CN101014386A - 拮抗性抗－cd40单克隆抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抑制通过C4BP与CD40结合介导的CD40导向活性的组合物和方法。本发明组合物包括具有以下特征的抗CD40抗体或其抗原结合片段：1)结合于CD40抗原时没有显著的CD40激动剂活性；和2)能够特异性结合于细胞表面上表达的CD40抗原，其中此种与CD40抗原的结合阻断了C4BP－介导的CD40信号转导，从而抑制一种或多种CD40导向活性。这些拮抗性抗CD40抗体可有效用于治疗C4BP刺激CD40信号转导介导的CD40相关疾病，包括癌症如B细胞相关性癌症和实体瘤，以及含有自身免疫和/或炎性组分的疾病或失调，包括器官和组织移植排斥。

Description

拮抗性抗-CD40单克隆抗体及其使用方法
发明领域
本发明涉及能够结合CD40细胞表面抗原，从而阻断C4BP-介导的CD40信号转导的抗体，和使用该抗体的方法，包括治疗C4BP刺激CD40表达细胞上CD40信号转导而介导的疾病的方法。
发明背景
CD40是涉及人神经生长因子(NGF)受体、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体和Fas的细胞表面抗原。首先在B淋巴细胞上发现TNF受体家族的这个成员的表达，但最近的发现证明，它在许多细胞类型上广泛表达。在造血***中，CD40表达细胞包括CD34+造血祖细胞、B细胞祖细胞、成熟的B淋巴细胞(正常和恶性)、浆细胞、单核细胞、树突细胞、eisonophil、嗜碱性细胞和一些T淋巴细胞。表达CD40的非造血细胞包括内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞。CD40也在类风湿性关节炎的滑膜、活化血小板、发炎的血管平滑肌细胞和皮肤成纤维细胞上表达。它在血管内皮细胞上的表达水平低，在局部炎症区域上调。因为其宽泛的表达模式，CD40可能通过介导T细胞和B细胞以及其它细胞类型之间的相互作用在免疫调节中起到更为综合的作用。参见例如，Kooten和Banchereau(1997)Frontiers in Biosciences 2：1-11。
配体CD40L或CD154与CD40受体结合介导的CD40信号转导的活化效果取决于所涉及的细胞类型。因此，在B细胞上激活CD40信号转导能刺激B细胞增殖和分化、抗体产生、同种型交换和B细胞记忆产生，而在树突细胞和单核细胞上活化CD40信号转导导致表达共同刺激分子和分泌炎症细胞因子(如IL-8、IL-12和TNF-α)，以有效活化T淋巴细胞。激动性(agonist)抗-CD40单克隆抗体和寡聚可溶性CD40L可刺激CD40信号传导通路(参见例如，国际公开WO 00/75348和美国专利号6,087,329)。这些信号的总作用是显著增强T-细胞初敏作用(priming)，对于表达CD40的树突细胞来说，有助于产生Th1细胞免疫应答。
补体级联反应在体内先天免疫应答中起重要作用。参见例如，William Paul(1993)Fundamental Immunology(第3版，Raven Press)，924-929页。在补体级联反应中，抗原-结合的IgG启动了一系列水解反应，最终产生能够刺穿细菌细胞膜的攻膜复合物(MAC)。C4是此通路中的重要组分。通常在血清中失活的C4可被抗原-抗体复合物中存在的C1切割。C1将C4切成C4a和C4b片段。C4a是可溶性小蛋白，用作弱过敏毒素。C4b结合于细菌细胞膜的表面，可独立地用作调理素，或可结合C3b形成经典补体结合通路的C3转化酶。产生作为靶点的结合C4b是一个低效率过程，仅5％-10％的C4b变成底物结合形式。血清调控蛋白负责清除过量C4b。
C4b结合蛋白(C4BP)是结合C4b的血清调节蛋白之一。它由肝脏细胞和活化的单核细胞合成，它是C4b和C3b的因子I-介导的代谢中的辅因子。参见例如，Dahlback和Hildebrand(1983)Biochem.J.209：857；Lappin和Whaley(1990)Biochem.J.271：767；Kusada-Funakoshi等(1991)Biochem.Med.Metab.Biol.45：350；Blom等(2001)JBiol.Chem.276：27136；Blom等(2001)J Immunol.166：6764；Blom等(2003)MoI.Immunol.399：547。在循环***中，C4BP以基于α(70kDa)和β(45kDa)链不同组合的三种同种型的形式存在。主要同种型是7个α亚基和1个β亚基的八聚体(α7β1)(Pardo-Manuel等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：4529；Kask等(2002)Biochemistry41：9348)。据报道，C4BP也能够结合CD40，体外结合B细胞上的CD40可以模拟CD40L结合的方式活化这些细胞(Brodeur等(2003)Immunity18：837)。而且，此体外活性与C4BP在不竞争性抑制CD40配体结合的分子区域中直接结合CD40蛋白的能力相关。CD40刺激是自身免疫病的关键介导因素。C4BP可直接诱导CD40信号转导，从而帮助导致自身免疫病和炎性疾病的发生和发展。C4BP也可附加或协同地与CD40配体一起起作用，加强CD40刺激并帮助导致疾病的发生和发展。因此，C4BP与CD40上C4BP结合位点的结合可将异常或不良信号转导至CD40表达细胞。
阻断CD40作用和活化可能抑制抗体和细胞介导的免疫应答。可用抗-CD40拮抗性抗体治疗自身免疫病，如***性狼疮、牛皮癣、多发性硬化、炎性肠病和类风湿性关节炎。也用这种抗体通过抑制自身免疫应答来预防器官和组织移植的排斥，通过去除由CD40提供活化信号的恶性B淋巴细胞治疗淋巴瘤，以及以特定方式将毒素递送给携带CD40的细胞。两种类型的抗-CD40拮抗性单克隆抗体可阻断CD40活化：1)阻断CD40配体介导的CD40信号转导的抗体，和2)阻断C4BP介导的CD40信号转导的抗体。由于C4BP在CD40活化途径中的推定的作用，需要干扰C4BP-介导的CD40信号转导，以便治疗与C4BP-CD40结合作用相关的疾病。
发明概述
提供了用于抑制通过C4BP与CD40结合介导的CD40-导向活性的组合物和方法，就是治疗通过此C4BP-CD40结合作用介导的CD40相关疾病的方法。本发明组合物包含具有以下特征的抗-CD40抗体，或其抗原结合片段：1)结合于CD40表达细胞上的CD40抗原时没有显著的CD40激动剂活性；和2)能够特异性结合于细胞表面上表达的CD40抗原，其中此种与CD40抗原的结合阻断了这些细胞中C4BP-介导的CD40信号转导，从而抑制一种或多种CD40-导向的活性。这些抗CD40抗体或其抗原结合片段对CD40细胞表面抗原具有强大的单位点结合亲和力。在一些实施方式中，本发明抗体与CD40的离解平衡常数(KD)至少为10-5M，至少3×10-5M，优选至少10-6M-10-7M，更优选至少10-8M-约10-12M。合适的单克隆抗体含有人恒定区；它们也优选含有完全或部分人源化的构架区；最优选完全是人抗体或其抗原结合片段。组合物也包含产生这些抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞系，以及包含这些抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
抑制CD40表达细胞的CD40导向活性的方法包括将该细胞与有效量的本发明抗CD40抗体，或有效量的它的抗原结合片段相接触。可被抑制的CD40导向活性包括但不限于：细胞生长和增殖、细胞分化、抗体产生、细胞记忆产生、同种型交换、细胞间粘着、分泌细胞因子、分泌金属蛋白酶和表达细胞粘着分子。可用本发明抗CD40抗体治疗通过C4BP活化CD40导向活性介导的CD40相关疾病，包括但不限于：癌症，包括B细胞相关性癌症和实体瘤，以及具有自身免疫和/或炎性组分的疾病或失调，包括器官和组织移植排斥。也提供了对CD40具有拮抗剂活性并在CD40表达细胞中干扰C4BP-介导的CD40信号转导的抗体的鉴定方法。
发明详述
本发明涉及抗CD40抗体和其使用方法。这些抗CD40抗体和其抗原结合片段能够特异性结合细胞表面上表达的CD40抗原，并且在结合于CD40抗原时没有显著的CD40激动剂活性。这些抗CD40抗体或其抗原结合片段与CD40表达细胞上的CD40抗原结合而有效阻断这些细胞中C4b结合蛋白(C4BP)-介导的CD40信号转导。″C4BP-介导的CD40信号转导″指当C4BP结合于在细胞表面上表达的CD40抗原时对CD40信号转导的刺激。″阻断″指部分或完全抑制通常在没有拮抗剂如本发明抗CD40抗体时由C4BP与细胞表面上表达的CD40上的C4BP结合位点结合而产生的CD40信号转导。阻断此CD40信号转导提供了部分抑制(即活性降低)或完全抑制(即阻断活性)由C4BP-介导的CD40信号转导产生的一种或多种CD40导向活性的方法。抑制这些CD40导向活性可有益地用于治疗CD40相关疾病，包括但不限于：癌症，如B细胞相关性癌症和实体瘤，以及具有自身免疫和/或炎性组分的疾病或失调，包括器官和组织移植排斥，如本文以下所述。
本发明通篇使用以下术语，下面进一步定义这些术语。
本文所用″肿瘤″指所有肿瘤细胞(无论是恶性或良性)生长和增殖，以及所有癌前细胞、癌前组织、癌细胞和癌组织。
术语″癌症″和″癌″指或描述了一般特征为细胞生长不受调节的哺乳动物生理条件。癌症的例子包括但不限于：淋巴瘤和白血病，以及实体瘤。
″抗体″和″免疫球蛋白″(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体具有抗原结合特异性，免疫球蛋白包括缺少抗原特异性的抗体和其它抗体样分子。后一种多肽是(例如)淋巴***以低水平产生和骨髓瘤以高水平产生的多肽。
术语“抗体”以最广义用时包括全装配的抗体、能结合抗原的抗体片段(例如，Fab、F(ab′)2、Fv、单链抗体、双体分子)和包含以上物质的重组肽。
本文使用的术语“单克隆抗体”指得自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能存在极少量天然发生的突变以外，构成该群的每个抗体是相同的。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白。每条轻链经共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目视不同免疫球蛋白同种型的重链而不同。每条重链和轻链也具有有规律地隔开的链内二硫桥。每条重链的一端为可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端为可变区(VL)，在另一端为恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区配对，轻链可变区与重链的可变区配对。据信，特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成相互作用界面。
术语“可变”表示以下内容：在抗体之间，可变区的某些部分在序列上差别很大，这部分是每种特定抗体用于与其特定抗原特异性结合的部分。然而，可变性不是均匀分布于整个抗体可变区中。它集中于位于轻链或重链可变区的称为互补决定区(CDR)或超变区的3个区段。可变区的较保守部分称为框架(FR)区。天然轻链和重链的可变区包含主要采取β-折叠片层构型并由3个CDR相连的4个FR区，CDR形成(有时形成部分)连接β-折叠片层结构的环。每条链中的CDR通过FR区紧密相聚，并且与另一条链的CDR紧靠在一起形成抗体的抗原结合位点(参见，Kabat等，(1991)NIH Publ.No.91-3242，第I卷，647-669页)。恒定区不直接参与抗体抗原结合，但具有各种效应器功能，如Fc受体(FcR)结合、抗体参与抗体依赖性细胞毒性、启动补体依赖性细胞毒性和肥大细胞脱粒。
术语“超变区”指负责结合抗原的抗体氨基酸残基。超变区包括“互补决定区”的氨基酸残基(即轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of proteins of Immunological Interest)(第5版，Public HealthService，National Institute of Health，Bethesda，MD)和/或“超变环”的氨基酸残基(即，轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J. Mol.Biol.196：901)。“框架”或“FR”残基是除超变区残基以外的可变区残基。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体分子；线性抗体(Zapata等，(1995)Protein Eng 10：1057)；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性(multispecific)抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段(每种具有一个抗原结合位点)与一残留的“Fc”片段(其名字反映它易于结晶)。胃蛋白酶处理得到能够交联抗原的具有两个抗原结合位点的F(ab′)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv抗体中，该区由紧密的非共价缔合的一条重链可变区和一条轻链可变区的二聚体组成。在单链Fv抗体中，一条重链可变区和一条轻链可变区经可弯曲的肽接头共价相连从而使轻链和重链缔合成类似于双链Fv抗体中的“二聚体”结构。每个可变区的3个CDR正是在这种构型中相互作用而确定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR共同赋予了该抗体的抗原结合特异性。然而，即使一个可变区(或仅含有3个抗原特异性CDR的半个Fv)也能识别并结合抗原，虽然亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段也含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)。Fab片段因在重链CH1结构域的羧基末端多几个残基(包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸残基)而不同于Fab’片段。本文称为Fab′-SH的是其恒定区半胱氨酸残基带有一个游离巯基的Fab′。F(ab′)2抗体片段最初制备为之间具有绞链半胱氨酸的成对Fab′片段。抗体片段的其它化学偶联反应也是已知的。
任何脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可分为两种类型，这两种类型根据它们恒定区的氨基酸序列称为kappa(κ)和lambda(λ)。
免疫球蛋白可依它们重链恒定结构域的氨基酸序列包括不同类型。人免疫球蛋白主要有5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，在人类中，这些类型可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是熟知的。不同的同种型具有不同的效应器功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
本文所用的“标记”指直接或间接与抗体偶联而产生“标记”抗体的化合物或组合物。标记本身可检测(如放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，可催化可检测的底物化合物或组合物化学转变。可用作可检测标记的放射性核素包括例如：I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。标记也可以是不可检测的实体如毒素。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括能部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的靶蛋白分子的生物活性或其转录或翻译的任何分子。拮抗性抗体是结合于细胞相关抗原但不给细胞转导信号的抗体。信号可包括导致细胞状态改变的任何生化反应，包括诱导增殖和/或存活、诱导凋亡、诱导其它蛋白的磷酸化、诱导钙储存释放和诱导细胞因子分泌。
本文所用的“载体”包括当其以所用剂量和浓度与细胞或哺乳动物接触时没有毒性的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的例子包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如吐温、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克。“联合”一种或多种其它治疗性药物给药包括同步(同时)和以任何顺序连续给药。
本文所用的术语“宿主细胞”指以单核实体培养的微生物或真核细胞或细胞系，它们可以是或已用作重组载体或其它转移多核苷酸的受者，并且包括受转染原始细胞的后代。应理解，由于天然的、偶发的或设计的突变，一个细胞的后代在形态或基因组或总DNA互补性上无需和原始的亲代完全相同。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。这些细胞优选至少表达FcγRIII并行使依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。具有ADCC活性的抗体通常是IgG1或IgG3同种型。除了分离得到IgG1和IgG3抗体以外，ADCC介导性抗体可通过将非ADCC抗体的可变区或可变区片段工程改造为IgG1或IgG3同种型的恒定区来合成。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述能结合抗体Fc区域的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR可结合IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体或者交替剪接形式。FcγRII受体包括具有相似氨基酸序列、主要在于胞质结构域不同的FcγIIA(“活化受体”)和FcγIIB(“抑制性受体”)。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15：203)。FcR综述见Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9：457；Capel等，(1994)Immunomethods 4：25和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126：330。本文的术语“FcR”包括其它FcR，包括将来鉴定到的FcR。该术语也包括将成熟IgG转移至胎儿的新生受体，FcRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117：587和Kim等，(1994)J.Immunol.24：249)。
合成人抗体的方法很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌细胞永生化。然而，EBV-感染的细胞难于克隆并且通常得到的免疫球蛋白产量较低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 100：5)。最后，可能通过引入转化基因的有限组合来实现人B细胞的永生化。近来的发现增加了这种可能性，此发现即端粒酶催化性亚基连同SV40大癌蛋白以及H-ras的癌等位基因一起表达可导致正常人上皮细胞和成纤维细胞的致癌性转变(Hahn等，(1999)Nature 400：464)。转基因动物(如小鼠)经过免疫后，在不产生内源性免疫球蛋白的情况下能产生全套人抗体(Jakobovits等，(1993)Nature 362：255；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13：65；Fishwild等，(1996)Nat.Biotechnol.14：845；Mendez等，(1997)Nat.Genet.15：146；Green(1999)J.Immunol.Methods 231：11；Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727；综述见Little等，(2000)Immunol.Today 21：364)。例如，已有描述，嵌合型和种系突变小鼠的抗体重链连接区(JH)基因的纯合子消除可完全抑制内源性抗体的产生(Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551)。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这种种系突变小鼠导致在抗原刺激后产生人抗体(Jakobovits等，(1993)Nature362：255)。Mendez等，(1997)(Nature Genetics15：146)，产生用抗原刺激时产生高亲和力完全人抗体的转基因小鼠。这通过将兆碱基的人重链和轻链基因座通过种系整合入删除了上述内源性JH区段的小鼠来实现。这些小鼠(XenoMouseIItechnology(Abgenix；Fremont，California))具有1,020kb的人重链基因座和800kb的人κ基因座，其中人重链基因座含有约66个VH基因、完全的DH和JH区域，以及3个不同的恒定区，人κ基因座含有32个Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。这些小鼠中产生的抗体在各方面，包括基因重排、装配和所有成分方面极其类似于在人中观察到的抗体。由于删除了内源性片段从而防止了鼠基因座中的基因重排，这些人抗体压倒内源性抗体而优先表达。这种小鼠可用特别感兴趣的抗原免疫。
可筛选这种免疫动物血清对感兴趣抗原的抗体反应性。可从淋巴节或脾细胞分离淋巴细胞，选择CD138-阴性和CD19-阳性淋巴细胞来选择B细胞。一方面，可将这种B细胞培养物(BCC)与骨髓瘤细胞融合以产生上述杂交瘤。
在另一方面，宜进一步筛选这种B细胞培养物对原先(接种)抗原的反应性。这种筛选包括用靶/抗原蛋白质的ELISA、用能与感兴趣抗原结合的已知抗体进行竞争性试验和与瞬时感染的表达该靶抗原的CHO或其它细胞的体外结合试验。
以下更详细地描述本发明抗CD40抗体和其使用方法。
拮抗性抗CD40抗体
本发明抗CD40抗体和其抗原结合片段优选具有对CD40的拮抗剂活性，因此在本文中称为″拮抗性″抗CD40抗体。更具体说，本发明拮抗性抗CD40抗体特异性结合于CD40表达细胞表面上的CD40抗原，这种结合阻断了C4BP-介导的CD40信号转导。阻断此信号转导通路导致抑制激动剂如C4BP结合于CD40细胞表面抗原时启动的一种或多种CD40导向活性。
“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”指属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的跨膜糖蛋白(参见，例如美国专利号5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等，(1989)EMBO8：1403；Clark(1990)Tissue Antigens36：33；Barclay等，(1997)《白血球抗原手册》(The Leucocyte Antigen Facts Book)(第二版；AcademicPress，San Diego))。已鉴定到该基因交替剪接转录变体编码的人CD40的两种同种型。第一种同种型(也称为“长同种型”或“同种型1”)表达为具有由前19个残基代表的信号序列的277个氨基酸的前体多肽(首次报道为GenBank登录号CAA43045，鉴定为同种型1，GenBank登录号NP_001241，由GenBank登录号X60592和NM_001250编码)。第二种同种型(也称为“短同种型”或“同种型2”)表达为也具有由前19个残基表示的信号序列的203个氨基酸的前体多肽(GenBank登录号NP_690593；由GenBank登录号NM_152854编码)。人CD40的这两种同种型的前体多肽的前165个残基相同。短同种型的前体多肽由缺少编码区段，导致翻译移码的转录物变体编码；与CD40长同种型所含的C末端(GeneBank登录号NP_001241和GeneBank登录号CAA43045的残基166-277所示的C末端)相比，得到的CD40同种型含有较短且不同的C-末端(GeneBank登录号NP_690593的残基166-203)。对于本发明的目的，术语“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”、“CD40受体”或“CD40”包括CD40的短和长同种型。
