CN101325970B - 抗cd40抗体的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症患者的方法，其中所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)。也提供了抑制FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)的B细胞产生抗体的方法。所述方法包括给予所述病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体。也提供了鉴定患有可用抗CD40抗体治疗但用利妥昔单抗(利妥昔
Figure B2006800462131A00011
)难以治疗的癌症或癌前病症病人的方法和试剂盒，以及选择用于治疗患有用利妥昔单抗(利妥昔

Description

抗CD40抗体的应用
本发明涉及抗CD40抗体的新应用，具体是治疗细胞表达CD40的癌症和癌前病症。
                        发明背景
配体的肿瘤坏死因子(TNF)家族的许多成员和其对应受体能通过诱导凋亡或提高细胞存活和增殖调节正常细胞的生长。凋亡信号与存活和增殖信号之间的这种平衡维持了正常的细胞稳态。迄今为止，鉴定了至少26种TNF受体家族成员和18种TNF配体家族成员。这些受体和配体的生物活性形式是自身组装的蛋白质三聚体。已经鉴定了这些受体和配体的跨膜和可溶形式。虽然这些受体的胞内域没有序列同源性，但其胞外结构域含有40个氨基酸，富含半胱氨酸的重复。它们的胞质尾信号通过与两类主要的胞内蛋白：TNF受体相关因子(TRAF)和含死亡结构域(DD)的蛋白质相互作用而传递。至少六种人TRAF和一些受体胞质尾上的TRAF-结合位点之间的相互作用启动了几种信号传导途径，包括AKT(丝氨酸/苏氨酸激酶，称为蛋白激酶B或PKB)、核因子-κB(NF-κB)和促***原活化蛋白激酶(MAPK)途径。参见例如，Younes和Kadin(2003)J Clin.Oncol.18：3526-3534的综述。
TNF受体家族成员CD40是50-55kDa细胞表面抗原，存在于正常和恶性人B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD8+T细胞、内皮细胞、单核细胞和上皮细胞以及许多实体瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和结肠癌)表面。CD40配体(CD40L)与B细胞膜上CD40抗原的结合提供了刺激B细胞激活和增殖的共同刺激阳性信号，导致B细胞成熟为分泌高水平可溶性免疫球蛋白的浆细胞。CD40能激活TRAF-2、-3、-5和-6，以便在CD40与CD40L(膜结合的CD40L或可溶性CD40L)结合后上调各种信号传导途径，包括胞外信号调节的激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38促***原活化蛋白激酶(MAPK)、AKT和NF-κB途径(参见例如，Younes和Carbone(1999)Int.J.Biol.Markers 14：135-143；van Kooten和Banchereau(2000)J.Leukoc.Biol.67：2-17)。
B-细胞谱系肿瘤类型的恶性B细胞表达CD40，似乎依赖CD40信号转导方能存活和增殖。低级和高级B细胞淋巴瘤、急性B细胞淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和霍奇金病患者的转化细胞均表达CD40。在急性髓母细胞性白血病和50％AIDS相关性淋巴瘤中检测到CD40表达。
许多癌和肉瘤的CD40表达水平也很高，但尚不明了CD40信号转导在这些癌细胞中的作用。表达CD40的癌包括膀胱癌(Paulie等(1989)J.Immunol.142：590-595；Braesch-Andersen等(1989)J.Immunol.142：562-567)、乳腺癌(Hirano等(1999)Blood 93：2999-3007；Wingett等(1998)Breast Cancer Res.Treat.50：27-36)；***癌(Rokhlin等(1997)Cancer Res.57：1758-1768)、肾细胞癌(Kluth等(1997)Cancer Res.57：891-899)、未分化的鼻咽癌(UNPC)(Agathanggelou等(1995)Am.J.Pathol.147：1152-1160)、鳞状细胞癌(SCC)(Amo等(2000)Eur.J.Dermatol.10：438-442；Posner等(1999)Clin.Cancer Res.5：2261-2270)、甲状腺***状癌(Smith等(1999)Thyroid 9：749-755)、皮肤恶性黑色素瘤(van den Oord等(1996)Am.J.Pathol.149：1953-1961)、胃癌(Yamaguchi等(2003)Int.J.Oncol.23(6)：1697-702)和肝癌(参见例如，Sugimoto等(1999)Hepatology 30(4)：920-26，讨论人肝细胞癌)。就表达CD40的肉瘤而言，参见例如，Lollini等(1998)Clin.Cancer Res.4(8)：1843-849，讨论人骨肉瘤和尤因肉瘤。
