CN101426817B - 拮抗性抗-cd40抗体药物组合物 - Google Patents

拮抗性抗-cd40抗体药物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN101426817B
CN101426817B CN2007800139737A CN200780013973A CN101426817B CN 101426817 B CN101426817 B CN 101426817B CN 2007800139737 A CN2007800139737 A CN 2007800139737A CN 200780013973 A CN200780013973 A CN 200780013973A CN 101426817 B CN101426817 B CN 101426817B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
composition
cell
ser
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2007800139737A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101426817A (zh
Inventor
陆晓峰
B·-L·陈
K·阿拉亚
A·奥克哈马菲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Xoma Technology Ltd USA
Original Assignee
Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Xoma Technology Ltd USA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38556677&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101426817(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Vaccines and Diagnostics AG, Xoma Technology Ltd USA filed Critical Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Publication of CN101426817A publication Critical patent/CN101426817A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101426817B publication Critical patent/CN101426817B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

提供了包含拮抗性抗-CD40抗体作为治疗或预防活性组分的稳定液体药物组合物以及它们的制备方法。这些组合物包含拮抗性抗-CD40抗体、维持组合物的pH在约pH5.0和约pH7.0之间的缓冲剂、以及含量足以使该液体组合物接近等渗的精氨酸-HCl。发现本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的稳定液体药物组合物可用于治疗增生性疾病以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法。