如本文别处所述，CD40受体展示在各种类型细胞的表面。“展示于表面”和“表达于表面”指CD40抗原的全部或一部分暴露在细胞的外部。展示的或表达的CD40抗原可完全或部分糖基化。
″C4b结合蛋白″或″C4BP″指至少包括一部分α亚基(GenBank登录号NP_000706，由GenBank登录号NM_000715编码；Kask等(2002)Biochemistry 41：9349)或一部分β亚基(GenBank登录号NP_000707，由GenBank登录号NM_000716编码；Webb等(2003)Eur.J.Biochem.270：93)的可溶性肽或其片段。本文所用术语″C4BP″可包括单独的α或β亚基或者包含这些亚基的更大的异聚体，如三个血清同种型：α7β1(血清中主要的同种型)、α7β0和α6β1。″CD40上的C4BP结合位点″指任何C4BP亚基的任何部分能结合的CD40抗原区域。参见例如，Brodeur等(2003)Immunity18：837，全文纳入本文作参考。结合位点可包括CD40上的线性决定簇，或者它可包含不连续氨基酸形成的结合结构域，其中不连续氨基酸通过二级或三级构象、或其组合来形成C4BP结合位点。在一些情况下，C4BP结合位点仅与C4BPα亚基相互作用。
当C4BP结合于CD40表达细胞上的CD40抗原时，它用作CD40信号转导的激动剂，因此据说具有CD40激动剂活性。“激动剂活性”指该物质能发挥激动剂的作用。激动剂结合细胞上的受体，并引起与该受体的天然配体(如CD40的天然配体CD40L)所引起的类似或相同的反应或活性。CD40激动剂如C4BP可诱导但不限于在CD40转导信号时发生的以下任何或所有活性：抗原递呈细胞(APC)增殖和/或分化；B细胞抗体产生；胞间粘着；B细胞记忆产生；B细胞同种型转换(尤其是在IL-4存在下IgE同种型转化)；上调APC中II型MHC、CD54、CD95和CD80/86的细胞表面表达；上调bcl-XL、A20、二酰甘油激酶α、p38和c-myc基因表达；NFκB的核易位；分泌细胞因子如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNFα；分泌金属蛋白酶如MMP-I/胶原酶和MMP-9/明胶酶B；以及表达细胞粘着分子如E-选择蛋白、VCAM-1和ICAM-1。出于本发明目的，这些活性称为“CD40导向活性”，通过C4BP结合于CD40上它的结合位点而诱导这种活性称为″C4BP-介导的CD40信号转导″。
本发明抗CD40抗体和其抗原结合片段对它们与CD40的结合作用有拮抗剂活性。此拮抗剂活性来源于抗CD40抗体能够在其结合于CD40时阻断C4BP-介导的CD40信号转导或通过CD40发出负调节信号。″拮抗剂活性″指该物质能用作拮抗剂。本发明拮抗性抗CD40抗体防止或降低由于CD40受体与激动性配体(具体是C4BP)结合而诱导的任何一种或多种CD40导向活性的诱导。本发明拮抗性抗CD40抗体可将对C4BP与CD40结合诱导的一种或多种CD40导向活性的诱导降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％，优选40％、45％、50％、55％、60％，更优选70％、80％、85％，最优选90％、95％、99％或100％。本领域技术人员已知测定抗CD40抗体和C4BP结合特异性和拮抗剂活性的方法，包括但不限于：标准竞争结合试验、树突细胞诱导T细胞增殖的试验、监测B细胞分泌的免疫球蛋白的试验、B细胞增殖试验、Banchereau样B细胞增殖试验、T辅助细胞产生抗体的试验、共同刺激B细胞增殖试验和上调APC活化标记的试验。参见例如，这种试验公开于Brodeur等(2003)Immunity 18：837，WO 00/75348和美国专利号6,087,329，纳入本文作为参考。在一些实施方式中，结合展示在人细胞表面上的CD40阻断C4BP-介导的CD40信号转导，导致抑制这些人细胞的增殖和分化。因此，本发明拮抗性抗CD40抗体包括对表达细胞表面CD40抗原的人正常细胞或肿瘤细胞具有拮抗剂活性的抗体。
通过阻断C4BP-介导的CD40信号转导，例如，竞争性或空间性干扰C4BP与CD40上它的结合位点的结合，证明了本发明抗CD40抗体的拮抗剂活性。“竞争性抑制”指抗CD40抗体或其抗原结合片段与天然可溶性C4BP结合CD40上相同的C4BP结合位点或至少其一部分，从而抑制C4BP与CD40上它的结合位点结合。“空间性抑制”或“空间抑制”指抗CD40抗体或其抗原结合片段结合于或至少部分结合于CD40上的C4BP结合位点以外，其中该抗体仍能通过空间干扰或破坏CD40上C4BP结合位点的结构或其组合来抑制C4BP或其片段结合于CD40。在一些实施方式中，拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段与CD40抗原的结合阻断了C4BP连接于CD40抗原时产生的CD40信号转导。本领域技术人员可用本领域熟知的标准方法确定抗体是否竞争性或空间性干扰了C4BP与CD40的结合，或阻断了C4BP结合于CD40上它的结合位点后进行的CD40信号转导。
当本发明拮抗性抗CD40抗体结合CD40表达细胞(如人正常和致瘤性B细胞以及人树突细胞)表面上展示的CD40时，抗体结合于CD40时没有显著的激动剂活性。″显著的″激动剂活性指在CD40表达细胞应答试验中所检测的激动剂活性比中性物质或阴性对照诱导的高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。“显著的”激动剂活性优选在B细胞应答试验中检测到的激动剂活性比中性物质或阴性对照诱导的高至少2倍或3倍。因此，例如当感兴趣的B细胞应答是B细胞增殖时，“显著的”激动剂活性指诱导的B细胞增殖水平比中性物质或阴性对照诱导的B细胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一个实施方案中，不结合CD40的非特异性免疫球蛋白，例如IgG1作为阴性对照。“无明显激动剂活性”的物质显示激动剂活性不高于中性物质或阴性对照诱导的激动剂活性约25％，优选不高约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或甚至不高约0.1％。出于本发明目的，用B细胞应答试验测定本发明抗CD40抗体的激动剂活性。本领域熟知这种试验，包括但不限于：监测B细胞分泌的免疫球蛋白的试验、B细胞增殖试验、Banchereau样B细胞增殖试验、共同刺激B细胞增殖试验。参见例如，这种试验公开于Brodeur等(2003)Immunity 18：837，WO 00/75348和美国专利号6,087,329，纳入本文作为参考。在本发明的一个实施方式中，拮抗性抗CD40抗体在一种B细胞应答中没有显著的激动剂活性。在本发明的另一实施方式中，拮抗性抗CD40抗体在一种以上B细胞应答试验(如增殖和分化，或增殖、分化和抗体产生)中没有显著的激动剂活性。
在一些实施方式中，本发明拮抗性抗CD40抗体是杂交瘤细胞系产生的IgG1同种型的完全人抗-CD40单克隆抗体。用来自免疫小鼠，包括用XenoMouse技术(Abgenix；Fremont，Califomia)获得的小鼠(参见例如美国专利号6,075,181和PCT国际公开号WO 94/02602)的脾细胞产生这些细胞系。将脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(Sierra BioSource)融合。将得到的杂交瘤亚克隆数次，建立单克隆细胞系。类似地，可用带有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠或用本领域已知和/或本文所述的其它方法制备本发明其它抗体。本发明的人抗-CD40单克隆抗体特异性结合CD40，例如人CD40，但它们也特异性结合于含有人抗CD40抗体识别的表位的非人序列。
在其它实施方式中，可用(例如)美国专利号5,766,886或美国专利号6,180,370所述方法使CD40人源化。此外，可用C4BP筛选人抗体的噬菌体展示文库，以鉴定具有本文所述结合特征的抗CD40抗体。
除了拮抗剂活性以外，一些本发明抗CD40抗体具有另外的作用机制，例如，具有抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体。或者，可在具有ADCC活性的另一种抗体同种型上表达抗CD40抗体的可变区。也可能将抗CD40抗体的天然形式、重组形式或抗原结合片段偶联于细胞毒性毒剂。这种拮抗性抗CD40抗体可用于靶向(例如)表达CD40的肿瘤细胞，如恶性B细胞或实体瘤中表达CD40的肿瘤细胞。
在一些实施方式中，本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在ELISA-类型的试验中结合可溶性CD40；在其它实施方式中，抗体或其抗原结合片段抑制C4BP与细胞表面CD40的结合，从而取代了预先结合的C4BP，如流式细胞术所测定。用于本发明方法的合适的拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段对CD40细胞表面抗原具有强大的单位点结合亲和力。在一些实施方式中，用标准试验如BiacoreTM测定，本发明抗体与CD40的离解平衡常数(KD)至少为10-5M，至少3×10-5M，优选至少10-6M-10-7M，更优选至少10-8M-约10-12M。本领域已知Biacore分析，BIAapplicationsHandbook中提供了详情。可用WO 01/27160所述方法调节结合亲和力。
产生拮抗性抗CD40抗体
本发明拮抗性抗CD40抗体包括特异性识别CD40细胞表面抗原的抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体和保留亲本抗CD40抗体的抗原结合功能的它们的片段，如Fab、F(ab′)2、Fv和其它片段。本发明方法尤其感兴趣的是结合于CD40时能阻断C4BP-介导的CD40细胞信号转导并且没有显著的激动剂活性的抗CD40抗体。可用本领域已知的抗体生产方法产生这些抗体，包括能阻断C4BP-介导的CD40信号转导并且是重组产生的拮抗性抗CD40抗体和其抗原结合片段。
可用常规方法制备多克隆血清。通常，首先用含有CD40抗原的溶液免疫合适的动物，优选小鼠、大鼠、兔或山羊。由于可获得的血清体积大以及标记的抗兔和抗山羊抗体的可用性，兔或山羊优选用于制备多克隆血清。
可在转基因动物，优选携带人免疫球蛋白基因座的小鼠中制备多克隆血清。在一优选的实施方案中，表达CD40的SF9细胞用作免疫原。也可用盐水，优选用完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，经胃肠外(通常是皮下或肌肉内)注射该混合物或乳剂来免疫。每次注射50-200μg的剂量一般足够。通常在2-6周后注射用盐水配制，优选用不完全弗氏佐剂配制的蛋白质加强免疫一次或多次。或者可用本领域已知的方法体外免疫产生抗体，就本发明目的而言体外与体内免疫等效。将免疫动物的血液放入玻璃或塑料容器25℃孵育该血液1小时，然后4℃孵育2-18小时获得多克隆抗血清。离心(例如，1,000×g10分钟)回收血清。每次放血可自家兔获得约20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞的制备方法见纳入本文作为参考的美国专利号6,004,552中所述。简言之，将编码人CD40的序列用转移载体重组入杆状病毒。将质粒与野生型杆状病毒DNA共同转染入Sf9细胞。鉴定重组杆状病毒感染的Sf9细胞并克隆纯化。
优选的抗体性质上是单克隆抗体。“单克隆抗体”指得自基本上均质抗体群的抗体，即除了存在极少量天然发生的突变以外，组成该群的每个抗体是相同的。该术语不受限于抗体的种类或来源。该术语包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了抗体结合功能的其它片段。单克隆抗体是高度特异性的，针对一个的抗原性位点，即在本发明中为CD40细胞表面抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上一个决定簇。修修词“单克隆的”表示得自基本上均质的抗体群的抗体特性，不可理解为需要通过任何具体方法产生该抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过Kohler等，(1975)Nature 256：495首次描述的杂交瘤方法或重组DNA方法制备(参见，例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可用，例如Clackson等，(1991)Nature 352：624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；和美国专利号5,514,548中所述技术自噬菌体抗体文库分离得到。
“表位”指抗原性分子中能诱导产生抗体并结合该抗体的那一部分。表位可含有线性氨基酸残基(即，表位内的残基以线性方式一个接一个顺序排列)，非线性氨基酸残基(本文称为“非线性表位”；这些表位非顺序排列)或线性与非线性氨基酸残基。
可使用Kohler等，(1975)Nature 256：495-496所述方法或其改进形式制备单克隆抗体。通常用含抗原的溶液免疫小鼠。可用盐水，优选用完全弗氏佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，经胃肠外注射混合物或乳剂来免疫。可用本领域已知的任何免疫方法来获得本发明的单克隆抗体。免疫动物后，取出脾脏(任选取出几个大的***)解离成为单个细胞。使细胞混悬液涂布于包被有感兴趣抗原的板或孔来筛选脾细胞。表达抗原特异性膜结合免疫球蛋白的B细胞与板结合而不被洗掉。然后诱导得到的B细胞或所有分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，用选择性培养基培养。接种得到的细胞系列稀释液并测定能特异性结合感兴趣抗原的抗体(和不结合无关抗原的抗体)的产生。然后将分泌单克隆抗体(mAb)的选出的杂交瘤在体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(作为小鼠的腹水)培养。
当用重组DNA方法制备本发明的拮抗性抗-CD40抗体时(即重组产生的拮抗性抗-CD40抗体)，使用常规方法(例如，用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)不难分离得到并测序编码单克隆抗体的DNA。本文所述的杂交瘤细胞是这种DNA的优选来源。一旦分离后，可将此DNA置于表达载体中，然后将载体转染入本身不产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如大肠杆菌、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中从而获得在该重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述性文章包括Skerra等，(1993)Curr.Opinionin Immunol.5：256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130：151。
或者，如纳入本文作为参考的美国专利号5,545,403；5,545,405和5,998,144中所公开的，可在细胞系，例如CHO细胞系中制备抗体。简言之，用能表达轻链和重链的载体分别转染该细胞系。嵌合性抗体可通过转染不同载体上的两种蛋白质来制备。另一优点是该抗体正确糖基化。在另一实施方案中，可用GS基因表达***(LonzaBiologies，Portsmouth，New Hampshire)在CHO细胞中制备拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段，所述表达***使用谷氨酰胺合成酶作为标记。也参见其内容全文纳入本文作为参考的美国专利号5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216。
本领域已知CD40的单克隆抗体。参见例如，以下文献中有关B-细胞抗原的章节，McMichael编，(1987；1989)《白细胞分型III和IV》(Leukocyte Typing III and IV)(牛津大学出版社，纽约)；美国专利号5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；国际公开号WO 00/63395、WO 02/28905和WO 02/28904；美国专利申请公开号US2002/0142358 A1和2003/0059427；2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的题为″拮抗性抗-CD40单克隆抗体和其使用方法″(AntagonistAnti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use)的临时申请中公开的拮抗性抗CD40抗体，以及转让的美国专利申请号60/517,337(代理案卷号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理案卷号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理案卷号PP20107.003(035784/277214))，2004年11月4日提交的题为″拮抗性抗-CD40单克隆抗体和其使用方法″的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916))；Gordon等(1988)J.Immunol.140：1425；Valle等(1989)Eur.J.Immunol.19：1463；Clark等(1986)PNAS83：4494；Paulie等(1989)J.Immunol.142：590；Gordon等(1987)Eur.J.Immunol.17：1535；Jabara等(1990)J.Exp.Med.172：1861；Zhang等(1991)J.Immunol.146：1836；Gascan等(1991)J Immunol.147：8；Banchereau等(1991)Clin.Immunol.Spectrum3：8；和Banchereau等(1991)Science251：70；将所有上述文献纳入本文作参考。本发明尤其感兴趣的是本文公开的结合在CD40上C4BP结合位点上或其附近，从而阻断CD40-介导的CD40信号转导的拮抗性抗CD40抗体，其阻断CD40信号转导的机制可能是拮抗性抗CD40抗体能够竞争性和空间性抑制C4BP与C4BP上它的结合位点结合或者它们能够通过C4BP与CD40上它的结合位点结合而阻断CD40信号转导。
本文所用″CD40-抗原表位″指除了CD40抗原本身以外，能够与本发明抗CD40单克隆抗体发生免疫反应的分子。CD40-抗原表位可包括蛋白、蛋白片段、肽、糖、脂质和其它分子，但出于本发明目的，最常用的是蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(即模拟CD40抗原的抗体结合特性的有机物)或其组合。合适的寡肽参见PCT申请US91/04282等。
此外，本发明拮抗性抗CD40抗体包括嵌合抗CD40抗体和人源化抗CD40抗体；本发明的嵌合抗CD40抗体和人源化抗CD40抗体结合于CD40上的C4BP结合位点上或其附近，从而阻断C4BP-介导的CD40信号转导。″嵌合″抗体指最优选用重组脱氧核糖核酸技术获得并且包含人(包括免疫″相关性″物种如黑猩猩)和非人组分的抗体。因此，嵌合抗体的恒定区最优选与天然人抗体的恒定区基本相同；嵌合抗体的可变区最优选获自非人来源，并具有对CD40细胞表面抗原的所需抗原特异性。非人来源可以是可用于产生针对人CD40细胞表面抗原或包含人CD40细胞表面抗原的物质的抗体的任何脊椎动物来源。这种非人来源包括但不限于：啮齿类(如兔、大鼠、小鼠等；参见例如，美国专利号4,816,567，纳入本文作参考)和非人灵长类(如旧大陆猴(Old World Monkey)、猿等；参见例如，美国专利号5,750,105和5,756,096；纳入本文作参考)。利妥昔是具有鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体的例子。提到嵌合抗CD40抗体时，本文所用术语“免疫活性”指结合CD40、具体是人CD40的嵌合抗体。
“人源化”指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗-CD40抗体形式。就大部分序列而言，人源化抗体指其中受者的超变区残基(也称为互补决定区或CDR)被非人种类(供体抗体)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的超变区残基取代的，具有所需特异性、亲和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗体)。短语“互补决定区”指共同确定了天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。参见，例如Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Kabat等，(1991)美国健康与人类服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，NIH公布号91-3242)。短语“恒定区”指抗体分子中赋予效应器功能的那部分。在以前涉及产生用于治疗人疾病的无免疫原性抗体的研究中，小鼠恒定区被人恒定区取代。所述人源化抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。然而，这些人源化抗体仍能在人中引发有害且可能危险的免疫应答并且丧失了亲和力。用于本发明方法的人源化抗-CD40抗体具有类似于本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12单克隆抗体所显示的结合特性。本发明的人源化抗CD40抗体也特异性结合CD40，从而阻断或抑制C4BP-介导的CD40信号转导。
人源化基本上可根据Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等，(1988)Science 239：1534-1536)的方法通过用啮齿类或突变型啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。也参见纳入本文作为参考的美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一个或多个可变区的框架区内的残基为对应的非人残基所取代(参见，例如美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗体可含有在受者抗体或供体抗体中没发现的残基。制备这些修饰物可进一步精制抗体的性能(例如，获得所需的亲和力)。总体上，人源化抗体基本上含有所有可变区、至少一个，通常两个可变区，其中所有或基本上所有的超变区是对应的非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架区是对应的人免疫球蛋白序列。人源化抗体也任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多的细节见引作参考的Jones等，(1986)Nature331：522-525；Riechmann等，(1988)Nature332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。因此，这种“人源化”抗体可包括其中基本上小于完整的人可变区被非人种类的相应序列取代的抗体。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。参见，例如美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370，和国际公布号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和产生对预定抗原具有改进亲和力的人源化抗体的技术。
本发明抗-CD40抗体也包括非人哺乳动物宿主，更具体说是以灭活的内源性免疫球蛋白(Ig)基因座为特征的转基因小鼠产生的异种或修饰的抗-CD40抗体。在这种转基因动物中，使得表达宿主免疫球蛋白轻链和重链的活性内源性基因无功能，并用同类人免疫球蛋白基因座取代。这些转基因动物产生基本上无宿主免疫球蛋白轻或重链亚基的人抗体。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号5,877,397和5,939,598。因此，这种抗体是完全人抗CD40抗体。