CD40信号转导保护不成熟的B细胞和B细胞淋巴瘤避免IgM或Fas诱导的凋亡(参见例如，Wang等(1995)J.Immunol.155：3722-3725)。套细胞淋巴瘤细胞表达高水平的CD40，加入外源性CD40配体能增加其存活，并从氟达拉滨-诱导凋亡中拯救它们(Clodi等(1998)Brit.J.Haematol.103：217-219)。CD40信号转导在恶性B细胞存活和增殖中的作用使CD40抗原成为抗癌治疗的潜在靶点。实际上，在体外拮抗性抗CD40抗体能抑制恶性人B细胞的体外增殖和/或分化(参见例如，美国专利申请公开号20040109857)。而且，侵袭性人淋巴瘤的鼠模型证明，抗CD40抗体在体内具有提高动物存活率的功效。参见例如，Funakoshi等(1994)Blood 83：2787-2794；Tutt等(1998)J Immunol.161：3176-3185；和Szocinski等(2002)Blood 100：217-223。
CD40配体(CD40L)也称为CD154，它是32-33kDa跨膜蛋白，也分别以两种较小的生物活性可溶形式18kDa和31kDa存在(Graf等(1995)Eur.J.Immunol.25：1749-1754；Mazzei等(1995)J Biol.Chem.270：7025-7028；Pietravalle等(1996)J.Biol.Chem.271：5965-5967)。CD40L在活化、而非静息的CD4+T-辅助细胞上表达(Lane等(1992)Eur.J.Immunol.22：2573-2578；Spriggs等(1992)JExp.Med.176：1543-1550；和Roy等(1993)J Immunol.151：1-14)。已经克隆和鉴定了CD40和CD40L(Stamenkovi等(1989)EMBO J.8：1403-1410；Armitage等(1992)Nature 357：80-82；Lederman等(1992)J Exp.Med.175：1091-1101；和Hollenbaugh等(1992)EMBO J.11：4313-4321)。也参见美国专利号5,945,513对人CD40L的描述。用CD40L基因转染并且表面表达CD40L蛋白的细胞可引发B-细胞增殖，与其它刺激信号一起诱导产生抗体(Armitage等(1992)同上；和美国专利号5,945,513)。恶性淋巴肿瘤、自身免疫病、心血管病和特发性血小板增多症的患者的可溶性CD40L(sCD40L)血清水平升高，而健康对象中没有这种现象。在患有几种B细胞恶性淋巴肿瘤，包括套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、弥散性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和HIV-感染的B-细胞淋巴瘤的患者亚组中观察到CD40L的组成型表达。参见例如，Clodi等(1998)Br.J.Haematol.103：270-275；Schattner等(1998)Blood 91：2689-2697；Moses等(1997)Nat.Med.3：1242-1249；Trentin等(1997)Cancer Res.57：4940-4947；和Pham等(2002)Immunity 16：37-50)。CD40L可能在癌症滤泡内表达CD40的肿瘤B细胞或霍奇金疾病区域内表达CD40的里德-斯特恩伯格细胞的细胞接触依赖性相互作用中起到重要作用(Carbone等(1995)Am.J.Pathol.147：912-922)。然而，尚未完全了解CD40L介导的CD40信号转导导致恶性B-细胞的存活与细胞死亡反应的机制。例如，在滤泡淋巴瘤细胞中，凋亡诱导性TRAIL分子下调(APO-2L)(Ribeiro等(1998)British J.Haematol.103：684-689)和bcl-2过度表达，在B-CLL病例中CD95(Fas/APO-1)下调(Laytragoon-Lewin等(1998)Eur.J.Haematol.61：266-271)是其存活机制。相反，从滤泡性淋巴瘤获得的证据表明，CD40激活可导致TNF(Worm等(1994)International Immunol.6：1883-1890)和CD95分子(Plumas等(1998)Blood 91：2875-2885)上调。
人抗CD40单克隆抗体及其诸多应用可参见公开号WO 2005/044854、WO2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO2005/044307和WO 2005/044294的待批专利申请。这些申请特别公开了人IgG1抗CD40单克隆抗体，其中称为CHIR-12.12的单抗，它通过免疫接种携带人IgG1重链基因座和人K轻链基因座的转基因小鼠产生(捷诺小鼠技术公司(XenoMouse
Figure S2006800462131D00041
technology)；加州阿布吉尼克斯(Abgenix，California))。
如FACS分析所示，CHIR-12.12能特异性结合人CD40，可阻断CD40-配体(CD40L)的结合。CHIR-12.12可竞争除去预先结合于细胞表面CD40的CD40L。CHIR-12.12单克隆抗体是一种强拮抗剂，在体外抑制CD40L介导的正常和恶性B细胞增殖。CHIR-12.12单克隆抗体直接抑制CD40L介导的正常人B-淋巴细胞存活和信号传导途径。在体外，CHIR-12.12通过ADCC杀伤NHL患者的原发性癌细胞。在异种移植瘤人淋巴瘤模型中观察到其剂量依赖性抗肿瘤活性。CHIR-12.12目前处于治疗B细胞恶性肿瘤的I期临床试验中。
CD20是B细胞分化早期表达的一种细胞表面抗原，在整个B细胞发育过程中保持在细胞表面上表达。CD20参与了B细胞激活，在恶性B细胞中表达水平非常高，是临床上认定的治疗靶点(参见例如，Hooijberg等(1995)CancerResearch 55：2627)。美国食品药品管理局已经批准将靶向CD20的抗体如利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00042