Description

拮抗性抗-CD40抗体药物组合物
发明领域
本发明涉及药物制剂领域，更具体涉及含有拮抗性抗-CD40抗体的稳定的液体药物组合物，其可用于治疗增生性疾病以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病。
发明背景
遗传工程技术研究的最新进展已经提供了许多生物活性多肽，其存在量之大足以用作药物。然而，由于物理不稳定性(包括变性和形成可溶及不溶的聚集体)以及各种化学不稳定性(如水解、氧化和脱酰胺)，多肽可能丧失其生物活性。多肽在液体药物制剂中的稳定性可受到诸如pH、离子强度、温度、反复的冻融循环以及例如在加工期间发生的接触机械剪切力等因素的影响。聚集体的形成以及生物活性的丧失也可能是物理搅动以及储存药瓶的溶液中和液-气界面上的多肽分子相互作用所致。由于运输或其他过程中的搅动，吸附到气-液和固-液界面上的多肽在界面的压缩-延伸期间可发生进一步的构象变化。这种搅动可造成蛋白质缠绕、聚集、形成颗粒、并最终与吸附的其他蛋白质一起沉淀。有关蛋白质药物稳定性的综述可参见，例如，Manning等(1989)Pharm.Res.6:903-918，以及Wang和Hanson(1988)J.Parenteral Sci.Tech.42:S14。
含多肽的液体药物制剂的不稳定性促使将这些制剂以冻干形式与合适的重建用液体介质一起包装。尽管冻干提高了组合物的储存稳定性，但许多多肽表现出活性降低，这发生在以干燥状态储存期间(Pikal(1990)Biopharm.27:26-30)或者在重建成液体制剂时由于聚集体形成或丧失纯化活性(参见，例如，Carpenter等(1991)Develop.Biol.Standard 74:225-239；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18:1169-1206；Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11:12-20；Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25:459-470；和Roser(1991)Biopharm.4:47-53)。尽管使用添加剂能提高干燥蛋白质的稳定性，但许多再水合的制剂仍旧有无法接受或不良含量的无活性聚集蛋白质(参见，例如，Townsend和DeLuca(1983)J.Pharm.Sci.80:63-66；Hora等(1992)Pharm.Res.9:33-36；Yoshiaka等(1993)Pharm.Res，10:687-691)。再者，需要重建也不方便并有可能造成错误剂量。
药学上有用的多肽包括重组制造的单克隆抗体。在这种类型的治疗剂中，靶向TNF家族受体成员CD40的拮抗性抗-CD40抗体最有可能用于治疗B细胞相关性恶性肿瘤和非血液恶性肿瘤，以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病。CD40受体是一种50-55kDa的细胞表面抗原，其存在于正常和肿瘤性人B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD8+T细胞、内皮细胞、单核和上皮细胞、一些上皮癌、以及许多实体瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和结肠癌)表面。CD40抗原还表达在活化的T细胞、活化的血小板、炎性血管平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、类风湿性关节炎的滑膜、皮肤成纤维细胞和其他非淋巴细胞类型上。根据表达CD40的细胞类型，结合可导致胞间粘连、分化、活化和增殖。
例如，CD40与其同源配体CD40L(也称为CD154)结合能刺激B细胞增殖和分化成浆细胞、抗体产生、同种型转换、以及产生B细胞记忆。在B细胞分化期间，CD40在前B细胞上表达但在分化成浆细胞之后丧失。APC上的CD40表达在这些细胞的活化中扮演重要的共刺激(co-stimulatory)作用。例如，激动性(agonistic)抗-CD40单克隆抗体(mAb)已显示能模拟T辅助细胞在B细胞活化中的作用。当出现在表达FcγRII的粘附细胞上时，这些抗体诱导B细胞增殖(Banchereau等(1989)Science 251:70)。此外，当存在IL-4时，激动性抗-CD40mAb可代替负责分泌IgM、IgG和IgE的T辅助细胞信号(Gascan等(1991)J.Immunol.147:8)。此外，激动性抗-CD40mAb可防止从***分离的B细胞的程序性细胞死亡(凋亡)。
这些以及其他观察结果支持了目前的理论，即CD40和CD40L的相互作用在调节体液和细胞-介导的免疫反应中扮演关键作用。更近的研究已经揭示了CD40/CD40L相互作用在各种生理和病理过程中更加广泛的作用。
因此，CD40与CD40L的结合以及随后CD40信号传导的激活是正常免疫反应的必需步骤；然而，CD40信号传导的失调可导致疾病。CD40信号传导途径已显示参与自身免疫性疾病(Ichikawa等(2002)J.Immunol.169:2781-2787和Moore等(2002)J.Autoimmun.19:139-145)。此外，CD40/CD40L相互作用在炎性过程中扮演重要角色。例如，在人的和实验性的动脉粥样硬化病损中CD40和CD40L都过表达。CD40刺激诱导粥样斑相关细胞类型如内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中基质降解酶类的表达和组织因子的表达。再者，CD40刺激诱导促炎性细胞因子如IL-1、IL-6和IL-8以及粘附分子如ICAM-1、E-选择蛋白和VCAM的产生。抑制CD40/CD40L相互作用在动物模型中能防止动脉粥样化形成。在移植模型中，阻断CD40/CD40L相互作用能防止炎症。已显示CD40/CD40L结合与与阿尔茨海默病淀粉样蛋白-β肽协同作用以促进小胶质细胞活化，从而导致神经毒性。在类风湿性关节炎(RA)患者中，关节软骨细胞的CD40表达提高，因此，CD40信号传导可能促使损伤性细胞因子和基质金属蛋白酶产生。参见，Gotoh等(2004)J.Rheumatol.31:1506-1512。
类似地，肿瘤类型B细胞谱系的恶性B细胞表达CD40，而其存活和增殖似乎依赖于CD40信号传导。低级和高级B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症以及霍奇金病患者的转化细胞表达CD40。还在2/3的急性成髓细胞性白血病病例和50％的AIDS相关性淋巴瘤中检测到CD40的表达。
许多癌和肉瘤还显示出高水平的CD40表达，尽管与CD40表达有关的CD40信号传导对这些癌细胞的作用还不十分清楚。表达CD40的癌包括膀胱癌(Paulie等(1989)J.Immunol.142:590-595；Braesch-Andersen等(1989)J.Immunol.142:562-567)，乳腺癌(Hirano等(1999)Blood 93:2999-3007；Wingett等(1998)Breast Cancer Res.Treat.50:27-36)；***癌(Rokhlin等(1997)Cancer Res.57:1758-1768)，肾细胞癌(Kluth等(1997)Cancer Res.57:891-899)，未分化鼻咽癌(UNPC)(Agathanggelou等(1995)Am.J.Pathol.147:1152-1160)，鳞状细胞癌(SCC)(Amo等(2000)Eur.J.Dermatol.10:438-442；Posner等(1999)Clin.Cancer Res.5:2261-2270)，甲状腺***状癌(Smith等(1999)Thyroid9:749-755)，皮肤恶性黑色素瘤(van den Oord等(1996)Am.J.Pathol.149:1953-1961)，胃癌(Yamaguchi等(2003)Int.J.Oncol.23(6):1697-702)，以及肝癌(参见，例如，Sugimoto等(1999)Hepatology30(4):920-26，其中讨论了人肝细胞癌)。关于表达CD40的肉瘤，参见，例如，Lollini等(1998)Clin.Cancer Res.4(8):1843-849，其中讨论了人骨肉瘤和尤因肉瘤。
鉴于拮抗性抗-CD40抗体在各种癌症和自身免疫性疾病/炎性疾病中调节CD40L-介导的CD40信号传导中的潜在治疗作用，以及配制这些多肽的问题，需要包含这些抗体的稳定的药物组合物。
发明简述
提供了包含拮抗性抗-CD40抗体作为治疗或预防活性组分的稳定的稳定的液体药物组合物以及它们的制备方法。这些组合物包含拮抗性抗-CD40抗体、维持组合物的pH在约pH5.0和约pH7.0之间的缓冲剂、以及含量足以使该液体组合物接近等渗的精氨酸-HCl。在一些实施方式中，所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，所述拮抗性抗-CD40抗体是CHIR-12.12或CHIR-5.9拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，所述组合物包含精氨酸-HCl作为等渗剂，且该组合物还包含非离子表面活性剂和/或L-甲硫氨酸作为其它稳定剂。发现本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的稳定的液体药物组合物可用于治疗增生性疾病以及具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法。
附图简述
图1显示了通过SEC-HPLC分析测得的缓冲剂类型对于在25℃储存3个月或5个月的mAb CHIR-12.12制剂纯度的影响。
图2显示了通过SEC-HPLC分析测得的缓冲剂类型对在25℃储存3个月或5个月的各种抗体制剂内mAb CHIR-12.12的聚集体形成的影响。
图3显示了通过SEC-HPLC分析测得的缓冲剂类型对在25℃储存3个月或5个月的各种抗体制剂内mAb CHIR-12.12的片段化的影响。
图4显示了通过SEC-HPLC分析测得的缓冲剂类型对于在40℃储存3个月或5个月的mAb CHIR-12.12制剂纯度的影响。
图5显示了通过SEC-HPLC分析测得的缓冲剂类型对在40℃储存3个月或5个月的各种抗体制剂内mAb CHIR-12.12的聚集体形成的影响。
图6显示了通过SEC-HPLC分析测得的缓冲剂类型对在40℃储存3个月或5个月的各种抗体制剂内mAb CHIR-12.12的片段化的影响。
图7显示了含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中mAb CHIR-12.12的差示扫描量热法的热分析图。
图8显示了通过SEC-HPLC测得的当在25℃储存2、4或6个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中保留的mAb CHIR-12.12单体形式％。
图9显示了通过SEC-HPLC测得的当在25℃储存2、4或6个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中的mAb CHIR-12.12聚集体％。
图10显示了通过SEC-HPLC测得的当在25℃储存2、4或6个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中的mAb CHIR-12.12片段％。
图11显示了通过SEC-HPLC测得的当在40℃储存2或4个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中保留的mAb CHIR-12.12单体形式％。
图12显示了通过SEC-HPLC测得的当在40℃储存2或4个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中的mAb CHIR-12.12聚集体％。
图13显示了通过SEC-HPLC测得的当在40℃储存2或4个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中的mAb CHIR-12.12片段％。
图14显示了通过CIEX-HPLC测得的当在25℃储存2、4或6个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中mAb CHIR-12.12的纯度％。
图15显示了通过CIEX-HPLC测得的当在25℃储存2、4或6个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中mAb CHIR-12.12的酸性变体％。
图16显示了通过CIEX-HPLC测得的当在25℃储存2、4或6个月时含NaCl或L-精氨酸-HCl作为等渗剂的制剂中mAb CHIR-12.12的碱性变体％。
发明详述
下文参考附图中更详细地描述本发明，附图中显示了部分但非全部的本发明实施方式。实际上，这些发明可以许多不同形式体现而不限于文中列出的实施方式；再者，因为提供了这些实施方式从而本发明将满足所适用的法律要求。
从以上描述和相关附图的教导中获益的本发明所属领域的技术人员会想到文中列出的本发明的许多改进和其他实施方式。因此，应理解，本发明不限于披露的特定实施方式，这种改进和其他实施方式也包含在所附权利要求的范围之内。尽管文中采用了特定术语，但只以一般性和描述性含义使用而非出于限制目的。
本发明涉及包含至少一种拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段作为治疗或预防活性组分的稳定的液体药物组合物，并涉及它们的制备方法。出于本发明的目的，药物组合物或制剂的相关术语“液体”包括术语“水性”。“治疗或预防活性组分”是指具体将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段掺入组合物，从而当将药物组合物给予对象时，能带来治疗、预防或诊断对象的疾病或症状相关的所需治疗或预防反应。
“稳定的”是指本发明的药物组合物提供了拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的物理和/或化学稳定性。这就是说，该拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段基本保留其物理和/或化学稳定性并具有所需生物活性，即本文其他地方定义的一种或多种拮抗活性，包括但不限于：抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞的免疫球蛋白分泌；抑制Jurkat T细胞刺激的正常人外周B细胞的存活和/或增殖；抑制表达CD40L的细胞或可溶性CD40配体(sCD40L)刺激的正常人外周B细胞的存活和/或增殖；抑制sCD40L或固相CD40L刺激的任何细胞内的＂存活的＂抗-凋亡胞内信号；抑制sCD40L或固相CD40L结合之后任何细胞内的CD40信号转导；抑制人恶性B细胞增殖；带有CD40的靶细胞或带有CD40同源配体的细胞(包括但不限于T细胞和B细胞)的删除、无反应性和/或耐受诱导；诱导CD4+CD25+调节T细胞的扩增或活化(参见，例如，经CD40-CD40L干扰发生的供体同种抗原-特异性组织排斥，van Maurik等(2002)J.Immunol.169:5401-5404)；经任何机制发生的细胞毒性(包括但不限于靶细胞中依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、依赖于补体的细胞毒性(CDC)、增殖的下调和/或凋亡)；调节靶细胞细胞因子分泌和/或细胞表面分子表达；以及它们的组合。
监测蛋白质稳定性的方法是本领域熟知的。参见，例如，Jones(1993)Adv.DrugDelivery Rev.10:29-90；Lee编(1991)Peptide and Protein Drug Delivery(肽和蛋白质药物的递送)(MD公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约)；以及下文中描述的稳定性试验。通常，蛋白质稳定性是在所选温度下在特定时间期内测定的。在优选实施方式中，稳定的抗体药物组合物在室温(约25℃)储存至少1个月、至少3个月或至少6个月，和/或在约2-8℃储存至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月能提供拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的稳定性。
蛋白质如抗体被配制成药物组合物时，如果该药物组合物中未显示出沉淀、聚集和/或变性的可见标志(即，变色或丧失透明度)或可测标志(例如，采用尺寸排阻层析(SEC)或UV光散射)则认为其在给定时间点上保留其物理稳定性。就化学稳定性而言，当蛋白质如抗体被配制成药物组合物时，如果化学稳定性的测量值提示在药物组合物中该蛋白质(即，抗体)保留感兴趣的生物活性，则认为其在给定时间点上保留其化学稳定性。监测化学稳定性改变的方法是本领域熟知，包括但不限于：检测蛋白质化学改变形式(如切割(clipping)所致)的方法，其采用，例如，SDS-PAGE，SEC，和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱；和与分子电荷变化相关的(例如，与脱酰胺相关)降解，其采用，例如，离子交换层析。参见，例如，下文所述的方法。
拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段被配制成药物组合物时，如果通过测量所需生物活性的合适试验测得给定时间点的所需生物活性在该药物组合物制备时显示出的所需生物活性的约30％之内，优选约20％之内则认为其在该时刻保留了所需生物活性。测定本文所述拮抗性抗-CD40抗体及其抗原结合片段所需生物活性的试验可按以下申请中的描述进行：2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27提交的并分别给予美国专利申请号60/517,337(代理人案卷号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案卷号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案卷号PP20107.003(035784/277214))的题为“AntagonistAnti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的临时申请；以及2004/11/4提交并公布为WO2005/044854的同样题为“Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理人案卷号PP20107.004(035784/282916))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。也可参见以下申请中描述的试验：题为“Methods for Diagnosis and Treatment ofProliferative Disorders Mediated by CD40 Signaling(诊断和治疗CD40信号传导介导的增生性疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并给予美国专利申请号60/749,285(代理人案卷号PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125143的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019414(代理人案卷号PP028035.0003(035784/311611))；和题为“Methods for Diagnosis andTreatment of Diseases Having an Autoimmune and/or Inflammatory Component(诊断和治疗具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并给予美国专利申请号60/749,336(代理人案卷号PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125117的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019325(代理人案卷号PP028062.0003(035784/311608))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。也可参见以下文献中描述的试验：Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8200-8204；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.2:6-15；Evans等(2000)J.Immunol.164:688-697；Noelle(1998)AgentsActions Suppl.49:17-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.3:77-86；Coligan等(1991)Current Protocols in Immunology 13:12；Kwekkeboom等(1993)Immunology79:439-444；以及美国专利号5,674,492和5,847,082；通过引用纳入本文。
要按照本发明方法配制的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段可采用任何本领域已知方法制备，包括本文其他地方描述的那些方法。在一个实施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体，或其抗原结合片段是在下文所述的CHO细胞系内重组产生。
制备和纯化之后，可采用本文所述方式将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段制备成液体药物组合物。如果要先储藏拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段再配制，可将其冷冻在例如≤-20℃，然后室温下解冻以进一步配制。
本发明的液体药物组合物包含治疗或预防有效量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。制剂中抗体或其抗原结合片段的存在量考虑了给药途径和所需剂量体积。
该方式中，本发明的液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体，或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，约0.5mg/ml至约40.0mg/ml，约1.0mg/ml至约35.0mg/ml，约1.0mg/ml至约30.0mg/ml，约5.0mg/ml至约25.0mg/ml，约5.0mg/ml至约20.0mg/ml，约10.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约15.0mg/ml至约25.0mg/ml。在一些实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约5.0mg/ml，约5.0mg/ml至约10.0mg/ml，约10.0mg/ml至约15.0mg/ml，约15.0mg/ml至约20.0mg/ml，约20.0mg/ml至约25.0mg/ml，约25.0mg/ml至约30.0mg/ml，约30.0mg/ml至约35.0mg/ml，约35.0mg/ml至约40.0mg/ml，约40.0mg/ml至约45.0mg/ml，或约45.0mg/ml至约50.0mg/ml。在其他实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，其浓度为约15.0mg/ml，约16.0mg/ml，约17.0mg/ml，约18.0mg/ml，约19.0mg/ml，约20.0mg/ml，约21.0mg/ml，约22.0mg/ml，约23.0mg/ml，约24.0mg/ml，约25.0mg/ml，约26.0mg/ml，约27.0mg/ml，约28.0mg/ml，约29.0mg/ml，约30.0mg/ml，约31.0mg/ml，约32.0mg/ml，约33.0mg/ml，约34.0mg/ml，或约35.0mg/ml。
根据本发明，拮抗性抗-CD40抗体，例如，下述单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或其抗原结合片段，与维持药物组合物的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂以及含量足以使该组合物接近等渗的酸形式的精氨酸(本文称为精氨酸-HCl)一起配制。“接近等渗”是指水性制剂的摩尔渗透压浓度为约240mmol/kg至约360mmol/kg，优选约240至约340mmol/kg，更优选约250至约330mmol/kg，再优选约260至约320mmol/kg，更优选约270至约310mmol/kg。在一些实施方式中，该液体药物组合物的摩尔渗透压浓度为约295mmol/kg。测定溶液等渗性的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，Setnikar等(1959)J.Am.Pharm.Assoc.48:628。
精氨酸-HCl不仅作为等渗剂，而且可用来稳定抗体以抵抗本发明液体药物组合物储存期间的构象改变、聚集体形成、片段化和/或脱酰胺。“储存期间”是指在液体药物组合物或制剂制备之后不立即给于对象。而是在制备之后将其包装以供储存，可以是液体形式、冷冻状态或以后重建成液体形式的干燥形式或适合给予对象的其他形式。“干燥形式”是指液体药物组合物或制剂通过以下方法干燥：冷冻干燥(即，冻干；参见，例如，Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38:48-59)，喷雾干燥(参见，Masters(1991)Spray-Drying Handbook(喷雾干燥手册)(第五版；英国埃西泽朗曼科技出版社(Longman Scientific and Technical，Essez，U.K.))，491-676页；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18:1169-1206；和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11:12-20)，或空气干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25:459-470；以及Roser(1991)Biopharm.4:47-53)。液体药物组合物储存期间抗体的构象改变、聚集体形成、片段化和/或脱酰胺可对抗体的生物活性造成不利影响，导致药物组合物丧失疗效。此外，聚集体形成可造成其他问题，如当采用输注***给予含有抗体的药物组合物时会阻塞管道、膜或泵。
精氨酸的任何立体异构体(即，L、D或DL异构体)或这些立体异构体的组合也存在于本发明的药物组合物中，只要精氨酸以其酸形式，即精氨酸-HCl存在。优选采用L-立体异构体。本发明的组合物也可用这种氨基酸的类似物配制。“氨基酸类似物”是指天然产生氨基酸的衍生物，其带来使得组合物接近等渗以及降低在本发明液体药物组合物储存期间多肽的聚集体形成、片段化和/或脱酰胺等所需效果。合适的精氨酸类似物包括，例如，氨基胍和N-单乙基L-精氨酸。与精氨酸一样，氨基酸类似物也以它们的酸形式掺入组合物。
精氨酸-HCl在药物组合物中的浓度将取决于其他组分对张力的作用。在一些实施方式中，精氨酸-HCl的浓度为约50mM至约300mM，约50mM至约250mM，约50mM至约200mM，约50mM至约175mM，约50mM至约150mM，约75mM至约175mM，约75mM至约150mM，约100mM至约175mM，约100mM至约200mM，约100mM至约150mM，约125mM至约175mM，约125mM至约150mM，约130mM至约170mM，约130mM至约160mM，约135mM至约155mM，约140mM至约155mM，或约145mM至约155mM。在一个这样的实施方式中，精氨酸-HCl的浓度为约125mM，约150mM，或约175mM。
含有抗体的液体药物组合物的pH会影响其中所含抗体的稳定性，这种影响主要通过其对多肽聚集体形成的影响。因此，本发明药物组合物中缓冲剂的存在量将根据使感兴趣的特定拮抗性抗-CD40抗体稳定性的最佳pH而变化。确定该最佳pH可通过本领域通常可采用的方法，包括，例如：评估构象稳定性的差示扫描量热法(DSC)；评估聚集和片段化的SDS-PAGE和大小排阻层析(SEC-HPLC)；和评估电荷改变相关降解的阳离子交换HPLC(CIEX-HPLC)分析。本发明的液体药物组合物的优选pH为约pH5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，以及约pH5.0至约pH7.0范围内的其他此类值。在一些实施方式中，所述缓冲剂将该药物组合物的pH维持在约pH5.0至约pH6.5，约pH5.0至约pH6.0，约pH5.0至约pH5.5，约pH5.5至约7.0，约pH5.5至约pH6.5，或约pH5.5至约pH6.0的范围内。
维持拮抗性抗-CD40抗体液体药物组合物的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的任何合适缓冲剂可用于该制剂，只要所述抗体能保留物理化学稳定性和所需生物活性，如上所述。合适的缓冲剂包括，但不限于，常规的酸及其盐，其中的抗衡离子可以是，例如，钠，钾，铵，钙，或镁。可用来缓冲该液体药物组合物的常规酸及其盐的离子包括，但不限于，柠檬酸或柠檬酸盐，琥珀酸或琥珀酸盐，醋酸或醋酸盐，酒石酸或酒石酸盐，磷酸或磷酸盐，葡糖酸或葡糖酸盐，谷氨酸或谷氨酸盐，天冬氨酸或天冬氨酸盐，马来酸或马来酸盐，以及苹果酸或苹果酸盐缓冲剂。已知缓冲剂可以是酸和该酸的盐形式的混合物，例如，柠檬酸和柠檬酸盐的混合物(文中称为柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂)，琥珀酸和琥珀酸盐的混合物(文中称为琥珀酸盐/琥珀酸缓冲剂)，醋酸和醋酸盐的混合物(文中称为醋酸盐/醋酸缓冲剂)，以及上述每种酸/酸盐对。缓冲剂的浓度可以从约1mM至约50mM，包括约1mM，2mM，5mM，8mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，或约1mM至约50mM范围内的其他此类值。在一些实施方式中，缓冲剂的浓度是从约5mM至约15mM，包括约5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，11mM，12mM，13mM，14mM，15mM，或约5mM至约15mM范围内的其他此类值。
在本发明的一些实施方式中，所述液体药物组合物包含所需浓度(即，约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，如上所述)的本文其他地方所述的拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，使组合物接近等渗的一定量的精氨酸-HCl，以及缓冲剂，该缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，其中缓冲剂的浓度能维持药物组合物的pH在约pH5.0至约pH7.0的范围内，优选约pH5.0至约pH6.5，包括约pH5.0，5.5，6.0和6.5。“柠檬酸盐”是指含有柠檬酸的盐的缓冲剂。在优选实施方式中，柠檬酸盐抗衡离子是钠阳离子，因此该柠檬酸盐缓冲剂组分是柠檬酸钠。然而，预计任何阳离子都是有效的。其他可能的柠檬酸盐阳离子包括，但不限于，钾，铵，钙，和镁。如上所述，柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂包含酸(即，柠檬酸)和该酸的盐形式(即，柠檬酸盐)的混合物，其中，酸的盐形式中的抗衡离子可以是任何合适的阳离子。在一个这样的实施方式中，酸的盐形式中的抗衡离子是钠阳离子，因此该缓冲剂包含柠檬酸和柠檬酸钠的混合物。如上所述，柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂的浓度可从约1mM至约50mM，包括约1mM，2mM，5mM，8mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，45mM，50mM，或1mM至约50mM范围内的其他此类值。在一些实施方式中，柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂的浓度从约5mM至约15mM，包括约5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，11mM，12mM，13mM，14mM，或约15mM。
在其他实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，约5.0mg/ml至约35.0mg/ml，约10.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约10.0mg/ml至约20.0mg/ml；使组合物接近等渗的一定量的精氨酸-HCl；以及缓冲剂，所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约1mM至约20mM，约5mM至约15mM，优选约10mM。再在其他实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体如单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，约5.0mg/ml至约35.0mg/ml，约10.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约10.0mg/ml至约20.0mg/ml；使组合物接近等渗的一定量的精氨酸-HCl；以及缓冲剂，所述缓冲剂是柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约1mM至约20mM，约5mM至约15mM，优选约10mM。
在一些优选实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段；维持药物组合物的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂；和精氨酸-HCl的浓度为约100mM至约200mM。在这些实施方式的一些中，所述缓冲剂是柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约5mM至约15mM，所述液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，且该药物组合物的pH为约pH5.0至约pH7.0，约pH5.0至约pH6.5，或约pH5.5至约pH6.0。在其他实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，约5.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约10.0mg/ml至约35.0mg/ml，包括约10.0mg/ml，约15.0mg/ml，约20.0mg/ml，约25.0mg/ml，约30.0mg/ml，或约35.0mg/ml；约150mM精氨酸-HCl；以及缓冲剂，其为约10mM的柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂；该制剂的pH为约pH5.5。
由于本发明液体药物制剂的加工期间因冻融或机械剪切造成的蛋白质降解可通过在制剂中加入表面活性剂降低液-气界面的表面张力来抑制。因此，在一些实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段；维持药物组合物的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂；一定量的使液体药物组合物接近等渗的精氨酸-HCl；以及还包含表面活性剂。在其他实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段；维持药物组合物的pH在约pH5.0至约pH7.0范围内的缓冲剂；精氨酸-HCl，其浓度为约50mM至约300mM，或约100mM至约200mM；以及还包含表面活性剂。
所采用的典型表面活性剂是非离子型表面活性剂，包括聚氧乙烯山梨醇酯，例如聚山梨酸酯80(吐温80)和聚山梨酸酯20(吐温20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，例如Brij35；二甲硅油；聚乙二醇，例如PEG400；溶血磷脂酰胆碱；和聚氧乙烯-对-叔辛基苯酚，例如Triton X-100。表面活性剂或乳化剂的经典药物稳定作用描述于，例如纳入本文作为参考的Levine等(1991)，J.Parenteral Sci.Technol.45(3)：160-165。用于实施本发明的优选表面活性剂是聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80。当包含表面活性剂时，一般按以下量加入：0.001％至约1.0％，约0.001％至约0.5％，约0.001％至约0.4％，约0.001％至约0.3％，约0.001％至约0.2％，约0.005％至约0.5％，约0.005％至约0.2％，约0.01％至约0.5％，约0.01％至约0.2％，约0.03％至约0.5％，约0.03％至约0.3％，约0.05％至约0.5％，或约0.05％至约0.2％，其中的百分比为重量/体积(w/v)百分比。
因此，在一些实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段；所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，例如，柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约1mM至约50mM，约5mM至约25mM，或约5mM至约15mM；组合物的pH为约pH5.0至约pH7.0，约pH5.0至约pH6.5，或约pH5.5至约pH6.0；存在精氨酸-HCl，其浓度为约50mM至约300mM，约100mM至约200mM，或约50mM至约150mM；该药物组合物还包含表面活性剂，例如，聚山梨酸酯20，其含量从约0.001％至约1.0％(w/v)或从约0.001％至约0.5％(w/v)。在其他实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，约5.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约10.0mg/ml至约35.0mg/ml，包括约10.0mg/ml，约15.0mg/ml，约20.0mg/ml，约25.0mg/ml，约30.0mg/ml，或约35.0mg/ml；约50mM至约200mM精氨酸-HCl，包括约150mM精氨酸-HCl；所述缓冲剂是柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约5mM至约20mM，包括约10mM；且该药物组合物任选包含表面活性剂，例如，聚山梨酸酯20，含量从约0.001％至约1.0％(w/v)，包括约0.001％至约0.5％(w/v)，约0.01％至约0.25％(w/v)，约0.025％至约0.2％(w/v)，约0.025％至约0.1％(w/v)，或约0.05％至约0.2％(w/v)；其中的液体药物组合物的pH为约pH5.0至约pH7.0，约pH5.0至约pH6.0，约pH5.0至约pH5.5，约pH5.5至约pH6.5，约pH5.5至约pH6.0，或约pH5.5。
该液体药物组合物可基本上不含任何防腐剂和其它载体、赋形剂或稳定剂。或者，该药物组合物可任选包含一种或多种防腐剂，例如抗细菌剂，药学上可接受的载体、赋形剂或本文它处描述的稳定剂，前提是它们对抗-CD40抗体或其抗原结合片段的理化稳定性无不利影响。可接受的载体、赋形剂和稳定剂的例子包括，但不限于：额外的缓冲试剂，助溶剂，表面活性剂，抗氧化剂，包括维生素C和甲硫氨酸，螯合剂，例如EDTA、金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和生物可降解的聚合物，例如聚酯。关于制剂和选择药学上可接受的载体、稳定剂和等渗剂(isomolytes)的详尽讨论见纳入本文作为参考的Remington′s PharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)(第18版；宾西法尼亚州伊顿市麦克出版公司(MackPublishing Company，Eaton，Pennsylvania)，1990)。
因此，在一个实施方式中，本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物还包含氨基酸甲硫氨酸以抑制抗体多肽链内可氧化的氨基酸残基的氧化。“抑制”是指尽可能降低随时间产生的氧化种类的累积。抑制氧化使得更多的拮抗性抗-CD40抗体维持其合适的分子形式。可采用甲硫氨酸的任何立体异构体(L、D或DL异构体)或其组合。加入量应为足以抑制可氧化氨基酸残基氧化的量，从而使得氧化种类的量为管理机构所接受。通常，这意味着该组合物含有不超过约10％至约30％的氧化产物。一般来说，这可通过加入甲硫氨酸来实现，从而加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的比值范围为约1:1至约1000:1，更优选10:1至约100:1。
要加入的甲硫氨酸的优选量通过制备包含感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段以及不同浓度甲硫氨酸的组合物并测定对于多肽氧化种类形成的相对效果从而根据经验方便地确定，测定相对效果可采用，例如，层析分离分子种类并利用多肽分子量标准品鉴定，如采用RP-HPLC或实施例1所述的疏水相互作用层析(HIC)。最大可能抑制可氧化氨基酸残基的氧化而对抗体聚集的氨基酸相关抑制没有不良影响的甲硫氨酸浓度代表着要加入组合物以进一步提高抗体稳定性的甲硫氨酸的优选量。
因此，在本发明的一些实施方式中，所述液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段；所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，例如，柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约1mM至约50mM，约5mM至约25mM，或约5mM至约15mM；药物组合物的pH为约pH5.0至约pH7.0，约pH5.0至约pH6.5，或约pH5.5至约pH6.0；存在精氨酸-HCl，其浓度为约50mM至约300mM，约100mM至约200mM，或约50mM至约150mM；存在表面活性剂，例如，聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，其含量从约0.001％至约1.0％(w/v)或从约0.001％至约0.5％(w/v)；且该药物组合物还包含甲硫氨酸，其浓度为约0.5mM至约20.0mM，约0.5mM至约10.0mM，约1.0mM至约20.0mM，约1.0mM至约10.0mM，约1.0mM至约7.0mM，约2.0mM至约6.0mM，或约2.5mM至约5.0mM。在其他实施方式中，该液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，约5.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约10.0mg/ml至约35.0mg/ml，包括约10.0mg/ml，约15.0mg/ml，约20.0mg/ml，约25.0mg/ml，约30.0mg/ml，或约35.0mg/ml；约50mM至约200mM精氨酸-HCl，包括约150mM精氨酸-HCl；柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约5mM至约20mM，包括约10mM；任选的表面活性剂，例如，聚山梨酸酯20，其含量从约0.001％至约1.0％(w/v)，包括约0.001％至约0.5％(w/v)，约0.01％至约0.25％(w/v)，约0.025％至约0.2％(w/v)，约0.025％至约0.1％(w/v)，或约0.05％至约0.2％(w/v)；以及任选的甲硫氨酸，例如，其浓度为约0.5mM至约10.0mM，约1.0mM至约7.0mM，约2.0mM至约6.0mM，或约2.5mM至约5.0mM，包括约2.0mM，约2.5mM，约3.0mM，约3.5mM，约4.0mM，约4.5mM，约5.0mM，或约5.5mM；其中，该液体药物组合物的pH为约pH5.0至约pH7.0，约pH5.0至约pH6.0，约pH5.0至约pH5.5，约pH5.5至约pH6.5，约pH5.5至约pH6.0，或约pH5.5。