针对CD40的完全人抗体优选通过免疫转基因小鼠获得。这种小鼠可用XenoMouse技术(Abgenix；Fremont，California)获得并公开于纳入本文作为参考的美国专利号6,075,181；6,091,001和6,114,598中。因此，例如，在一个实施方式中，可通过用表达人CD40的Sf9细胞免疫具有人IgG1重链基因座和人κ轻链基因座的转基因小鼠，产生本文公开的人拮抗性抗CD40抗体。小鼠也可以是其它同种型的转基因动物。本发明的完全人拮抗性抗-CD40抗体的特征也是结合于CD40上C4BP结合位点上或其附近，从而阻断C4BP-介导的CD40信号转导。
本发明拮抗性抗CD40抗体的片段适合用于本发明方法，只要它们保持相应的全长拮抗性抗CD40抗体的所需亲和力，并且特征是特性类似于相应的全长拮抗性抗CD40抗体。即，该片段将特异性结合细胞表面上表达的CD40抗原(例如人细胞表面上的人CD40抗原)，并且在结合于CD40抗原时没有显著的激动剂活性，但具有拮抗剂活性。因此，此片段与CD40表达细胞上的CD40结合能阻断C4BP-介导的CD40信号转导，从而抑制一种或多种CD40导向活性。本文将此片段称为″抗原结合″片段，适用于本发明中的任何方法。
抗体的合适抗原结合片段包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括但不限于：Fab、F(ab′)2和Fv片段以及单链抗体分子。“Fab”指由轻链或重链的一部分组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。F(ab′)2指含有两条轻链和两条重链的一部分的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”抗体片段指含有抗体的VH和VL结构域的片段，其中这些结构域以一条多肽链的形式存在。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL结构域之间还含有一多肽接头使sFv形成能与抗原结合所需的结构。sFv的综述见Pluckthun(1994)《单克隆抗体的药理学》(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，NewYork)，269-315页。如下文所述，本文公开的拮抗性抗-CD40抗体的抗原结合片段也可与细胞毒素偶连以起杀伤靶细胞(如靶癌细胞)的作用。
可利用例如McCafferty等，(1990)Nature348：552-554(1990)和美国专利号5,5 14,548中描述的技术从抗体噬菌体文库分离得到抗体或抗体片段。Clackson等，(1991)Nature352：624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Bird.222：581-597分别描述了利用噬菌体文库分离得到鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过构建非常大的噬菌体文库方案的链改组(Marks等，(1992)Bio/Technology10：779-783)以及组合感染和体内重组来产生高亲和力(nM范围)人抗体(Waterhouse等，(1993)Nucleic.Acids Res.21：2265-2266)。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
已开发了各种技术来制备抗体片段。这些片段通过使完整抗体蛋白水解消化而获得(参见，例如Morimoto等，(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods24：107-117(1992)和Brennan等，(1985)Science 229：81)。然而，现在这些片段可通过重组宿主细胞直接制备。例如，可从上述噬菌体文库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，(1992)Bio/Technology 10：163-167)。根据另一方法，可从重组宿主细胞培养物直接分离得到F(ab′)2片段。其它制备抗体片段的技术是技术人员熟知的。
本发明方法所用的拮抗性抗-CD40抗体包括本文上述抗CD40单克隆抗体以及与这些抗体不同但保留了CDR的抗体；具有一个或多个氨基酸添加、删除或取代的抗体，其中可通过该抗体阻断C4BP-介导的CD40信号转导、从而抑制一种或多种CD40-导向活性的能力来测定其拮抗剂活性。本发明也包括脱免疫的(de-immunized)拮抗性抗-CD40抗体，该抗体可按纳入本文作为参考的国际公布号WO 98/52976和WO 0034317所述制备。本发明的拮抗性抗-CD40抗体内的残基以该方式修饰而使得这些抗体对人无免疫原性或免疫原性较低，但却保留了对人CD40表达细胞的拮抗活性，具体是能够阻断C4BP-介导的CD40信号转导、导致抑制了一种或多种CD40-导向活性，所述活性可用本文其它部分所述试验测定。权利要求的范围也包括含有本发明拮抗性抗-CD40抗体或其片段的融合蛋白，如本领域所知，所述融合蛋白可合成或从相应的多核苷酸载体表达。参考下述抗体偶联法来描述这类融合蛋白。
本发明的抗体可具有用例如纳入本文作为参考的专利公布号EP0983303A1、WO 00/34317和WO 98/52976中所述方法产生的序列变异。例如，CDR中的序列显示可导致抗体与II型MHC结合并引发有害的辅助性T细胞应答。保守取代可使得该抗体保留结合活性而丧失其引发有害T细胞应答的能力。可用本领域已知，例如本文其它部分所述的方法进行任何这种保守或非保守取代，得到的抗体属于本发明的范围。用本文所述方法常规测试变体抗体的拮抗活性、亲和力和特异性。
如果用上述方法或本文未公开的任何其它方法产生的抗体与CD40抗原的结合阻断了C4BP-介导的CD40信号转导，那么该抗体属于本发明范围。该抗体可通过以下方式阻断C4BP-介导的CD40信号转导，所述方式包括但不限于：通过空间抑制C4BP与CD40上它的结合位点结合来防止C4BP结合，通过竞争CD40上C4BP结合位点的至少一部分来竞争性抑制C4BP结合，当C4BP连接于细胞表面CD40时阻断CD40信号转导。因此，本发明拮抗性抗CD40抗体可抑制通过C4BP与CD40上它的结合位点结合而诱导的一种或多种CD40导向活性，包括但不限于：本文公开的CD40导向活性，例如，T细胞刺激的正常人外周血B细胞分泌免疫球蛋白；Jurkat T细胞刺激的正常人外周血B细胞的存活和/或增殖；表达C4BP的细胞或可溶性C4BP刺激的正常人外周血B细胞的存活和/或增殖；可溶性C4BP或固相C4BP刺激的任何细胞中的″存活″抗凋亡胞内信号；与可溶性C4BP或固相C4BP连接后任何细胞中的CD40信号转导；以及如下所述人恶性B细胞增殖。可如本文实施例所述进行测定拮抗性抗CD40抗体抑制这些CD40导向活性的能力的试验。也参见纳入本文作为参考的Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：8200；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.2：6-15；Evans等(2000)J Immunol.164：688；Noelle(1998)Agents ActionsSuppl.49：17-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.3：11；Coligan等，(1991)Current Protocols in Immunology13：12；Kwekkeboom等(1993)Immunology79：439；和美国专利号5,674,492和5,847,082所述试验。
对特异性结合于CD40-抗原和以本文所述的方式阻断C4BP-介导的CD40信号转导的拮抗性抗-CD40抗体进行检测的代表性试验是“竞争性结合试验”。竞争性结合试验是通过未知物抑制标记的已知配体(如C4BP)和其特异性受体(如CD40)结合的能力来检测和定量未知物的血清学试验。也称为竞争性抑制试验。在代表性的竞争性结合试验中，标记的CD40多肽被样品中的候选抗体沉淀，例如与针对本发明抗体的一种或多种表位而产生的单克隆抗体结合而沉淀。可通过筛选针对CD40蛋白或含有感兴趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制备的一系列抗体来鉴定能与感兴趣表位特异性结合的抗-CD40抗体。例如，就人CD40而言，感兴趣的表位包括含有以下同种型的线性和/或非线性氨基酸残基的表位：人CD40的短同种型(参见GenBank登录号NP_690593，由GenBank登录号NM_152854编码)，或人CD40的长同种型(参见GenBank登录号CAA43045和NP_001241，由GenBank登录号X60592和NM_001250编码)。或者，可用以前鉴定的合适的拮抗性抗-CD40抗体进行竞争性结合试验来选择与以前鉴定的抗体相当的单克隆抗体。
这种免疫试验采用的抗体可以是标记的或未标记的。未标记的抗体可用于凝结试验或ELISA；采用各种各样标记物的标记抗体可用于各种试验。通过使抗体与可检测物质连接有助于检测抗-CD40抗体与感兴趣表位之间形成的抗体-抗原复合物。合适的检测方式包括使用例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等标记。合适的酶的例子包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物例子包括：链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。这种标记的试剂可用于各种熟知的试验，例如放射性免疫试验，酶免疫试验如ELISA、荧光免疫试验等。参见，例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
可将任何前述的拮抗性抗-CD40抗体或它们的抗原结合片段偶联然后用于本发明方法。制备偶联抗体的方法是本领域已知的。因此，可用间接标记或间接标记方法来标记抗-CD40抗体。“间接标记”或“间接标记方法”指将螯合剂共价偶联于抗体并且将至少一种放射性核素***该螯合剂中。例如，参见纳入本文作为参考的Srivagtava和Mease，(1991)Nucl.Med.Bio.18：589-603中所述的螯合剂和放射性核素。合适的标记包括荧光基团、生色团、放射性原子(特别是32P和125I)、电子密集试剂(electron-dense reagent)、酶和具有特异性结合伴侣(partner)的配体。一般通过其活性来检测酶。例如，常通过将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变为可用分光光度计定量的蓝色色素的能力来检测辣根过氧化物酶。“特异性结合伴侣”指能以高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原和其特异性单克隆抗体。其它特异性结合伴侣包括生物素和亲和素或链霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本领域已知的许多受体-配体对。因为相同的标记可以几种不同模式使用，以上描述应该理解为不是要将各种标记归为截然不同的种类。例如，125I可用作放射性标记或作为电子密集试剂。辣根过氧化物酶(HRP)可用作酶或单克隆抗体的抗原。此外，可为所需的作用组合各种标记。例如，单克隆抗体与亲和素在实施本发明中也需要标记：因此，可用生物素标记单克隆抗体，然后用标记125I的亲和素或用标记HRP的抗-生物素单克隆抗体检测其存在。其它预先(制备)的突变与可能性对本领域普通技术人员不难理解，应认为是本发明范围内的等价物。
或者，抗-CD40抗体可使用放射性核素与抗体直接共价相连(一般通过氨基酸残基)的“直接标记”或“直接标记方法”标记。优选的核素见Srivagtava和Mease(1991)，同上。特别优选间接标记方法。也参见，例如国际公布号WO 00/52031和WO00/52473，其中接头用于连接放射性标记与抗体；抗-CD40抗体的受标记形式描述于纳入本文作为参考的美国专利号6,015,542。
此外，抗体(或其片段)可与治疗性部分，例如细胞毒素、治疗性药物或放射性金属离子或放射性同位素偶联。细胞毒素或细胞毒药物包括对细胞有害的任何药物。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、足叶乙苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红菌素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素及它们的类似物或同系物。治疗性药物包括，但不限于抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥、thioepa、瘤可宁、美法仑、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，道诺红菌素(曾用名道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(曾用名放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝***药物(例如，长春新碱和长春碱)。放射性同位素包括，但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。本发明的偶联抗体可用于修饰给定的生物应答；此类药物部分不应理解为限制于典型的化学治疗剂。例如，此类药物部分可以是拥有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、干扰素-α、干扰素-β、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物；或生物应答修饰剂，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
将这种治疗性部分偶联于抗体的技术是熟知的。参见，例如《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中的Arnon等，(1985)，“癌症治疗中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体”(Monoclonal Antibodies for Immunotargetingof Drugs in Cancer Therapy)，Reisfeld等编，(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256页；Hellstrom等，(1987)，《受控药物递送》(Controlled Drug Delivery)中的“用于药物递送的抗体”(Antidodies for Drug Delivery)，Robinson等编，(第二版；MarcelDekker，Inc.)，第623-653页；《单克隆抗体’84：生物学和临床应用》(Monoclonal Antibodies′84：Biological andClinical Applications)中的Thorpe，(1985)，“癌症治疗中细胞毒性药物的抗体载体：综述”(Antibody carriers of Cytoxic Agents in Cancer Therapy：A review)，Pinchera等编，(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)，第475-506页；《癌症诊断和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)中的“在癌症治疗中治疗性应用放射性标记抗体的分析、结果和前景”(Analysis，Results，and FutureProspective of Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therpy)，Baldwin等编，(Academic Press，New York，1985)，第303-316页；和Thorpe等，(1982)Immunol.Rev.62：119-158。
或者，可将抗体与二抗偶联形成如美国专利号4,676,980所述的抗体杂合偶联物。此外，可在标记和本发明的抗体之间使用接头(参见美国专利号4,831,175)。抗体或其抗原结合片段可用放射性碘、铟、铱或本领域已知的其它放射性颗粒直接标记(美国专利号5,595,721)。治疗方案可由同时或依次给予偶联和非偶联抗体的组合治疗方案构成(国际公开号WO 00/52031和WO 00/52473)。
拮抗性抗-CD40抗体的变体
拮抗性抗-CD40抗体的合适的生物活性变体可用于本发明的方法。这种变体保留了亲代拮抗性抗-CD40抗体的所需结合特性。制备抗体变体的方法一般是本领域可用的。
例如，拮抗性抗-CD40抗体的氨基酸序列变体可通过突变克隆的编码感兴趣抗体的DNA序列来制备。诱变与核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。例如，参见纳入本文作为参考的Walker和Gaastra编，(1983)，《分子生物学技术》(Techniques inMolecular Biology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488；Kunkel等，(1987)Methods Enzymol.154：367；Sambrook等，(1989)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，(冷泉港，纽约)；美国专利号4,873,192；和本文引用的参考文献。适当的氨基酸取代而不影响感兴趣多肽的生物活性的指南见纳入本文作为参考的Dayhoff等，(1978)《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protezh Sequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。优选保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
在构建感兴趣的拮抗性抗-CD40抗体多肽的变体过程中，进行修饰使变体继续具有所需活性，即相似的结合亲和力并能特异性地结合表达于人细胞表面的人CD40抗原，从而阻断C4BP-介导的CD40信号转导，并且当与人CD40表达细胞上的CD40抗原结合时无明显的激动活性而显示拮抗活性。很显然，编码这种变体多肽的DNA中的任何突变都必须不能将其序列置于读码框外并且优选不生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利公布号75,444。
此外，可以许多方式使拮抗性抗-CD40抗体的恒定区突变而改变其效应器功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公布号2004/0132101A1所述的优化抗体与Fc受体结合的Fc突变。
参比的拮抗性抗-CD40抗体的变体的氨基酸序列优选与该参比拮抗性抗-CD40抗体分子的氨基酸序列，或与该参比抗体分子的较短部分具有至少70％或75％序列相同性，优选至少80％或85％序列相同性，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。这些分子更优选具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出于本发明的目的，可使用Smith-Waterman同源性检索算法以相关空格(affine gap)检索确定序列相同性百分比，所用参数为空格开放罚分12、空格延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2：482-489。例如，变体与参比的抗-CD40抗体有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基的不同。
就两条氨基酸序列的最佳比对而言，与参比氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的毗连区段可具有额外的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于和参比氨基酸序列比较的毗连区段包括至少20个毗连氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可对与保守残基取代或空格相关的序列相同性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。
能特异性结合CD40并保留拮抗活性的抗-CD40抗体(特别是当与CD40抗原结合时)的精确化学结构，取决于许多因素。由于分子中存在可电离的氨基和羧基，特定的多肽可以酸性盐或碱性盐，或以中性盐形式获得。在合适的环境中可保留它们的生物活性的所有这种制剂包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗体的定义中。此外，可通过使用糖组分衍生(糖基化)或通过其它补充分子，例如脂质、磷酸、乙酰基等增加该多肽的一级氨基酸序列。也可通过和糖偶联来增加该多肽的一级氨基酸序列。这种增加的某些方面可通过生产宿主的翻译后加工***来实现；可在体外引入其它这种修饰。在任何情况中，只要抗-CD40抗体的拮抗特性能未遭破坏，这种修饰就包括在本文所用的抗-CD40抗体的定义中。在各种试验中，期望这种修饰可通过提高或降低该抗体的活性来定量或定性地影响其活性。此外，可通过氧化、还原或其它衍生方式来修饰链中的各个氨基酸残基，可切割该抗体得到保留活性的片段。这种不破坏拮抗活性的改变未将该抗体多肽序列排除在本文所用感兴趣的抗-CD40抗体的定义之外。
本领域为有关抗体变体的制备和使用提供了基本指南。在制备抗-CD40抗体变体过程中，本领域的技术人员易于确定对天然核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰将导致适合用作本发明方法药物组合物中治疗性活性组分的变体。
使用本发明拮抗性抗-CD40抗体的治疗方法
由于拮抗性抗CD40抗体提供了阻断C4BP-介导的CD40信号转导的方法，可用它们抑制本文上述一种或多种CD40导向活性。因此，本发明提供了抑制CD40表达细胞中CD40导向活性的方法，该方法包括将该细胞与本发明拮抗性抗CD40抗体相接触，抗体用量能有效阻断C4BP-介导的CD40信号转导。如上所述，阻断此信号通路可能是通过竞争性抑制或空间抑制了C4BP与CD40上它的结合位点结合，或阻断了通过C4BP与CD40上它的结合位点结合而进行的CD40信号转导，只要抗CD40抗体与CD40的结合阻断了C4BP-介导的CD40信号转导。
本文所述拮抗性抗CD40抗体可用于治疗患有C4BP刺激CD40表达细胞上CD40信号转导介导的疾病的患者。″CD40表达细胞″指表达CD40细胞表面抗原的任何细胞类型，特别是B细胞和其它APC，包括树突细胞，可以是正常或恶性CD40表达细胞。本领域已知检测细胞中CD40表达的方法，包括但不限于：PCR技术、免疫组化、流式细胞术、Western印迹、ELISA等。
″恶性B细胞″指任何致瘤性B细胞，包括但不限于：衍生自淋巴瘤(包括低级、中级和高级B细胞淋巴瘤)的B细胞、免疫母细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)诱导的淋巴瘤和AIDS相关性淋巴瘤，以及B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成髓细胞性白血病等。在其它实施方式中，CD40表达细胞是实体瘤细胞。″表达CD40的实体瘤细胞″指实体瘤的表达CD40细胞表面抗原的任何恶变细胞或恶变前细胞。出于本发明目的，表达CD40抗原的癌细胞和癌前或恶变前细胞称为″表达CD40的肿瘤细胞″。而且，当CD40配体(CD40L)和C4BP通过CD40活化协同作用时，可用本发明抗CD40抗体阻断C4BP-介导的CD40信号转导，从而影响CD40/CD40L作用介导的疾病。