)用于治疗非霍奇金淋巴瘤(参见例如，Boye等(2003)Ann.Oncol.14：520)。利妥昔
Figure S2006800462131D00043
已经显示能有效治疗低级、中级和高级非霍奇金淋巴瘤(NHL)，并且在其它B细胞恶性肿瘤中有活性(参见例如，Maloney等(1994)Blood 84：2457-2466)，McLaughlin等(1998)J Clin.Oncol 16：2825-2833，Maloney等(1997)Blood 90：2188-2195，Hainsworth等(2000)Blood 95：3052-3056，Colombat等(2001)Blood 97：101-106，Coiffer等(1998)Blood 92：1927-1932)，Foran等(2000)J.Clin.Oncol.18：317-324，Anderson等(1997)Biochem.Soc.Trans.25：705-708，或Vose等(1999)Ann.Oncol.10：58a)。
虽然准确的作用机制未知，但有证据表明，利妥昔
Figure S2006800462131D00044
的抗淋巴瘤作用部分归因于其补体介导的细胞毒性(CMC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抑制细胞增殖和最终直接诱导凋亡。ADCC是许多市售和研究的单克隆抗体的主要作用机制。然而，一些患者逐渐对利妥昔
Figure S2006800462131D00051
治疗产生耐药性(参见Witzig等(2002)；J Clin.Oncol.20：3262，Grillo-Lopez等(1998)J Clin.Oncol.16：2825，或Jazirehi等(2003)Mol.Cancer Ther.2：1183-1193)。例如，在抗-CD20抗体治疗后，一些患者的恶性B细胞不表达CD20(Davis等(1999)Clin.Cancer Res.5：611)。而且，30％-50％低级NHL患者对此单克隆抗体没有临床反应(Hainsworth等(2000)Blood 95：3052-3056；Colombat等(2001)Blood97：101-106)。利妥昔单抗在NHL中有无临床活性也能够与患者的FcγRIIIa基因型相关联。FcγRIIIa 158aa多态性V/V或V/F患者对利妥昔单抗的反应高于F/F多态性患者(例如，参见Cartron等(2002)Blood 99(3)：754-758或DalPOzzo等，Cancer Res.(2004)64：4664-4669)。对此种单克隆抗体产生耐药性的患者，或对此抗体初次治疗有耐药性的B-细胞淋巴瘤的患者需要采用其它形式的治疗干预。
因此，癌症和癌前病症一直需要新型治疗剂和新型治疗方案。具体说，需要治疗FcγRIIIa-158F纯合或杂合子和抗-CD20抗体如利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00052
)难以治疗的患者的新型治疗方案。而且，需要无需偶联物即能杀伤恶性细胞的制备成本便宜且副作用较少的抗体。
                        发明概述
提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人的方法，其中所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)。所述方法包括给予病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体。本发明也提供了治疗或预防有效量的抗CD40抗体在制备治疗FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)细胞表达CD40的癌症或癌前病症中的应用。
还提供了抑制FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)的B细胞产生抗体的方法，该方法包括给予病人有效量的抗CD40抗体。本发明也提供了有效量的抗CD40抗体在制备抑制FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(V/F或F/F)的B细胞产生抗体的药物中的应用。
也提供了鉴定患有可用抗CD40抗体治疗但用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00053
)难以治疗的癌症或癌前病症病人的方法和试剂盒。在一些实施方式中，所述方法包括：
a)鉴定患有细胞表达CD40但用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00061
)难以治疗的癌症或癌前病症病人；和
b)测定该病人的FcγRIIIa-158基因型(Y/V，V/F或F/F)；其中如果该病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合(基因型V/F或F/F)，则可用抗CD40抗体治疗其癌症或癌前病症。本发明还可包括给予用此方法鉴定的病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体的步骤。能够鉴定可用抗CD40抗体治疗的癌症或癌前病症病人的本发明试剂盒中装有测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂。
本发明也提供了选择用于治疗用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00062