再在其他实施方式中，所述液体药物组合物包含单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，其浓度为约0.1mg/ml至约50.0mg/ml，约5.0mg/ml至约35.0mg/ml，或约10.0mg/ml至约35.0mg/ml，包括约10.0mg/ml，约15.0mg/ml，约20.0mg/ml，约25.0mg/ml，约30.0mg/ml，或约35.0mg/ml；约100mM至约200mM精氨酸-HCl，包括约150mM精氨酸-HCl；柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，其浓度为约5mM至约20mM，包括约10mM；任选的表面活性剂，例如，聚山梨酸酯20，其含量从约0.025％至约0.1％(w/v)；以及任选的甲硫氨酸，例如，其浓度为约2.0mM至约5.5mM，包括约5.0mM；其中，该液体药物组合物的pH为约pH5.0至约pH6.0，包括约pH5.5。
除了上述那些试剂，可任选加入其他稳定剂如白蛋白、乙二胺四乙酸(EDTA)或它的一种盐如EDTA二钠以进一步提高液体药物组合物的稳定性。需要时，可加入的白蛋白的浓度为约1.0％w/v或更低。EDTA作为已知能催化许多氧化反应的金属离子的清除剂，从而提供了一种额外的稳定剂。需要时，可加入的EDTA的浓度为约0.1至约5.0mM。
需要时，本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的稳定的液体药物组合物中也可包含糖或糖醇。可使用任何糖类，如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。蔗糖是最优选的糖添加剂。“糖醇”定义为具有羟基的C4-C8烃，包括例如，甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇(galacititol)、卫矛醇、木糖醇和***糖醇，甘露醇是最优选的糖醇添加剂。上述糖或糖醇可单独或组合使用。对于用量没有固定限制，只要糖或糖醇在液体制品中可溶且对采用本发明方法获得的稳定效果没有不良影响。优选地，糖或糖醇的浓度在约1.0％和约15.0％(w/v)之间，更优选在约2.0％和约10.0％(w/v)之间。
制备了上述液体药物组合物之后可将其冻干以防降解。冻干液体组合物的方法是本领域一般技术人员已知的。使用前，组合物可用含有其它成分的无菌稀释剂(例如林格溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建。重建后，组合物优选用本领域技术人员已知的方法给药。
本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物是稳定的，因此与用含有氯化钠作为等渗剂的缓冲溶液制备的拮抗性抗-CD40抗体组合物相比，储存稳定性提高。不受理论局限，认为在液体制剂中观察到了这种提高的储存稳定性，而无论以后来使用的形式直接储存，以冷冻状态储藏并在使用之前解冻，或制备成干燥形式，如冻干的、空气干燥的或喷雾干燥的形式，以便日后在使用前重建成液体形式或其他形式。优选地，本发明的组合物以其液体形式直接储存以充分利用液体形式储存稳定性提高的益处，无需重建从而便于给药，以及能够提供预装填、随时可用的注射剂或者作为多剂量制品，如果该制剂可与抑菌剂配伍。
本发明的组合物涉及以下发现，即与用氯化钠和相应缓冲剂制备的含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物相比，使用精氨酸-HCl作为等渗剂以及使用酸和它的盐形式的混合物，如柠檬酸钠/柠檬酸，作为缓冲剂能使含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物的储存稳定性提高。组合物储存稳定性的这种提高是由于精氨酸的酸形式对治疗活性拮抗性抗-C40抗体稳定性的影响，更具体说是它对液体制剂储存期间的多肽聚集、片段化和脱酰胺的影响所致。此外，将精氨酸-HCl作为等渗剂掺入用本文所述方式缓冲的拮抗性抗-CD40抗体液体组合物中能使该液体药物组合物接近等渗而无需加入其他等渗剂，如氯化钠。
掺入本发明稳定的液体药物组合物中的精氨酸的酸形式能保护治疗活性拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段免遭物理和化学改变，从而提高组合物储存期间的抗体稳定性。“提高稳定性”是指与包含拮抗性抗-CD40抗体和相同制剂组分但不含这种特定等渗剂和稳定剂的液体药物组合物在储存期间观察到的相比，液体药物组合物储存期间抗体的聚集体形成、片段化和脱酰胺中的一种或多种情况有所降低。通过测量溶液中可溶性抗-CD40抗体随时间的变化不难测定液体组合物储存期间精氨酸-HCl对拮抗性抗-CD40抗体聚集的影响。溶液中可溶性抗-CD40抗体的量可通过适合检测感兴趣抗体的许多分析试验来量化。这种试验包括，例如，反相(RP)-HPLC、尺寸排阻(SEC)-HPLC和UV吸光度。聚集也可采用SDS-PAGE来监测。也可参见下面的实施例。
就聚集而言，要掺入含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物以获得本发明的稳定药物组合物的精氨酸-HCl的有效量是能降低随时间形成的聚集体，从而在溶液中保留更多未聚集的、生物活性分子形式可溶性拮抗性抗-CD40抗体的用量。因此，例如，当所述拮抗性抗-CD40抗体是下面实施例中所述的CHIR-12.12单克隆抗-CD40抗体时，用于制备本发明的稳定组合物的精氨酸-HCl的有效量是使CHIR-12.12抗体更多地保持其单体分子形式的量。
不受理论局限，本发明的含有拮抗性抗-CD40抗体的稳定液体组合物的储存稳定性提高也可能与储存期间精氨酸-HCl对抗体片段化和/或治疗活性抗体内谷氨酰胺和/或天冬酰胺残基脱酰胺的抑制作用有关。精氨酸-HCl对抗体片段化的作用通过监测制剂内分子种类随时间的改变不难确定，例如，使用SDS-PAGE和/或SEC-HPLC分析；见下文中的实施例。储存期间，精氨酸-HCl对液体组合物中抗-CD40抗体多肽脱酰胺的作用通过监测以其脱去酰氨基的形式存在的拮抗性抗-CD40抗体的量随时间的改变不难确定。测量溶液相中存在的多肽的分子类型(即天然的或脱去酰氨基的)的方法是本领域公知的。这种方法包括层析分离分子种类并采用多肽分子量标准品鉴定，如下文实施例所述的RP-HPLC或阳离子交换层析(CIEX-HPLC)。
本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的稳定液体药物组合物可含有其他化合物，这种化合物能提高作为治疗活性组分的感兴趣拮抗性抗-CD40抗体的功效或提高其所需特性，只要对精氨酸-HCl实现的基础稳定作用没有不良影响。该组合物对于所选途径给药必需安全，必需无菌，且必需保留其所需治疗活性。
例如，可通过预混合稳定剂和缓冲剂，以及任何其他赋形剂，之后掺入感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体来制备本发明的药物组合物。可加入以进一步稳定本发明的组合物的任何其他赋形剂必需对基础等渗剂和稳定剂，即精氨酸-HCl的稳定作用没有不良影响，再将其与缓冲剂混合，以获得本文所述的新组合物。加入精氨酸-HCl以使感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体接近等渗并提高稳定性之后，可用缓冲剂调节该液体组合物的pH，优选调至本文所述范围内，更优选调至感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体的最佳pH，例如，对单克隆抗体CHIR-12.12而言，pH在约pH5.0和pH7.0之间，优选约pH5.5。尽管可在将拮抗性抗-CD40抗体加入组合物之后调节pH，但优选在加入这种多肽之前调节，因为这样可降低多肽变性的风险。然后采用合适的机械装置来实现各组分的适当混合。
因此，本发明提供了一种提高液体药物组合物中拮抗性抗-CD40抗体，或其抗原结合片段的稳定性的方法。该方法包括将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与维持药物组合物的pH在约pH5.0和pH7.0之间的缓冲剂以及用量足以使组合物接近等渗的精氨酸-HCl混合。在一些实施方式中，所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，所述缓冲剂的浓度为约5mM至约50mM，精氨酸-HCl的用量能提供组合物中该等渗剂的浓度在约50mM至约300mM精氨酸-HCl之间。在其他实施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗体是CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体，或其抗原结合片段；所述缓冲剂为约5mM至约25mM的柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂；组合物中的精氨酸-HCl浓度为约150mM，且该组合物的pH为约5.0，约5.5，约6.0，或约6.5。
包含感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体，例如，拮抗性抗-CD40抗体如CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体，或其抗原结合片段的稳定液体药物组合物应配制成单位剂量并且可以是可注射或可输注形式，如溶液、悬浮液或乳剂。如上所述，可将其冷冻储存或制成干燥形式，如冻干粉末，在通过各种方法给药如口服或胃肠外给药途径之前将其重建成液体溶液、悬浮液或乳剂。优选以液体制剂储存，从而能利用按照上述本发明方法获得的提高的储存稳定性。这种稳定的药物组合物优选通过膜过滤灭菌并储存在单位剂量或多剂量容器中，如密封的药瓶或安瓿。可采用本领域已知的配制药物组合物的其他方法进一步提高本文所述液体药物组合物的储存稳定性，只要这些方法对上文所述的优选稳定剂和缓冲剂的有益效果没有不良影响。制剂和选择药学上可接受的载体、稳定剂等的详尽讨论见纳入本文作为参考的Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(第18版；宾西法尼亚州伊顿麦克出版公司，1990)。
在这种方式中，本发明提供了一种制品，其中包含装有本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的稳定液体药物组合物的容器，并任选包含使用说明书。合适的容器包括，例如，小药瓶、瓶子和注射器。该容器可用各种材料制成，如塑料或玻璃。在一个实施方式中，该容器是3-50cc的一次性玻璃药瓶。或者，对于立即可用的制剂，该容器可以是，例如，3-100cc的玻璃药瓶。该容器中装有制剂并贴有标签，或附有使用说明。所述制品还可包含从商业或使用者角度看来所需的其他物质，其中包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器以及使用说明书。
本发明药物组合物中的抗-CD40抗体
本发明的药物组合物包含抗-CD40抗体，尤其是拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，其靶向CD40受体并调节ADCC，干扰CD40信号传导，特别是由CD40和CD40配体(CD40L)相互作用介导的CD40信号传导途径，或这两者。“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”指属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的跨膜糖蛋白(参见，例如美国专利号5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等(1989)EMBO8：1403；Clark(1990)Tissue Antigens 36：33；Barclay等(1997)TheLeucocyte Antigen Facts Book(白血球抗原手册)(第二版；学术出版社，圣地亚哥))。已鉴定到该基因交替剪接转录变体编码的人CD40的两种同种型。第一种同种型(也称为“长同种型”或“同种型1”)表达为277个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：12(首次报道为GenBank登录号CAA43045，在GenBank登录号NP_001241中鉴定为同种型1)，由SEQ ID NO：11(参见GenBank登录号X60592和NM_001250)编码)，其具有由前19个残基代表的信号序列。第二种同种型(也称为“短同种型”或“同种型2”)表达为203个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：10(首次报道为GenBank登录号NP690593)，由SEQ ID NO：9(GenBank登录号NM_152854)编码)，其也具有由前19个残基表示的信号序列。人CD40的这两种同种型的前体多肽的前165个残基相同(即，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的残基1-165)。短同种型的前体多肽(SEQ ID NO：10所示)由缺乏编码区段，导致翻译读框移位的转录物变体(SEQID NO：9)编码；与CD40长同种型所含有的(SEQ ID NO：12的残基166-277所示C-末端)相比，得到的CD40同种型含有较短且不同的C-末端(SEQ ID NO：10的残基166-203)。对于本发明的目的，术语“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”包括CD40的短和长同种型。
如本文别处所述，CD40抗原展示在各种类型细胞的表面。“展示于表面”和“表达于表面”指CD40抗原的全部或一部分暴露在细胞的外部。展示的或表达的CD40抗原可完全或部分糖基化。
“激动活性”指作为激动剂的物质功能。激动剂可结合细胞的受体，引起与该受体的天然配体所引起的类似或相同的反应或活性。CD40激动剂可诱导但不限于以下所有应答：B细胞增殖和分化；抗体产生；胞间粘连；B细胞记忆产生；同种型转换；上调II类MHC和CD80/60的细胞表面表达；分泌促炎性细胞因子如IL-8、IL-12和TNF等。“拮抗活性”指作为拮抗剂的物质功能。CD40的拮抗剂可防止或降低通过CD40受体与激动剂配体，特别是CD40L结合所诱导的应答。拮抗剂可使激动剂结合所诱导的一种或多种应答降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、优选40％、45％、50％、55％、60％、更优选70％、80％、85％和最优选90％、95％、99％或100％。检测抗-CD40治疗剂，例如抗-CD40抗体和CD40-配体结合特异性与拮抗活性的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于标准的竞争性结合试验、监测B细胞分泌免疫球蛋白的试验、B细胞增殖试验、Banchereau样B细胞增殖试验、抗体产生的T细胞辅助试验、B细胞增殖的共同刺激试验和上调B细胞激活标记的试验。参见，例如纳入纳入本文作为参考的WO00/75348和美国专利号6,087,329中公开的试验。也可参见，2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27分别提交并给予美国专利申请号60/517,337(代理人案卷号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案卷号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案卷号PP20107.003(035784/277214))的题为“AntagonistAnti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的临时申请；以及2004/11/4提交并公布为WO2005/044854的同样题为“Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理人案卷号PP20107.004(035784/282916))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。
“明显的”激动活性指在B细胞应答试验中所检测的激动活性比天然物质或阴性对照诱导的高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。“明显的”激动活性优选在B细胞应答试验中检测到的激动活性比天然物质或阴性对照诱导的高至少2倍或3倍。因此，例如当感兴趣的B细胞应答是B细胞增殖时，“明显的”激动活性指诱导的B细胞增殖水平比天然物质或阴性对照诱导的B细胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一个实施方案中，不结合CD40的非特异性免疫球蛋白，例如IgG1作为阴性对照。“无明显激动活性”的物质显示在B细胞应答试验中检测到的激动活性高出天然物质或阴性对照诱导的激动活性不超过约25％，优选不超过约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不超过约0.1％。
在本发明的一些实施方式中，本发明的稳定液体药物组合物包含拮抗性抗-CD40抗体。如上所述，当这种抗体与人细胞上的CD40抗原结合时无明显激动活性。在本发明的一个实施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗体在一种细胞应答中无明显激动活性。在本发明的其他实施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗体在一种以上细胞应答(例如，增殖和分化，或增殖、分化，以及对B细胞而言的抗体产生)试验中无明显激动活性。在本发明的一些实施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗体是，例如，完整的人单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段，如下文所述。
任何本领域已知试验可用来测定抗-CD40抗体是否能作为一种或多种B细胞应答的拮抗剂。在一些实施方式中，所述抗-CD40抗体作为至少一种B细胞应答的拮抗剂，所述应答选自下组：B细胞增殖，B细胞分化，抗体产生，胞间粘连，B细胞记忆产生，同种型转换，上调II类MHC和CD80/60的细胞表面表达，以及分泌促炎性细胞因子如IL-8、IL-12和TNF。特别感兴趣的是当结合人B细胞表面的人CD40抗原时对B细胞增殖无明显激动活性的拮抗性抗-CD40抗体。
在一个这样的实施方式中，如在例如下文实施例4中所述的B细胞增殖试验中所测得的，所述抗-CD40抗体是B细胞增殖的拮抗剂，且该拮抗性抗-CD40抗体刺激B细胞增殖的水平高出天然物质或阴性对照诱导的B细胞增殖不超过约25％，优选高出不超过约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至高出不超过约0.1％。
在其他实施方式中，如在下文实施例4中所述的B细胞增殖试验中所测得的，所述抗-CD40抗体是其他抗-CD40抗体，如S2C6抗-CD40抗体诱导的B细胞增殖的拮抗剂，且存在该拮抗性抗-CD40抗体时由其他抗-CD40抗体刺激的B细胞增殖的水平不超过不存在该拮抗性抗-CD40抗体时由其他抗-CD40抗体诱导的B细胞增殖的约25％(即，至少75％抑制)，优选不超过约20％，15％，10％，5％，1％，0.5％，或者甚至不超过约0.1％。
再在其他实施方式中，如在下文实施例4中所述的B细胞活化试验中所测得的，所述抗-CD40抗体是细胞系EL4B5诱导的B细胞增殖的拮抗剂，且存在该拮抗性抗-CD40抗体时由EL4B5细胞系刺激的B细胞增殖的水平不超过不存在该拮抗性抗-CD40抗体时由该细胞系诱导的B细胞增殖的约25％(即，至少75％抑制)，优选不超过约20％，15％，10％，5％，1％，0.5％，或者甚至不超过约0.1％。
再在其他实施方式，如在下文实施例4中所述的B细胞产生抗体的人辅助T细胞试验中所测得的，所述抗-CD40抗体是人T细胞诱导的人B细胞抗体产生的拮抗剂。在这种方式中，存在所述拮抗性抗-CD40抗体时由T细胞刺激的B细胞产生IgG抗体、产生IgM抗体、或者产生IgG和IgM两者抗体的水平不超过不存在该拮抗性抗-CD40抗体时由T细胞刺激的B细胞产生各种抗体水平的约50％(即，至少75％抑制)，优选不超过约25％，20％，15％，10％，5％，1％，0.5％，或者甚至不超过约0.1％。
“CD40配体”表示可结合并活化一种或多种CD40信号传导途径的任何肽、多肽或蛋白质。因此，“CD40配体”包括，但不限于，全长CD40配体蛋白以及保留了充足活性以在表达CD40的细胞上行使结合并刺激CD40信号传导功能的它的变体和片段。对天然CD40配体，例如，人CD40配体(CD40L；也称为CD154)的修饰包括，但不限于，取代、缺失、平截、延伸、融合蛋白、片段、肽模拟物，等等。在本发明的一些实施方式中，评价拮抗性抗-CD40抗体生物活性的试验包括使用可溶性CD40L，例如，可溶性重组人CD40L(英国诺丁汉郡宾汉亚历克西斯公司(Alexis Corporation，Bingham，Nottinghamshire，UK))来刺激表达CD40的细胞中的CD40信号传导。
“CD40L-介导的CD40信号传导”是指细胞表面受体CD40和CD40配体相互作用导致的任何生物活性。CD40信号传导的例子是导致表达CD40的细胞增殖和存活，以及刺激表达CD40的细胞内的一种或多种CD40-信号传导途径的信号。CD40“信号传导途径”或“信号转导途径”用来表示CD40受体和CD40配体，例如CD40L，相互作用所导致并生成信号的至少一种生化反应，或一组生化反应，当该信号通过信号途径传递时导致信号传导级联中一个或多个下游分子的活化。信号转导途径涉及多个信号转导分子，该分子导致信号从细胞表面CD40受体传递通过细胞脂膜，并通过一系列信号传导分子中的一个或多个，通过细胞胞质，且在某些情况下还进入细胞核。CD40信号转导途径包括，例如，AKT信号传导途径，其导致AKT活化，并最终经NF-κB信号传导途径激活NF-κB；和促***原-活化的蛋白激酶(MAPK)信号传导途径，包括MEK/ERK信号传导途径和MEK/p38信号传导途径，其分别导致ERK和p38活化。这些信号传导途径的激活和阻断之间的平衡有利于细胞存活或凋亡。
在一些实施方式中，本发明的稳定药物组合物包含阻断CD40L-介导的CD40信号传导的拮抗性抗-CD40抗体。拮抗性抗-CD40抗体在阻断CD40L-介导的CD40信号传导中的作用的更加详细描述可参见，例如，2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27分别提交并给予美国专利申请号的60/517,337(代理人案卷号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案卷号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案卷号PP20107.003(035784/277214))的题为“AntagonistAnti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的临时申请，以及2004/11/4提交并公布为WO2005/044854的同样题为“Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理人案卷号PP20107.004(035784/282916))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。也可参见题为“Methods for Diagnosis and Treatment of Proliferative Disorders Mediatedby CD40 Signaling(诊断和治疗CD40信号传导介导的增生性疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并给予美国专利申请号60/749,285(代理人案卷号PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125143的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019414(代理人案卷号PP028035.0003(035784/311611))；和题为“Methods for Diagnosis and Treatment of Diseases Havingan Autoimmune and/or Inflammatory Component(诊断和治疗具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并给予美国专利申请号60/749,336(代理人案卷号PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125117的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019325(代理人案卷号PP028062.0003(035784/311608))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。
本发明的稳定液体药物组合物包含抗-CD40抗体，尤其是拮抗性抗-CD40抗体和/或其抗原结合片段。以下术语和定义适用于这种抗体。
“抗体”和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。使用这两个术语时意义相同。一些情况下，免疫球蛋白的抗原特异性是已知的。
术语“抗体”以最广泛含义使用，包括完整装配的抗体、能够结合抗原的抗体片段(例如，Fab，F(ab’)2，Fv，单链抗体，双特异抗体，抗体嵌合体，杂交抗体，双特异性抗体，人源化抗体，等等)、以及包含以上物质的重组肽。
本文使用的术语“单克隆抗体”和“mAb”指得自基本上均质的抗体群的抗体，即除了可能存在极少量天然发生的突变以外，构成该群的每个抗体是相同的。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白。每条轻链经共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目视不同免疫球蛋白同种型的重链而不同。每条重链和轻链也具有律则隔开的链内二硫桥。每条重链的一端为可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端为可变区(VL)，在另一端为恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区配对，轻链可变区与重链的可变区配对。据信，特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成相互作用界面。
术语“可变”表示以下内容：在抗体之间，可变区的某些部分在序列上差别很大。可变区赋予抗原结合特异性。然而，可变性不是均匀分布于整个抗体可变区中。它集中于位于轻链或重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区的3个区段。可变区的较保守部分称为框架(FR)区。天然轻链和重链的可变区各包含主要采取β-片层构型并通过3个CDR相连的4个FR区，CDR形成(有时形成部分)连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过FR区紧密相聚，并且与另一条链的CDR紧靠在一起形成抗体的抗原结合位点(参见，Kabat等(1991)NIHPubl.No.91-3242，第I卷，647-669页)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示各种效应器功能，例如Fc受体(FcR)结合、抗体参与依赖于抗体的细胞毒性、启动依赖补体的细胞毒性和肥大细胞脱颗粒。
本文使用的术语“超变区”指负责结合抗原的抗体氨基酸残基。超变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等(1991)Sequences of proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)(第5版，马里兰州贝萨达国立卫生研究院公众健康服务部(Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD))和/或“超变环”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。“框架”或“FR”残基是除超变区残基以外的可变区残基。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab、F(ab′)2和Fv片段；双特异抗体；线性抗体(Zapata等(1995)Protein Eng 8(10):1057-1062)；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性(multispecific)抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个称为“Fab”片段的相同抗原结合片段(各具有一个抗原结合位点)与一残留的“Fc”片段(其名字反映它易于结晶)。胃蛋白酶处理得到具有两个抗原结合位点的F(ab′)2片段，该片段仍能交联抗原。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由紧密地非共价缔合的一条重链可变区和一条轻链可变区的二聚体组成。每个可变区的3个CDR正是以这种构型相互作用而确定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR共同赋予了该抗体的抗原结合特异性。然而，即使一个可变区(或仅含有3个抗原特异性CDR的半个Fv)也能识别并结合抗原，虽然亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段也含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)。Fab片段因在重链CH1结构域的羧基末端多几个残基(包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸残基)而不同于Fab’片段。本文称为Fab′-SH的是其恒定区半胱氨酸残基带有一个游离巯基的Fab′。通过还原F(ab′)2片段的重链二硫键产生Fab′片段。抗体片段的其它化学偶联反应也是已知的。
任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可分为两种明显不同的类型，该两种类型根据它们恒定区的氨基酸序列称为κ和λ。
免疫球蛋白可依它们重链恒定结构域的氨基酸序列分为不同类型。人免疫球蛋白主要有5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。不同的同种型具有不同的效应器功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有ADCC(依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性)活性。
本文所用的“标记”指直接或间接与抗体偶联而产生“标记”抗体的可检测化合物或组合物。标记本身可检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学转变。
本文所用的术语“宿主细胞”指以单核实体培养的微生物或真核细胞或细胞系，它们可以或已用作重组载体或其它转移多核苷酸的受者，并且包括受转染原始细胞的后代。应理解，由于天然的、偶发的或设计的突变，一个细胞的后代在形态或基因组或总DNA互补性上无需和原始亲代完全相同。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。这些细胞优选至少表达FcγRII并行使依赖抗原的细胞介导细胞毒性(ADCC)效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核的细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。具有ADCC活性的抗体通常是IgG1或IgG3同种型。应注意，除了分离IgG1和IgG3抗体以外，这种ADCC介导性抗体可通过将非ADCC抗体的可变区或可变区片段工程改造为IgG1或IgG3同种型的恒定区来制备。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述能结合抗体Fc区域的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR可结合IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体或者交替剪接形式。FcγRII受体包括具有相似氨基酸序列(主要在于胞质结构域不同)的FcγIIA(“活化性受体”)和FcγIIB(“抑制性受体”)。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15:203-234)。FcR综述见Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel等(1994)Immunomethods 4:25-34和de Haas等(1995)J.Lab.Clin.Med.126:330-341。本文的术语“FcR”包括其它FcR，包括将来鉴定到的FcR。该术语也包括将母体IgG转移至胎儿的新生受体，FcRn(Guyer等(1976)J.Immunol.117:587和Kim等(1994)J.Immunol.24:249(1994))。
制备人抗体的方法有很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌细胞无限增殖。然而，EBV-感染的细胞难于克隆并且得到的免疫球蛋白产量通常较低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 100:5-40)。将来，可能通过引入转化基因的有限组合来实现人B细胞的无限增殖。近来的发现增加了这种可能性，即端粒酶催化性亚基连同H-ras的SV40大癌蛋白和H-ras癌等位基因一起表达可导致正常人上皮细胞和成纤维细胞的致癌性转变(Hahn等(1999)Nature 400：464-468)。现在已可能制备经过免疫后能产生全套人抗体而不产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)(Jakobovits等(1993)Nature 362:255-258；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65-93；Fishwild等(1996)Nat.Biotechnol.14:845-851；Mendez等(1997)Nat.Genet.15:146-156；Green(1999)J.Immunol.Methods 231:11-23；Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727；综述见Little等(2000)Immunol.Today 21:364-370)。例如，嵌合型和种系突变小鼠的抗体重链连接区(JH)基因的纯合消除可完全抑制内源性抗体的产生已见描述(Jakobovits等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-2555)。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这种种系突变小鼠可制备转基因小鼠品系(Jakobovits等(1993)Nature 362:255-258)。Mendez等(1997)(Nature Genetics 15:146-156)，当用抗原攻击后可产生高亲和力完全人抗体。这可通过将兆碱基的人重链和轻链基因座通过种系整合入删除了上述内源性JH区段的小鼠来实现。这些小鼠(II技术(抗体基因公司(Abgenix)；弗里蒙特(Fremont)，加州(California)))具有1,020kb的人重链基因座和800kb的人κ基因座，其中人重链基因座含有约66个VH基因、完全的DH和JH区域，以及3个不同的恒定区，人K基因座含有32个Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。这些小鼠中产生的抗体在各方面，包括基因重排、装配和所有成分极其类似于在人中观察到的抗体。由于删除了内源性片段从而防止了鼠基因座中基因重排，优先表达此种人抗体而不是内源性抗体。这种小鼠可用特别感兴趣的抗原免疫。
可筛选这种免疫动物血清对原先(接种)抗原的抗体反应性。可从***或脾细胞分离淋巴细胞，可进一步选择淋巴细胞中的CD138-阴性和CD19-阳性细胞来选择B细胞。一方面，可将这种B细胞培养物(BCC)与骨髓瘤细胞融合以产生上述杂交瘤。
在另一方面，宜进一步筛选这种B细胞培养物对原先(接种)抗原的反应性。这种筛选包括采用靶/抗原蛋白质的酶联免疫吸附试验(ELISA)，用能与感兴趣抗原结合和与瞬时转染的表达该靶抗原的CHO或其它细胞体外结合的已知抗体的竞争性试验。
CD40的单克隆抗体是本领域已知的。参见，例如以下文献中有关B-细胞抗原的章节，McMichael编，(1987；1989)Leukocyte Typing III and IV(白细胞分型III和IV)(牛津大学出版社，纽约)；美国专利号5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO00/63395；国际公布号WO02/28905和WO02/28904；Gordon等(1988)J.Immunol.140:1425；Valle等(1989)Eur.J.Immunol.19:1463；Clark等(1986)PNAS 83:4494；Paulie等(1989)J.Immunol.142:590；Gordon等(1987)Eur.JImmunol 17:1535；Jabara等(1990)J.Exp.Med.172:1861；Zhang等(1991)J.Immunol.146:1836；Gascan等(1991)J.Immunol.147:8；Banchereau等(1991)Clin.Immunol.Spectrunt 3:8；和Banchereau等(1991)Science 251:70；所有文献纳入本文作为参考。其他抗-CD40单克隆抗体包括，但不限于，人源化抗-CD40抗体，如SGN-40(Tai等(2004)Cancer Res.64:2846-52；美国专利号6,838,261)，它是鼠抗-CD40抗体SGN-14的人源化形式(Francisco等(2000)Cancer Res.60：3225-31)，以及美国专利申请公布号2004/0120948中所述的激动性和拮抗性抗体；通过引用全文纳入本文。
本发明特别感兴趣的是用来阻断CD40L-介导的CD40信号传导的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，它也可调节ADCC，如例如下文所述的CHIR-12.12抗体所做的那样。
用于本发明的稳定液体药物组合物中的拮抗性抗-CD40抗体包括能特异性结合人细胞表面表达的人CD40抗原的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述稳定的液体药物组合物内的拮抗性抗-CD40抗体对CD40细胞表面抗原显示出强烈的单一位点结合亲和力。采用标准试验，例如BiacoreTM测定这种单克隆抗体对CD40的解离平衡常数(KD)显示为至少10-5M、至少3×10-5M、优选至少10-6M至10-7M、更优选至少10-8M至约10-12M。Biacore分析是本领域已知的，其细节见“BIAapplications handbook”(BIA应用手册)。WO01/27160所述的方法用于调节结合亲和力。
特别感兴趣的是当结合人细胞上的CD40抗原时，尤其是当结合肿瘤性人B细胞上的CD40抗原时，如上文所定义无明显激动活性但显示出拮抗活性的拮抗性抗-CD40抗体。在本发明的一个实施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗体在一种B细胞应答中无明显激动活性。在本发明的其他实施方式中，所述拮抗性抗-CD40抗体在一种以上B细胞应答(例如，增殖和分化，或者增殖，分化，和抗体产生)试验中无明显激动活性。合适的单克隆抗-CD40抗体具有人恒定区；优选它们还具有完整的或部分人源化框架区；和最优选是完整的人抗体或其抗原结合片段。这种单克隆抗体的例子是本文称为CHIR-5.9和CHIR-12.12的抗体。
因此，在一些实施方式中，存在于本发明的稳定液体药物组合物中的拮抗性抗-CD40抗体是单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12。所述CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体是杂交瘤细胞系131.2F8.5.9(本文称为细胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(本文称为细胞系12.12)产生的IgG1同种型完全人抗-CD40单克隆抗体。采用含有人IgG1重链基因座和人κ链基因座的免疫的异种小鼠(
Figure G2007800139737D0028100608QIETU
II技术；抗体基因公司；弗里蒙特，加州)的脾细胞产生这些细胞系。使脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(谢拉生物源公司(Sierra BioSource))融合。将得到的杂交瘤亚克隆数次得到稳定的单克隆细胞系5.9和12.12。本发明的其它抗体可用含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠或通过本领域已知和/或本文所述的其它方法类似地制备。
本文公开了CHIR-12.12抗体可变区的核苷酸和氨基酸序列，以及CHIR-5.9抗体可变区的氨基酸序列。更具体地说，mAb CHIR-12.12轻链和重链前导区、可变区和恒定区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2(mAb CHIR-12.12轻链的完整序列)，SEQ ID NO:4(mAb CHIR-12.12重链的完整序列)，和SEQ ID NO:5(SEQ IDNO:4所示mAb CHIR-12.12重链的变体的完整序列，其中所述变体用丝氨酸取代了SEQ ID NO:4第153位残基上的丙氨酸)。mAb CHIR-12.12轻链和重链的编码核苷酸序列示于SEQ ID NO:1(mAb CHIR-12.12轻链的编码序列)和SEQ ID NO:3(mAb CHIR-12.12重链的编码序列)。CHIR-5.9mAb轻链和重链的前导区、可变区和恒定区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:6(mAb CHIR-5.9轻链的完整序列)，SEQID NO:7(mAb CHIR-5.9重链的完整序列)，和SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:7所示mAb CHIR-5.9重链的变体的完整序列，其中所述变体用丝氨酸取代了SEQ IDNO:7第158位残基上的丙氨酸)。再者，表达CHIR-5.9抗体的杂交瘤(小鼠杂交瘤系131.2F8.5.9(CMCC#12047)和表达CHIR-12.12抗体的杂交瘤(小鼠杂交瘤系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056)于2003/9/17由ATCC(美国典型培养物保藏中心；10801大学大道，马纳斯，弗吉尼亚20110-2209(美国))保藏，专利保藏编号分别为PTA-5542和PTA-5543。