本文将“治疗”定义为将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应用于或给予患者，或将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应用于或给予患者的分离的组织或细胞系，所述患者患有疾病，疾病症状，或疾病的易感性，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响该疾病、疾病的症状、或疾病的易感性。“治疗”也指将含有拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物应用于或给予患者，或将含有拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物应用于或给予患者的分离的组织或细胞系，所述患者患有疾病，疾病的症状，或疾病的易感性，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响该疾病、疾病的症状、或疾病的易感性。
采用本发明至少一种拮抗性抗CD40抗体(或其抗原结合片段)的治疗产生对治疗人体中C4BP激活CD40表达细胞的CD40信号转导相关性疾病(本文中称为CD40相关性疾病)的有益生理应答。这些CD40相关疾病包括但不限于：过度增殖、可导致癌症的恶变前疾病，癌症，包括B细胞相关性癌症和包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤，以及自身免疫和/或炎性疾病。因此，本发明拮抗性抗CD40抗体可通过抑制自身免疫应答用于治疗自身免疫和/或炎性疾病，如***性狼疮、牛皮癣、多发性硬化、炎性肠病(克罗恩氏病)、类风湿性关节炎以及器官和组织移植排斥，通过清除CD40提供活化信号的恶性B淋巴细胞治疗淋巴瘤，和以特定方式将毒素递送给携带CD40的细胞。
因此，例如，本发明拮抗性抗CD40抗体可用于治疗异常、不可控B细胞增殖或累积相关的非霍奇金淋巴瘤。出于本发明目的，根据《工作试剂》(WorkingFormulation)分类表分类这些淋巴瘤，即将B细胞淋巴瘤分类为低级、中级和高级(参见“非霍奇金淋巴瘤病理学分类方案”(The non-Hodgkin’s Lymphoma PathologicClassification Project)，(1982)Cancer 49：2112)。因此，低级B细胞淋巴瘤包括小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性小粘着细胞淋巴瘤以及滤泡混合性小粘着细胞和大细胞淋巴瘤；中级淋巴瘤包括滤泡性大细胞淋巴瘤、弥散性小粘着性细胞淋巴瘤、弥散混合性小细胞和大细胞淋巴瘤以及弥散性大细胞淋巴瘤；高级淋巴瘤包括伯基特类型和非伯基特类型的大细胞免疫母细胞淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤和小非粘着性细胞淋巴瘤。
应该认识到，本发明拮抗性抗CD40抗体可用于治疗性治疗按修正的欧美淋巴瘤分类(REAL)***分类的B细胞淋巴瘤。这种B细胞淋巴瘤包括但不限于：前B细胞瘤，例如B淋巴细胞性白血病/淋巴瘤；外周B细胞瘤，包括慢性B细胞型淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、浆细胞样淋巴细胞(lymphoplasmacytoid)淋巴瘤/免疫细胞瘤、外套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)(包括弥散性小细胞、弥散性小和大细胞，与弥散性大细胞淋巴瘤)、边缘层B细胞淋巴瘤(包括结节外、结节的和脾脏类型)、毛细胞性白血病、浆细胞瘤/骨髓瘤、原发性纵隔(胸腺)亚型弥散性大细胞型B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和伯基特样高级B细胞淋巴瘤；急性白血病；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；成髓细胞白血病；急性髓细胞性白血病；前髓细胞性白血病；粒单核细胞白血病；单核细胞性白血病；红白血病；髓细胞性白血病(慢性髓细胞性白血病)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；真红细胞增多；多发性骨髓瘤；特发性巨球蛋白血症；重链疾病；和不可分类的低级或高级B细胞淋巴瘤。
本发明拮抗性抗CD40抗体可用于预防治疗期间产生的其它肿瘤派生物，并可用于治疗患有低级B细胞淋巴瘤的对象，尤其是在标准化疗后复发的对象。低级B细胞淋巴瘤比中级和高级B细胞淋巴瘤进展缓慢，其特征是复发/缓解过程。因此，用本发明拮抗性抗CD40抗体改进了这些淋巴瘤的治疗，因为可降低复发的次数和严重性。
包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤包括但不限于：卵巢癌、肺癌(如鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌类型的非小细胞肺癌，以及小细胞肺癌)、乳腺癌、结肠癌、肾癌(包括例如肾细胞癌)、膀胱癌(如膀胱癌)、肝癌(包括例如肝细胞癌)、胃癌、***、***癌、鼻咽癌、甲状腺癌(如甲状腺***状癌)和皮肤癌如黑色素瘤、以及肉瘤(包括例如骨肉瘤和尤因肉瘤)。
当给予患有包含表达CD40的肿瘤细胞的癌症的对象时，本发明拮抗性抗CD40抗体和其抗原结合片段可提供抗肿瘤活性。″抗肿瘤活性″指表达CD40的肿瘤细胞增殖或积累速率降低，从而使已存在的肿瘤或在治疗期间发生的肿瘤的生长速率降低，和/或破坏已存在的肿瘤细胞或新形成的肿瘤细胞，从而在治疗期间使肿瘤整体大小减小。
因此，本发明提供了治疗包含CD40表达细胞的癌症如B细胞淋巴瘤和实体瘤的方法，其中将治疗有效量的本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段给予患有该癌症的对象。给予这些抗体或其抗原结合片段能够促进阳性治疗反应。提到癌症治疗时，″阳性治疗反应″指与这些抗体或其片段的抗肿瘤活性相关的疾病有改进，和/或与该疾病相关的症状有改进。因此，例如，阳性治疗反应指以下疾病改进的一种或多种：(1)肿瘤大小减小；(2)癌(即肿瘤)细胞数目减少；(3)肿瘤细胞死亡增加；(4)抑制了肿瘤细胞存活；(4)抑制(即减缓到一定程度，优选中止)肿瘤生长；(5)抑制(即减缓到一定程度，优选中止)癌细胞浸润周围器官；(6)抑制(即减缓到一定程度，优选中止)肿瘤转移；(7)预防其它肿瘤派生物；(8)提高患者生存率；和(9)一定程度上缓解与该癌症相关的一种或多种症状。还可根据改善程度进一步表征这些治疗反应。因此，例如，疾病改善的特征可以是完全应答。“完全应答”指以前异常的放射显影研究、骨髓和脑脊髓液(CSF)正常化后临床上无可检测的疾病。用本发明的方法治疗后这种应答必须维持至少一个月。或者，疾病的改善可归类为部分应答。“部分应答”指在无新的病损时，所有可检测的肿瘤负荷(即对象中肿瘤细胞的数量)至少降低约50％并至少持续一个月。这种应答仅适用于可检测的肿瘤。
可用以下筛选技术评价肿瘤应答所导致的肿瘤形态(即，总的肿瘤负荷、肿瘤体积等)变化：例如磁共振成像(MRI)扫描、x-放射显影成像、计算机化断层显像(CT)扫描、生物发光成像，如萤光素酶成像、骨扫描成像和包括抽取骨髓(BMA)的肿瘤活体组织取样。除了这些阳性治疗性应答以外，用拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段治疗的对象可经历疾病相关症状改善的有益作用。因此，就B细胞肿瘤而言，对象可经历所谓的B症状，即盗汗、发热、体重降低和/或荨麻疹的减轻。
本文所述拮抗性抗CD40抗体也可用于治疗其它CD40相关疾病，其中阻断C4BP-介导的CD40信号转导，导致抑制一种或多种CD40导向活性，这种抑制导致疾病改善，或至少减轻了所述疾病的一种或多种不良症状。因此，当C4BP-介导的CD40信号转导与不良免疫应答或体内过程相关时，如与自身免疫和/或炎性组分有关的疾病或失调相关时，可将本发明拮抗性抗CD40抗体给予有风险的对象或需要治疗一种或多种CD40相关性疾病的对象，以阻断C4BP-介导的CD40信号转导，从而抑制或预防与各种CD40相关性疾病相关的症状。
炎性疾病的特征是炎症和组织损伤，或其组合。″炎性疾病″包括启动事件或免疫应答靶点包括非自身抗原的任何炎性免疫介导过程，所述非自身抗原包括例如同种抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或变应原。
而且，出于本发明目的，术语″炎性疾病″包括″自身免疫病″。通常理解，本文所用术语″自身免疫″包括涉及″自身″抗原的炎性免疫介导过程。在自身免疫病中，自身抗原引发宿主的免疫应答。
同时，本发明包括治疗与组织移植排斥相关的炎症。″移植排斥″或″移植物排斥″指宿主对移植物产生的任何免疫应答，移植物包括但不限于HLA抗原、血型抗原等。
本发明也可用于治疗移植物抗宿主病，如骨髓移植相关的移植物抗宿主病。在这种移植物抗宿主病中，供体骨髓包括淋巴细胞和成熟后成为淋巴细胞的细胞。供体的淋巴细胞将受体的抗原识别为非自身物质并产生炎性免疫应答。因此，本文所用″移植物抗宿主病″或″移植物抗宿主反应″指供体淋巴细胞对宿主抗原起反应的T细胞介导的免疫应答。
因此，可按照本发明方法用本文所述拮抗性抗CD40抗体和其抗原结合片段治疗自身免疫和/或炎性疾病，包括但不限于：***性红斑狼疮(SLE)，盘状狼疮，狼疮性肾炎，结节病，炎性关节炎，包括少年关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎，器官或组织移植排斥，过急性、急性或慢性排斥和/或移植物抗宿主病，多发性硬化，高免疫球蛋白E血症综合征，结节性多动脉炎，原发性胆汁性肝硬化，炎性肠病，克罗恩氏病，乳糜泻(麸胶敏感性肠病)，自免疫肝炎，恶性贫血，自身免疫性溶血性贫血，牛皮癣，硬皮病，重症肌无力，自身免疫性血小板减少性紫癜，自身免疫性甲状腺炎，格雷夫斯病，桥本甲状腺炎，免疫复合物病，慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)，多肌炎和皮肌炎，冷球蛋白血症，溶栓，心肌病，寻常天疱疮，肺间质纤维化，I型和II型糖尿病，1型、2型、3型和4型迟发型***反应，过敏或过敏性疾病，对治疗性蛋白的不良/无意免疫应答(参见例如，美国专利申请号US2002/0119151和Koren等，(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3：349-60)，哮喘，丘-施综合征(过敏性肉芽肿病)，特应性皮炎，过敏性和刺激性接触性皮炎，风疹，IgE-介导的过敏，动脉粥样硬化，血管炎，特发性炎性肌病，溶血性疾病，阿耳茨海默病，慢性炎性脱髓鞘多神经病等。在一些其它实施方式中，本发明拮抗性抗CD40抗体可用于治疗肺部炎症，包括但不限于肺移植排斥、哮喘、结节病、肺气肿、囊性纤维化病、特发性肺纤维化、慢性支气管炎、过敏性鼻炎和肺部变应性病、如过敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、由骨髓和/或肺移植或其它原因引起的闭塞性细支气管炎、移植性动脉粥样硬化/移植性静脉硬化，以及由胶原病、血管病和自身免疫病如类风湿性关节炎和红斑狼疮引起的肺纤维化。
″抗炎活性″指降低或预防炎症。用本文其它地方所述的至少一种抗CD40抗体或其抗原结合片段进行治疗提供对治疗自身免疫病和/或炎性疾病有益的生理应答，该疾病包括表达CD40抗原的细胞。应认识到，本发明方法可用于预防细胞的表型改变如增殖、活化等。
提到自身免疫病和/或炎性疾病时，″阳性治疗应答″指与这些抗体或其抗原结合片段的抗炎活性相关的疾病改善，和/或与该疾病相关的症状改善。即，可观察到抗增殖效果、防止CD40表达细胞进一步增殖、降低炎性反应，包括但不限于：减少炎性细胞因子、粘着分子、蛋白酶、免疫球蛋白(在携带CD40的细胞是B细胞的情况下)和其组合的分泌等，提高抗炎蛋白的产量，减少自身反应细胞的数量，增加免疫耐受，抑制自身反应细胞存活，和/或减轻刺激CD40表达细胞介导的一种或多种症状。这种阳性治疗反应并不限制给药途径，可包括给予供体、供体组织(如器官灌注)、宿主、它们的组合等。
对于进行自身免疫和/或炎性疾病治疗的对象来说，可用以下筛选技术评价临床反应，例如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机化断层(CT)扫描、流式细胞术或荧光激活的细胞分选(FACS)分析、组织学、宏观病理学和血液化学，包括但不限于可用ELISA、RIA、色谱等检测的改变。除了这些阳性治疗反应以外，用拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段进行治疗的对象可能获得该疾病相关的症状改善的有利效果。
“治疗有效剂量或量”指给予拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段后，可导致与治疗CD40相关性疾病患者相关的阳性治疗性反应的量。在本发明的一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其片段的治疗有效量为约0.003mg/kg-50mg/kg、约0.01mg/kg-40mg/kg、约0.01mg.lkg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg或约7mg/kg-12mg/kg。应知道该治疗方法可包括一次给予或多次给予治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一实施方案是将拮抗性抗-CD40抗体用作临床测试过程的一部分来诊断性监测组织中蛋白质水平，例如用于检测给定治疗方案的有效性。将该抗体与可检测的物质偶联有助于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
拮抗性抗CD40抗体可与已知的化疗药、细胞因子和/或其它单克隆抗体，包括具有不同作用方式的其它拮抗性抗CD40抗体联用，以治疗CD40相关疾病。例如，本发明拮抗性抗CD40抗体可与细胞因子如白介素-2联用。在另一实施方式中，本发明抗CD40抗体可与(例如)其它单克隆抗体，如利妥昔单抗(IDEC-C2B8；利妥昔；E)EC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)联用，以治疗B细胞淋巴瘤。在其它实施方式中，本发明抗CD40抗体可与阻断CD40L-介导的CD40信号转导的抗CD40单克隆抗体联用。这种组合可能用于治疗自身免疫病和/或炎性疾病，包括但不限于：器官和组织移植排斥。当对象进行组织或器官移植时，拮抗性抗CD40抗体可与抑制移植的组织/器官排斥的其它治疗剂联用。这种治疗剂包括但不限于：皮质类固醇、环孢霉素和硫唑嘌呤。当多种治疗剂联用时，可依次、以任一顺序或同时(即同时或在相同时间框内)给予这些治疗剂。
以此方式、当对象正在治疗B细胞相关性癌症(包括但不限于本文上述癌症)时，本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段与至少一种其它癌症疗法联合给予，其它癌症疗法包括但不限于：外科或手术方法(如脾切除术、肝切除术、***切除术、白细胞去除术(leukophoresis)、骨髓移植等)；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植组合，其中合适的化疗药物包括，但不限于氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、环磷酰胺、阿霉素、***和它们的组合，例如含有蒽环类的联用方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加***)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、***加阿霉素)、VAD(长春新碱、阿霉素加***)、MP(美法仑加***)，和用于化疗的其它细胞毒和/或治疗性药物，如米托蒽醌、道诺红菌素、依达比星、天冬酰胺酶和抗代谢物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨(nelarabine)；其它抗癌症单克隆抗体疗法(例如，阿来组单抗(alemtuzumab)(Campath)或其它靶向恶性B细胞上CD52细胞表面糖蛋白的抗-CD52抗体；利妥昔单抗(利妥昔)、完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗(tositumomab)/I-131托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)或任何其它靶向恶性B细胞上CD20抗原的治疗性抗-CD20抗体；抗-CD19抗体(例如，MT103，双特异性抗体)；抗-CD22抗体(例如，人源化单克隆抗体埃坡组单抗(epratuzumab))；贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)或其它靶向人血管内皮细胞生长因子的抗癌抗体；靶向恶性B细胞上CD22抗原的抗-CD22抗体(例如，单克隆抗体BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬细胞集落刺激因子的α-M-CSF抗体；靶向多发性骨髓瘤中过度表达的核因子-κB(RANK)及其配体(RANKL)的受体激活剂的抗体；靶向恶性B细胞上CD23抗原的抗-CD23抗体(例如，IDEC-152)；靶向CD80抗原的抗-CD80抗体(例如，IDEC-114)；靶向恶性B细胞上的CD38抗原的抗-CD38抗体；靶向表达于恶性B细胞上主要组织相容性复合体II类受体的抗体(抗-MHC抗体)；其它靶向恶性B细胞上CD40抗原的抗-CD40抗体(例如SGN-40；和能阻断CD40表达细胞上CD40L介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD-40抗体如CHIR-12.12和CHIR-5.9，及其抗原结合片段，如2004年11月4日提交的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916)，题目也是“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies andMethods For Their Use))所述)；和靶向表达于许多实体肿瘤和造血来源肿瘤上肿瘤坏死因子相关促凋亡配体受体1(TRAIL-R1)的抗体(例如，激动性人单克隆抗体HGS-ETR1)和靶向TRAIL-R2的抗体)；基于小分子的癌症疗法，所述小分子包括但不限于微管和/或托扑异构酶抑制剂(例如，有丝***抑制剂多拉斯他汀(dolastatin)和其类似物；微管蛋白结合药物T900607；XL119；和托扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林(midostaurin)((PKC-412、CGP41251、N-苯甲酰基十字孢碱)、pixantrone、奥沙利铂(eloxatin)(一种抗肿瘤药物)、硝酸镓(硝酸镓)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(诱导恶性淋巴细胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷类似物，如氯法拉滨(clofarabine)、癌细胞产生蛋白质Bc1-2的抑制剂(例如，反义药物奥利默森(oblimersen)和Genasense)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米(bortezomib)))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰酶的小分子抑制剂(例如，杂交/极性细胞分化HPC)药物，如N-辛二酰苯异羟肟酸(suberanilohydroxamic acid)(SAHA)、和FR-901228)和凋亡药物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬钆(motexafin gadolinium))；基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法，包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化的免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，MyVax个性化免疫疗法，以前命名为GTOP-99)、Promune(CpG7909，一种toll-样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素-α疗法、白介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法；类固醇疗法；或其它癌症疗法；其中其它癌症疗法在拮抗性抗-CD40抗体治疗给予之前、期间或之后给予。
当对象正在治疗包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤(包括但不限于本文上述实体瘤)时，本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段可与至少一种其它癌症治疗联合给予，其它癌症治疗包括但不限于：手术、放疗、化疗、细胞因子治疗或考虑用于治疗感兴趣实体瘤的其它单克隆抗体，在抗CD40抗体治疗之前、期间或之后给予其它癌症治疗。
因此，当组合疗法包括给予拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段时联合给予例如化疗、放疗、其它抗癌抗体疗法、基于小分子的癌症疗法或基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法的另一种治疗性药物时，本发明的方法包括用分开的制剂或单独的药物制剂共同给药，或/和以任一顺序连续给药。当本发明的方法包括组合治疗方案时，这些治疗可同时进行，即拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与其它癌症疗法同时给予或在相同的时间框内给予(即，同时进行治疗，但拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段不与其它疗法在正好相同的时间给予)。或者，本发明的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段也可在其它疗法之前或之后给予。可依次进行不同的癌症疗法而不论受治疗的对象是否对第一疗程反应以降低缓解(remission)或复发的可能性。当组合疗法包括联合给予拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段和细胞毒药物时，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段优选在给予细胞毒药物之前给予。
在本发明的一些实施方案中，对象患有B-细胞相关性癌症，将本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段与化疗联合给予，并且任选与自体骨髓移植联合，其中抗体和化疗药物可以依次给予、以任一顺序给予或同时给予(即同时或在相同时间框内)。合适的化疗药物的例子包括，但不限于：氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷、环磷酰胺、阿霉素、***和它们的组合，例如含有蒽环类的方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加***)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、***加阿霉素)、VAD(长春新碱、阿霉素加***)、MP(美法仑加***)，和用于化疗的其它细胞毒和/或治疗性药物，如米托蒽醌、道诺红菌素、依达比星、天冬酰胺酶和抗代谢物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨。在一些实施方案中，本文所述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用化疗药物治疗之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用化疗药物治疗之后给予。在还有的其它实施方案中，化疗药物与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予。
因此，例如，在一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与氟达拉滨或磷酸氟达拉滨联合给予B细胞相关性癌症患者。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予氟达拉滨或磷酸氟达拉滨之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用氟达拉滨或磷酸氟达拉滨治疗之后给予。在还有其它的实施方案中，氟达拉滨或磷酸氟达拉滨与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予。