)难以治疗的癌症或癌前病症病人的抗体疗法的方法和试剂盒。在一些实施方式中，所述方法包括：a)鉴定细胞表达CD40但用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00063
)难以治疗的癌症或癌前病症病人；和b)测定该病人的FcγRIIIa-158基因型(V/V、V/F或F/F)；如果该病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合(基因型V/F或F/F)，选择抗CD40抗体治疗其癌症或癌前病症。本发明还包括给予用此方法鉴定的病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体的步骤。用于选择治疗患有细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人的抗体疗法的本发明试剂盒中装有测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂。
本发明还提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症患者的方法，其中该方法包括给予所述病人缓慢内化的抗体。在一个这类实施方式中，给予所述病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体，给药后CD40表达细胞不明显内化抗CD40抗体。在另一个这类实施方式中，给予所述病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体，给药后抗CD40抗体保持基本均一地分布在CD40表达细胞表面上。在另一个这类实施方式中，给予所述病人抗CD40抗体，给药后治疗或预防有效量的抗CD40抗体存在于病人的CD40表达细胞表面上。
用于本发明的抗CD40抗体特异性结合CD40抗原。在一些实施方式中，用于本发明方法的抗CD40抗体，特别是单克隆抗体，与人FcγRIIIa-158V有强烈的结合亲和力，与人FcγRIIIa-158F有强烈的结合亲和力，或者与人FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F有强烈的结合亲和力。在一些实施方式中，抗CD40抗体可结合病人自然杀伤(NK)细胞上的两种FcγRIIIa氨基酸158同种异型之一(V或F)，其结合特性足以引起有效的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。合适的抗CD40抗体包括但不限于：无显著激动活性的抗CD40抗体，包括例如，能拮抗CD40表达细胞上CD40-CD40L信号转导的抗CD40抗体。在一些实施方式中，抗CD40抗体选自：
a)单克隆抗体CHIR-12.12；
b)杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体；
c)包含选自以下氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示序列以及SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示序列；
d)含有选自以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列以及SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3所示序列；
e)能够与杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体表位结合的单克隆抗体；
f)结合包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示人CD40序列残基82-87的表位的单克隆抗体；
g)结合包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示人CD40序列残基82-89的表位的单克隆抗体；
h)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；
i)前述项目a)所述的单克隆抗体或前述项目c)-h)中任一项所述的单克隆抗体，所述抗体是重组产生的；和
j)作为前述项目a)-i)中任一项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，所述片段保持了特异性结合人CD40抗原的能力。
本发明方法可用于治疗细胞表达CD40的癌症和癌前病症。例子包括但不限于：B-细胞谱系癌症、非B细胞血液恶性肿瘤，例如，急性髓细胞白血病、实体瘤和细胞表达CD20的癌症或癌前病症。就细胞同时表达CD40和CD20的癌症和癌前病症而言，本发明方法特别有利。以此方式，本发明能够治疗用其它癌症疗法剂难以治疗的癌症或癌前病症患者，这些治疗剂包括用于FcγRIIIa-158F纯合或杂合病人(基因型V/F或F/F)的抗-CD20抗体。
                        附图简要说明
图1A-1F显示了对六种细胞系抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的分析结果。
图2A-2D显示了对CLL患者细胞(n＝8)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的分析结果。
图3小结了对CLL患者细胞(n＝9)ADCC的分析结果。
图4显示了分析两位不同供者的NK效应细胞对CLL患者细胞的ADCC的结果。
图5显示了对CLL患者细胞和正常B细胞细胞表面表达CD40和CD20的定量结果。
图6小结了定量测定对表面表达CD40和CD20的细胞的ADCC活性。