除了拮抗活性，用于本发明的稳定液体药物组合物的抗-CD40抗体可具有抵抗肿瘤细胞的其他作用机制。例如，天然CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体具有ADCC活性。或者，CHIR-5.9和CHIR-12.12抗体的可变区可表达具有ADCC活性的其他抗体同种型。还可以将CHIR-5.9或CHIR-12.12的天然形式、重组形式或抗原结合片段与细胞毒素、治疗剂或者放射性金属离子或放射性同位素偶联，如下文所述。
在ELISA类型的试验中，通过流式细胞术试验测定，CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体结合可溶性CD40，防止CD40-配体与细胞表面CD40结合，并替代了之前结合的CD40-配体。抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12相互竞争结合CD40，但不与2000/10/2提交的题为“Human Anti-CD40 Antibodies(人抗-CD40抗体)”的美国临时申请序列号60/237,556以及2001/10/2提交的同样题为“Human Anti-CD40Antibodies(人抗-CD40抗体)”的PCT国际申请号PCT/US01/30857(代理人案卷号PP16092.003)中所述的抗-CD40单克隆抗体15B8竞争，这两个申请通过引用全文纳入本文。当在体外检测对来自正常人对象的B细胞增殖的作用时，CHIR-5.9和CHIR-12.12作为拮抗性抗-CD40抗体。此外，CHIR-5.9和CHIR-12.12不诱导来自正常人对象的人淋巴细胞强烈增殖。这些抗体能够通过依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀死表达CD40的靶细胞。通过BiacoreTM试验测得，CHIR-5.9对人CD40的结合亲和力为1.2x10-8M，对CHIR-12.12的结合亲和力为5x10-10M。
具有与上述单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12相同结合特性的其他拮抗性抗-CD40抗体包括，但不限于以下抗体：(1)由称为131.2F8.5.9(文中称为细胞系5.9)和153.8E2.D10.D6.12.12(文中称为细胞系12.12)的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体，所述两种细胞系由ATCC分别以专利保藏编号PTA-5542和专利保藏编号PTA-5543保藏；(2)包含选自下组的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO:2所示序列，SEQ ID NO:4所示序列，SEQ ID NO:5所示序列，SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4二者所示的序列，以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5二者所示的序列；(3)包含选自下组的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO:6所示序列，SEQ ID NO:7所示序列，SEQ ID NO:8所示序列，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7二者所示的序列，以及SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8二者所示的序列；(4)具有由包含选自下组的核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，以及SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3二者所示的核苷酸序列；(5)与能够结合杂交瘤细胞系5.9或杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体的表位结合的单克隆抗体；(6)与包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的残基82-87的表位结合的单克隆抗体；(7)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-5.9或CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；和(8)作为CHIR-12.12或CHIR-5.9单克隆抗体或者上述项目(1)-(7)中所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，其中所述片段保留了特异性结合人CD40抗原的能力。
本领域技术人员知道，本文所述的抗体以及这些抗体的抗原结合片段包括采用本领域熟知和下文描述的方法重组产生的抗体及其抗原结合片段，包括，例如，重组产生的单克隆抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12。
其他拮抗性抗-CD40抗体包括称为5D12、3A8和3C6的单克隆抗体，它们分别由ATCC登录号为HB11339、HB12024和HB11340的杂交瘤分泌。参见，例如，美国专利号6,315,998，通过引用全文纳入本文。
其他拮抗性抗-CD40抗体是本领域已知。参见，例如，由通过引用全文纳入本文的美国专利申请公布号20020142358和20030059427中披露的称为F4-465的杂交瘤制造的人抗-CD40抗体。F4-465获自HAC小鼠(Kuroiwa等(2000)NatureBiotech.10:1086(2000))并因此而表达人λ轻链。
本发明药物组合物中抗体的产生
可用本领域技术人员已知的任何抗体产生方法制备用于本发明药物组合物中的抗体，例如，本文披露的拮抗性抗-CD40抗体。因此，可通过常规方法制备多克隆血清。通常先用含感兴趣的抗原，即CD40抗原的溶液免疫合适的动物，优选小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可获得大量血清同时有标记的抗-家兔和抗-山羊抗体可用，优选用家兔和山羊制备多克隆血清。
可在转基因动物，优选携带人免疫球蛋白基因座的小鼠中制备多克隆血清。在一优选的实施方案中，表达感兴趣的蛋白质，例如CD40，的SF9细胞用作免疫原。也可用盐水，优选佐剂，例如完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，经胃肠外(通常是皮下或肌肉内)注射该混合物或乳剂来免疫。每次注射50-200μg的剂量一般足够。通常在2-6周后注射用盐水，优选用不完全弗氏佐剂配制的蛋白质加强免疫一次或多次。或者可用本领域已知的方法通过体外免疫产生抗体，就本发明目的而言体外与体内免疫等效。将免疫动物的血液放入玻璃或塑料容器，25℃孵育该血液1小时，然后4℃孵育2-18小时获得多克隆抗血清。离心(例如，1,000×g10分钟)回收血清。每次放血可自家兔获得约20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞的制备方法见纳入本文作为参考的美国专利号6,004,552中所述。对于CD40，简言之，将编码人CD40的序列用转移载体重组入杆状病毒。将质粒与野生型杆状病毒DNA共同转染入Sf9细胞。鉴定重组杆状病毒感染的Sf9细胞并克隆纯化。
优选的抗体在性质上是单克隆抗体。“单克隆抗体”指得自基本上均质抗体群的抗体，即除了存在极少量天然发生的突变以外，组成该群的每个抗体相同。该术语不受限于抗体的种类或来源。该术语包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了抗体的抗原结合功能的其它片段。单克隆抗体是高度特异性的，针对一个的抗原性位点；例如，对于抗-CD40抗体是CD40细胞表面抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上一个决定簇。修饰词“单克隆的”表示得自基本上均质的抗体群的抗体特性，不可理解为需要通过任何具体方法产生该抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过Kohler等(1975)Nature 256：495首次描述的杂交瘤方法或重组DNA方法制备(参见，例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可用，例如Clackson等(1991)Nature 352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；和美国专利号5,514,548中所述技术从噬菌体抗体文库分离得到。
“表位”指抗原性分子中能产生抗体并结合该抗体的那一部分。表位可含有线性氨基酸残基(即，表位内的残基以线性方式一个接一个顺序排列)，非线性氨基酸残基(本文称为“非线性表位”；这些表位非顺序排列)或线性与非线性氨基酸残基。
可使用Kohler等(1975)Nature 256：495-496所述方法或其改进形式制备单克隆抗体。通常用含抗原的溶液免疫小鼠。可用盐水，优选佐剂，例如完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，经胃肠外注射混合物或乳剂来免疫。可用本领域已知的任何免疫方法来获得本发明的单克隆抗体。免疫动物后，取出脾脏(任选取出几个大的***)解离成为单个细胞。使细胞混悬液涂布于包被有感兴趣抗原的板或孔来筛选脾细胞。表达抗原特异性膜结合免疫球蛋白的B细胞与板结合而不被洗掉。然后诱导得到的B细胞或所有分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，用选择性培养基培养。通过连续稀释接种得到的细胞并测定能特异性结合感兴趣抗原(但不结合无关抗原)的抗体产生。然后将分泌单克隆抗体(mAb)的选出的杂交瘤在体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(作为小鼠的腹水)培养。
当用重组DNA方法制备拮抗性抗-CD40抗体时，使用常规方法(例如，用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)不难分离并测序编码单克隆抗体的DNA。本文所述的杂交瘤细胞是这种DNA的优选来源。一旦分离后，可将此DNA置于表达载体中，然后将载体转染入本身不产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如大肠杆菌、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中从而获得在该重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述包括Skerra等(1993)Curr.Opinion in Immunol.5：256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130：151。或者，如纳入本文作为参考的美国专利号5,545,403；5,545,405和5,998,144中所公开的，可在细胞系，例如CHO细胞系中制备抗体。简言之，用能表达轻链和重链的载体分别转染该细胞系。嵌合抗体可通过转染不同载体上的两种蛋白质来制备。另一优点是该抗体正确糖基化。
在一些实施方案中，用GS基因表达***(新罕布什尔州朴茨茅斯隆萨生物技术公司(Lonza Biologics，Portsmouth，New Hampshire))在CHO细胞中制备拮抗性抗-CD40抗体，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段，所述表达***使用谷氨酰胺合成酶作为标记。也参见其内容全文纳入本文作为参考的美国专利号5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216。
此外，用于本发明药物组合物的抗体可以是具有所需结合特性的嵌合抗体。因此，例如，用于本发明方法的嵌合抗-CD40抗体可具有本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体的结合特性。“嵌合”抗体指最好是用重组脱氧核糖核酸技术衍生的含有人(包括免疫相关物种，例如黑猩猩)和非人组分的抗体。因此，嵌合抗体恒定区最好基本上与天然人抗体的恒定区相同；嵌合抗体可变区最好衍生自非人来源并对感兴趣的抗原，即CD40抗原具有所需的抗原特异性。非人来源是可用来产生针对人抗原或含有人CD40抗原物质的抗体的任何脊椎动物来源。这种非人来源包括，但不限于啮齿类(例如，家兔、大鼠、小鼠等；参见，例如，纳入本文作为参考的美国专利号4,816,567)和非人灵长类(例如，古猴(Old World Monkey)，类人猿等；例如纳入本文作为参考的美国专利号5,750,105和5,756,096)。当本文所用的短语“免疫活性”指嵌合性抗-CD40抗体时，指能结合人CD40的嵌合抗体。
“人源化”指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最少序列的抗体形式。人源化抗体的大部分是具有所需特异性、亲和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者超变区(也称为互补决定区或CDR)的残基被非人物种(供体抗体)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的超变区的残基取代。短语“互补决定区”指共同确定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。参见，例如Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Kabat等(1991)美国健康与人类服务部(U.S.Dept.ofHealth and Human Services)，NIH公布号91-3242)。短语“恒定区”指抗体分子中赋予效应器功能的那部分。在以前涉及产生用于治疗人疾病的无免疫原性抗体的研究中，小鼠恒定区被人恒定区取代。所述人源化抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。然而，这些人源化抗体仍能在人中引发有害且可能危险的免疫应答并且丧失了亲和力。用于本发明药物组合物的人源化抗体，例如，人源化抗-CD40抗体，具有类似于感兴趣的亲代抗体，例如本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体所显示的结合特性。
人源化基本上可根据Winter及其同事(Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)的方法通过用啮齿类或突变型啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。也参见纳入本文作为参考的美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一个或多个可变区的框架区内的残基为对应的非人残基所取代(参见，例如美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗体可含有在受者抗体或供体抗体中没发现的残基。制备这些修饰物可进一步精制抗体的性能(例如，获得所需的亲和力)。总体上，人源化抗体基本上含有所有可变区、至少一个，通常两个可变区，其中所有或基本上所有的超变区对应于非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列。人源化抗体也任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多的细节见引作参考的Jones等(1986)Nature 331:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。因此，这种“人源化”抗体可包括其中基本上小于完整的人可变区被非人种类的相应序列取代的抗体。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。参见，例如美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370，和国际公布号WO01/27160，其中公开了人源化抗体和产生对预定抗原的亲和力改进的人源化抗体的技术。
实践本发明时还可采用在以灭活的内源性免疫球蛋白(Ig)基因座为特征的非人哺乳动物宿主，更具体说是转基因小鼠内产生异种抗体或修饰抗体。在这种转基因动物中，使得表达宿主免疫球蛋白轻链和重链的活性内源性基因无功能，并用同类人免疫球蛋白基因座取代。这些转基因动物可产生基本上无宿主免疫球蛋白轻或重链亚基的人抗体。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号5,877,397和5,939,598。
在一些实施方式中，针对CD40的完整人抗体例如是通过免疫转基因小鼠获得的。这种小鼠可采用
Figure G2007800139737D0034100843QIETU
II技术(抗体基因公司；弗里蒙特，加州)获得并公开于纳入本文作为参考的美国专利号6,075,181；6,091,001和6,114,598中。为制备本文公开的抗体，用表达人CD40的Sf9细胞免疫具有人IgG1重链基因座和人K轻链基因座的转基因小鼠。小鼠也可以是具有其它同种型的转基因动物。本发明的稳定液体药物组合物所用的完整人抗体的特征在于其结合特性与本文公开的CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体所显示的特征相似。
感兴趣的特定抗体，例如抗-CD40抗体(包括拮抗性抗-CD40抗体)的片段也适用于本发明的稳定液体药物组合物，只要它们保留了全长抗体的所需亲和力。因此，例如，抗-CD40抗体的片段将保留结合CD40B细胞表面抗原的能力。这种片段的特征在于其性能与相应的全长抗体相似。因此，例如，全长拮抗性抗-CD40抗体的片段可特异性结合人细胞表面表达的人CD40抗原，并且当与人CD40表达细胞上的CD40抗原结合时无明显激动活性却显示拮抗活性。本文将这种片段称为“抗原结合”片段。
抗体的合适抗原结合片段含有全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括，但不限于Fab、F(ab′)2、Fv片段和单链抗体分子。“Fab”指由轻链或重链的一部分组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。F(ab′)2指含有两条轻链和两条重链的一部分的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”抗体片段指含有抗体的VH和VL结构域的片段，其中这些结构域存在于一条多肽链中。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL结构域之间还含有一多肽接头使sFv能形成抗原结合的所需结构。sFv的综述见Pluckthun(1994)The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，纽约)，269-315页。如下文所述，本文公开的拮抗性抗-CD40抗体的抗原结合片段也可与细胞毒素偶连以起杀死靶癌细胞的作用。
可利用例如McCafferty等(1990)Nature 348:552-554(1990)和美国专利号5,514,548中描述的技术从抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等(1991)Nature 352:624-628和Marks等(1991)J.Mol.Bird.222:581-597分别描述了利用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等(1992)Bio/Technology 10:779-783)以及组合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的方案来产生高亲和力(nM范围)人抗体(Waterhouse等(1993)Nucleic.Acids Res.21:2265-2266)。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
已开发了各种技术来制备抗体片段。这些片段通过使完整抗体蛋白水解消化而获得(参见，例如Morimoto等(1992)Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992)和Brennan等(1985)Science 229:81)。然而，现在这些片段可通过重组宿主细胞直接制备。例如，可从上述噬菌体文库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等(1992)Bio/Technology 10:163-167)。根据另一方法，可从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab′)2片段。其它制备抗体片段的技术是技术人员熟知的。
本发明的稳定液体药物组合物所用的拮抗性抗-CD40抗体包括本文公开的CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体以及与该抗体不同但保留了CDR的抗体；具有一个或多个氨基酸添加、删除或取代的抗体，其中所述拮抗活性可通过抑制B细胞增殖和/或分化来测定。本发明也包括脱免疫的(de-immunized)抗体，特别是脱免疫的拮抗性抗-CD40抗体，该抗体可按纳入本文作为参考的国际公布号WO98/52976和WO0034317所述制备。本发明的拮抗性抗-CD40抗体内的残基以该方式修饰而使得该抗体对人无免疫原性或较低，但却保留了它们对人CD40表达细胞的拮抗活性，所述活性可用本文其它部分所述试验测定。本发明的范围也包括本领域已知的含有感兴趣的抗体，例如拮抗性抗-CD40抗体或其片段的融合蛋白，所述融合蛋白可合成或从相应的多核苷酸载体表达。参考本文它处所述的抗体偶联来描述这种融合蛋白。
具有感兴趣的结合特异性的任何已知抗体可具有用例如纳入本文作为参考的专利公布号EP 0 983303A1、WO00/34317和WO98/52976中所述方法产生的序列变异。例如，CDR中的序列显示可导致抗体与II类MHC结合并引发有害的辅助性T细胞应答。保守取代可使得该抗体保留结合活性而丧失其引发有害T细胞应答的能力。可用本领域已知，例如本文其它部分所述的方法进行任何这种保守或非保守取代，得到的抗体也可用于本发明的稳定液体药物组合物。用本文所述方法常规测试变体抗体的具体活性，例如拮抗活性、亲和力和特异性。
通过上述任一种方法或本文所述任何其他方法制造的拮抗性抗-CD40抗体可按类似于CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体的方法使用，其中，它具有以下生物活性中的至少一种：抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T细胞刺激的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制表达CD40L的细胞或可溶性CD40配体(sCD40L)刺激的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固相CD40L刺激的任何细胞中“存活的”抗-凋亡胞内信号转导；抑制细胞与sCD40L或固相CD40L结合时的CD40信号转导；抑制人恶性B细胞增殖；带有CD40的靶细胞或带有CD40同源配体的细胞(包括但不限于T细胞和B细胞)的删除、无反应性和/或耐受诱导；诱导CD4+CD25+调节T细胞的扩增或活化(参见，例如，经CD40-CD40L干扰发生的供体同种抗原-特异性组织排斥，van Maurik等(2002)J.Immunol.169:5401-5404)；经任何机制发生的细胞毒性(包括但不限于靶细胞中依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、依赖于补体的细胞毒性(CDC)、增殖的下调和/或凋亡)；调节靶细胞细胞因子分泌和/或细胞表面分子表达；以及它们的组合。测定本文所述拮抗性抗-CD40抗体及其抗原结合片段的所需生物活性的试验可按以下申请中的描述进行：2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27分别提交并给予美国专利申请号60/517,337(代理人案卷号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案卷号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案卷号PP20107.003(035784/277214))的题为“Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodiesand Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的临时申请；以及2004/11/4提交并公布为WO2005/044854的同样题为“Antagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗CD40单克隆抗体及其用法)”的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理人案卷号PP20107.004(035784/282916))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。也可参见以下申请中描述的试验：题为“MethodsforDiagnosis and Treatment of Proliferative DisordersMediated by CD40 Signaling(诊断和治疗CD40信号传导介导的增生性疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并指定为美国专利申请号60/749,285(代理人案卷号PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125143的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019414(代理人案卷号PP028035.0003(035784/311611))；和题为“Methods for Diagnosis and Treatment ofDiseases Having an Autoimmune and/or Inflammatory Component(诊断和治疗具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并指定为美国专利申请号60/749,336(代理人案卷号PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125117的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019325(代理人案卷号PP028062.0003(035784/311608))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。也可参见以下文献中描述的试验：Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8200-8204；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.2:6-15；Evans等(2000)J.Immunol.164:688-697；Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49:17-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.3:77-86；Coligan等(1991)Current Protocols in Immunology 13:12；Kwekkeboom等(1993)Immunology79:439-444；以及美国专利号5,674,492和5,847,082；通过引用纳入本文。
检测本文所鉴定的CD40-抗原表位的特异性拮抗性抗-CD40抗体的代表性试验是“竞争性结合试验”。竞争性结合试验是通过抑制标记的已知配体和其特异抗体结合的能力来检测和定量未知物的血清学试验。也称为竞争性抑制试验。在代表性的竞争性结合试验中，标记的CD40多肽与样品中的候选抗体，例如与用本发明单克隆抗体的一种或多种表位产生的单克隆抗体结合而沉淀。可通过筛选用CD40蛋白或含有感兴趣CD40蛋白的特定表位的蛋白片段而制备的一系列抗体来鉴定能与感兴趣某表位特异性反应的抗-CD40抗体。例如，就人CD40而言，感兴趣的表位包括含有人CD40短同种型(参见，GenBank登录号NP_690593，示于SEQ IDNO:10，由SEQ ID NO:9所示序列编码；也可参见GenBank登录号NM_152854)或人CD40长同种型(参见，GenBank登录号CAA43045和NP_001241，示于SEQ IDNO:12，由SEQ ID NO:11所示序列编码；参见GenBank登录号X60592和NM_001250)的线性和/或非线性氨基酸残基的表位。或者，可用以前鉴定的合适的拮抗性抗-CD40抗体进行竞争性结合试验来选择与以前鉴定的抗体相当的单克隆抗体。
这种免疫试验采用的抗体可以是标记的或未标记的。未标记的抗体可用于凝结试验；采用各种各样标记物的标记抗体可用于各种试验。通过使抗体与可检测物质连接有助于检测抗-CD40抗体与感兴趣表位之间形成的抗体-抗原复合物。合适的检测方式包括使用例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等标记。合适的酶的例子包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物例子包括：链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。这种标记的试剂可用于各种熟知的试验，例如放射性免疫试验，酶免疫试验如ELISA、荧光免疫试验等。参见，例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
可先偶联任何前述的拮抗性抗-CD40抗体或它们的抗原结合片段，再用于本发明的药物组合物。制备偶联抗体的方法是本领域已知的。因此，可用间接标记或间接标记方法来标记抗-CD40抗体。“间接标记”或“间接标记方法”指将螯合剂共价偶联于抗体并且将至少一种放射性核素***该螯合剂中。例如，参见纳入本文作为参考的Srivagtava和Mease，(1991)Nucl.Med.Bio.18：589-603中所述的螯合剂和放射性核素。合适的标记包括荧光基团、生色团、放射性原子(特别是32P和125I)、高电子密度试剂、酶和具有特异性结合伴侣的配体。一般通过其活性来检测酶。例如，常通过将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变为可用分光光度计定量的蓝色色素的能力来检测辣根过氧化物酶。“特异性结合伴侣”指能以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原和其特异性单克隆抗体。其它特异性结合伴侣包括生物素和亲和素或链霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本领域已知的许多受体-配体对。因为相同的标记可以几种不同模式使用，以上描述应该理解为不是要将各种标记归为截然不同的种类。例如，125I可用作放射性标记或作为高电子密度试剂。HRP可用作酶或mAb的抗原。此外，可为所需作用组合各种标记。例如，mAb与亲和素在实施本发明中也需要标记：因此，可用生物素标记mAb，然后用标记125I的亲和素或用标记HRP的抗-生物素mAb检测其存在。其它排列组合与可能性对本领域普通技术人员不难理解，应认为是本发明范围内的等价物。
或者，感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体可使用放射性核素与抗体直接共价相连(一般通过氨基酸残基)的“直接标记”或“直接标记方法”标记。优选的核素见Srivagtava和Mease(1991)，同上。特别优选间接标记方法。也参见，例如国际公布号WO00/52031和WO00/52473，其中接头用于连接放射性标记与抗体；抗-CD40抗体的受标记形式描述于纳入本文作为参考的美国专利号6,015,542。
抗体变体
本发明的药物组合物可用本领域已知的拮抗性抗-CD40抗体的变体来配制。这种变体将保留亲代抗体的所需结合特性。因此，例如，当要配制的拮抗性抗-CD40抗体是亲代CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体的变体时，该变体抗体将保留亲代CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体的结合特性。制备抗体变体的方法一般是本领域可用的。
例如，拮抗性抗-CD40抗体，如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12单克隆抗体的氨基酸序列变体可通过突变克隆的编码感兴趣抗体的DNA序列来制备。诱变与核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，纳入本文作为参考的Walker和Gaastra编，(1983)，Techniques in Molecular Biology(分子生物学技术)(纽约麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Company，New York))；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(冷泉港，纽约)；美国专利号4,873,192；和其中引用的参考文献。不影响感兴趣多肽的生物活性的适当氨基酸取代的指南见纳入本文作为参考的Dayhoff等(1978)Atlas of Protezh Sequence and Structure(蛋白质序列和结构图)(Natl.Biomed.Res.Found.，华盛顿特区)中的模型。优选保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于 Gly ⇔ Ala , Val ⇔ Ile ⇔ Leu , Asp ⇔ Glu , Lys ⇔ Arg , Asn ⇔ G ln 和 Phe ⇔ Trp ⇔ Tyr .
在构建感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体多肽，例如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体的变体过程中，进行修饰使变体继续具有所需活性，即相似的结合亲和力并且，以拮抗性抗-CD40抗体为例，能特异性地结合表达于人细胞表面的人CD40抗原，并且当与人CD40表达细胞上的CD40抗原结合时无明显的激动活性而显示拮抗活性。编码这种变体多肽的DNA中的任何突变显然无须将其序列置于读框外并且优选不要生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利申请公布号75,444。
此外，可以许多方式使拮抗性抗-CD40抗体的恒定区突变而改变其效应器功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公布号2004/0132101A1所述的优化抗体与Fc受体结合的Fc突变。
优选地，参比拮抗性抗-CD40抗体的变体的氨基酸序列与该参比抗体，例如本文所述的CHIR-5.9或CHIR-12.12单克隆抗体的氨基酸序列，或与该参比抗体分子的较短部分具有至少70％或75％序列相同性，优选至少80％或85％序列相同性，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。更优选地，这些分子具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出于本发明的目的，可使用Smith-Waterman同源性检索算法以仿射空位(affine gap)检索确定序列相同性百分比，所用参数为空位开放罚分12、空位延伸罚分2、BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2:482-489。例如，变体与参比的抗-CD40抗体有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基的不同。
就两条氨基酸序列的最佳比对而言，与参比氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的毗连区段可具有额外的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于和参比氨基酸序列比较的毗连区段包括至少20个毗连氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可对与保守残基取代或空位相关的序列相同性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。
采用本发明药物组合物的治疗方法
发现本发明药物组合物可用于治疗患有与表达CD40的细胞相关的癌症或恶变前病症(pre-malignant condition)的对象，或用于治疗与表达CD40的细胞相关的炎性疾病和/或自身免疫性疾病。本文将“治疗”定义为将含有拮抗性抗-CD40抗体的药物组合物应用于或给予对象，或将含有拮抗性抗-CD40抗体的药物组合物应用于或给予对象的分离的组织或细胞系，所述对象具有疾病，疾病症状，或对疾病具有易感性，其中所述给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响该疾病、疾病的症状、或对疾病的易感性。
“对象”指任何动物。优选地，所述对象是哺乳动物，更优选地，所述对象是人。除人之外，特别重要的哺乳动物包括，但不限于，狗、猫、牛、马、绵羊和猪。
当给药是出于治疗目的时，给药可以出于预防性或治疗性目的。当预防性提供时，药物组合物在任何症状出现之前提供。药物组合物的预防性给药用来预防或缓解任何之后的症状。当治疗性提供时，药物组合物在症状发作时(或之后不久)提供。药物组合物的治疗性给药用来缓解任何实际症状。
典型的给药途径包括，但不限于，口服给药和肠胃外给药，包括静脉内、肌内、鞘内、鼻内、舌下、动脉内和腹膜内注射或输注，以及皮下注射。实现这种给药的方法是本领域一般技术人员已知的。
在优选实施方式中，本发明的药物组合物是静脉内给予的。进行静脉内给药时优选通过输注进行，输注时间约1至约10小时，更优选约1至约8小时，再优选约2至约7小时，再优选约4至约6小时，输注时间取决于所给予的拮抗性抗-CD40抗体。第一次输注药物组合物的时间可以是约4至约6小时，之后可以更加快地输注。后面的输注可为期约1至约6小时，包括，例如，约1至约4小时，约1至约3小时，或约1至约2小时。
将药学上有效量的本发明药物组合物给予对象。“药学上有效量的”指用来治疗疾病或症状的用量，其中所述治疗可出于如上文所述的预防或治疗目的。在这种方式中，药学上有效量的组合物将治疗有效剂量或用量的拮抗性抗-CD40抗体给予需要治疗的对象。“治疗有效剂量或用量”或“有效量”指拮抗性抗-CD40抗体的用量，当给予该用量时对于治疗患有包含表达CD40的细胞的疾病的患者能带来正面的治疗反应。在本发明的一些实施方式中，拮抗性抗-CD40抗体，例如，单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或其抗原结合片段的治疗有效剂量范围从约0.01mg/kg至约40mg/kg，从约0.01mg/kg至约30mg/kg，从约0.1mg/kg至约30mg/kg，从约1mg/kg至约30mg/kg，从约3mg/kg至约30mg/kg，从约3mg/kg至约25mg/kg，从约3mg/kg至约20mg/kg，从约5mg/kg至约15mg/kg，或从约7mg/kg至约12mg/kg。应该知道，该治疗方法可包括一次给予或多次给予治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
发现本发明的药物组合物可用于治疗患有对用抗-CD40治疗剂，更具体说是拮抗性抗-CD40抗体治疗有反应的癌症或恶变前病症的任何对象。测定癌症或恶变前病症对用抗-CD40抗体治疗的反应性的方法包括诊断和预后试验，例如以下申请中描述的试验：题为“Methods for Diagnosis and Treatment of Proliferative DisordersMediated by CD40 Signaling(诊断和治疗CD40信号传导介导的增生性疾病的方法)”的待批和共有临时专利申请，该申请于2005/12/9提交，并指定为美国专利申请号60/749,285(代理人案卷号PP028035.0002(035784/304312)，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125143的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019414(代理人案卷号PP028035.0003(035784/311611))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。类似地，发现本发明的药物组合物可用于治疗患有对用抗-CD40治疗剂，更具体说是拮抗性抗-CD40抗体治疗有反应的炎性和/或自身免疫性疾病的任何对象。测定炎性和/或自身免疫性疾病对用抗-CD40抗体治疗的反应性的方法包括诊断和预后试验，例如以下申请中描述的试验：题为“Methods for Diagnosis and Treatment ofProliferative Disorders Mediated by CD40 Signaling(诊断和治疗CD40信号传导介导的增生性疾病的方法)”的待批和共有临时专利申请，该申请于2005/12/9提交，并指定为美国专利申请号60/749,336(代理人案卷号PP028062.0002(035784/304311)，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125117的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019325(代理人案卷号PP028062.0003(035784/311608))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。
“肿瘤”在文中指所有恶性或良性的肿瘤性细胞生长和增殖，以及所有癌前和癌性细胞和组织。“肿瘤性”在文中指任何形式的无论恶性或良性的失调的或不受调控的细胞生长，这种生长导致异常的组织生长。因此，“肿瘤性细胞”包括细胞生长失调或不受调控的恶性和良性细胞。