在其它实施方案中，瘤可宁(一种烷化药物)与本文所述拮抗性抗-CD40抗体，或其抗原结合片段联合给予B细胞相关性癌症患者。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予瘤可宁之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用瘤可宁治疗之后给予。在还有其它的实施方案中，瘤可宁与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予。
在其它的实施方案中，含有蒽环类的方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加***)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、***加阿霉素)与本文所述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段联合给予。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予含有蒽环类的方案之前给予B细胞相关性癌症患者。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用含有蒽环类的方案治疗之后给予该患者。在还有其它的实施方案中，含有蒽环类的方案与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予该患者。
在其它实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与阿来组单抗(alemtuzumab)(Campath；Berlex Laboratories，Richmond，California经销)联合给予B细胞相关性癌症患者。阿来组单抗是靶向表达于恶性B细胞上CD52抗原的重组人源化单克隆抗体(Campath-1H)。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予阿来组单抗之前给予。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用阿来组单抗治疗之后给予。在还有其它的实施方案中，阿来组单抗与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予。
在其它实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与靶向恶性B细胞上的CD20抗原的治疗性抗-CD20抗体，例如利妥昔单抗(利妥昔)、完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar)或替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)联合给予B细胞相关性癌症患者。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予抗-CD20抗体之前给予患者。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用抗-CD20抗体治疗之后给予患者。在还有其它的实施方案中，抗-CD20抗体与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予患者。
考虑可与本发明抗CD40抗体联用以治疗B细胞相关性癌症的单克隆抗体的其它例子包括但不限于：阻断CD40L-介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体，包括例如，完全人单克隆抗体CHIR-12.12和CHIR-5.9，如2004年11月4日提交的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916)，题目也是“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use))所述。
在其它实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与基于小分子的癌症疗法联合给予B细胞相关性癌症患者，所述小分子包括但不限于微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如有丝***抑制剂多拉斯他汀和其类似物；微管蛋白结合药物T900607；XL119；和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林(PKC-412、CGP41251、N-苯甲酰基十字孢碱)、pixantrone、奥沙利铂(一种抗肿瘤药物)、硝酸镓(硝酸镓)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(诱导恶性淋巴细胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷类似物，如氯法拉滨、癌细胞产生的蛋白Bc1-2的抑制剂(例如，反义药物奥利默森和Genasense)、蛋白酶体抑制剂(如VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰酶的小分子抑制剂(例如，杂交/极型细胞分化HPC)药物，如N-辛二酰苯异羟肟酸(SAHA)和FR-901228)和凋亡药物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬钆)。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予基于小分子的癌症疗法之前给予该患者。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用基于小分子的癌症疗法治疗之后给予该患者。在还有其它的实施方案中，基于小分子的癌症疗法与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予该患者。
在其它的实施方案中，本文所述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法联合给予B细胞相关性癌症患者，所述疗法包括但不限于疫苗方法(如Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化的免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，MyVax个性化免疫疗法，以前命名为GTOP-99)、Promune(CpG7909，一种toll-样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素-α疗法、白介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法；或类固醇疗法。在一个这种实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在给予基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法之前给予该患者。在其它实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在用基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法治疗之后给予该患者。在还有其它的实施方案中，基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法与拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段同时给予该患者。
在一个这种实施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与IL2联合给予。IL2是已知的一种可扩增受治疗患者的天然杀伤(NK)效应细胞数量的药物，可在给予本发明拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段之前或同时给予。当本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)作为另一种作用方式时，伴随给予IL-2的NK效应器细胞数量增加，可导致给予的拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的ADCC活性提高。在其它实施方式中，IL-21用作免疫治疗剂，与本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段联合给予时能刺激NK细胞活性。
在本发明的一些实施方式中，对象患有包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤，将本文所述抗CD40抗体或其抗原结合片段与化疗或细胞因子治疗联合给予此对象，其中抗体和化疗药物或细胞因子可以依次给予、以任一顺序给予或同时给予(即同时或在相同时间框内)。用于包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤患者的合适化疗药的例子包括但不限于：可用于(例如)治疗结直肠癌和非小细胞肺癌的CPT-11(伊立替康)；可用于(例如)治疗肺癌、乳腺癌和上皮性卵巢癌的吉西他滨；以及适合治疗实体瘤的其它化疗药。感兴趣的细胞因子包括但不限于：α干扰素，γ干扰素、白介素-2(IL-2)、IL-12、IL-15和IL-21、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或这些细胞因子的生物活性变体。
在本发明的其它实施方式中，将本文所述抗CD40抗体或其抗原结合片段与考虑用于治疗实体瘤的其它单克隆抗体联合给予包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤患者。因此，例如，当治疗对象的包含表达CD40的癌细胞的乳腺癌时，治疗可包括给予有效量的本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段，再联合给予有效量的靶向Her2+乳腺癌细胞上的Her2受体蛋白的贺赛汀(Genentech，Inc.，加利福尼亚州旧金山)。类似地，当治疗对象的包含表达CD40的癌细胞的的结直肠癌时，治疗可包括给予有效量的本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段，联合给予有效量的结合于并抑制血管内皮生长因子(VEGF)的人源化单克隆抗体阿瓦斯汀TM(也称为贝伐单抗；Genentech，Inc.，加利福尼亚州旧金山)，VEGF是在肿瘤新生血管发生中起重要作用的蛋白质。考虑可与本发明抗CD40抗体联用以治疗实体瘤的单克隆抗体的其它例子包括但不限于：靶向表皮生长因子受体的抗-EGFR抗体(例如IMC-C225(ImClone Systems，纽约州纽约)(参见例如，Mendelsohn和Baselga(2000)Oncogene19：6550-6565和Solbach等(2002)Int.J.Cancer101：390-394)；靶向IGF-1受体蛋白的抗IGF-1受体抗体(参见例如，Maloney等(2003)Cancer Res.63：5073-5083和Hailey等(2002)Mol.Cancer.Ther.1：1349-1353)；靶向肿瘤相关抗原MUC1的抗-MUC1抗体；靶向相应整联蛋白的抗α5β1、抗αvβ5和抗αvβ3，整联蛋白能调节细胞粘附以及参与细胞增殖和存活的信号通路(参见例如，Laidler等(2000)ActaBiochimica Polonica47(4)：1159-1170和Cruet-Hennequart等(2003)Oncogene22(11)：1688-1702)；靶向此钙粘着蛋白家族成员的抗-P-钙粘着蛋白抗体(参见例如，共待审的美国专利申请公开号20030194406)；靶向此内皮细胞-特异性粘着分子的血管新生相关功能的抗-VE-钙粘着蛋白抗体(参见例如，Liao等(2002)Cancer Res.62：2567-2575)；和能阻断CD40L-介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体，包括例如，完全人单克隆抗体CHIR-12.12和CHIR-5.9，如2004年11月4日提交的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916))，题目也是“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(AntagonistAnti-CD40 MonoclonalAntibodies and Methods For Their Use))所述。
也考虑将联合治疗应用于包含自身免疫和/或炎性组分的CD40相关性疾病的患者。以此方式，当治疗对象的自身免疫和/或炎性疾病，包括但不限于本文所述疾病时，可将靶向C4BP-介导的CD40信号转导的本发明拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段与用于自身免疫和炎性疾病的任何已知治疗联合给予，已知治疗包括已知可用于、或已经用于或目前用于治疗自身免疫和炎性疾病的任何药剂或药剂组合。这种治疗和治疗剂包括但不限于：外科或手术方法(如脾切除术，***切除术，甲状腺切除术，血浆去除术，白细胞去除术，细胞、组织或器官移植，肠操作，器官灌注等)、放疗、诸如类固醇治疗和非类固醇治疗等治疗、激素治疗、细胞因子治疗、用皮肤病药物(例如用于治疗皮肤病如过敏、接触性皮炎和牛皮癣的局部药剂)治疗、免疫抑制疗法和其它抗炎性单克隆抗体治疗等。以此方式，将本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段与至少一种其它治疗联合给予，其它治疗包括但不限于：手术、器官灌注、放疗、类固醇治疗、非类固醇治疗、抗生素治疗、抗真菌治疗、激素治疗、细胞因子治疗、用皮肤病药物(例如用于治疗皮肤病如过敏、接触性皮炎和牛皮癣的局部药剂)治疗、免疫抑制疗法、其它抗炎性单克隆抗体治疗、它们的组合等。
当本发明方法包括用于自身免疫病和/或炎性疾病患者的联合治疗方案时，这些治疗可同时给予，即拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段与其它治疗同时或在相同时间框内给予(即治疗同时进行，但抗CD40抗体或其抗原结合片段与其它治疗不在正好相同的时间上给予)。或者，也可在其它治疗之前或之后给予本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段。可以连续给予不同治疗，而不管接受治疗的对象是否对第一疗程起反应以降低缓解或复发的可能。
在本发明的一些实施方式中，本文所述拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段与免疫抑制药物或抗炎药物联合给予，其中抗体和治疗剂可以依次给予、以任一顺序给予或同时给予(即同时或在相同时间框内)。可与本发明拮抗性抗CD40抗体联合给予的合适免疫抑制药物的例子包括但不限于：甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、瘤可宁、环孢霉素如雾化环孢霉素(参见美国专利申请公开号US20020006901、全文纳入本文作参考)、他克莫司(FK506；ProGrafTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特和其丙二腈酰胺类似物；以及免疫抑制蛋白，包括例如，抗-CTLA4抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激物抗体(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗体和依坦西普(Enbrel)以及抗-T细胞抗体如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等。合适的抗炎药的例子包括但不限于：皮质类固醇，例如氯倍他索、卤倍他索、氢化可的松、曲安西龙、醋布倍他米松、氟轻松(fluocinole)、醋酸氟轻松、氯***、氟泼尼龙、甲泼尼龙；非甾类抗炎药(NSAID)例如柳氮磺吡啶、含有美沙拉嗪(mesalamine)的药物(称为5-ASA药)、塞来考昔、双氯芬酸、依托度酸、芬洛芬(fenprofen)、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、meclofamate、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、罗非考昔、水杨酸盐、舒林酸和托美丁；抗炎抗体如阿达木单抗(HUMIRA，TNF-α拮抗剂)和英夫利昔单抗(Remicade，TNF-α拮抗剂)等。在其它实施方式中，将本发明抗CD40抗体或其合适的抗原结合片段与靶向CD40表达细胞上CD40L-介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体联合给予接受自身免疫和/或炎性疾病治疗的对象，其它拮抗性抗CD40抗体例如，拮抗性抗CD40抗体CHIR-12.12和CHIR-5.9及其抗原结合片段，如2004年11月4日提交的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916))，题目也是“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use)所述。
移植排斥和移植物抗宿主病可以是过急性(体液)、急性(T细胞介导)或慢性(未知病因)，或其组合。因此，本发明拮抗性抗CD40抗体可用于一些实施方式以预防和/或缓解排斥和与任何组织的过急性、急性和/或慢性移植排斥相关的症状，所述组织包括但不限于：肝、肾、胰脏、胰岛细胞、小肠、肺、心脏、角膜、皮肤、血管、骨、异体或自体骨髓等。移植组织可获自任何供者，并移植入任何受体宿主，因此移植程序可包括将动物组织移植到人(如异种移植物)、将组织从一个人移植到另一个人(如同种异体移植物)，和/或将组织从人体的一部分抑制到另一部分(如自体移植物)。用本发明抗体治疗也可减少移植后遗症，如发热、食欲缺乏、血液动力学异常、白细胞减少症、白细胞浸润移植的器官/组织，以及条件性感染。
在一些实施方式中，本发明拮抗性抗CD40抗体可单独使用或与免疫抑制药物联用，以治疗和/或预防移植排斥，如过急性、急性和/或慢性排斥和/或移植物抗宿主病。因此，在用本发明拮抗性抗CD40抗体治疗移植排斥的一些实施方式中，可将这些抗体与合适的免疫抑制药物联用，包括但不限于：甲氨蝶呤；环磷酰胺；咪唑立宾；瘤可宁；环孢霉素如雾化环孢霉素(参见美国专利申请公开号US20020006901、以全文纳入本文作参考)、他克莫司(FK506；ProGraFTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特和其丙二腈酰胺类似物；以及免疫抑制蛋白，包括例如，抗-CTLA抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激物抗体(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗体和依坦西普(Enbrel)，以及抗-T细胞抗体如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等；或靶向CD40表达细胞上CD40L介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体，如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段。
同样，特别考虑到本发明组合物和方法可与其它药物联用，以进一步改善移植受体如接受肺移植的患者的症状和结果。因此，在一些实施方式中，单独使用本发明拮抗性抗CD40抗体，或与胃肠道外或非胃肠道外给予的环孢霉素(包括例如口服环孢霉素、可注射环孢霉素、雾化(如吸入型)环孢霉素和其组合)联用以治疗移植排斥(如肺移植受体的过急性、急性和/或慢性排斥或移植物抗宿主病)。在治疗的至少一个组分是雾化环孢霉素的一些实施方式中，采用(例如)加压递送装置或喷雾器吸入气溶胶喷雾形式的环孢霉素，从而将环孢霉素递送到受体的肺部。可以干粉形式或湿形式给予环孢霉素。
在一些其它实施方式中，可单独使用本发明拮抗性抗CD40抗体或与免疫抑制药物联用，以治疗和/或预防类风湿性关节炎。因此，在用本发明拮抗性抗CD40抗体治疗类风湿性关节炎的一些实施方式中，这些抗体可与合适的免疫抑制药物联用，包括但不限于：甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、瘤可宁、环孢霉素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特和其丙二腈酰胺类似物；免疫抑制蛋白，包括例如抗-CTLA抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激物抗体(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗体(如利妥昔)；完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131、托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(Zevalin)；抗-CD80抗体和依坦西普(ENBREL)，以及抗-T细胞抗体如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等；或靶向CD40表达细胞上CD40L介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体，如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段。如上所述，可用任何方式评价治疗有效性，包括但不限于：如美国风湿病学院标准、欧洲风湿病联盟标准或任何其它标准确定的临床反应所测定的有效性。参见例如，Felson等(1995)ArthritisRheum.38：727-35和van Gestel等(1996)Arthritis Rheum.39：34-40。
在其它实施方式中，本发明拮抗性抗CD40抗体可单独使用或与免疫抑制药物联用，以治疗或预防多发性硬化。因此，在用本发明拮抗性抗CD40抗体治疗多发性硬化的一些实施方式中，该抗体可与合适的免疫抑制药物联用，包括但不限于：甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、瘤可宁、环孢霉素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、麦考酚酸吗乙酯，和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷帕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特和其丙二腈酰胺类似物；免疫抑制蛋白，包括例如抗-CTLA抗体和Ig融合物、抗-B淋巴细胞刺激物抗体(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗体(如利妥昔)；完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131、托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(Zevalin)；抗-CD80抗体和依坦西普(ENBREL)，以及抗-T细胞抗体如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等；或靶向CD40表达细胞上CD40L介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体，如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗体或其抗原结合片段。