图7是显示道迪(Daudi)和ARH77细胞系上细胞表面结合的CHIR-12.12水平的柱状图。
图8显示了用FACS分析CLL患者细胞中CHIR-12.12和利妥昔单抗内化的研究结果。
图9显示了用共聚焦显微镜观察FITC标记抗体，从而分析正常B细胞中CHIR-12.12和利妥昔单抗内化的研究结果。
图10显示了用共聚焦显微镜观察Alexa488-标记抗体，从而分析CLL患者细胞中CHIR-12.12和利妥昔单抗内化的研究结果。
图11小结了ADCC活性和内化之间的关系。
图12是柱状图，显示了CHIR-12.12或利妥昔单抗介导FcγRIIIa基因型不同供者的纯化NK效应细胞特异性裂解道迪细胞的最大百分数。
图13是柱状图，显示了CHIR-12.12或利妥昔单抗介导FcγRIIIa基因型不同供者的纯化NK效应细胞对道迪细胞的ADCC功效(ED50)。
图14小结了比较了CHIR-12.12和利妥昔单抗介导多种基因型人供者的NK细胞对CLL患者细胞(n＝9)的ADCC活性。
                        发明详述
本发明者令人惊讶地发现，抗CD40抗体如CHIR-12.12能够在其它ADCC介导抗体效率较低或相对无效的条件下介导对表达CD40的靶细胞强效抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。与其它抗体如利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00081
)相反，本发明所用的抗CD40抗体可结合于病人的自然杀伤(NK)细胞上的两种FcγRIIIa氨基酸158同种异型(V或F)，其结合特征足以引起有效ADCC。此发现出乎意料，代表了我们跨越整个患者层面治疗癌症和癌前病症能力的进展。
因此，除FcγRIIIa-158V纯合子病人(基因型V/V)以外，抗CD40抗体如CHIR-12.12可用于治疗FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或V/F)的细胞表达CD40的癌症和癌前病症。
因此，本发明提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人的方法，其中所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)，所述方法包括给予所述病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体。本发明还提供了治疗或预防有效量的抗CD40抗体在制备用于治疗FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)的细胞表达CD40的癌症或癌前病症的药物中的应用。
如上所述，利妥昔单抗在NHL中的临床活性与患者的FcγRIIIa基因型相关联。FcγRIIIa 158aa多态性F/F患者对利妥昔单抗的反应低于V/V或V/F多态性患者(例如，参见Cartron等(2002)Blood 99(3)：754-758或Dall′Ozzo等(2004)Cancer Res.64：4664-4669)。因此，对于用抗-CD20抗体如利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00091
)治疗无反应的癌症和癌前病症的治疗而言，本发明特别有利。
除FcγRIIIa-158V纯合子病人(基因型V/V)以外，抗CD40抗体如CHIR-12.12可用于抑制FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)的B细胞产生抗体的方法。
因此，本发明提供了抑制FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)的B细胞产生抗体的方法，所述方法包括给予所述病人有效量的抗CD40抗体，如CHIR-12.12。本发明还提供了有效量的抗CD40抗体在制备抑制FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(V/F或F/F)的B细胞产生抗体的药物中的应用。
本领域技术人员没有预料到，可以抑制FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)的B细胞产生抗体。
本发明提供了根据患者的FcγRIIIa-158基因型选择患者个体的治疗方案，该治疗方案给予ADCC介导性抗CD40抗体。
本发明提供了鉴定患有可用抗CD40抗体治疗但用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00092
)难以治疗的癌症或癌前病症病人的方法，所述方法包括：
a)鉴定患有细胞表达CD40但用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00101
)难以治疗的癌症或癌前病症病人；和
b)测定所述病人的FcγRIIIa-158基因型(V/V、V/F或F/F)；
其中如果所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)，则可用抗CD40抗体治疗其癌症或癌前病症。本发明还可包括给予用这种方法鉴定的病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体的步骤。
本领域技术人员采用合适诊断试剂盒不难用此方法鉴定患有可用抗CD40抗体治疗的癌症或癌前病症病人。该试剂盒应装有适合测定病人FcγRIIIa-158基因型的试剂。因此，本发明还提供鉴定患有可用抗CD40抗体治疗的癌症或癌前病症病人的试剂盒，其中装有测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂。在本文其它地方更详细地描述了合适的试剂盒。