“抗肿瘤活性”指降低表达CD40的恶性细胞增殖或积累的速率从而降低已存在的肿瘤或在治疗期间产生的肿瘤的生长速率，和/或破坏已存在的肿瘤性(肿瘤)细胞或新形成的肿瘤性细胞从而减小治疗期间肿瘤的总体积。用本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的药物组合物治疗可导致就治疗与人体中表达CD40的细胞上CD40信号转导的激活相关的癌症和恶变前病症而言有益的生理应答。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述了通常以不受调控的细胞生长为特征的哺乳动物的生理状况。癌症的例子包括，但不限于，淋巴瘤和白血病，以及实体瘤。“B细胞相关癌症”或“B细胞谱系癌症”是指其中失调的或不受调控的细胞生长与B细胞相关的任何类型的癌症。
“难治”就癌症而言是指特定癌症对用特定治疗剂，例如感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体治疗有抗药性或无反应。某癌症可以从用特定治疗剂治疗开始时就对用该特定治疗剂治疗难治(即，一开始接触该治疗剂就无反应)，或者由于对该治疗剂产生了抗药性而难治，抗药性可以在用该治疗剂治疗的第一个治疗期内产生或者在随后的治疗期内产生。
发现本发明的药物组合物可用于治疗需要对由表达CD40的细胞上的CD40信号传导的激活介导的癌症或恶变前病症，或者对由表达CD40的细胞上的CD40信号传导介导的炎性或自身免疫性疾病进行治疗干预的对象。“表达CD40的细胞”是指表达CD40抗原的正常细胞、恶变前细胞以及恶性细胞。在一些实施方式中，表达CD40的细胞是恶性B细胞。“恶性”B细胞指任何肿瘤性B细胞，包括但不限于衍生自淋巴瘤的B细胞，包括低级、中级和高级B细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金病，Epstein-Barr病毒(EBV)诱导的淋巴瘤，和AIDS相关淋巴瘤以及B细胞急性淋巴细胞性白血病，骨髓瘤，慢性淋巴细胞性白血病，等等。在其他实施方式中，表达CD40的细胞是癌细胞或肉瘤细胞。“表达CD40的癌细胞”或“表达CD40的肉瘤细胞”指表达CD40细胞表面抗原的实体瘤的任何恶性(即，肿瘤性)或恶变前的癌细胞或肉瘤细胞。出于本发明的目的，表达CD40抗原的癌细胞以及癌前细胞或恶变前细胞被称为“表达CD40的肿瘤性细胞”。检测细胞内CD40表达的方法是本领域熟知的，并且包括，但不限于，PCR技术、免疫组织化学、流式细胞术、Western印迹、ELISA，等等。当允许用拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段进行治疗时，包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物可通过任何合适的给药途径给予。
需要用本发明的药物组合物进行治疗干预的对象可能患有以下疾病或者有产生或复发的风险：由表达CD40的肿瘤性细胞上的CD40信号传导介导的任何癌症或恶变前病症。这种癌症和恶变前病症的例子包括，但不限于，B细胞谱系的任何癌症，非-B细胞血液恶性肿瘤，以及已知由表达CD40的肿瘤性细胞上的CD40信号传导介导的实体瘤。
包含表达CD40的肿瘤性细胞的B细胞谱系癌症的例子是：急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，幼淋巴细胞白血病(PLL)，多毛细胞白血病，霍奇金病，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，重链病，以及淋巴瘤，包括但不限于，弥散性小淋巴细胞性淋巴瘤，滤泡性，DLBCL，粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤，单核细胞样B细胞淋巴瘤，脾淋巴瘤，淋巴瘤样肉芽肿病，血管内淋巴瘤病，免疫母细胞性淋巴瘤，AIDS相关性淋巴瘤，等等。
因此，发现本发明的药物组合物可用于治疗患有与异常、不受控的B细胞增殖或累积相关的非霍奇金淋巴瘤的对象。出于本发明的目的，根据WorkingFormulation(工作试剂)分类表，这种淋巴瘤的分类为低级、中级或高级的B细胞淋巴瘤(参见“The Non-Hodgkin′s Lymphoma Pathologic Classification Project”(非霍奇金淋巴瘤病理分类项目)，Cancer49(1982)：2112-2135)。因此，低级B细胞淋巴瘤包括小淋巴细胞性淋巴瘤，滤泡性小卵裂细胞(small-cleaved cell)淋巴瘤，和滤泡性混合性小卵裂细胞及巨细胞淋巴瘤；中级淋巴瘤包括滤泡性巨细胞淋巴瘤，弥散性小卵裂细胞淋巴瘤，弥散性混合性小细胞和巨细胞淋巴瘤，和弥散性巨细胞淋巴瘤；而高级淋巴瘤包括巨细胞免疫母细胞性淋巴瘤，成淋巴细胞淋巴瘤，和伯基特和非伯基特类型的小非卵裂细胞淋巴瘤。
应该知道本发明的药物组合物可用于治疗按修正的欧美淋巴瘤分类(REAL)***分类为B细胞型的淋巴瘤。这种B细胞淋巴瘤包括，但不限于按以下分类的淋巴瘤：前B细胞瘤，例如B淋巴细胞性白血病/淋巴瘤；外周B细胞瘤，包括B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、浆细胞样淋巴细胞(lymphoplasmacytoid)淋巴瘤/免疫细胞瘤、外套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)(包括弥散性小细胞、弥散性小和巨细胞，与弥散性巨细胞淋巴瘤)、边缘区B细胞淋巴瘤(包括结节外、结节的和脾脏类型)、浆细胞瘤/骨髓瘤、原发性纵隔(胸腺)亚型弥散性巨细胞型B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和伯基特样高级B细胞淋巴瘤；和不可分类的低级或高级B细胞淋巴瘤。
本发明的药物组合物也可用于治疗患有称为MGUS(意义未定的单克隆丙种球蛋白病)的恶变前病症的对象。经评价，大约25％的MGUS患者最终发展成多发性骨髓瘤(MM)或相关的浆细胞疾病(Kyle(1993)Mayo Clinic.Proc.68:26-36)。骨髓中恶性浆细胞增殖、在血清或尿液中检测出单克隆蛋白(M蛋白)、贫血、高钙血症、肾机能不全、以及溶骨性骨损伤都是MM的临床表现，而临床上通过血清或尿液中出现M蛋白以及其他MM临床特征来判别MGUS(参见，例如，Kyle和Lust(1989)Semin.Hematol.26:176-200；Greipp和Lust Stem Cells(1995)13:10-21)。MGUS患者是无症状的并具有稳定的M蛋白测量值(Kyle(1993)Mayo Clinic.Proc.68:26-36)。一旦鉴定对象有MGUS，采用合适的本发明药物组合物，例如，含有本文所述拮抗性抗-CD40抗体的组合物的维持疗法能够阻断这些对象中多发性骨髓瘤的发展。
具体地说，本发明的药物组合物可用于治疗对于第一线肿瘤疗法难治(即，有抗药性或已经变得有抗药性)的B细胞淋巴瘤，包括上述那些。术语“肿瘤疗法(oncotherapeutic)”用来指癌症治疗方法，例如化疗、手术、放疗、单一抗癌抗体治疗以及它们的组合。需要用一种或多种能调节CD40L-介导的CD40信号传导、调节ADCC或这两者的抗-CD40抗体对这类患者亚群进行治疗干预。
本发明的药物组合物还可用于治疗非B细胞相关血液恶性肿瘤。这种恶性肿瘤包括，但不限于，急性白血病；成髓细胞性白血病；急性髓细胞性白血病；前髓细胞性白血病；髓性单核细胞性白血病；单核细胞性白血病；红白血病；粒细胞性白血病(慢性粒细胞性白血病)；真性红细胞增多症；等等。
包含表达CD40的肿瘤性细胞、因此受益于用本发明药物组合物治疗的实体瘤包括，但不限于：卵巢癌，肺癌(例如，鳞状细胞癌、腺癌和巨细胞癌类型的非小细胞肺癌，以及小细胞肺癌)，乳腺癌，结肠癌，肾癌(包括，例如，肾细胞癌)，膀胱癌，肝癌(包括，例如，肝细胞癌)，胃癌，***，***癌，鼻咽癌，甲状腺癌(例如，甲状腺***状癌)，皮肤癌如黑色素瘤，以及肉瘤(包括，例如，骨肉瘤和尤因肉瘤。
通过给患有癌症或恶变前病症的对象施用本发明的药物组合物能实现的有益结果包括就癌症或症状而言的任何正面治疗反应。就癌症治疗而言，“正面治疗反应”指与抗-CD40治疗剂的抗肿瘤活性相关疾病的改善，和/或与感兴趣的疾病相关症状的改善。即，可观察到抗增殖作用、防止肿瘤进一步增殖，肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量降低、和/或CD40表达细胞激活所介导的一种或多种症状的减轻。因此，例如，正面治疗反应将涉及疾病中以下一种或多种改善：(1)肿瘤体积减小；(2)癌症(即，肿瘤性)细胞数目降低；(3)肿瘤性细胞死亡增加；(4)抑制肿瘤性细胞存活；(4)抑制(即，减缓到一定程度，优选停止)肿瘤生长；(5)抑制(即，减缓到一定程度，优选停止)癌细胞渗透入外周器官；(6)抑制(即，减缓到一定程度，优选停止)肿瘤转移；(7)防止进一步肿瘤生长；(8)提高患者存活率；和(9)在一定程度上缓解一种或多种癌症相关症状。可通过专门用于恶性肿瘤的标准反应指标来测定对于任何给定的恶性肿瘤的正面治疗反应。可用以下筛选技术评价肿瘤应答所导致的肿瘤形态(即，总的肿瘤负荷、肿瘤体积等)变化：例如磁共振成像(MRI)扫描、x-放射显影成像、计算机化断层显像(CT)扫描、骨扫描成像以及包括抽取骨髓(BMA)的肿瘤活体组织取样和循环肿瘤细胞计数。除了这些正面治疗反应以外，用本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的药物组合物治疗的对象可经历疾病相关症状改善的有益作用。因此，就B细胞肿瘤而言，对象可经历所谓的B症状，即盗汗、发热、体重降低和/或荨麻疹的减轻。就恶变前病症而言，用抗-CD40治疗剂治疗可阻断和/或延长发展成相关恶性症状之前的时间，如患有意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)的对象中多发性骨髓瘤的发展。
“抗炎活性”是指减轻或预防炎症。用本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物治疗能产生就治疗自身免疫性疾病和/或炎性疾病而言有益的生理反应，其中所述疾病涉及表达CD40抗原的细胞。应了解，本发明的组合物可用于预防细胞的表型改变，如增殖、活化等等。
正在接受本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物治疗干预的对象可能患有以下疾病或者有产生或复发的风险：由表达CD40的肿瘤性细胞上的CD40信号传导介导的任何炎性或自身免疫性疾病。炎性疾病的特征为炎症和组织破坏，或者它们的组合。“炎性疾病”包括任何炎性免疫介导的过程，其免疫反应的起始事件或目标涉及非自身抗原，包括，例如，同种抗原，异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或变应原。
再者，出于本发明的目的，术语“炎性疾病”包括“自身免疫性疾病”。文中，术语“自身免疫性”通常被理解为包括涉及“自身”抗原的炎性免疫介导的过程。在自身免疫性疾病中，自身抗原触发宿主的免疫反应。
同时，本发明的药物组合物可用于治疗与组织移植排斥相关的炎症。“移植排斥”或“移植物排斥”指任何在宿主产生的针对移植物，包括但不限于HLA抗原、血型抗原等的免疫反应。
本发明的药物组合物也可用于治疗移植物抗宿主病，如与骨髓移植相关的移植物抗宿主病。在这种移植物抗宿主病中，供体骨髓包含淋巴细胞和成熟后变为淋巴细胞的细胞。供体的淋巴细胞将受者的抗原识别成非自身抗原并启动炎性免疫反应。因此，“移植物抗宿主病”或“移植物抗宿主反应”在文中指其中供者淋巴细胞与宿主的抗原发生反应的任何T细胞介导的免疫反应。
自身免疫性和/或炎性疾病的例子包括，但不限于，***性红斑狼疮(SLE)，盘状狼疮，狼疮肾炎，结节病，炎性关节炎，包括幼年型关节炎，类风湿性关节炎，银屑病关节炎，莱特尔综合征，强直性脊柱炎，以及痛风性关节炎，器官或组织移植排斥，超急性、急性或慢性排斥反应和/或移植物抗宿主病，多发性硬化，超IgE综合征，结节性多动脉炎，原发性胆汁性肝硬变，炎性肠病，克罗恩病，乳糜泻(麸胶敏感性肠病)，自身免疫性肝炎，恶性贫血，自身免疫性溶血性贫血，银屑病，硬皮病，重症肌无力，自身免疫性血小板减少性紫癜，自身免疫性甲状腺炎，格雷夫斯病，桥本甲状腺炎，免疫复合物病，慢性疲劳性免疫功能障碍综合征(CFIDS)，多肌炎和皮肌炎，冷球蛋白血症，溶栓，心肌病，寻常型天疱疮，肺间质纤维化，I型和II型糖尿病，1、2、3和4型迟发型超敏反应，***反应或***反应性疾病，对治疗蛋白质的不希望/非故意免疫反应(参见，例如，美国专利申请号US2002/0119151和Koren等，(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3:349-60)，哮喘，丘-施二氏综合征(变应性肉芽肿病)，特应性皮炎，过敏性和刺激性接触性皮炎，荨麻疹，IgE介导的***反应，动脉粥样硬化，血管炎，特发性炎性肌病，溶血性疾病，阿尔茨海默病，慢性炎性脱髓鞘性多神经病，等等。在一些其他实施方式，本发明的药物组合物被用于治疗个体的肺部炎症，其中包括但不限于，肺移植排斥，哮喘，结节病，肺气肿，囊性纤维化病，特发性肺纤维化，慢性支气管炎，变应性鼻炎和变应性肺病如超敏感性肺炎，嗜酸细胞性肺炎，由于骨髓和/或肺移植或其他原因造成的梗阻性细支气管炎，移植物动脉粥样硬化/移植物静脉硬化，以及胶原、血管和自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和红斑狼疮导致的肺纤维化。
在其他实施方式中，本发明的药物组合物用于治疗对于其它已知治疗方法一开始就有抗药性或者产生了抗药性的自身免疫性疾病和炎性疾病，所述已知疗法的作用模式不同于通过调节CD40L-介导的CD40信号传导、调节ADCC、或这二者。本发明的药物组合物也可用于治疗需要用一种或多种能调节CD40L-介导的CD40信号传导、调节ADCC或这二者的拮抗性抗-CD40抗体进行治疗干预的患者亚群。
通过给患有炎性疾病或自身免疫性疾病的对象施用本发明的药物组合物能实现的有益结果包括就该病而言的任何正面治疗反应。就自身免疫性疾病和/或炎性疾病而言，“正面治疗反应”是指与这些抗体或其抗原结合片段的抗炎活性相关的疾病改善，和/或与疾病相关的症状改善。即，可观察到抗增殖作用，防止表达CD40的细胞进一步增殖，炎性反应减轻，包括但不限于炎性细胞因子、粘附分子、蛋白酶、免疫球蛋白(此时，带有CD40的细胞为B细胞)的分泌减少，或其组合，等等，抗炎症蛋白的产量提高，自身反应性细胞数目减少，免疫耐受性提高，抑制自身反应性细胞的存活，和/或表达CD40的细胞介导的一种或多种症状减轻。这种正面治疗反应不限于给药途径，同时可包括对供者给药、对供者组织给药(例如器官灌注)、对宿主给药、其任意组合，等等。
可采用以下筛选技术评价临床反应：例如磁共振成像(MRI)扫描、x-放射显影成像、计算机化断层显像(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活细胞分选(FACS)分析、组织学、普通病理学、以及血液化学，包括但不限于通过ELISA、RIA、层析法等可检测的变化。除了这些正面治疗反应，用本发明的含拮抗性抗-CD40抗体的液体药物组合物治疗的对象可经历疾病相关症状改善的有益效果。
提供以下实施例是为了说明，绝非限制。
实验
CHIR-12.12是通过CHO细胞培养方法制造的完全人源化的抗-CD40IgG1单克隆抗体。该分子的分子量为150kDa，其分子结构由通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链构成。CHIR-12.12靶向人CD40细胞表面受体蛋白。它是强烈拮抗剂并在体外抑制正常B细胞的CD40配体-介导的增殖，同时在体外抑制CD40配体-介导的NHL和CLL患者癌细胞增殖。表达CHIR-12.12抗体的杂交瘤细胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056)于2003/9/17由美国典型培养物保藏中心[ATCC；10801大学大道，马纳斯，弗吉尼亚20110-2209(美国)]以专利保存号PTA-5543保藏。
不受理论局限，CHIR-12.12抗体是具有独特特性组合的双作用拮抗性抗-CD40单克隆抗体。这种完全的人单克隆抗体阻断B细胞存活和增殖所需的CD40L-介导的CD40信号传导途径；这种拮抗作用最终导致细胞死亡。CHIR-12.12还介导效应细胞的识别和结合，启动依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。一旦CHIR-12.12与效应细胞结合便释放溶细胞酶类并导致B细胞凋亡和溶解。
有关CHIR-12.12生物活性更加详细的描述以及用来测定它们的试验可参见：2003/11/4、2003/11/26和2004/4/27提交的并分别指定为美国专利申请号60/517,337(代理人案卷号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理人案卷号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理人案卷号PP20107.003(035784/277214))的题为“Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methodsfor Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的临时申请；以及2004/11/4提交并公布为WO2005/044854的同样题为“Antagonist Anti-CD40 MonoclonalAntibodies and Methods for Their Use(拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其用法)”的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理人案卷号PP20107.004(035784/282916))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。也可参见国际公布号WO2005/044304，WO2005/044305，WO2005/044306，WO2005/044855，WO2005/044307，和WO2005/044294；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。也可参见以下申请中描述的试验：题为“Methods for Diagnosis and Treatment of Proliferative DisordersMediatedby CD40 Signaling(诊断和治疗CD40信号传导介导的增生性疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并指定为美国专利申请号60/749,285(代理人案卷号PP028035.0002(035784/304312))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125143的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019414(代理人案卷号PP028035.0003(035784/311611))；和题为“Methods for Diagnosis and Treatment ofDiseases Having an Autoimmune and/orInflammatory Component(诊断和治疗具有自身免疫性和/或炎性成分的疾病的方法)”的临时申请，该申请于2005/12/9提交并指定为美国专利申请号60/749,336(代理人案卷号PP028062.0002(035784/304311))，以及2006/5/18提交并公布为WO2006/125117的相应的国际专利申请号PCT/US2006/019325(代理人案卷号PP028062.0003(035784/311608))；它们各自的内容通过引用全文纳入本文。
CHIR-12.12的主要临床应用是治疗B细胞相关的恶性肿瘤，包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，多发性骨髓瘤(MM)，和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，以及与表达CD40的细胞相关的自身免疫性和/或炎性疾病。将用于临床实验的CHIR-12.12药物产品配制成20mg/ml CHIR-12.12抗体的液体制剂。进行以下研究以确定在液体制剂中稳定抗体的最佳缓冲剂、等渗剂和各种赋形剂。
实施例1：各种缓冲剂种类和甲硫氨酸对于稳定CHIR-12.12的作用
溶液状况(例如，pH、缓冲剂种类和离子强度)和赋形剂(例如，表面活性剂和稳定剂)是液体制剂中蛋白质稳定性的关键因素。CHIR-12.12的理化稳定性在pH5.5时最佳。然而，CHIR-12.12蛋白在不利的溶液条件下会通过聚集和片段化而降解；它也会被氧化，尤其是当存在与原始赋形剂材料如吐温一起引入的过氧化物杂质和/或痕量金属时。进行下面的实验以鉴定当在最佳pH5.5配制时对于稳定CHIR-12.12单克隆抗体以避免聚集、片段化和氧化的最佳缓冲剂种类和适合的赋形剂。
材料
用于该研究的CHIR-12.12药品(DS)批次为CHO-衍生的纯化原料，其批号为CD021105A和PD010705A。DS批次由Xoma有限公司(伯克利，加州)制造。用各种缓冲剂溶液透析DS，然后掺加所需量的吐温，以此制备用于该研究的制剂样品。所有样品中CHIR-12.12蛋白的浓度约为20mg/ml。
分析方法
尺寸排阻层析(SEC)。
通过SEC-HPLC以分子量降低的顺序分离分子。因此，首先从HPLC柱上洗脱下CHIR-12.12聚集体，然后是单体，最后洗脱片段。通过Water Alliance HPLC分析CHIR-12.12的纯度、聚集和片段化，分析时采用Tosohaas TSK-GEL3000SWXI柱，50mM磷酸钠，200mM NaCl，pH7.0作为流动相，流速为0.7mL/分。
疏水相互作用层析(HIC)
CHIR-12.12的氧化采用Waters Alliance HPLC***测量，采用Tosoh TSK凝胶丁基-NPR柱，2M硫酸铵/20mM Tris，pH7.0作为流动相A，20mM Tris，pH7.0作为流动相B，流速为1.0ml/分。CHIR-12.12抗体用木瓜蛋白酶消化以产生Fab和Fc片段。CHIR-12.12的氧化产物是氧化的Fc片段(metSO)，该片段是在主要Fab种类和主要Fc种类之间从HPLC柱被洗脱的前-Fc种类。
实验和结果
柠檬酸盐缓冲剂对聚集和片段化的稳定作用
用含150mM NaCl，0.1％(w/v)吐温80，pH5.5的10mM柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液将DS批号为PD010705A的CHIR-12.12配制成20mg/ml。将1.2ml制剂样品溶液装入3cc玻璃瓶并在5℃、25℃和40℃储存。在指定的时间点通过SEC试验分析CHIR-12.12样品的稳定性。
图1-3分别显示了对25℃储存的样品的纯度、聚集体和片段进行的SEC分析。图4-6分别总结了40℃储存的样品的纯度、聚集体和片段的SEC分析。所有结果显示，在所测试的4种制剂中基于柠檬酸盐的制剂样品保留了最高的纯度、最低的聚集和片段化水平。尽管对于在5℃储存5个月的样品几乎未检测到变化(数据未显示)，但升高的SEC数据预测，柠檬酸盐缓冲剂在改善CHIR-12.12抵抗聚集和片段化的长期实时稳定性方面有可能优于其他三种常用缓冲剂类型。
柠檬酸盐缓冲剂对CHIR-12.12的氧化抑制作用
用柠檬酸盐、醋酸盐和琥珀酸盐缓冲剂以及0.1％和0.2％(w/v)吐温80制备CHIR-12.12稳定性样品。将样品储藏于5℃、25℃和40℃并通过疏水相互作用层析(HIC)分析预定时间点的氧化。测定CHIR-12.12氧化产物中前-Fc峰种类总和的百分比，即前-Fc％。表1的结果显示，基于柠檬酸盐的制剂产生的氧化产物少于琥珀酸盐-和醋酸盐-缓冲的制剂，说明柠檬酸盐缓冲剂能使CHIR-12.12的氧化最小化。这些结果提示，柠檬酸可能作为螯合剂从而抑制痕量金属诱导的CHIR-12.12蛋白氧化。
SEC和HIC分析表明，柠檬酸盐缓冲剂在保护CHIR-12.12免于聚集和片段化方面优于琥珀酸盐、醋酸盐和磷酸盐缓冲剂种类。柠檬酸盐缓冲剂也优于琥珀酸盐和醋酸盐缓冲剂，这是由于它能使CHIR-12.12蛋白的氧化最小化。
表1.通过HIC试验测得的缓冲剂种类对CHIR-12.12(20mg/ml)氧化的影响
*N/D，未检测。
L-甲硫氨酸对CHIR-12.12的氧化抑制作用
用10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM NaCl，0.1％吐温80或吐温20以及各种量(0-5mM)的L-甲硫氨酸将批号为CD021105A的DS配制成20mg/ml。将2.5ml制剂样品装入3cc样品并在40℃储存。表2显示了开始时和在40℃储存3个月时的样品的HIC结果。开始时，所有制剂中CHIR-12.12的氧化程度与批号为CD021105A的最初原料药品(DS)相当。在40℃储存3个月后不含L-甲硫氨酸的制剂中氧化水平高出一倍以上。然而，含有L-甲硫氨酸的制剂在40℃储存3个月后的氧化水平几乎没变。
结果表明，5mM L-甲硫氨酸能有效而充分地防止高应力储存条件下CHIR-12.12的氧化。Lyc-肽图证实了L-甲硫氨酸对CHIR-12.12的氧化抑制作用。
表2.L-甲硫氨酸对CHIR-12.12氧化的抑制作用
Figure G2007800139737D00512
Figure G2007800139737D00521
*N/D，未检测。
总之，柠檬酸盐缓冲剂能使CHIR-12.12的聚集、片段化和氧化最小化，因此是CHIR-12.12液体制剂的最佳缓冲剂。L-甲硫氨酸有效抑制CHIR-12.12的氧化，其中优选5mM L-甲硫氨酸。
实施例2：精氨酸-HCl对CHIR-12.12的稳定作用
以下研究的目的是选择配制成通过静脉内输注给药的液体药物组合物的CHIR-12.12长期储存稳定性的等渗剂和稳定剂。尽管NaCl是最经常使用的肠胃外蛋白质制品的等渗剂，但它对于抗体疗法没有最佳稳定作用。该研究比较了氯化钠和精氨酸的酸形式(精氨酸-HCl)对水性制剂中CHIR-12.12的稳定作用。
CHIR-12.12原料抗体药品用pH5.5的柠檬酸盐缓冲剂配制，采用150mM NaCl或150mM L-精氨酸-HCl以使CHIR-12.12液体制剂达到295mOsm/kg的目标摩尔渗透压浓度。采用差示扫描量热法(DSC)，尺寸排阻层析(SEC-HPLC)，SDS-PAGE，和阳离子交换HPLC(CIEX-HPLC)评价CHIR-12.12抗体的生物物理和/或生化稳定性。研究证实，150mM L-精氨酸-HCl不仅赋予CHIR-12.12水性制剂等渗性，而且能提高CHIR-12.12的构象稳定性以抵抗聚集、片段化和脱酰胺。经证实，在加速稳定条件下L-精氨酸-HCl优于NaCl。此外，这种加速稳定数据预测，CHIR-12.12L-精氨酸-HCl制剂有较长储存期。
材料
用于该研究的CHIR-12.12药品(DS)是CHO-衍生的纯化原料，其批号为CD021105A。DS批次由Xoma有限公司(伯克利，加州)制造。
该DS批次的CHIR-12.12被用于下述制剂：
制剂1：20mg/ml CHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM NaCl，0.1％吐温80，pH5.5
制剂2：20mg/ml CHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM L-精氨酸-HCl，0.1％吐温80，pH5.5
分析方法
差示扫描量热法(DSC)
以1℃/分钟从15℃加热至90℃后，采用MicroCal VP-DSC评价CHIR-12.12配方样品的构象稳定性。
尺寸排阻层析(SEC-HPLC)。
通过Waters Alliance RPLC分析CHIR-12.12的纯度、聚集和片段化，采用TSK-GEL3000SWXL柱，50mM钠的磷酸盐，200mMNaCl，pH7.0作为流动相，流速为0.7ml/分。
SDS PAGE(非还原性和还原性)
用12％Tris-甘氨酸凝胶在非还原和还原条件下评价CHIR-12.12的纯度。蛋白质通过考马斯蓝染色检测。
阳离子交换层析(CIEX-HPLC)
用Waters Alliance HPLC***测量CHIR-12.12的电荷改变相关脱酰胺，使用Dionex Propac WCX-10柱，50mM HEPES，pH7.3作为流动相A，含500mM NaCl的50mM HEPES，pH7.3作为流动相B，流速为0.8ml/分。
以下是本文结果部分所提及的图中缩写的含义：
琥珀酸盐，NaCl，0.1％TW80＝10mM琥珀酸钠/琥珀酸缓冲剂，
                           150mM NaCI，0.1％吐温80，pH5.5
柠檬酸盐，NaCl，0.1％Tw80＝10mM柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，
                           150mM NaCl，0.1％吐温80，pH5.5
醋酸盐，NaCl，0.1％Tw80＝10mM醋酸钠/醋酸缓冲剂，
                         150mM NaCl，0.1％吐温80，pH5.5
Phos，NaCl，0.1％Tw80＝10mM磷酸氢二钠/磷酸钠
                       磷酸二氢钠缓冲液，150mM NaCl，0.1％吐温80，pH5.5
柠檬酸盐，Arg，0.1％Tw80＝10mM柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂，
                          150mM L-精氨酸-HCl，0.1％吐温80，pH5.5
结果
差示扫描量热法(DSC)
图7显示了上文“材料”章节中所述两种制剂中的CHIR12.12的DSC热分析图(theogram)。CHIR-12.12的热解折叠显示出至少两个热跃迁，可能分别代表了Fab和Fc结构域的解折叠/解链。在较高温度时，推测蛋白质是聚集的，导致DSC信号丧失。该研究中，最低热跃迁温度被定义为解链温度Tm。含L-精氨酸-HCl的制剂显示出的Tm高于含NaCl的制剂，说明L-精氨酸-HCl提供的CHIR-12.12构象稳定性高于NaCl提供的。
SEC-HPLC分析。
在5℃存放6个月之后，SEC-HPLC检测出含L-精氨酸-HCl的制剂和含NaCl的制剂中蛋白质聚集体和片段的量可忽略(<0.5％)，且这两种制剂之间的稳定性差异不明显(数据未显示)。在加速储存条件下，即25℃储存6个月，含L-精氨酸-HCl的制剂含有较高比例的单体，如图8所示。随着单体的消耗，聚集体和片段的含量随储存时间缓慢增加。然而，含L-精氨酸-HCl的制剂产生的聚集体和片段少于含NaCl的制剂，分别如图9和10所示。类似地，当在40℃储存时，相比含NaCl的制剂，含L-精氨酸-HCl的制剂显示出较高比例的单体和较低比例的聚集体和片段，分别如图11、12和13所示。在40℃储存4个月后，含L-精氨酸-HCl的制剂仍旧含有91.8％单体，1.7％聚集体和6.5％片段，而含NaCl的制剂含有87.9％单体，2.2％聚集体和9.9％片段。SEC-HPLC结果证实，相比NaCl，L-精氨酸-HCl提高了CHIR-12.12蛋白的稳定性。
SDS-PAGE(非还原性和还原性)
表3为非还原(NR)和还原(R)条件下含L-精氨酸-HCl的制剂和含NaCl的制剂的SDS-PAGE分析结果。CHIR-12.12的纯度通过非还原条件下主带的百分比或还原条件下重链和轻链条带之和的百分比来测量。除了0时刻，在非还原和还原条件下，含L-精氨酸-HCl的制剂的纯度都高于含NaCl的制剂。SDS-PAGE的观察结果与SEC-HPLC结果一致，说明L-精氨酸-HCl在提高CHIR-12.12稳定性方面优于NaCl。
表3.通过SDS-PAGE分析比较L-精氨酸-HCl和NaCl
Figure G2007800139737D00541
CIEX-HPLC分析
CIEX-HPLC基于电荷区分分子，因此酸性变体在主峰之前洗脱出来，而碱性变体在主峰之后洗脱出来。CHIR-12.12的纯度及其脱酰胺产物的含量分别通过主峰的百分比和酸性变体的百分比来测量。
图14、15和16分别显示了两种制剂的纯度、脱酰胺产物的含量和碱性变体的含量。在0时刻，两种制剂的纯度为68.6％，含15.5％脱酰胺产物以及15.9％碱性变体。当在25℃储存时，相比含NaCl的制剂，含L-精氨酸-HCl的制剂仍旧具有较高的纯度和较高的碱性变体含量，并显示较低的脱酰胺产物百分比。在25℃储存6个月后，含L-精氨酸-HCl的制剂的纯度为47.3％，含12.5％碱性变体，并产生了40.0％脱酰胺产物，而含NaCl的制剂的纯度为45.6％，含11.7％碱性变体，和42.7％脱酰胺产物。尽管含L-精氨酸-HCl的制剂和含NaCl的制剂在5℃储存6个月后显示几乎没有变化，但在加速储存条件(25℃)下获得的CIEX-HPLC结果预测，在提高CHIR-12.12的长期实时稳定性以抵抗脱酰胺方面，L-精氨酸-HCl可能优于NaCl。
总之，该研究证实，150mM L-精氨酸-HCl不仅赋予CHIR-12.12液体制剂等渗性，而且能提高CHIR-12.12的构象稳定性以抵抗聚集、片段化和脱酰胺。在加速稳定条件下L-精氨酸-HCl优于NaCl，且加速稳定数据进一步预测，CHIR-12.12L-精氨酸-HCl制剂具有较长的储存期。
实施例3：吐温80和吐温20在使冷冻保存的CHIR-12.12原料药品聚集最小 化方面的作用
要储存几个季度时，将CHIR-12.12原料药品冷冻储存要优于液体储存，其优势在于能提高产品的稳定性和储存期、降低微生物生长、以及消除运输过程中产生泡沫。然而，冷冻和随后的解冻会由于引入冰-液界面和溶质浓度梯度而在蛋白质溶液中诱导产生应力。这种应力会使蛋白质变性并导致聚集，在更坏的情况下，形成可见的颗粒或沉淀。蛋白质聚集通常与药物功效降低和免疫原性提高相关，因此通过优化蛋白质制剂主峰和冻融条件以使聚集最小化是非常关键的。
制剂赋形剂，如糖类、多元醇、氨基酸和表面活性剂可以稳定蛋白质和抗体防止聚集。在一项单克隆抗体研究中，发现一些通常使用的糖类、多元醇和氨基酸比表面活性剂能更有效地减轻冻融引发的聚集。然而，对CHIR-12.12的早期研究显示，单独使用糖(例如，海藻糖)、多元醇(例如，山梨醇)或氨基酸(如甘氨酸)不能显著降低冷冻和解冻期间CHIR-12.12的聚集。
该研究关注的是能使冷冻和解冻期间CHIR-12.12的聚集最小化的配制方法。在这种方式中，评价了各种表面活性剂以最小化冻融诱导的CHIR-12.12的聚集。尽管实际上冷冻的CHIR-12.12药品不可能经历如该研究所评价的多次冻融循环，但密集冻融应力研究是用来预测如果在长期储存和运输期间不经意发生多次冷冻和解冻配制的原料药聚集的可能性的最坏情况假想研究。
材料
该研究采用批号为UA7870、TC23-2、UB1291、PD010705A和CD083005A的CHIR-12.12原料DS。吐温80、吐温20、Brij35和Pluronic F68分别购自西格玛公司(Sigma)、贝克公司(J.T.Baker)、AA公司(AlfaAesar)和MTC公司(MediaTechCellgro)。用于冷冻储存CHIR-12.12药品的聚碳酸酯(PC)药瓶购自奈尔基因公司(Nalgene)。
方法
除了对照样品，所有其他样品在-20℃或-60℃完全冷冻，然后在室温完全解冻，如此进行多个循环。
采用三种分析方法来检测从单体到可见聚集体的CHIR-12.12蛋白。Tyndal光(MW科技有限公司(M.W.Technologies，Inc.))下目测来检测可见颗粒。利用液体颗粒计数***(HIAC/Royco)计算≥10μm和≥25μm的亚可见聚集体的数目。利用动态光散射分析仪(MalvernNano Series)测定单体和聚集体的流体力学半径以及粒度分布。
可见颗粒评价
用于冻融研究的样品从批号为UA7870和TC23-2的CHIR-12.12药品制备。所有样品用10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM NaCl，和pH5.5缓冲液通过透析配制，然后加入各种百分比(0-0.5％w/v)的以下非离子型表面活性剂中的一种：吐温80，吐温20，Brij35，和Pluronic F68。将2.5ml各样品装入玻璃瓶，在-60℃冷冻过夜，然后在室温充分解冻，最多8个循环。目测最初时刻(0时刻)和每次冻融循环之后的样品的澄清度和可见沉淀/聚集体。
亚可视颗粒计数
将批号为UB1291和PD010705A的CHIR-12.12药品配制成溶液(20mg/mlCHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mMNaCl，pH5.5)，然后加入0-0.5％(w/v)吐温80或吐温20。将20-ml等分制剂样品装入125cc聚碳酸酯药瓶，然后在-60℃冷冻并在室温解冻。5个冻融循环之后，用HIAC-Royco液体颗粒计数***测量样品中≥10μm和≥25μm的亚可视聚集体。
动态光散射分析
在进行5轮冻融之前和之后用动态光散射分析仪评价制剂(20mg/mlCHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM L-精氨酸-HCl，5mM L-甲硫氨酸，0-0.2％吐温20，pH5.5)中的聚集体。
动态光散射(DLS)分光术采用Stokes-Einstein方程并假设颗粒呈球形从测得的颗粒扩散系数计算包括单体和聚集体在内的颗粒的流体力学直径。通过DLS研究还获得了聚集体种类的数目和多分散性。
结果
可视颗粒评价
表4总结了目测观察的结果。在开始冻融循环之前的0时刻，所有样品轻微发白，没有可视聚集体/沉淀。1次冻融循环之后，未添加任何表面活性剂的所有制剂，含有0-0.05％(w/v)吐温80的制剂和含有0-0.1％(w/v)Brij35的制剂以及含有0-0.5％(w/v)Pluronic F68的样品中都形成少数可视聚集体/沉淀。含有0.05％-0.5％(w/v)吐温20的样品在8轮冻融之后未显示任何聚集体或沉淀。这说明吐温20在防止多轮冻融循环后形成不可溶的大聚集体方面比吐温80更加有效。Brij35和Pluronic F68远不如吐温80和吐温20有效。
表4.含有各种浓度表面活性剂的柠檬酸盐缓冲制剂中CHIR-12.12的外观
Figure G2007800139737D00571
Figure G2007800139737D00581
缩写的含义：XFT＝冻融循环数；SO＝轻微发白；ppt＝沉淀/聚集体
亚可视颗粒计数
表5显示了每毫升含不同浓度吐温80的柠檬酸盐/柠檬酸缓冲制剂中亚可视颗粒的数目。观察到随着吐温80浓度的升高亚可视颗粒数目有下降趋势；当吐温80超过0.1％(w/v)时亚可视颗粒数目的降低适度，说明使用吐温80的合适浓度为0.1-0.2％(w/v)。
表5.含20mg/ml CHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM NaCl以及各种浓度(0-0.2％w/v)吐温80，pH5.5的制剂中亚可视颗粒的数目
Figure G2007800139737D00582
表6显示了每毫升含或不含吐温20的柠檬酸盐/柠檬酸缓冲制剂中亚可视颗粒的数目。在制剂中加入吐温20大大降低了聚集体的数目。当吐温20为0.05％(w/v)或更高时，亚可视聚集体数目的降低几乎达到平台，说明使用吐温20的合适浓度为0.05-0.2％(w/v)。
表6.含20mg/ml CHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM NaCl以及各种浓度(0-0.2％w/v)吐温80，pH5.5的制剂中亚可视颗粒的数目
Figure G2007800139737D00583
此外，表5和表6显示，含吐温80和吐温20的制剂都产生非常少量的≥25μm的聚集体，而在5轮冻融之后，含吐温20的制剂产生的≥10μm的聚集体比含吐温80的制剂更少。该结果说明，吐温20在使CHIR-12.12柠檬酸盐/柠檬酸缓冲制剂中亚可视聚集体形成最小化方面比吐温80更加有效。
基于表4、5和6的结果，在最小化CHIR-12.12制剂中形成聚集体方面，吐温-20是比吐温80优选的赋形剂。因此，进行了额外的研究以进一步优化消除CHIR-12.12制剂中形成聚集体所需的吐温-20的浓度。从批号为CD083005A的CHIR-12.12药品制备制剂(20mg/ml CHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM L-精氨酸-HCl，5mM L-甲硫氨酸，0-0.2％吐温20，pH5.5)。将20ml制剂样品装入125cc聚碳酸酯药瓶，在-20℃冷冻并室温解冻。5轮冻融循环之前和之后，用HIAC-Royco液体颗粒记数仪测量制剂样品中亚可视颗粒的数目。结果总结于表7。
表7.含20mg/ml CHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，150mM L-精氨酸-HCl，5mM L-甲硫氨酸，0-0.2％吐温20，pH5.5的制剂中亚可视颗粒的数目
Figure G2007800139737D00591
*缩写含义：XFT＝冻融循环数
5轮冻融之后，含L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸的样品产生的聚集体远小于不含L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸的制剂，即，不含吐温20时为169颗粒/ml≥10μm对比1439或1671颗粒/ml≥10μm(参见，表6和7)。然而，直到加入吐温20，L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸未显著降低冻融诱导的聚集体至最低水平。这说明L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸在使冻融诱导的CHIR-12.12聚集最小化方面不十分有效。
由表5-7中总结的数据可见，经冻融处理的含0.025-0.1％(w/v)吐温20的样品中亚可视聚集体数目与冻融循环之前的各样品仍旧相当。这说明含吐温20与L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸组合的制剂产生了最少的亚可视聚集体。因此，吐温20是能有效使冻融期间CHIR-12.12产生亚可视聚集体最小化的制剂赋形剂。测定吐温20的有效浓度为0.025-0.1％(w/v)。
动态光散射分析
表8显示了颗粒的平均流体力学直径、多分散性、以及CHIR-12.12单体种类的百分强度。动态光散射分析仅检测5轮冻融前后所有样品中的单体种类，如表所示为100％强度单体种类。这说明所有样品主要由单体构成。5轮冻融研究之后，不含吐温20和含0.005％(w/v)吐温20的样品中可能有少数聚集体(可能是二聚体或三聚体)与单体共存，如流体力学直径和多分散性提高所示。含0.025-0.1％(w/v)吐温20的样品显示流体力学直径和多分散性值有轻微改变，表面它们保留了之前的单体水平而没有明显的聚集体形成。
表8.5轮冻融前后含20mg/ml CHIR-12.12，10mM柠檬酸钠/柠檬酸，
150mM L-精氨酸-HCl，5mM L-甲硫氨酸，和各种浓度(0-0.2％)吐温20，pH5.5的制剂中CHIR-12.12的动态光散射分析
Figure G2007800139737D00601
*缩写含义：FT＝冻融；XFT＝冻融循环数
基于目测、亚可视颗粒计数和动态光散射分析，就使冻融诱导的CHIR-12.12聚集最小化而言，确定吐温20的最佳浓度为0.025-0.1％(w/v)。
总之，发现吐温20和吐温80能使冻融期间的CHIR-12.12聚集最小化。吐温20和吐温80的最佳浓度分别为0.025-0.1％(w/v)和0.1-0.2(w/v)％。吐温20比吐温80更加有效，因为较低浓度的吐温20能将聚集体形成的数目和程度降至降低水平。该研究证实，加入最佳浓度的吐温，优选与L-精氨酸-HCl和L-甲硫氨酸组合加入，能在-20℃或以下储存柠檬酸盐/柠檬酸缓冲的CHIR-12.12原料药品而没有显著聚集。
实施例4：测定抗-CD40抗体的拮抗活性
