL离心管中,分别在25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、70℃、72℃、75℃、80℃和90℃水浴中预热5min,加入25μL实施例1制备的粗酶液,精确反应20min后,加入450μL DNS溶液混合后置沸水浴中5min,冷却至室温,取50μL反应液于384孔板中测定540nm处吸光度(Eon微孔板分光光度计,美国Bio Tek公司)。每组设置3个平行样,各温度梯度以煮沸5min失活的粗酶液为阴性对照,以70℃反应体系的酶活力为100%,计算该酶在各温度下的相对活性并做图(见图2)。结果显示,该酶在70~75℃反应体系中表现出较高相对酶活性(大于80%),在70℃时表现出最大酶活性。
2)将实施例1制备的粗酶液在45℃、65℃、72℃、75℃和80℃水浴中分别热处理0h、0.25h、0.5h、0.75h、2h、3h和4h后,按实施例2中1)所述方法测定酶活力。以未经处理的原酶液活力为100%,计算该酶的热稳定性(见图3)。结果显示,在65℃条件下热处理45min,剩余相对酶活性仍高于80%。
实施例3:Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶最适反应pH及其酸碱稳定性
1)用不同pH值的缓冲液(pH 3.0~6.0为柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液,7.0~8.0为磷酸盐缓冲液,9.0~11为甘氨酸–氢氧化钠缓冲液)配制pH值分别为4、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5的0.5%可溶性淀粉溶液。每组设置3个平行样,各pH梯度以煮沸5min失活的粗酶液为阴性对照,测定淀粉酶活性。以pH8.0反应体系的酶活力为100%,计算该酶在各pH下的相对活性(见图4)。结果显示,该酶在pH8.0~9.5反应体系中表现出较高相对酶活性(大于80%),在pH8.0反应体系中表现出最大酶活性。
2)用上述pH缓冲液及浓盐酸,氢氧化钠溶液分别调整粗酶液的pH值为1.5、3.5、4.5、5.5、6.5、8.5、9.5、10.5、12于室温放置60min,在pH 8.0,温度70℃下测定剩余酶活。以未处理的原酶液活力为100%,计算该酶的酸碱稳定性(见图5)。结果显示,该酶在pH4.5~10.5范围内均比较稳定,剩余相对酶活性均高于80%。
参考文献:
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Claims (3)
1.一种产淀粉酶的菌株Phaeocystidibacter merougensis G18,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.9861。
2.如权利要求1所述的菌株Phaeocystidibacter merougensis G18用于产生淀粉酶的用途。
3.一种生产淀粉酶的方法,包括:
利用权利要求1所述的菌株Phaeocystidibacter merougensis G18进行发酵;和提取发酵液中的淀粉酶;
其中所述发酵在发酵培养液中pH 6.0~8.0、28~37℃的条件下恒温培养;
所述发酵培养液包括以每升海水计,2~10g淀粉,5~15g胰蛋白胨和2~5g酵母粉。
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