本发明还提供了选择用于治疗患有用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00102
)难以治疗的癌症或癌前病症病人的抗体疗法的方法，所述方法包括：
a)鉴定患有细胞表达CD40但用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00103
)难以治疗的癌症或癌前病症病人；和
b)测定所述病人的FcγRIIIa-158基因型(V/V、V/F或F/F)；
如果所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)，那么选择抗CD40抗体治疗其癌症或癌前病症。具体说，与用利妥昔单抗(利妥昔)治疗相比，优先选择此种抗CD40抗体。本发明还包括给予用此方法鉴定的病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体的步骤。
本领域技术人员采用合适的诊断试剂盒不难用此方法选择用于治疗患有癌症或癌前病症病人的抗体疗法。该试剂盒应装有适合测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂。因此，本发明还提供了选择用于治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人的抗体疗法的试剂盒，该试剂盒装有测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂。
本发明者也令人惊讶地发现，给药后抗CD40抗体如CHIR-12.12显然不会被CD40表达细胞内化。反之，在给药后相当长的一段时间内抗CD40抗体如CHIR-12.12基本均一地分布在CD40表达细胞表面上。这与其它抗体，特别是抗-CD20抗体，如利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00111
)相反。
CD40表达细胞表面上结合的抗CD40抗体持续存在和在CD40表达细胞表面的均一分布使得抗CD40抗体能够通过结合FcR如自然杀伤(NK)细胞上的FcγRIIIa受体结合而介导表达CD40靶细胞的强效抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
因此，本发明提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人的方法，所述方法包括给予所述病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体，给药后抗CD40抗体不被CD40表达细胞明显内化。
本发明还提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症患者的方法，所述方法包括给予所述病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体，给药后所述抗CD40抗体保持基本均一地分布在CD40表达细胞表面上。
本发明还提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症患者的方法，所述方法包括给予所述病人抗CD40抗体，例如给药后治疗或预防有效量的抗CD40抗体存在于所述病人的CD40表达细胞表面上。
因此，本发明这些方面包括给予患者“缓慢内化的”抗体。“缓慢内化的抗体”指在相当长的一段时间内保持分布在细胞表面上的抗体。本领域技术人员应明白，这种特性与认为有效治疗需要抗体-受体复合物内化的许多治疗应用的特性截然不同。在本文中所述的相当长一段时间通常指超过3小时，优选6小时，更优选12小时，更优选24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时或更长时间。
在上述相当长一段时间内，最初位于CD40表达细胞表面上的抗体优选至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多仍保持分布在细胞表面上。
可通过各种试验评估抗体内化。例如，可采用细胞系如道迪淋巴瘤细胞系，或ARH77 MM细胞系评估候选抗体结合对内化的影响。用人IgG1(对照抗体)或候选抗体在冰上(含有0.1％叠氮化钠以阻断内化)或在37℃下(不含叠氮化钠)培育细胞一段时间，适合为3小时。用冰冷的染色缓冲液(如PBS+1％BSA+0.1％叠氮化钠)洗涤后，用(例如)山羊抗-人IgG-FITC在冰上染色细胞30分钟。然后评估着色程度；在本实施例中，可通过(例如)FACS Calibur记录荧光强度的几何平均值(MFI)。本领域技术人员知道其它合适试验(参见例如http://www.abgenix.com/documents/SBS2003％20poster.pdf)。
在本文实施例4和5所述的实验中，叠氮化钠存在下用CH12.12冰上培育的细胞或不存在叠氮化钠时37℃培育的细胞之间没有观察到MFI差异(参见图7-10)。这些数据证明，结合CD40后，CH12.12不内化，继续展示在细胞表面上，展示时间比利妥昔单抗长。
可用于本发明的标准技术和方法的小结见下。应理解，本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、载体和试剂。还应理解，本文所用术语只是为了描述具体实施方式，这些术语不应限制本发明的范围。本发明的范围仅受所附权利要求书的术语的限制。
本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域技术人员的知识范围。