用以下试验来评价抗-CD40抗体的拮抗活性。可通过，例如，从获自接受扁桃体切除术个体的扁桃体分离获得用于这些试验的人B细胞，该过程基本描述于DeGroot等(1990)Lymphokine Research(1990)9:321。简言之，用解剖刀分散组织，用5mM L-亮氨酸甲酯处理以除去吞噬细胞和NK细胞，并用2-氨乙基异硫代溴化脲(2-aminoethyl isothiouronium bromide)处理的绵羊红细胞(SRBC)进行一轮花结形成(rosetting)以除去T细胞。可通过佛罗里达州海尔勒阿市考特克隆公司的抗-(CD20)mAb B1(Coulter Clone，Hialeah，FA)或新泽西州拉里坦市澳索公司的抗-(CD3)mAb OKT3(Ortho，Raritan，NJ)以及FITC-偶联的兔抗-(小鼠Ig)的F(ab’)2片段(扎迈得公司(Zymed)，旧金山，加州)直接免疫荧光标记和FACS分析检测所得B淋巴细胞制品的纯度。
B细胞增殖试验。
在96孔平底微滴定板中用添加有10％胎牛血清的200μl IMDM培养B细胞(每孔4x104)。加入固定的抗-(IgM)抗体(免疫珠(Immunobead)；5μg/ml；拜尔莱得公司(BioRad)，里士满(Richmond)，加州)以刺激B细胞。需要时加入100U/ml重组IL-2。在微量培养开始时加入各种浓度的待测单克隆抗体(mAb)，并在第3天通过测量18小时脉冲后(3H)-胸腺嘧啶的掺入来评价增殖。
当存在固定的抗-IgM或存在固定的抗-IgM和IL-2时，拮抗性抗-CD40抗体不会显著共刺激人B细胞增殖。
Banchereau-样B细胞增殖试验
为检测抗-CD40单克隆抗体刺激B细胞增殖的能力，在类似于Banchereau等(1991)Science(1991)251：70所述的培养***中使用表达人FcγRII HR等位基因形成的小鼠3T6转化细胞。在存在1x104转染细胞(用5000拉德照射)时，在平底微孔中用添加了10％胎牛血清和100U/ml重组IL-4的200μl IMDM中培养B细胞(每孔2x104)。加入B细胞之前，使3T6细胞附于培养塑料(culture plastic)至少5小时。加入从15ng/ml到2000ng/ml各种浓度的抗-CD40mAb，并在第7天用[3H]胸腺嘧啶脉冲18小时后通过测量胸腺嘧啶掺入来估算B细胞的增殖。
用拮抗性抗-CD40mAb抑制S2C6-刺激的B细胞增殖
还采用上述B细胞增殖试验通过拮抗性抗-CD40单克隆抗体(mAb)抑制抗-CD40抗体如S2C6(也称为SGN-14，据报道它是CD40刺激B细胞增殖的激动剂；Francisco等(2000)CancerRes.60:3225-3231)刺激B细胞增殖的能力对它们进行了表征。在存在与琼脂糖珠偶联的抗-IgM(5μg/ml)和抗-CD40mAb S2C6(1.25μg/ml)时，在微孔中用200μl培养基中培养人扁桃体B细胞(每孔4x104)。加入各种浓度的感兴趣的抗-CD40mAb，3天后评价[3H]-胸腺嘧啶掺入。以类似浓度加入抗-(葡糖脑苷脂酶)mAb8E4作为对照。Barneveld等(1983)Eur.J.Biochem.134:585。拮抗性抗-CD40抗体可抑制mAb S2C6对抗-IgM诱导的人B细胞增殖的共刺激，例如，抑制至少75％或者更多(即，存在拮抗性抗-CD40抗体时，S2C6-刺激的增殖不超过不存在拮抗性抗-CD40抗体时观察到的增殖的25％)。相反，用等量的针对β-葡糖脑苷脂酶的非相关mAb8E4未见显著抑制。Barneveld等，同上。这种结果说明，抗-CD40mAb不递送人B细胞增殖的刺激信号，相反，能够抑制其他mAb触发CD40而产生的刺激信号。
用EL4B5细胞进行的B细胞活化试验
Zubler等(1985)J.Immunol.(1985)134:3662观察到，小鼠胸腺瘤EL-4系的突变型亚克隆，称为EL4B5，在体外能够强烈刺激鼠源和人源B细胞增殖和分化成分泌免疫球蛋白的血浆细胞。发现这种活化作用不依赖于抗原，并不受MHC限制。为优化人B细胞刺激，需要存在来自活化的人T细胞的上清液，但当用佛波醇-12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(PMA)或IL-1预活化EL4B5细胞时还会发生B细胞应答。Zubler等(1987)Immunological Reviews 99:281；和Zhang等(1990)J.Immunol.144:2955。该培养***中的B细胞活化是充足的—有限稀释试验显示，大多数人B细胞被活化以增殖或分化成分泌抗体的细胞。Wen等(1987)Eur.J.Immunol.17:887。
将B细胞(每孔1000)与经照射的(5000拉德)EL4B5细胞(每孔5x104)一起在平底微滴定板中用添加有10％热灭活胎牛血清、5ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(Sigma)和5％人T细胞上清液的200μl IMDM培养。培养开始时加入不同浓度的mAb，用[3H]-胸腺嘧啶脉冲18小时后评价胸腺嘧啶掺入。为制备T细胞上清液，在存在1μg/ml PHA和10ng/ml PMA时以106/ml密度将纯化的T细胞培养36小时。Wen等(1987)Eur.J.Immunol.(1987)17:887。通过细胞离心获得T细胞上清液并储存于-20℃。检测了T细胞上清液增强EL4B5-B细胞培养物中人B细胞增殖的功效并收集最有效的上清液用于实验。当评价抗-CD40抗体对EL4B5诱导的人B细胞增殖的作用时，可加入单克隆抗体如MOPC-141(IgG2b)作为对照。
拮抗性抗-CD40抗体能够抑制EL4B5细胞系刺激的B细胞增殖，例如，抑制至少75％或更高(即，存在拮抗性抗-CD40抗体时EL4B5诱导的B细胞增殖不超过不存在拮抗性抗-CD40抗体时观察到的值的25％)。相反，对照抗体如MOPC-141对于EL4B5诱导的B细胞增殖没有显著影响。
B细胞产生抗体的人T辅助细胞试验
拮抗性抗-CD40抗体可作为B细胞产生免疫球蛋白的拮抗剂。在T辅助细胞试验中，可通过评价抗体抑制B细胞产生免疫球蛋白的能力来检测抗-CD40抗体的这种拮抗活性，其中所述B细胞已经用活化的T细胞以依赖于接触的方式刺激过。在这种方式中，用1:500稀释的抗-CD3mAb CLB-T3/3腹水液(CLB，阿姆斯特丹，荷兰)涂布96孔组织培养板。按照指示加入共刺激mAb：抗CD2mAbCLB-T11.1/1和CLB-T11.2/1(CLB，阿姆斯特丹，荷兰)，1:1000腹水和抗-CD28mAbCLB-28/1(CLB，阿姆斯特丹，荷兰)二者。随后加入扁桃体T细胞(经照射，3000拉德；105每孔)，扁桃体B细胞(104每孔)，和rIL-2(20U/ml)。各细胞培养物的终体积为200μl。8天后离心细胞，收获不含细胞的上清液。如下所述通过ELISA估算(稀释)样品中人IgM和IgG的浓度。
在一个实施方式中，将人扁桃体B细胞(104/孔)与经照射的纯化T细胞(3000拉德，105/孔)一起在用抗-CD3mAb涂布的96孔板中培养，各孔中含或不含不同mAb以共刺激T细胞。培养8天后收获上清液以测定B细胞产生的免疫球蛋白。通过下述ELISA试验测定B细胞产生的免疫球蛋白。培养开始时加入各种浓度的感兴趣抗-CD40抗体。可加入mAb MOPC-141作为对照。
拮抗性抗-CD40抗体可以抑制人T细胞刺激的B细胞产生IgG和IgM抗体达至少50％或更高(即，存在拮抗性抗-CD40抗体时的T细胞诱导的B细胞产生抗体不超过不存在拮抗性抗-CD40抗体时的观察值的50％)。相反，对照抗体如MOPC-141对于T细胞诱导的B细胞产生抗体没有显著影响。
定量测定免疫球蛋白的ELISA试验
通过ELISA估算人IgM和IgG的浓度。96孔ELISA平板用0.05M碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)配制的4μg/ml小鼠抗-人IgG mAb MH16-01(CLB，阿姆斯特丹，荷兰)或1.2μg/ml小鼠抗-人IgM mAb4102(Tago，伯林盖姆(Burlingame)，加州)涂布，4℃培育16小时。平板用PBS-0.05％吐温-20(PBS-吐温)洗涤3次并用BSA饱和1小时。2次洗涤后将平板与测试样品的不同稀释液一起在37℃培育1小时。3次洗涤后与1μg/ml过氧化物酶标记的小鼠抗-h人IgG mAb MH16-01(CLB)或小鼠抗-人IgM mAb MH15-01(CLB)一起在37℃培育1小时以检测结合的Ig。将平板洗涤4次并加入O-苯二胺作为底物以显示结合的过氧化物酶的活性。利用人标准血清(H00，CLB)建立各试验的标准曲线。
冠词“一个”在文中表示一个或多个(即，至少一个)该冠词的逻辑主语。例如，“一个元件”是指一个或多个元件。
说明书中述及的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域技术人员的水平。如同每篇单独的出版物或专利申请特定且独立地用作参考一样，所有出版物和专利申请纳入本文作为参考。
尽管出于透彻理解的目的已经通过举例和实施例在一定程度上详细描述了上述发明，但显然，在附加权利要求的范围之内可采取一定的变化和修饰。
Figure G2007800139737D00651
Figure G2007800139737D00661
Figure G2007800139737D00671
序列表
<110>LU，Xiaofeng(Lu，Xiaofeng)
     B.-L.陈(Chen，Bao-Lu)
     K.阿拉亚(Araya，Kidisti)
     A.奥克哈马菲(Okhamafe，Augustus)
<120>拮抗性抗-CD40抗体药物组合物
<130>PP028228.0002(325023)
<150>60/794,011
<151>2006-04-21
<160>12
<170>FastSEQ，Windows版本4.0
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗体轻链编码序列
<221>CDS
<222>(1)...(720)
<400>1
atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct  48
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
  1               5                  10                  15
gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc  96
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
             20                  25                  30
gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tcc agt cag agc  144
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
         35                  40                  45
ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag  192
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
     50                  55                  60
cca ggg cag tct cca cag gtc ctg atc tct ttg ggt tct aat cgg gcc  240
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
 65                  70                  75                  80
tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt  288
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                 85                  90                  95
aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac  336
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa  384
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
        115                 120                 125
gtg gat atc aga cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg  432
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg  480
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat  528
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac  576
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa  624
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag  672
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag  720
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys *
225                 230                 235
<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗体轻链
<400>2
Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser
  1              5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr
            20                  25                  30
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>3
<211>2016
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗体重链编码序列(带有内含子)
<400>3
atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct att tta aga ggt  48
gtc cag tgt cag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag  96
cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc  144
agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg  192
gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gag gaa agt aat aga tac cat gca  240
gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag atc  288
acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctc aga act gag gac acg gct gtg  336
tat tac tgt gcg aga gat ggg ggt ata gca gca cct ggg cct gac tac  384
tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gca agt acc aag ggc  432
cca tcc gtc ttc ccc ctg gcg ccc gct agc aag agc acc tct ggg ggc  480
aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg  528
acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc  576
ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg  624
acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg  672
aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt ggt gag agg  720
cca gca cag gga ggg agg gtg tct gct gga agc cag gct cag cgc tcc  768
tgc ctg gac gca tcc cgg cta tgc agt ccc agt cca ggg cag caa ggc  816
agg ccc cgt ctg cct ctt cac ccg gag gcc tct gcc cgc ccc act cat  864
gct cag gga gag ggt ctt ctg gct ttt tcc cca ggc tct ggg cag gca  912
cag gct agg tgc ccc taa ccc agg ccc tgc aca caa agg ggc agg tgc  960
tgg gct cag acc tgc caa gag cca tat ccg gga gga ccc tgc ccc tga  1008
cct aag ccc acc cca aag gcc aaa ctc tcc act ccc tca gct cgg aca  1056
cct tct ctc ctc cca gat tcc agt aac tcc caa tct tct ctc tgc aga  1104
gcc caa atc ttg tga caa aac tca cac atg ccc acc gtg ccc agg taa  1152
gcc agc cca ggc ctc gcc ctc cag ctc aag gcg gga cag gtg ccc tag  1200
agt agc ctg cat cca ggg aca ggc ccc agc cgg gtg ctg aca cgt cca  1248
cct cca tct ctt cct cag cac ctg aac tcc tgg ggg gac cgt cag tct  1296
tcc tct tcc ccc caa aac cca agg aca ccc tca tga tct ccc gga ccc  1344
ctg agg tca cat gcg tgg tgg tgg acg tga gcc acg aag acc ctg agg  1392
tca agt tca act ggt acg tgg acg gcg tgg agg tgc ata atg cca aga  1440
caa agc cgc ggg agg agc agt aca aca gca cgt acc gtg tgg tca gcg  1488
tcc tca ccg tcc tgc acc agg act ggc tga atg gca agg agt aca agt  1536
gca agg tct cca aca aag ccc tcc cag ccc cca tcg aga aaa cca tct  1584
cca aag cca aag gtg gga ccc gtg ggg tgc gag ggc cac atg gac aga  1632
ggc cgg ctc ggc cca ccc tct gcc ctg aga gtg acc gct gta cca acc  1680
tct gtc cct aca ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc  1728
cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg  1776
gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat  1824
ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc  1872
gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg  1920
tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg  1968
cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga  2016
<210>4
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗体重链
<400>4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
 1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>5
<211>469
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>12.12人抗-CD40抗体变体重链
<400>5
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly
 1               5                  10                  15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>6
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5.9人抗-CD40抗体轻链
<400>6
Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro
            20                  25                  30
Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg
        115                 120                 125
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
                165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
        195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>7
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5.9人抗-CD40抗体重链
<400>7
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
 1               5                  10                  15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
            260                 265                 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
        275                 280                 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
    290                 295                 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305                 310                 315                 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                325                 330                 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
            340                 345                 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
        355                 360                 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
    370                 375                 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                405                 410                 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
            420                 425                 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
        435                 440                 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
    450                 455                 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>8
<211>474
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>5.9人抗-CD40抗体变体重链
<400>8
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
 1               5                  10                  15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
        115                 120                 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
                165                 170                 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
        195                 200                 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
    210                 215                 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225                 230                 235                 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
            260                 265                 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
        275                 280                 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
    290                 295                 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305                 310                 315                 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                325                 330                 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
            340                 345                 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
        355                 360                 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
    370                 375                 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385                 390                 395                 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                405                 410                 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
            420                 425                 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
        435                 440                 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
    450                 455                 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>9
<211>612
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(612)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40短同种型编码序列
<400>9
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc  48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                   10                  15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta  96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
             20                  25                  30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg  144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
         35                  40                  45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa  192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
     50                  55                  60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac  240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
 65                  70                  75                  80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc  288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                 85                  90                  95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg  336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc  384
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag  432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa  480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt  528
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
                165                 170                 175
gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt  576
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
            180                 185                 190
ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa                  612
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln*
        195                 200
<210>10
<211>203
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
        35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
    50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly
                165                 170                 175
Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly
            180                 185                 190
Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln
        195                 200
<210>11
<211>834
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(834)
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人CD40长同种型编码序列
<400>11
atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc  48
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta  96
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
             20                  25                  30
ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg  144
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
         35                  40                  45
agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa    192
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
     50                  55                  60
agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac    240
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
 65                  70                  75                  80
aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc    288
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                 85                  90                  95
tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg    336
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc    384
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag    432
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa    480
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
tgt cac cct tgg aca agc tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag    528
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
                165                 170                 175
gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg    576
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
            180                 185                 190
aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc    624
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
        195                 200                 205
ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat    672
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
    210                 215                 220
aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac    720
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat    768
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
                245                 250                 255
gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca    816
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
            260                 265                 270
gtg cag gag aga cag tga                                            834
Val Gln Glu Arg Gln *
        275
<210>12
<211>277
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
        35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
    50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
                165                 170                 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
            180                 185                 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
        195                 200                 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
    210                 215                 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
                245                 250                 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
            260                 265                 270
Val Gln Glu Arg Gln
        275