而且，也可采用两种或多种治疗剂和本文所述拮抗性抗CD40抗体的联合疗法来治疗包含刺激的CD40表达细胞的疾病，例如B细胞相关性癌症、实体瘤以及自身免疫和/或炎性疾病。例子包括但不限于三联治疗，其中两种化疗药与本文所述拮抗性抗CD40抗体联合给予，或者一种化疗药和另一种抗癌性单克隆抗体(例如阿来组单抗、利妥昔单抗、抗-CD23抗体或另一种拮抗性抗CD40抗体如靶向CD40L-介导的CD40信号转导的CHIR-12.12或CHIR-5.9)与本文所述拮抗性抗CD40抗体联合给予。这种联合的例子包括但不限于：氟达拉滨、环磷酰胺和本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的联合；氟达拉滨、抗-CD20抗体如利妥昔单抗(利妥昔；IDEC Pharmaceuticals Corp.，加利福尼亚州圣地亚哥)和本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的联合；以及氟达拉滨、靶向CD40L介导的CD40信号转导的另一种拮抗性抗CD40抗体如CHIR-12.12或CHIR5.9和靶向C4BP-介导的CD40信号转导的本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的联合。
本文所述拮抗性抗CD40抗体还可用于提供试剂，如可用于(例如)鉴定表达CD40的细胞的标记抗体。这可能在测定未知样品的细胞类型中非常有用。可用单克隆抗体组鉴定组织的种类和/或器官类型。以相似方式，这些抗CD40抗体可用于筛选组织培养细胞中的污染(即筛选培养物中是否存在CD40表达细胞和非CD40表达细胞的混合物)。
药物制剂和给药方式
本发明的拮抗性抗-CD40抗体的给药浓度可在治疗上有效预防或治疗CD40-相关性疾病，如自身免疫病、超敏、炎症、产生自身抗体、器官或组织移植排斥、移植物抗宿主病和表达CD40的癌症，如B-细胞淋巴瘤和实体瘤。为实现此目的，可用本领域已知的各种可接受的赋形剂配制此抗体。这些抗体一般通过静脉内或腹膜内注射给药。实现此种给药的方法是本领域普通技术人员已知的。也可能获得可局部或口服给药，或能透过粘膜输送的组合物。
取决于所施用的抗-CD40抗体，静脉内给药优选通过输液在约1-10小时期间进行，更优选约1-8小时，甚至更优选约2-7小时、还要优选约4-6小时。该药物组合物的最初输液可在约4-6小时期间进行，后续输液可较快递送。后续输液可在约1-6小时期间，例如约1-4小时、约1-3小时或约1-2小时给予。
可将本发明的药物组合物配制成与其要采用的给药途径相容。可能的给药途径的例子包括胃肠外(例如，静脉内(IV)、肌肉内(IM)、真皮内、皮下(SC)或输液)、口服和肺部(例如，吸入)、鼻、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于胃肠外、真皮内或皮下应用的溶液或混悬液可含有以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不易挥发的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌试剂，例如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如维生素C或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调整张力的试剂，例如氯化钠和葡萄糖。可用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠外制剂可包装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
抗-CD40抗体通常用标准技术以药学上可接受的缓冲液提供，例如无菌盐水、无菌缓冲水、丙二醇、上述物质的组合等。纳入本文作为参考的《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版；Mack Publishing Company，Eaton，Pennsylvania，1990)描述了制备可胃肠外给予药物的方法。也参见，例如描述了适用于本发明方法的稳定的抗体药物制剂的国际公开号WO 98/56418。
本领域的普通技术人员不难确定待给予的至少一种拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的量而无需过多实验。影响给药方式和至少一种拮抗性抗-CD40抗体(或其抗原结合片段)的各自用量的因素包括，但不限于进行治疗的具体疾病、疾病的严重性、病史、所治疗个体的年龄、身高、体重、重量、健康和身体状况。类似地，待给予的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的用量取决于给药方式和对象是接受单剂量还是多剂量的该抗肿瘤药物。随着所治疗患者体重的增加，一般优选较高剂量的抗-CD40抗体或其抗原结合片段。待给予的抗-CD40抗体或其抗原结合片段的剂量为约0.003mg/kg-50m/kg、优选0.01mg/kg-约40mg/kg。因此，例如剂量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
在本发明的另一个实施方案中，该方法包括给予多剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。该方法可包括给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治疗有效剂量的含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物。多剂量的含抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物的给药频率和持续时间取决于疾病、疾病阶段和进行治疗的患者的病史。此外，用治疗有效量的抗体治疗对象包括一次治疗，或优选可包括一系列治疗。在一优选的实施例中，用拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段以约0.1-20mg/kg体重，在约1-10周之间进行每周一次的治疗，优选在约2-8周之间、更优选约3-7周之间、甚至更优选约4、5或6周。可每年进行治疗以防复发或根据复发的迹象进行治疗。也要理解用于治疗的抗体或其抗原结合片段的有效剂量在具体治疗期间可增加或减少。根据本文所述诊断试验的结果决定剂量的变化。
因此，在一个实施方案中，给药方案包括在治疗期间的第1、7、14和21天先给予治疗有效剂量的至少一种抗-CD40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，给药方案包括在治疗期间的每周的第1、2、3、4、5、6和7天先给予治疗有效剂量的至少一种抗-CD40抗体或其抗原结合片段。其它实施方案包括在治疗期间的每周的第1、3、5和7天先给予治疗有效剂量的至少一种抗-CD40抗体或其抗原结合片段的给药方案；包括在治疗期间每周第1和3天先给予治疗有效剂量的至少一种抗-CD40抗体或其抗原结合片段的给药方案；和在治疗期间每周第1天先给予治疗有效剂量的至少一种抗-CD40抗体或其抗原结合片段的优选给药方案。治疗时期可包括1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月或1年。治疗时期可连续或间隔1天、1周、2周、1个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量是约0.003mg/kg-50mg/kg、约0.01mg/kg-40mg/kg、约0.01mg/kg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约0.5mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30m/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg或约7mg/kg-12mg/kg。因此，例如，任何一种拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的剂量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15 mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg或在约0.003mg/kg-50mg/kg范围内的其它这种剂量。在整个抗体给药的每周可给予相同治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。或者，可在治疗期间采用不同的治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。
在其它实施方式中，本文它处定义的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效剂量可在较低的剂量范围(即约0.003mg/kg-20mg/kg)内，后续的剂量可在较高的剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)内。
在其它实施方案中，本文它处定义的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效剂量可在较高的剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)内，后续剂量可在较低的剂量范围(即约0.003mg/kg-20mg/kg)内。因此，在一个实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的最初治疗有效剂量是约20mg/kg-35mg/kg，包括约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg和约35mg/kg，随后的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量为约5mg/kg-15mg/kg，包括约5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg和约15mg/kg。
在本发明的一些实施方案中，拮抗性抗-CD40抗体治疗先是给予需要拮抗性抗-CD40抗体治疗的对象以“负荷剂量”的抗体或其抗原结合片段。“负荷剂量”指给予对象的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的初始剂量，其中给予的抗体或其抗原结合片段的剂量在较高的剂量范围内(即约20mg/kg-50mg/kg)。只要全部的“负荷剂量”在约24小时期间给予，该“负荷剂量”可以一次给药，例如该抗体或其抗原结合片段经静脉内一次输液；或可以多次给药，例如该抗体或其抗原结合片段经静脉内多次输液。给予“负荷剂量”后，可给予对象一次或多次额外治疗有效剂量的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段。随后可按，例如每周给药时间表、或每两周一次、每三周一次或每四周一次给予治疗有效剂量。在这种实施方案中，后续的治疗有效剂量在较低的剂量范围内(即0.003mg/kg-约20mg/kg)。
或者，在一些实施方案中，给予“负荷剂量”后，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段按照“维持时间表”给予，其中治疗有效剂量的抗体或其抗原结合片段按每月一次、每六周一次、每两个月一次、每十周一次、每三个月一次、每十四周一次、每四个月一次、每十八周一次、每五个月一次、每二十二周一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次或每十二个月一次给药。在这种实施方案中，特别是当随后的剂量以更高频率的间隔给药，例如每两个月一次到每月一次时，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量在较低剂量范围内(即0.003mg/kg-约20mg/kg)；或者特别是当随后的剂量以更低频率的间隔给药，例如约间隔一个月到约十二个月时，治疗有效剂量在较高剂量范围内(即约20mg/kg-50mg/kg)。
用于本发明方法的本文所述药物组合物中的拮抗性抗-CD40抗体可以是天然的或通过重组技术获得，可以是任何来源的，包括哺乳动物来源，例如小鼠、大鼠、家兔、灵长类、猪和人。这种多肽优选得自人来源，更优选得自杂交瘤细胞系的重组人蛋白。
本发明方法所用的药物组合物包含本发明的拮抗性抗-CD40抗体的生物活性变体。这种变体应该保留参比拮抗性抗CD40抗体的生物活性，从而使得当将包含变体多肽的药物组合物给予对象时具有与包含参比拮抗性抗CD40抗体的药物组合物相同的治疗作用。即，该变体抗-CD40抗体可以类似于参比拮抗性抗CD40抗体观察到的作用方式作为药物组合物中的治疗活性组分。本领域已建立了可用于确定变体抗-CD40抗体是否保留了所需生物活性从而可用作药物组合物中的治疗活性组分的方法。可采用为检测参比拮抗性抗CD40抗体活性而特别设计的试验，包括本发明所述的试验来测定抗体变体的生物活性。
任何含有本文所述结合特性的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段作为活性组分的药物组合物可用于本发明的方法。因此，包含一种或多种本发明的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的液体、冻干或喷雾干燥的组合物可根据本发明的方法制备用作随后给予对象的水性或非水性溶液或混悬液。这些组合物中的每种包含至少一种本发明的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段作为治疗或预防活性组分。“治疗或预防活性组分”指特别引入该组合物中的抗-CD40抗体或其抗原结合片段，当将该药物组合物给予对象时，可产生治疗、预防或诊断对象疾病或病症的所需治疗性或预防性应答。该药物组合物优选包含合适的稳定剂、填充剂，或同时包含二者以最大程度降低制备和储存期间与蛋白质稳定性和生物活性丧失相关的问题。
可在包含本发明的拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物组合物中加入一些制剂(formulant)。这些制剂包括，但不限于油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂或填充剂。碳水化合物优选包括糖或糖醇，例如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或它们的混合物。“糖醇”定义为具有羟基的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和***糖醇。这些糖或糖醇可单独或组合使用。糖或糖醇的浓度在1.0％和7％w/v之间，更优选在2.0％和6.0％w/v之间。优选的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒碱、精氨酸和甜菜碱；然而，也可加入其它氨基酸。优选的聚合物包括平均分子量为2,000和3,000之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量为3,000和5,000之间的聚乙二醇(PEG)。可加入该制剂的表面活性剂见欧洲专利号270,799和268,110。
此外，例如可通过与聚合物共价偶联来化学修饰抗体以增加它们的循环半衰期。优选的聚合物和连接肽的方法见全文纳入本文作为参考的美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546。优选的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温可溶于水并如通式R(O--CH2--CH2)nO--R所示，其中R可以是氢或保护性基团，如烷基或烷醇基团。保护性基团优选具有1-8个碳原子，更优选是甲基。符号n是优选1-1,000之间，更优选2-500之间的正整数。PEG优选具有平均分子量1,000-40,000、更优选2,000-20,000、最优选3,000-12,000。PEG优选具有至少一个羟基、更优选是末端羟基。优选激活该羟基以和抑制剂上的游离氨基反应。然而，应理解可改变反应基团的类型和数量以获得共价偶联的PEG/本发明的抗体。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本发明。它们包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)。优选POG。原因之一是聚氧乙基化甘油的骨架与例如动物和人的单、二、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，该分支在体内不会被视作外来物质。POG的优选分子量与PEG的相同。POG的结构见Knauf等，(1988)，J.Bio.Chem.263：15064-15070，美国专利号4,766,106描述了POG/IL-2偶联物，两篇文献均全文纳入本文作为参考。
另一种增加循环半衰期的药物递送***是脂质体。制备脂质体递送***的方法见Gabizon等，(1982)，Cancer Research 42：4734；Cafiso(1981)，Biochem Biophys Acta649：129和Szoka(1980)，Ann.Rev.Bioplays.Eng.9：467所述。本领域已知的其它药物递送***描述见，例如Poznansky等，(1980)，《药物递送***》(Drug DeliverySystems)，(R.L.Juliano编，Oxford，纽约)，第253页；Poznansky，(1984)，Pharm Revs36：277。
引入药物组合物中的制剂应使得拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段稳定。即，拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段应保留其物理和/或化学稳定性并具有所需生物活性，即，一种或多种本文以上定义的拮抗活性，包括但不限于抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T细胞刺激的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制C4BP表达细胞或可溶性C4BP刺激的正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制可溶性C4BP或固相C4BP刺激的任何细胞中“存活性”抗-凋亡胞内信号；抑制结合可溶性C4BP或固相C4BP后任何细胞中的CD40信号转导；和抑制本文它处所述人恶性B细胞的增殖。
监测蛋白质稳定性的方法是本领域熟知的。参见，例如Jones，(1993)Adv.DrugDelivery Rev.10：29-90；Lee编，(1991)，《肽和蛋白质药物递送》(Peptide and ProteinDrug Delivery)，(Marcel Dekker，Inc.，纽约，纽约)。通常在所选择的温度下，测定蛋白质在一段特定时期内的稳定性。在优选的实施方案中，当在室温(约25℃)储存至少1个月、至少3个月、或至少6个月，和/或在约2-8℃储存至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月时，稳定的抗体药物制剂将使得拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段稳定。
当将某种蛋白质，例如抗体配制入药物组合物时，如果在该药物组合物中未出现沉淀、凝聚和/或变性的可见迹象(即，变色或澄清度丧失)或可测迹象(例如，采用体积排阻层析(SEC)或紫外光散射法)时，则可认为该蛋白质在给定时间点保留了其物理稳定性。就化学稳定性而言，当将某种蛋白质，例如抗体配制入药物组合物时，如果化学稳定性的测定显示该蛋白质(即，抗体)在该药物组合物中保留了其感兴趣的生物活性，则可认为该蛋白质保留了其化学稳定性。测定化学稳定性变化的方法是本领域熟知的，包括但不限于用例如SDS-PAGE、SEC和/或衬质辅助激光解析与电离-飞行时间质谱检测因剪切所致蛋白质的化学改变形式的方法；和用例如离子交换色谱检测与分子荷电改变相关(例如，与脱氨基相关)的降解的方法。参见例如，以全文纳入本文作参考的2004年11月4日提交的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916))，题目也是“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use)所述的方法。
当将拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段配制入药物组合物时，如果在给定时间的所需生物活性处于该药物组合物制备之时用所需生物活性的合适试验检测到的所需生物活性的约30％以内，优选约20％以内，则可认为所述拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在该时间点保留了所需生物活性。检测拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的所需生物活性的试验可如本文的实施例所述进行。也参见纳入本文作为参考的以下文献所述的试验：Schutze等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci. USA92：8200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr Transplant.2：6-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164：688-697；Noelle，(1998)，Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等，(1996)，Curr Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等，(1991)，Current Protocols in Immunology 13：12；Kwekkeboom等，(1993)Immunology79：439-444；和美国专利号5,674,492和5,847,082。
当将拮抗性抗CD40抗体配制成液体制剂时，优选冻干液态药物组合物，以防止降解和保持无菌。本领域普通技术人员已知冻干液体组合物的方法。临用前，可用可包括其它成分的无菌稀释剂(如林格氏溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建该组合物。重建后，优选用本领域技术人员已知的方法将该组合物给予对象。
拮抗性抗-CD40抗体在生产药物中的应用
本发明也提供能阻断C4BP-介导的CD40信号转导的本发明拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗癌症患者的药物中的应用，所述癌症包含表达CD40的肿瘤细胞，其中所述药物与至少一种其它癌症疗法合作起作用。在一些实施方式中，该癌症的特征是致瘤性B细胞生长。这种癌症包括，但不限于上文所述的B细胞相关癌症，例如非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高级B细胞淋巴瘤、中级B细胞淋巴瘤、低级B细胞淋巴瘤、B细胞急性成淋巴细胞白血病、成髓细胞白血病、霍奇金病、浆细胞瘤、滤泡淋巴瘤、滤泡小粘着性淋巴瘤、滤泡大细胞淋巴瘤、滤泡混合小粘着性淋巴瘤、弥散性小粘着性细胞淋巴瘤、弥散性小淋巴细胞性淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病(PLL)、浆细胞样淋巴细胞淋巴瘤、边缘层淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞性淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛细胞性白血病、弥散性大细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞型淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、血管内淋巴瘤病、弥散性混合细胞性淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS-相关淋巴瘤和外套细胞淋巴瘤。在其它实施方式中，该癌症是实体瘤。包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤的例子包括但不限于：卵巢癌、肺癌(如鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌类型的非小细胞肺癌，以及小细胞肺癌)、乳腺癌、结肠癌、肾癌(包括例如肾细胞癌)、肝癌(包括例如肝细胞癌)、胃癌、***、***癌、鼻咽癌、甲状腺癌(如甲状腺***状癌)和皮肤癌如黑色素瘤、以及肉瘤(包括例如骨肉瘤和尤因肉瘤)。