Claims (25)

1.一种稳定的液体药物组合物，其包含：
a)作为治疗或预防活性组分的拮抗性抗-CD40单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体能够特异性结合人B细胞表面表达的人CD40抗原，所述单克隆抗体当与所述B细胞表面表达的CD40抗原结合时无明显激动活性；
b)含量足以使所述组合物的摩尔渗透压浓度为240mmol/kg至360mmol/kg的精氨酸-HCl；和
c)维持所述组合物的pH在pH5.0和pH7.0之间的缓冲剂，其中，所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂；
其中所述拮抗性抗-CD40单克隆抗体选自下组：
i)包含SEQ ID NO：2所示可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：4所示可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
ii)包含SEQ ID NO：2所示可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：5所示可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
iii)包含SEQ ID NO：2所示前导区、可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：4所示前导区、可变区和恒定区序列的单克隆抗体；和
iv)包含SEQ ID NO：2所示前导区、可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：5所示前导区、可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
其中，所述缓冲剂的浓度为5mM到100mM，所述组合物含有浓度为50mM到200mM的精氨酸-HCl。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40单克隆抗体是由ATCC保藏的保藏号为PTA-5543的杂交瘤细胞系获得的单克隆抗体CHIR-12.12。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40单克隆抗体由CHO细胞系产生。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为5mM至20mM。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为10mM。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂是柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH为pH5.5。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的精氨酸-HCl的浓度为100mM至175mM。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的精氨酸-HCl的浓度为150mM。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为5mM至20mM，和所述组合物包含的精氨酸-HCl的浓度为100mM至175mM。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂的浓度为10mM，和所述精氨酸-HCl的浓度为150mM。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂是柠檬酸钠/柠檬酸缓冲剂。
13.如权利要求1所述的组合物，还包含表面活性剂，其中，所述表面活性剂是聚山梨酸酯20，其浓度为0.025％至0.1％(w/v)。
14.如权利要求1所述的组合物，还包含甲硫氨酸，其含量足以抑制所述组合物储存期间所述抗-CD40单克隆抗体中至少一种可氧化的氨基酸残基的氧化。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的甲硫氨酸的浓度为0.5mM至20.0mM。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的甲硫氨酸的浓度为1.0mM到20.0mM。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的甲硫氨酸的浓度为5.0mM。
18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40单克隆抗体在所述组合物中的浓度为0.1mg/ml至50.0mg/ml。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40单克隆抗体在所述组合物中的浓度为1.0mg/ml至35.0mg/ml。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述拮抗性抗-CD40单克隆抗体在所述组合物中的浓度为10.0mg/ml至35.0mg/ml。
21.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物在2℃C至8℃C的温度下能稳定至少18个月，或在25℃C能稳定至少3个月。
22.一种提高抗-CD40单克隆抗体在液体药物组合物中的稳定性的方法，所述方法包括将所述抗-CD40单克隆抗体、含量足以使所述组合物的摩尔渗透压浓度为240mmol/kg至360mmol/kg的精氨酸-HCl以及维持所述组合物的pH在pH5.0和pH7.0之间的缓冲剂混合以配制所述组合物，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，其中所述抗-CD40单克隆抗体选自下组：
i)包含SEQ ID NO：2所示可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：4所示可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
ii)包含SEQ ID NO：2所示可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：5所示可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
iii)包含SEQ ID NO：2所示前导区、可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：4所示前导区、可变区和恒定区序列的单克隆抗体；和
iv)包含SEQ ID NO：2所示前导区、可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：5所示前导区、可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
其中，所述缓冲剂的浓度为5mM到100mM，所述组合物含有浓度为50mM到200mM的精氨酸-HCl。
23.一种制备含抗-CD40单克隆抗体的液体药物组合物的方法，所述方法包括将所述抗-CD40单克隆抗体、含量足以使所述组合物的摩尔渗透压浓度为240mmol/kg至360mmol/kg的精氨酸-HCl以及维持所述组合物的pH在pH5.0和pH7.0之间的缓冲剂混合以配制所述组合物，其中所述缓冲剂是柠檬酸盐/柠檬酸缓冲剂，其中所述抗-CD40单克隆抗体选自下组：
i)包含SEQ ID NO：2所示可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：4所示可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
ii)包含SEQ ID NO：2所示可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：5所示可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
iii)包含SEQ ID NO：2所示前导区、可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：4所示前导区、可变区和恒定区序列的单克隆抗体；和
iv)包含SEQ ID NO：2所示前导区、可变区和恒定区序列和SEQ ID NO：5所示前导区、可变区和恒定区序列的单克隆抗体；
其中，所述缓冲剂的浓度为5mM到100mM，所述组合物含有浓度为50mM到200mM的精氨酸-HCl。
24.如权利要求1-21中任一项所述的药物组合物用于制备治疗患有与表达CD40的细胞相关的癌症或恶变前病症的对象的药物的用途。
25.如权利要求1-21中任一项所述的药物组合物用于制备治疗患有与表达CD40的细胞相关的炎性疾病或自身免疫性疾病的对象的药物的用途。
CN2007800139737A 2006-04-21 2007-04-17 拮抗性抗-cd40抗体药物组合物 Expired - Fee Related CN101426817B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79401106P 2006-04-21 2006-04-21
US60/794,011 2006-04-21
PCT/US2007/066757 WO2007124299A2 (en) 2006-04-21 2007-04-17 Antagonist anti-cd40 antibody pharmaceutical compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101426817A CN101426817A (zh) 2009-05-06
CN101426817B true CN101426817B (zh) 2013-07-10