提到需要治疗癌症的患者时，“合作”指含有拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物在用至少一种其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用。用于B细胞相关性癌症患者的其它癌症疗法的例子如本文上述的包括但不限于：手术；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植组合，其中合适的化疗药物包括，但不限于氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、环磷酰胺、阿霉素、***和它们的组合，例如含有蒽环类的方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加***)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、***加阿霉素)、VAD(长春新碱、阿霉素加***)、MP(美法仑加***)，和用于化疗的其它细胞毒性和/或治疗性药物，如米托蒽醌、道诺红菌素、依达比星、天冬酰胺酶和抗代谢物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨；其它抗癌症单克隆抗体疗法(如阿来组单抗(Campath)或靶向恶性B细胞上CD52细胞表面糖蛋白的其它抗-CD52抗体；利妥昔单抗(利妥昔)、完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗(Zevalin)或靶向恶性B细胞上CD20抗原的任何其它治疗性抗-CD20抗体；抗-CD19抗体(如双特异性抗体MT103)；抗-CD22抗体(如人源化单克隆抗体埃坡组单抗(epratuzumab))；贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)或其它靶向人血管内皮细胞生长因子的抗癌抗体；靶向恶性B细胞上CD22抗原的抗-CD22抗体(例如，单克隆抗体BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬细胞集落刺激因子的α-M-CSF抗体；靶向多发性骨髓瘤中过度表达的核因子-κB(RANK)及其配体(RANKL)的受体激活剂的抗体；靶向恶性B细胞上CD23抗原的抗-CD23抗体(例如，IDEC-152)；靶向恶性B细胞上CD38抗原的抗-CD38抗体；靶向表达于恶性B细胞上主要组织相容性复合体II类受体的抗体(抗-MHC抗体)；其它靶向恶性B细胞上CD40抗原的抗-CD40抗体(如SGN-40；和阻断CD40表达细胞上CD40L-介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗-CD40抗体如CHIR-12.12和CHIR-5.9，及其抗原结合片段，如2004年11月4日提交的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916)，题目也是“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use))所述；和靶向表达于许多实体肿瘤和造血来源的肿瘤上肿瘤坏死因子相关促凋亡配体受体1(TRAIL-R1)的抗体(例如，激动性人单克隆抗体HGS-ETR1))；基于小分子的癌症疗法，所述小分子包括但不限于微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如，有丝***抑制剂多拉斯他汀和其类似物；微管蛋白结合药物T900607；XL119；和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲酰基十字孢碱)、pixantrone、奥沙利铂(一种抗肿瘤药物)、硝酸镓(硝酸镓)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白质激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(诱导恶性淋巴细胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷类似物，如氯法拉滨、癌细胞产生蛋白质Bc1-2的抑制剂(例如，反义药物奥利默森和Genasense)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰酶的小分子抑制剂(例如，杂交/极性细胞分化HPC)药物，如N-辛二酰苯异羟肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡药物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬钆)；基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法，包括但不限于疫苗方法(如Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化的免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，MyVax个性化免疫疗法，以前命名为GTOP-99)、Promune(CpG 7909，一种toll-样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素-α疗法、白介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法；类固醇疗法；或其它癌症疗法；其中用其它癌症疗法治疗可在用上述包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗对象之前、期间或之后给予。
用于包含表达CD40的肿瘤细胞的实体瘤的癌症患者的其它癌症治疗的例子包括但不限于：手术；放疗；化疗，其中合适的化疗药包括但不限于：氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、戊糖苷、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、环磷酰胺、多柔比星、氯***和其组合，例如含有蒽环类的方案如CAP(环磷酰胺、多柔比星加氯***)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、氯***加多柔比星)、VAD(长春新碱、多柔比星加***)、MP(美法仑家氯***)，以及用于化疗的其它细胞毒剂和/或治疗剂，如米托蒽醌、道诺霉素、黄胆素、天冬酰胺酶和抗代谢物，包括但不限于：阿糖胞苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨；细胞因子疗法，包括但不限于：α-干扰素治疗，γ-干扰素治疗，采用白介素-2(IL-2)、IL-12、IL-15和IL-21的治疗，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或这些细胞因子的生物活性变体；或考虑用于治疗感兴趣实体瘤的其它单克隆抗体，如靶向Her2+乳腺癌细胞上的Her2受体蛋白的贺赛汀(Genentech，Inc.，加利福尼亚州旧金山)；结合于并抑制血管内皮生长因子(VEGF)的能够用于治疗结肠癌的人源化单克隆抗体阿瓦斯汀TM(也称为贝伐单抗；Genentech，Inc.，加利福尼亚州旧金山)；靶向表皮生长因子受体的抗EGFR抗体(如IMC-C225(ImClone Systems，纽约州纽约)；靶向IGF-1受体蛋白的抗IGF-1受体抗体；靶向肿瘤相关抗原MUC1的抗MUC1抗体；靶向相应整联蛋白的抗α5β1、抗αvβ5和抗αvβ3，整联蛋白能调节细胞粘附以及参与细胞增殖和存活的信号通路；靶向此钙粘着蛋白家族成员的抗-P-钙粘着蛋白抗体(参见例如，共待审的美国专利申请公开号20030194406)；靶向此内皮细胞-特异性粘着分子的血管新生相关功能的抗-VE-钙粘着蛋白抗体；和能阻断表达CD40的肿瘤细胞上CD40L-介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体如CHIR-12.12和CHIR-5.9及其抗原结合片段，如2004年11月4日提交的国际专利申请号PCT/US2004/037152(代理案卷号PP20107.004(035784/282916))，题目也是“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use)所述；当采用其它癌症治疗时，在使用包含拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗患者之前、期间或之后进行治疗，如上所述。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了阻断C4BP-介导的CD40信号转导的拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的B细胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的药物中的应用，其中所述药物与至少一种其它癌症疗法合作起作用，其它癌症疗法选自：化疗、抗癌抗体治疗、基于小分子的癌症治疗和基于疫苗/免疫治疗的癌症治疗，其中，所述药物在用其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者，在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法之前、期间或之后使用。
因此，例如，在一些实施方式中，本发明提供了本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的B细胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的药物中的应用，其中所述药物与化疗合作起作用，化疗药选自环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、氯***和其组合，如CHOP。在其它实施方式中，本发明提供了本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的B细胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的药物中的应用，其中所述药物与至少一种其它抗癌抗体合作起作用，其它抗癌抗体选自：阿来组单抗(Campath)或靶向恶性B细胞上CD52细胞表面糖蛋白的其它抗-CD52抗体；利妥昔单抗(利妥昔)、完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar)、替伊莫单抗tiuxetan(Zevalin)或靶向恶性B细胞上CD20抗原的任何其它治疗性抗-CD20抗体；抗-CD19抗体(如双特异性抗体MT103)；抗-CD22抗体(如人源化单克隆抗体埃坡组单抗(epratuzumab))；贝伐单抗(阿瓦斯汀)或靶向人血管内皮细胞生长因子的其它抗癌抗体；完全人单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9或阻断CD40L-介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体；以及它们的任何组合；其中，所述药物在用其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者，在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法之前、期间或之后使用。
在其它实施方式中，本发明提供了本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的B细胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的药物中的应用，其中所述药物与至少一种基于小分子的其它癌症治疗合作起作用，基于小分子的其它癌症治疗选自微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如有丝***抑制剂多拉斯他汀和其类似物；微管结合剂T900607；XL119和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)，SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂如米哚妥林(PKC-412、CGP41251、N-苯甲酰基十字孢碱)、pixantrone、奥沙利铂(一种抗肿瘤药物)、硝酸镓(硝酸镓)、Thalomid(沙立度胺)、凋亡剂如Xcytrin(莫特沙芬钆)、癌细胞产生的蛋白Bc1-2的抑制剂(例如，反义药物奥利默森和Genasense)、奈拉滨及其任何组合；其中，所述药物在用其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者，在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法之前、期间或之后使用。
在其它实施方式中，本发明提供拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的B细胞性淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤的药物中的应用，所述药物与用至少一种选自以下的基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法的治疗合作起作用：疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化的免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，MyVax个性化免疫疗法，以前命名为GTOP-99)、Promune(CpG 7909，一种toll-样受体9(TLR9)的合成激动剂)、白介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法，和它们的任何组合；所述药物在其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用。
在一些实施方式中，在一些实施方案中，本发明提供了本发明拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的B细胞相关白血病，例如急性B细胞型淋巴细胞性白血病(B-ALL)的药物中的应用，所述药物与至少一种选自化疗和抗代谢物疗法的其它癌症疗法的治疗合作起作用，所述药物在其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者，在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法之前、期间或之后使用。这种实施方案的例子包括，但不限于包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物与选自以下的化疗药物或抗代谢物的治疗合作起作用：环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***、阿糖胞苷、米托蒽醌、依达比星、天冬酰胺酶、氨甲喋呤、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤，和它们的组合；所述药物在其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用，或者在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用。在一个这样的实施方案中，所述药物与阿糖胞苷加道诺红菌素、阿糖胞苷加米托蒽醌和/或阿糖胞苷加依达比星的治疗合作起作用；所述药物在其它癌症疗法治疗B-ALL对象之前、期间或之后使用，或者，在多重组合疗法中，所述药物在其它癌症疗法之前、期间或之后使用。
在一些实施方式中，本发明提供了阻断C4BP-介导的CD40信号转导的本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗实体瘤患者的药物中的应用，所述实体瘤包含表达CD40抗原的肿瘤细胞，其中所述药物与化疗合作起作用，化疗药选自可用于(例如)治疗结直肠癌和非小细胞肺癌的CPT-11(伊立替康)；可用于(例如)治疗肺癌、乳腺癌和上皮性卵巢癌的吉西他滨；以及适合用于治疗实体瘤的其它化疗药；在用包含拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗患者之前、期间或之后用其它癌症疗法治疗，如上所述。
在其它实施方式中，本发明提供了本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗实体瘤患者的药物中的应用，所述实体瘤包含表达CD40抗原的肿瘤细胞，其中所述药物与至少一种其它抗癌抗体的治疗合作起作用，所述其它抗癌抗体选自靶向Her2+乳腺癌细胞上的Her2受体蛋白的贺赛汀(Genentech，Inc.，加利福尼亚州旧金山)；结合于并抑制血管内皮生长因子(VEGF)的能够用于治疗结肠癌的人源化单克隆抗体阿瓦斯汀TM(也称为贝伐单抗；Genentech，Inc.，加利福尼亚州旧金山)；靶向表皮生长因子受体的抗EGFR抗体(如IMC-C225(LnClone Systems，纽约州纽约)；靶向IGF-1受体蛋白的抗IGF-1受体抗体；靶向肿瘤相关抗原MUC1的抗MUC1抗体；靶向相应整联蛋白的抗α5β1、抗αvβ5和抗αvβ3，整联蛋白能调节细胞粘附以及参与细胞增殖和存活的信号通路；靶向此钙粘着蛋白家族成员的抗-P-钙粘着蛋白抗体(参见例如，待批美国专利申请公开号20030194406)；靶向此内皮细胞-特异性粘着分子的血管新生相关功能的抗-VE-钙粘着蛋白抗体；和完全人单克隆抗体CHIR-12.12或CHIR-5.9，或能阻断CD40L-介导的CD40信号转导的其它拮抗性抗CD40抗体；在用包含拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗患者之前、期间或之后用其它癌症疗法治疗，如上所述。
本发明也提供本发明拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的癌症的药物中的应用，所述癌症包含表达CD40的肿瘤细胞，如特征为致瘤性B细胞增殖的癌症，包括本文上述的B细胞相关癌症或实体瘤，所述药物可用于已预先采用至少一种其它癌症疗法治疗过的对象。“预先治疗过”或“预先治疗”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物之前，对象已接受一种或多种其它癌症疗法(即，已用至少一种其它癌症疗法治疗过)。“预先治疗过”或“预先治疗”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗开始前的以下时间内曾采用至少一种其它癌症疗法治疗过的对象：2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。对象无需对先前一种或多种癌症疗法产生反应。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物的对象可以对先前癌症疗法或一种或多种先前癌症疗法(当预先治疗由多种疗法组成时)的预先治疗已产生反应或未产生反应。对象在接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物之前可接受的其它癌症疗法的例子包括，但不限于手术；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植组合，其中合适的化疗药物包括，但不限于上文所列的药物；其它抗癌症单克隆抗体疗法，包括但不限于上文所列的抗癌症抗体；基于小分子的癌症疗法，包括但不限于上文所列的小分子；基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法，包括但不限于上文所列的；类固醇疗法；其它癌症疗法；或它们的任何组合。
本文将合作使用本文所述的药物与一种或多种其它癌症疗法的“治疗”定义为将所述药物或其它癌症疗法应用于或给予患者，或将所述药物或其它癌症疗法应用于或给予患者的分离的组织或细胞系，所述患者患有包含表达CD40的肿瘤细胞的癌症，如特征为致瘤性B细胞增殖的癌症或实体瘤，具有这种癌症相关的症状，或患这种癌症的易感性，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响癌症、癌症相关症状、或发生癌症的易感性。
本发明也提供了阻断C4BP-介导的CD40信号转导的本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的自身免疫病和/或炎性疾病的药物中的应用，其中所述药物与至少一种其它治疗合作起作用。提到需要治疗自身免疫病和/或炎性疾病的患者时，“合作”指在用至少一种其它疗法治疗之前、期间或之后使用所述药物。用于自身免疫病和/或炎性疾病的其它疗法的例子包括但不限于：上述疗法，即外科或手术方法(如脾切除术，***切除术，甲状腺切除术，血浆去除术，白细胞去除术，细胞、组织或器官移植，器官灌注，肠操作等)、放疗、诸如类固醇治疗和非类固醇治疗等治疗、激素治疗、细胞因子治疗、用皮肤病药物(例如用于治疗皮肤病如过敏、接触性皮炎和牛皮癣的局部药剂)治疗、免疫抑制疗法和其它抗炎性单克隆抗体治疗等，其中在用包含拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗患者之前、期间或之后用其它疗法治疗，如上所述。在一个这种实施方式中，本发明提供了本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的自身免疫病和/或炎性疾病的药物中的应用，其中所述药物与至少一种其它治疗合作起作用，如上所述。
在一些实施方式中，包含本发明拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的药物与两种其它治疗合作起作用。当包含拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段的药物与两种其它治疗合作起作用时，可在用这两种治疗之一或二者治疗患者之前、期间或之后使用所述药物。
本发明也提供了阻断C4BP-介导的CD40信号转导的拮抗性抗CD40抗体或其抗原结合片段在生产治疗对象的自身免疫病和/或炎性疾病的药物中的应用，其中所述药物用于用至少一种其它疗法预先治疗过的对象。“预先治疗过”或“预先治疗”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物之前，已用一种或多种其它疗法治疗对象。“预先治疗过”或“预先治疗”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物治疗开始前的以下时间内曾采用其它疗法治疗过的对象：2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。对象无需对先前疗法的预治疗产生反应。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗体或其抗原结合片段的药物的对象可以对先前疗法的预治疗或一种或多种先前疗法(当预先治疗由多种疗法组成时)的预治疗产生反应或不产生反应。
本文将合作使用本文所述的药物与一种或多种用于自身免疫病和/或炎性疾病的其它疗法的“治疗”定义为将所述药物或其它癌症疗法应用于或给予患者，或将所述药物或其它癌症疗法应用于或给予来自患者的分离的组织或细胞系，所述患者患有自身免疫病和/或炎性疾病、与自身免疫病和/或炎性疾病相关的症状或发生自身免疫病和/或炎性疾病的易感性，目的是治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响自身免疫病和/或炎性疾病、自身免疫病和/或炎性疾病的相关症状或发生自身免疫病和/或炎性疾病的易感性。
提供以下实施例是为了说明，而非限制。
实验
以下方案可用于下述实施例。
用于定量免疫球蛋白的ELISA试验
用ELISA估计人IgM和IgG的浓度。用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的2μg/ml山羊抗-人IgG Mab(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)或2μg/ml山羊抗-人IgM mAb4102(Bio Source International，California)包被96-孔ELISA板，4℃孵育16小时。用PBS-0.05％吐温-20(PBS-吐温)洗涤板三次并用BSA饱和1小时。洗涤两次后，将板与测试样品的不同稀释液一起于37℃孵育2小时。洗涤三次后，与1μg/ml过氧化物酶标记的山羊抗-人IgG mAb或山羊抗-人IgM mAb37℃孵育2小时检测结合的Ig。洗涤板四次，加入邻-苯二胺作为底物显示结合的过氧化物酶活性。使用人IgG或IgM标准品(Caltaq，Burlingame，Califomia)建立每个试验的标准曲线。
分离人外周血的外周血单核细胞(PBMC)
在3只50ml的聚苯乙烯试管中各加入20ml Ficoll-Paque溶液(内毒素低；Pharmacia)，30分钟后加入血液。使Ficoll-Paque溶液加温至室温。制备3L1∶10稀释的漂白液(bleach)，用于洗涤接触血液的所有试管和移液管。血液以1.5ml血/1mlFicoll-Paque叠加在Ficoll-Paque溶液上部不再搅动Ficoll层。关闭离心机上的制动，在室温下1700rpm离心试管30分钟。尽可能多地吸取上层(血浆)，使真空度尽可能低以避免取出溶液的第二层。用无菌巴斯德移液管收集含有B和T淋巴细胞的第二层，并置于两个50ml聚苯乙烯试管中。收集液以3倍体积的无添加物的冷RPMI稀释，1000RPM离心试管10分钟。吸弃培养液，将两个50ml试管的细胞重悬于总体积10ml的冷RPMI(有添加物)中并转移至15ml试管。用血球计数器计数细胞，然后1000RPM离心10分钟。除去培养液，细胞重悬于4ml RPMI中。该组分含有PBMC。
从PBMC中分离B细胞
将100μl Dyna珠(抗-CD19)置于5-ml塑料试管中。向珠中加入3ml无菌PBS、混合、置于磁力支架上，然后静置2分钟。用巴斯德移液管吸弃溶液。加入3ml无菌PBS、混合、置于磁力支架上，然后静置2分钟。用无菌PBS再重复该过程一次，共洗涤三次。将PMBC加入珠中，搅拌下在40℃孵育30分钟。含有PBMC和珠的试管置于磁力支架上2分钟，然后将溶液移至磁力支架上的新的5ml试管内。2分钟后，将溶液移至新的15ml试管。再重复该步骤4次，将前4次的溶液收集在15ml试管中，然后1000RPM离心5分钟。该步骤产生了T细胞分离的沉淀。
加入100μl RPMI(有添加物)以收集珠，将溶液移入0.7ml试管内。在室温向悬液中加入10ul Dynal Detacha珠，旋状45分钟。将悬液移入新的5ml试管中并加入3ml RPMI(有添加物)。试管置于磁力支架上2分钟。将溶液移入支架上的新的5ml试管中，2分钟，然后移入15ml试管中。再重复前一步骤3次，溶液收集于15ml试管中。1000RPM离心15ml试管10分钟，细胞重悬于10ml RPMI中。再重复洗涤步骤两次，共洗涤3次。在最后离心之前计数细胞。该步骤完成了B细胞的纯化。细胞保存于90％FCS和10％DMSO中并于-80℃冷冻。
流式细胞术试验
将Ramos细胞(106个细胞/样品)于4℃用100μl一抗(以PBS-BSA配制为10μg/ml)孵育20分钟。用PBS-BSA或HBSS-BSA洗涤3次后，细胞在4℃用100μl FITC-标记的山羊抗-(人IgG)抗体(Caltaq)的F(ab′)2片段孵育20分钟。用PBS-BSA洗涤3次和用PBS洗涤1次后，细胞重悬于0.5-ml PBS中。用FACSCAN V (BectonDickinson，San Jose，California)进行分析。
产生杂交瘤克隆
如先前de Boer等，(1988)J.Immunol.Meth.113：143所述，采用50％聚乙二醇将取自免疫小鼠的脾细胞与SP2/0或P3×63Ag8.653鼠杂交瘤细胞以10∶1的比例融合。将融合的细胞重悬于补加了次黄嘌呤(0.1mM)、氨基喋呤(0.01mM)、胸苷(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)的完全IMDM培养基中。然后将融合的细胞分置于96-孔组织培养板的各孔之间，使平均每孔含有1个生长的杂交瘤。
10-14天后，筛选杂交瘤细胞群上清液中产生的特异性抗体。为筛选杂交瘤克隆产生的特异性抗体，合并每孔的上清液并先用ELISA检测抗-CD40活性特异性。然后将阳性(杂交瘤细胞)用于以上FACS试验所述EBV-转化B细胞的荧光细胞染色。通过在含有0.5ng/ml hIL-6的IMDM/FBS中有限稀释克隆阳性杂交瘤细胞两次。
实施例1：产生抗CD40抗体
利用携带人IgG1或IgG2重链基因座和人κ链基因座的转基因小鼠(Abgenixγ-1XenoMouse)产生抗CD40抗体。表达CD40胞外结构域的SF9昆虫细胞用作免疫原。融合小鼠脾(细胞)与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，以产生能在ELISA中识别重组CD40的抗体。平均约10％Abgenix XenoMouse产生的杂交瘤可能含有小鼠λ轻链，而非人κ链。选出含有小鼠λ轻链的抗体。选出也能结合细胞表面CD40的抗体亚组，进行进一步分析。在结合和功能试验中进一步鉴定用一系列亚克隆方法选出的稳定杂交瘤。进一步鉴定出，来自其它杂交瘤的克隆具有拮抗活性。根据它们的相对拮抗能力和抑制C4BP-介导的CD40信号转导从而影响CD40导向活性的能力，选择杂交瘤克隆进行进一步评价。
实施例2：所选择杂交瘤的结合特性
通过胺偶联将蛋白A固定在CM5生物传感器芯片上。以10μl/分钟的流速，用1.5分钟使1.5μg/ml抗CD40单克隆抗体捕获到修饰的生物传感器表面上。不同浓度的重组可溶性CD40-his流过生物传感器表面。用0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20(HBS-EP)稀释抗体和抗原。用Biaevaluation软件以1∶1交互作用模型/全局拟合测定动力学常数和亲和力常数。
实施例3：拮抗性抗CD40抗体对CD40/C4BP体外相互作用的影响
在一些情况下，候选抗体将防止C4BP结合于细胞表面CD40并取代预先结合的C4BP。测试候选抗体是否能够防止C4BP结合于淋巴瘤细胞系(Ramos)表面上的CD40。如流式细胞术所测定，合适的拮抗性抗CD40抗体与这些细胞上的CD40抗原结合防止后续的PE-C4BP、FITC-C4BP、生物素-C4BP或Alexfluor-C4BP结合。在第二组试验中，测试候选抗体是否能够取代预先结合于细胞表面CD40的C4BP。
实施例4：拮抗正常人对象的淋巴细胞的CD40导向增殖的抗体
C4BP对CD40的作用能刺激CD40信号转导，该信号通路能诱导正常人B细胞增殖。预计阻断C4BP-介导的CD40信号转导的拮抗性抗CD40抗体能抑制此增殖。
测定候选抗体是否能够抑制C4BP-介导的CD40信号转导和后续正常人对象的PBMC的增殖。可溶性C4BPα链亚基和C4BPα7β1异聚体用作激动剂。通过掺入氚标记的-胸苷来测定PBMC增殖。用多个供者的PBMC(n＞1)进行该试验，以保证观察到的抑制不是单个供者的细胞的特别现象。这些试验中采用多种抗体浓度(0.01μg/ml-100μg/ml)。通常，感兴趣抗体将干扰C4BP-介导的CD40信号转导，从而抑制CD40导向的增殖，大部分情况下抗体浓度为0.1μg/ml。
除了B细胞以外，人PBMC也含有可介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的天然杀伤细胞。为了阐明抗体介导的增殖抑制的机制，用从人PBMC纯化的B细胞进行试验。如果抗体可抑制C4BP与CD40结合诱导的纯化B细胞的CD40导向增殖，那么在这些试验中是候选抗体的拮抗剂活性而非ADCC机制引起了增殖抑制。
实施例5：拮抗性抗体不诱导正常人对象B细胞的强烈增殖
C4BP能诱导正常B细胞增殖。激动性抗CD40抗体的结合可为正常和恶性B细胞的增殖提供相似的刺激信号。具有强烈B细胞刺激活性的抗体不是治疗性治疗B细胞淋巴瘤和自身免疫病的合适候选物。测定能阻断C4BP-介导的CD40信号转导的候选抗体是否能够诱导正常志愿供者的B细胞增殖。用不同浓度的候选抗体(0.001-100μg/ml)培养由正常供者PBMC纯化的B细胞，共计4天。通过掺入氚标记的胸苷测定B细胞增殖。当可溶性C4BP诱导B细胞强烈增殖时，适合用于本发明方法的候选抗体仅诱导正常B细胞轻微增殖。
除了B细胞以外，人PBMC包含携带IgG1分子的Fc受体(FcR)的细胞类型，其可使结合于B细胞上CD40的抗CD40抗体交联。此交联可能增强抗CD40抗体的刺激活性。为证实在交联细胞存在下候选抗体没有B细胞刺激活性，用含有B细胞和FcR+细胞的总PBMC进行增殖实验。通常，即使在携带FcR的细胞的存在下，相对于对照人IgG1诱导的背景增殖，这些候选抗体也不刺激B细胞增殖。通过测定由于对培养孔的塑料表面上固定的候选抗CD40抗体起反应而发生的PBMC增殖，进一步证实候选mAb没有刺激活性。总之，这些数据证明，候选抗CD40抗体没有强烈的B细胞刺激特性。
实施例6：候选抗体能够通过ADCC杀伤携带CD40的靶细胞
在一些情况下，候选抗体可通过ADCC机制杀伤携带CD40的靶细胞(淋巴瘤细胞系和/或实体瘤细胞系)。预计IgG1同种型抗体能够通过ADCC机制诱导杀伤靶细胞。测定了候选抗CD40抗体是否能够在体外试验中杀伤癌细胞系。将两种人淋巴瘤细胞系(Ramos和Daudi)、一种人结肠癌细胞系(HCT116)和七种其它癌细胞系(包括卵巢癌细胞系SKOV3和HEY、皮肤鳞癌细胞系A431、乳腺癌细胞系MDA-MB231和MDA-MB435以及肺癌细胞系NCI-H460和SK-MES-I选作这些试验的靶细胞。将正常志愿供者的PBMC或富集的NK细胞用作这些试验中的效应器细胞。
实施例7：候选抗体不刺激来自NHL患者***的癌细胞增殖
CD40信号转导能诱导来自NHL患者的淋巴瘤细胞存活和增殖。因此，C4BP可能在NHL中起作用。一些抗CD40抗体(激动剂)的结合可为患者癌细胞增殖提供相似的刺激信号。如上所述，具有强烈B细胞刺激活性的抗体不是治疗性治疗B细胞淋巴瘤的合适候选物。测定候选抗体是否能够诱导患者的NHL细胞增殖。用不同浓度的候选抗体(0.01-300μg/ml)培养分离自***(LN)活检物的细胞，共计3天。通过掺入氚标记的胸苷测定细胞增殖。通常，候选mAb在任何受试浓度下都不应诱导癌细胞增殖。即使存在外源性加入的B细胞生长因子IL-4，候选抗体也不应诱导NHL细胞增殖。这些结果表明，候选抗体是否是非激动性抗CD40抗体和不刺激患者NHL细胞的体外增殖。
实施例8：候选抗体可阻断C4BP-诱导的非霍奇金淋巴瘤患者的癌细胞增殖
C4BP对CD40的作用可诱导NHL患者的癌细胞增殖。预计候选拮抗性抗CD40抗体能抑制此增殖。测定不同浓度(0.01μg/ml-100μg/ml)的候选抗CD40抗体是否能够抑制C4BP与这些细胞上的CD40抗原结合而诱导的CD40导向的NHL细胞增殖。在IL-4存在下与C4BP一起悬浮培养患者的NHL细胞。通过掺入3H-胸苷测定NHL细胞增殖。与对照相比，感兴趣的候选抗体以剂量依赖方式抑制NHL细胞增殖，抑制效果随拮抗性抗CD40抗体浓度增加而提高。
实施例9：与C4BP表达细胞一起培养时，候选抗体对活NHL细胞数量的影响
C4BP与CD40结合是刺激CD40表达细胞的一种可选方法。CD40信号转导对B细胞存活很重要。该组实验评价了在C4BP存在下，第7、10和14天候选抗CD40抗体对NHL细胞数量的影响。在IL-4存在下与C4BP一起悬浮培养患者的NHL细胞。在第0天和第7天加入浓度为10μg/ml的对照人IgG和候选抗体。在特定天计数各条件下的活细胞。对照组(IgG)的细胞数量通常随时间而增加。通常，与对照组相比细胞数量减少发生在拮抗性抗体存在时。
本发明所属领域的技术人员可从前文描述和相关附图中获益进而想出这些发明的许多改进形式和其它实施方案。因此，应该理解本发明不受限于所公开的具体实施方案，这些改进形式和其它实施方案均包括在附加权利要求的范围和本文所公开实施方案的内容中。虽然本文使用了特定的术语，但它们仅是一般性和描述性地使用并非出于限制的目的。
说明书中述及的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域技术人员的水平。如同每篇单独的出版物或专利申请特定且独立地用作参考一样，所有出版物和专利申请纳入本文作为参考。

Claims (46)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合于细胞表面上表达的CD40抗原，所述抗体或其抗原结合片段没有显著的CD40激动剂活性，其中所述抗体与所述CD40抗原结合阻断了C4b结合蛋白(C4BP)介导的CD40信号转导。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是完全人抗-CD40单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是人源化抗-CD40单克隆抗体。
5.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是有免疫活性的嵌合抗-CD40单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体与所述CD40抗原的结合亲和力(KD)至少约为10-6M-10-12M。
7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体与CD40上C4BP结合位点的至少一部分结合的亲和力高于C4BP。
9.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段与所述CD40抗原结合通过空间抑制所述C4BP与所述CD40抗原结合而阻断C4BP-介导的CD40信号转导。
10.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段通过竞争所述CD40抗原上C4BP结合位点的至少一部分而竞争性抑制C4BP与所述CD40抗原结合。
11.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段与所述CD40抗原结合阻断了所述C4BP连接于所述CD40抗原时产生的CD40信号转导。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是重组产生的。
13.一种杂交瘤细胞系，其能够产生权利要求2所述的单克隆抗体。
14.一种拮抗性抗CD40抗体，其能够结合于CD40上C4b结合蛋白(C4BP)结合位点的至少一部分。
15.如权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述抗体是完全人抗体。
16.如权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述抗体没有显著的CD40激动剂活性。
17.如权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段与所述CD40抗原结合通过空间抑制所述C4BP与所述CD40抗原结合而阻断C4BP-介导的CD40信号转导。
18.如权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段通过竞争所述CD40抗原上C4BP结合位点的至少一部分而竞争性抑制C4BP与所述CD40抗原结合。
19.如权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段与所述CD40抗原结合阻断了所述C4BP连接于所述CD40抗原时产生的CD40信号转导。
20.如权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述抗体与CD40上C4BP结合位点的至少一部分结合的亲和力高于C4BP。
21.一种抑制CD40表达细胞的CD40导向活性的方法，其中C4b结合蛋白(C4BP)与所述细胞表面上表达的CD40抗原结合介导了所述CD40导向活性，所述方法包括将所述细胞与有效量的能够特异性结合于所述CD40抗原的抗CD40抗体或其抗原结合片段相接触，所述抗CD40抗体或其抗原结合片段没有显著的CD40激动剂活性，其中所述抗体与所述CD40表达细胞上的所述CD40抗原结合阻断了C4BP-介导的CD40信号转导，从而抑制所述CD40导向活性。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述CD40导向活性选自细胞增殖、细胞分化、抗体产生、细胞记忆产生、同种型交换、胞间粘着、分泌细胞因子、分泌金属蛋白酶和表达细胞粘着分子。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述CD40表达细胞是正常的B细胞，受抑制的所述CD40导向活性选自细胞增殖、细胞分化和抗体产生。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述CD40表达细胞是恶性B细胞或实体瘤中表达CD40的肿瘤细胞，受抑制的所述CD40导向活性是细胞增殖。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗体或其抗原结合片段与所述CD40抗原结合通过空间抑制所述C4BP与所述CD40抗原结合而阻断C4BP-介导的CD40信号转导。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗体或其抗原结合片段通过竞争所述CD40抗原上C4BP结合位点的至少一部分而竞争性抑制C4BP与所述CD40抗原结合。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗体或其抗原结合片段与所述CD40抗原结合阻断了所述C4BP连接于所述CD40抗原时产生的CD40信号转导。
28.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗体是单克隆抗体。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体是完全人抗-CD40单克隆抗体。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体是人源化抗-CD40单克隆抗体。
31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体是有免疫活性的嵌合抗-CD40单克隆抗体。
32.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗体与所述CD40抗原的结合亲和力(KD)至少约为10-6M-10-12M。
33.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和单链Fv片段。
34.一种治疗需要治疗的对象的CD40相关性疾病的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的权利要求1-12和14-20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述CD40相关性疾病是癌症。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述癌症是B细胞相关性癌症，选自非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高级B细胞淋巴瘤、中级B细胞淋巴瘤、低级B细胞淋巴瘤、B细胞急性成淋巴细胞白血病、成髓细胞白血病、霍奇金病、浆细胞瘤、滤泡淋巴瘤、滤泡小粘着性淋巴瘤、滤泡大细胞淋巴瘤、滤泡混合小粘着性淋巴瘤、弥散性小粘着性细胞淋巴瘤、弥散性小淋巴细胞性淋巴瘤、前淋巴细胞性白血病、浆细胞样淋巴细胞淋巴瘤、边缘层淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞性淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛细胞性白血病、弥散性大细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞型淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、血管内淋巴瘤病、弥散性混合细胞性淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS-相关淋巴瘤和外套细胞淋巴瘤。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述癌症是包含表达CD40抗原的肿瘤细胞的实体瘤。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述实体瘤选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮肤癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、***癌、肾细胞癌、鼻咽癌、鳞状细胞癌、甲状腺***状癌、***和肉瘤。
39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，还包括给予所述对象考虑用于治疗所述癌症的至少一种其它癌症疗法，其中所述至少一种其它癌症疗法选自手术、放疗、化疗、其它抗癌单克隆抗体疗法、基于小分子的癌症疗法、基于疫苗的癌症疗法、基于免疫治疗的癌症疗法和类固醇疗法。
40.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述CD40相关性疾病是炎性疾病或自身免疫病。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病或自身免疫病选自***性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、结节病、少年关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、器官或组织移植排斥、移植物抗宿主病、多发性硬化、高免疫球蛋白E血症综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克罗恩氏病、乳糜泻(麸胶敏感性肠病)、自免疫肝炎、恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、牛皮癣、硬皮病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、溶栓、心肌病、寻常天疱疮、肺间质纤维化、结节病、I型和II型糖尿病、1型、2型、3型和4型迟发型***反应、过敏或过敏性疾病、哮喘、丘-施综合征(过敏性肉芽肿病)、特应性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、风疹、IgE-介导的过敏、动脉粥样硬化、血管炎、特发性炎性肌病、溶血性疾病、阿耳茨海默病和慢性炎性脱髓鞘多神经病。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述器官或组织移植选自心脏、肺、肾、胰、皮肤和骨髓。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述治疗还包括给予所述对象至少一种其它治疗，选自手术、器官灌注、放疗、类固醇治疗、非类固醇治疗、抗生素治疗、抗真菌治疗、激素治疗、细胞因子治疗、用皮肤病药物治疗、免疫抑制疗法和其它抗炎单克隆抗体治疗。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述CD40相关性疾病是器官或组织移植排斥，也给予所述对象免疫抑制剂，所述免疫抑制剂选自环孢霉素、FK506、雷帕霉素、皮质类固醇、CTLA4-Ig和抗B淋巴细胞刺激物抗体。
45.一种鉴定抑制C4BP与CD40抗原结合的抗体的方法，所述方法包括进行C4BP和结合CD40的抗体之间的竞争性结合试验。
46.一种人单克隆抗体，其能够特异性结合于人CD40表达细胞表面上表达的人CD40抗原，所述单克隆抗体没有显著的激动剂活性，其中所述抗体与所述CD40抗原结合阻断了所述细胞中C4BP-介导的CD40信号转导。
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