Family

ID=38556677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007800139737A Expired - Fee Related CN101426817B (zh) 2006-04-21 2007-04-17 拮抗性抗-cd40抗体药物组合物

Country Status (30)

Country Link
US (2) US8945564B2 (zh)
EP (1) EP2019841A2 (zh)
JP (2) JP5290152B2 (zh)
KR (1) KR101317235B1 (zh)
CN (1) CN101426817B (zh)
AR (1) AR060487A1 (zh)
AU (1) AU2007240507B2 (zh)
BR (1) BRPI0710826A2 (zh)
CA (1) CA2649907A1 (zh)
CR (1) CR10379A (zh)
CU (1) CU23856A3 (zh)
EA (1) EA018301B1 (zh)
EC (1) ECSP088903A (zh)
GE (1) GEP20125628B (zh)
GT (1) GT200700034A (zh)
HN (1) HN2008001572A (zh)
IL (1) IL194642A0 (zh)
MA (1) MA30470B1 (zh)
ME (1) MEP39508A (zh)
MX (1) MX2008013508A (zh)
NI (1) NI200800284A (zh)
NO (1) NO20084796L (zh)
NZ (1) NZ571757A (zh)
SA (1) SA07280191B1 (zh)
SM (1) SMP200800064B (zh)
SV (1) SV2008003071A (zh)
TN (1) TNSN08412A1 (zh)
TW (1) TW200808349A (zh)
UA (1) UA94264C2 (zh)
WO (1) WO2007124299A2 (zh)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
EP1909831A4 (en) 2005-06-14 2013-02-20 Amgen Inc PREPARATIONS OF SPONTANEOUS TAMPING PROTEINS
EA018301B1 (ru) * 2006-04-21 2013-07-30 Новартис Аг Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение
SI2044111T1 (sl) 2006-06-21 2015-02-27 Musc Foundation For Research Development Ciljanje komplementa faktorja H za zdravljenje bolezni
PE20091174A1 (es) * 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2498998C2 (ru) * 2008-05-30 2013-11-20 ИксБиотеч, Инк. АНТИТЕЛА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-1α И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
CA2725666A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009256250B2 (en) 2008-06-03 2013-05-30 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ590074A (en) 2008-07-08 2012-12-21 Abbott Lab Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
NZ594514A (en) 2009-03-05 2013-06-28 Abbott Lab Interleukin-17 BINDING PROTEINS
RS20120461A1 (en) 2009-07-02 2013-06-28 Musc Foundation For Research Development METHODS FOR STIMULATION OF LIVER REGENERATION
IN2012DN02737A (zh) 2009-09-01 2015-09-11 Abbott Lab
KR20140015139A (ko) 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
KR20120130748A (ko) 2009-11-05 2012-12-03 알렉시온 캠브리지 코포레이션 발작성 야간 혈색소뇨증, 용혈성 빈혈, 및 혈관내 및 혈관외 용혈을 수반한 질환 상태의 치료
GB0920944D0 (en) 2009-11-30 2010-01-13 Biotest Ag Agents for treating disease
AU2013202276B2 (en) * 2009-12-21 2016-03-24 Genentech, Inc. Antibody formulation
CN107095846A (zh) * 2009-12-21 2017-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗体配制剂
WO2011123489A2 (en) * 2010-03-31 2011-10-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-cd40 antibodies
ES2717912T3 (es) 2010-05-14 2019-06-26 Univ Colorado Regents Grupos dirigidos al receptor del complemento 2 (cr2) mejorados
EP2571532B1 (en) 2010-05-14 2017-05-03 Abbvie Inc. Il-1 binding proteins
KR20130036276A (ko) 2010-06-22 2013-04-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 보체 결합 3의 C3d 조각에 대한 항체들
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201211252A (en) 2010-08-26 2012-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20140031250A1 (en) 2010-10-07 2014-01-30 David Tsai Ting Biomarkers of Cancer
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
WO2012075111A1 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Novartis Ag Uses of anti-cd40 antibodies in combination therapy for b cell-related cancers
RU2627171C2 (ru) 2010-12-21 2017-08-03 Эббви Инк. Il-1 альфа и бета биспецифические иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
EP2676677B1 (en) * 2011-02-17 2019-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Highly concentrated anti-cd40 antibody pharmaceutical preparation
CA3122934A1 (en) * 2011-03-11 2012-09-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Fusion protein comprising a fragment of cd40 and method of producing same
CN106977604A (zh) 2011-04-21 2017-07-25 百时美施贵宝公司 拮抗cd40之抗体多肽
UA116189C2 (uk) 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
CN107998388B (zh) 2011-05-02 2023-07-14 千禧制药公司 抗α4β7抗体的制剂
CN103857699B (zh) 2011-05-24 2016-08-31 泽恩格尼亚股份有限公司 多价和单价多特异性复合物及其用途
RU2014120981A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Иммунные связывающие агенты против склеростина
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
US9592289B2 (en) 2012-03-26 2017-03-14 Sanofi Stable IgG4 based binding agent formulations
ES2702246T3 (es) * 2012-03-26 2019-02-28 Sanofi Sa Formulaciones de agente de unión IgG4 estables
JP6265970B2 (ja) * 2012-03-26 2018-01-24 サノフイ 安定なＩｇＧ４に基づく結合剤の製剤
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
AU2013270684B2 (en) 2012-06-08 2018-04-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
UY34905A (es) 2012-07-12 2014-01-31 Abbvie Inc Proteínas de unión a il-1
US10413620B2 (en) 2012-08-17 2019-09-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Light-emitting versions of the monoclonal antibody to C3D (MAB 3D29) for imaging
WO2014028865A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for detecting complement activation
EP4074728A1 (en) 2012-08-31 2022-10-19 Sutro Biopharma, Inc. Modified peptides comprising an azido group
AU2013337775B2 (en) 2012-11-01 2017-03-30 Abbvie Inc. Anti-VEGF/DLL4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
CA2907181C (en) 2013-03-15 2023-10-17 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
US20160075766A1 (en) 2013-05-21 2016-03-17 Roche Diagnostics Operations, Inc. Method for producing antibodies using ovine b-cells and uses thereof
ES2865473T3 (es) 2013-07-10 2021-10-15 Sutro Biopharma Inc Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso
WO2015054658A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
EP3892288A1 (en) * 2013-10-24 2021-10-13 Astrazeneca AB Stable, aqueous antibody formulations
WO2015134988A1 (en) 2014-03-07 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
ES2944563T3 (es) * 2014-05-19 2023-06-22 Hoffmann La Roche Procedimiento para producir anticuerpos usando linfocitos B ovinos y usos de los mismos
WO2016028810A1 (en) * 2014-08-18 2016-02-25 Biogen Ma Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
KR102656470B1 (ko) 2014-12-10 2024-04-09 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
WO2016115475A1 (en) * 2015-01-18 2016-07-21 Biogen Ma Inc. Anti-cd40 antibody formulations
CA2987051A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Abbvie Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
SG11201800864XA (en) 2015-08-11 2018-03-28 Univ Osaka Antibody
PL3344655T3 (pl) * 2015-09-01 2024-02-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Zastosowanie przeciwciał anty-cd40 w leczeniu toczniowego zapalenia nerek
SI3307322T1 (sl) 2015-09-04 2021-08-31 Primatope Therapeutics Inc. Humanizirana protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
EP3355921A4 (en) * 2015-09-30 2019-05-22 Janssen Biotech, Inc. ANTAGONIST ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO HUMAN CD40 AND METHODS OF USE
EA039944B1 (ru) * 2016-01-27 2022-03-30 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Применение антител к cd40 для лечения волчаночного нефрита
KR102429230B1 (ko) * 2016-02-20 2022-08-05 삼성전자주식회사 안테나 장치 및 안테나 장치를 포함하는 전자 장치
TWI826351B (zh) * 2016-05-31 2023-12-21 大陸商鴻運華寧（杭州）生物醫藥有限公司 Ｒ抗體,其藥物組合物及其應用
WO2017218698A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies with engineered ch2 domains, compositions thereof and methods of using the same
JP7461741B2 (ja) 2016-06-20 2024-04-04 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１およびｉｌ－２サイトカイン
BR112019007858A2 (pt) 2016-10-21 2019-07-02 Amgen Inc formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas
WO2018089688A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Jinjun Shi Restoration of tumor suppression using mrna-based delivery system
BR112019010236A2 (pt) * 2016-11-21 2019-08-20 Eiger Biopharmaceuticals Inc formulações tamponadas de exendina (9-39)
MX2019012255A (es) * 2017-04-11 2019-12-05 Kiniksa Pharmaceuticals Ltd Formulacion estable de anticuerpo contra el receptor de oncostatina m (osmr).
US11845798B2 (en) 2017-05-02 2023-12-19 Merck Sharp & Dohme Llc Formulations of anti-LAG3 antibodies and co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
MX2020001851A (es) * 2017-08-22 2020-08-20 Biogen Ma Inc Composiciones farmaceuticas y regimenes de dosificacion que contienen anticuerpos anti-alfa(v)beta(6).
GB201717966D0 (en) 2017-10-31 2017-12-13 Xenikos Bv Immunotoxins, formulations thereof and their use in medicine
WO2019157087A1 (en) 2018-02-06 2019-08-15 The General Hospital Corporation Repeat rna as biomarkers of tumor immune response
AU2019217207A1 (en) * 2018-02-12 2020-08-27 Diabetes-Free, Inc. Improved antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibodies
CA3103629A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
SG11202103907PA (en) * 2018-10-18 2021-05-28 Merck Sharp & Dohme Formulations of anti-rsv antibodies and methods of use thereof
WO2020213568A1 (ja) * 2019-04-18 2020-10-22 国立大学法人鹿児島大学 重合化ポリペプチドの集合体の製造方法及び重合化ポリペプチドを高分子量化させる方法
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
AU2021227871A1 (en) * 2020-02-24 2022-09-15 Medimmune, Llc Formulations of anti-endothelial lipase antibodies
US20230095053A1 (en) 2020-03-03 2023-03-30 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
KR20230157315A (ko) 2021-01-28 2023-11-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 사이토카인 방출 증후군을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
KR20240026507A (ko) 2021-06-29 2024-02-28 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도
US20230279135A1 (en) * 2021-11-05 2023-09-07 Kiniksa Pharmaceuticals, Ltd. Pharmaceutical compositions of humanized anti-cd40 antibodies
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999037329A1 (en) * 1998-01-22 1999-07-29 Astrazeneca Ab Pharmaceutical formulation comprising an antibody and a citrate buffer
WO2005044854A3 (en) * 2003-11-04 2005-08-11 Chiron Corp Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
WO2006020935A2 (en) * 2004-08-13 2006-02-23 Wyeth Stabilizing formulations

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3766162A (en) 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US4233402A (en) 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
JPS60500673A (ja) 1983-03-08 1985-05-09 コモンウエルス　セラム　ラボラトリ−ズ　コミツシヨン 抗原活性を有するアミノ酸配列
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5879936A (en) 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5891693A (en) 1990-01-25 1999-04-06 Alusuisse Holdings A.G. Recombinant DNA methods vectors and host cells
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5756096A (en) 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
US5962406A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
CA2115811A1 (en) 1993-02-17 1994-08-18 Claus Krebber A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
ES2211884T3 (es) 1993-10-01 2004-07-16 Immunex Corporation Anticuerpos contra el cd40.
ATE267607T1 (de) 1993-12-23 2004-06-15 Immunex Corp Verwendung von löslichen oligomerischen cd40 liganden oder monoklonalen antikörpern zur herstellung eines arzneimitells zur vorbeugung oder behandlung von neoplastischen krankheiten
ES2204944T3 (es) 1994-03-03 2004-05-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Genes y proteinas de fusion inhibidores del complemento terminal.
GB9425060D0 (en) 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5830698A (en) 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
TR199903141T2 (xx) 1997-06-20 2000-09-21 Biogen, Inc. Terap�tik protein engelleyici sendrom i�in CD154 blokaj tedavisi.
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
MY133346A (en) 1999-03-01 2007-11-30 Biogen Inc Kit for radiolabeling ligands with yttrium-90
US6914128B1 (en) * 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
EP1173589A1 (en) 1999-04-16 2002-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
HUP0203133A3 (en) * 1999-10-04 2005-07-28 Chiron Corp Emeryville Stabilized liquid polypeptide-containing pharmaceutical compositions
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
WO2001034649A2 (en) 1999-11-09 2001-05-17 Chiron Corporation Compositions and methods for treating autoimmune diseases and transplant rejections
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
WO2001083755A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
KR20030031957A (ko) 2000-07-12 2003-04-23 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈 항체 및 면역 조절 항체 관련 적용의 조합을이용한 ｂ 세포 악성종양의 치료
KR20040023565A (ko) 2000-09-18 2004-03-18 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 Ｂ 세포 고갈/면역조절 항체 조합을 이용한 자가면역질환의 치료를 위한 조합 요법
DE60143535D1 (de) 2000-10-02 2011-01-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Humane antikörper gegen cd40
AU2002243718B2 (en) 2001-01-31 2007-12-06 Biogen Idec Inc. Use of immunoregulatory antibodies in the treatment of neoplastic disorders
ATE507839T1 (de) 2001-04-02 2011-05-15 Genentech Inc Kombinationstherapie
CA2658221C (en) 2001-04-27 2012-11-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd40 monoclonal antibody
WO2003029296A1 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
KR100913714B1 (ko) 2001-11-08 2009-08-24 패시트 바이오테크 코포레이션 Ｉｇｇ 항체의 안정한 액상 약학 제형물
WO2003045978A2 (en) 2001-11-26 2003-06-05 Chiron Corporation Antagonist anti-cd40 monoclonal antibody therapy for multiple sclerosis treatment
WO2003072060A2 (en) * 2002-02-27 2003-09-04 Immunex Corporation Polypeptide formulation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040022792A1 (en) * 2002-06-17 2004-02-05 Ralph Klinke Method of stabilizing proteins at low pH
EP2174663A1 (en) 2003-01-08 2010-04-14 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Stabilized aqueous compositions comprising tissue factor pathway inhibitor (TFPI) or tissue factor pathway inhibitor variant
RU2332986C2 (ru) * 2003-04-04 2008-09-10 Дженентек, Инк. Высококонцентрированные композиции антител и белков
CN102940889A (zh) 2003-05-14 2013-02-27 伊缪诺金公司 药物缀合物组合物
US8496930B2 (en) * 2003-10-01 2013-07-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of stabilizing antibody and stabilized solution-type antibody preparation
WO2005044304A2 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Chiron Corporation Use of antagonist anti-cd40 antibodies for treatment of chronic lymphocytic leukemia
ES2346978T3 (es) 2003-11-04 2010-10-22 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Uso de anticuerpos monoclonantes anti-cd40 antagonistas para el tratamiento del mieloma multiple.
EP2236172A1 (en) 2003-11-04 2010-10-06 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination therapy comprising anti-CD20 and anti-CD40 antibodies for the treatment of B cell-related cancers
US8277810B2 (en) * 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
EP2301575A1 (en) 2003-11-04 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Methods of therapy for solid tumors expressing the CD40 cell-surface antigen
DE10355251A1 (de) * 2003-11-26 2005-06-23 Merck Patent Gmbh Pharmazeutische Zubereitung enthaltend einen Antikörper gegen den EGF-Rezeptor
ES2553987T3 (es) 2003-12-25 2015-12-15 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Preparación farmacéutica de base acuosa estable que contiene anticuerpo
WO2005117948A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Ares Trading S.A. Method of stabilizing proteins
DE102004028815A1 (de) 2004-06-15 2006-01-12 Siemens Ag Verfahren zur Ressourcen-Reservierung für ein Inter-Domain-Routing mit Dienstgütemerkmalen
US20080057070A1 (en) 2004-11-04 2008-03-06 Chiron Corporation Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use
AU2006247067B2 (en) 2005-05-18 2012-06-07 Novartis Ag Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by CD40 signaling
JP5421590B2 (ja) 2005-05-18 2014-02-19 ノバルティス アーゲー 自己免疫および／または炎症性成分を有する疾患の診断および治療のための方法
MX2007014148A (es) 2005-05-19 2008-01-11 Amgen Inc Composiciones y metodos para incrementar la estabilidad de anticuerpos.
CA2638811A1 (en) 2006-02-03 2007-08-16 Medimmune, Llc Protein formulations
EA018301B1 (ru) * 2006-04-21 2013-07-30 Новартис Аг Фармацевтические композиции, содержащие антагонистическое моноклональное антитело к cd40, и их применение

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999037329A1 (en) * 1998-01-22 1999-07-29 Astrazeneca Ab Pharmaceutical formulation comprising an antibody and a citrate buffer
WO2005044854A3 (en) * 2003-11-04 2005-08-11 Chiron Corp Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
WO2006020935A2 (en) * 2004-08-13 2006-02-23 Wyeth Stabilizing formulations

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090009204A (ko) 2009-01-22
JP5290152B2 (ja) 2013-09-18
EP2019841A2 (en) 2009-02-04
CU23856A3 (es) 2012-12-17
UA94264C2 (ru) 2011-04-26
AR060487A1 (es) 2008-06-18
JP2009534401A (ja) 2009-09-24
GEP20125628B (en) 2012-09-10
WO2007124299A2 (en) 2007-11-01
EA018301B1 (ru) 2013-07-30
US20150110783A1 (en) 2015-04-23
US20090304706A1 (en) 2009-12-10
GT200700034A (es) 2008-01-25
MA30470B1 (fr) 2009-06-01
IL194642A0 (en) 2011-08-01
TW200808349A (en) 2008-02-16
SA07280191B1 (ar) 2010-06-22
EA200802135A1 (ru) 2009-04-28
NZ571757A (en) 2012-01-12
TNSN08412A1 (en) 2010-04-14
HN2008001572A (es) 2011-06-08
NI200800284A (es) 2011-08-05
AU2007240507A1 (en) 2007-11-01
SV2008003071A (es) 2010-02-01
ECSP088903A (es) 2009-02-27
JP2013129673A (ja) 2013-07-04
MEP39508A (en) 2011-02-10
CA2649907A1 (en) 2007-11-01
SMP200800064B (it) 2009-11-06
KR101317235B1 (ko) 2013-10-15
WO2007124299A3 (en) 2008-01-03
US8945564B2 (en) 2015-02-03
AU2007240507B2 (en) 2013-07-18
CN101426817A (zh) 2009-05-06
BRPI0710826A2 (pt) 2011-08-23
CR10379A (es) 2009-01-07
NO20084796L (no) 2008-11-21
SMAP200800064A (it) 2008-11-26
WO2007124299A8 (en) 2008-11-06
MX2008013508A (es) 2008-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101426817B (zh) 拮抗性抗-cd40抗体药物组合物
CN1938045B (zh) 治疗自身免疫和炎性疾病以及器官移植排异的拮抗性抗-cd40抗体的应用
EP2406284B1 (en) Anti-bcma antibodies
JP6054129B2 (ja) Ｎｋｇ２ａに対するモノクローナル抗体
CN101325970B (zh) 抗cd40抗体的应用
RU2442606C2 (ru) Применение анти-cd40-антител
CN100475848C (zh) 抗trail-r抗体
CN1901937B (zh) 使用拮抗性抗-cd40单克隆抗体治疗多发性骨髓瘤
CN101014386A (zh) 拮抗性抗－cd40单克隆抗体及其使用方法
CN101970003A (zh) 抗cd40抗体的应用
MX2008005658A (en) Uses of anti-cd40 antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: NOVARTIS CO., LTD.

Free format text: FORMER NAME: NOVARTIS VACCINES + DIAGNOSTIC

CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Basel

Patentee after: Novartis Ag

Patentee after: Xoma Technology Ltd.

Address before: Basel

Patentee before: Novartis Vaccines & Diagnostic

Patentee before: Xoma Technology Ltd.

C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130710

Termination date: 20140417