文献中充分描述了这些技术。特别适合查阅的教科书的例子包括：Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：试验室手册)(第2版)；D.N Glover编(1985)DNA Cloning(DNA克隆)，第I和II卷；M.J.Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)；B.D.Hames和SJ.Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)；B.D.Hames和S.J.Higgins编(1984)Transcription and Translation(转录和翻译)；R.I.Freshney编(1986)Animal Cell Culture；Immobilized细胞and Enzymes(动物细胞培养：固定细胞和酶)(IRL出版社，1986)；B.Perbal(1984)A Practical Guide to MolecularCloning；the Methods in Enzymology series(分子克隆的实践指南：酶学方法丛书)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.))，特别是第154和155卷；J.H.Miller和M.P.Calos编(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell(哺乳动物细胞的基因转移载体)(冷泉港试验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法)(学术出版社，伦敦)；Scopes(1987)ProteinPurification：Principles and Practice(蛋白质纯化：原理和实践)(第2版；施普林格出版社(Springer Verlag)，纽约)；和D.M.Weir和C.C.Blackwell编(1986)Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)，第I-IV卷。
本发明方法包括采用抗CD40抗体治疗细胞表达CD40的癌症和癌前病症。
“CD40”、“CD40抗原”或“CD40受体”指肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的50-55kDa跨膜糖蛋白(参见例如，美国专利号5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等(1989)EMBO 8：1403；Clark(1990)Tissue Antigens(组织抗原)36：33；Barclay等(1997)The Leucocyte Antigen Facts Book(白细胞抗原文献)(第2版；学术出版社，圣地亚哥))。已经鉴定到人CD40基因另路剪接的转录物变体编码的人CD40的两种同种型。、第一种同种型(也称为“长同种型”或“同种型1”)表示为长277个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：9；首先报道为GenBank登录号CAA43045，和鉴定为GenBank登录号NP_001241的同种型1)，它由SEQ ID NO：8(见GenBank登录号X60592和NM_001250)编码，它含有前19个残基代表的信号序列。第二种同种型(也称为“短同种型”或“同种型2”)表示为长203个氨基酸的前体多肽(SEQ ID NO：7；GenBank登录号NP_690593)，它由SEQ ID NO：6(GenBank登录号NM_152854)编码，也含有前19个残基代表的信号序列。人CD40的这两种同种型的前体多肽中前165个残基相同(即SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的残基1-165)。所述短同种型前体多肽(SEQ ID NO：7所示)由缺少一编码区段(导致翻译框移位)的转录物变体(SEQID NO：6)编码；与CD40的长同种型所含的C末端(SEQ ID NO：9的残基166-277中所示的C末端)相比，得到的CD40同种型所含的C-末端(SEQ ID NO：7的残基166-203)较短且不相同。出于本发明目的，术语“CD40”或“CD40抗原”、“CD40细胞表面抗原”或“CD40受体”包括CD40的长同种型和短同种型二者。CD40抗原可以是完全或部分糖基化抗原。
如本文所述，在正常和恶性人B细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、CDS+T细胞、内皮细胞、单核和上皮细胞以及许多实体瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和结肠癌)表面上发现了CD40。B-细胞谱系肿瘤类型的恶性B细胞表达CD40，其存活和增殖似乎依赖于CD40信号转导。患有低级和高级B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和霍奇金病的患者的转化细胞表达CD40。也在急性成髓细胞性白血病和50％AIDS相关性淋巴瘤中检测到CD40表达。许多癌和肉瘤的CD40表达水平也很高，但尚不明了相对于CD40表达CD40信号转导对这些癌细胞的作用。表达CD40的癌包括膀胱癌、乳腺癌、***癌、肾细胞癌、未分化的鼻咽癌(UNPC)、鳞状细胞癌(SCC)、甲状腺***状癌、皮肤恶性黑色素瘤、胃癌和肝癌。
本文中“CD40表达细胞”指表达可检测水平的CD40抗原的任何正常或恶性细胞。优选地，CD40表达细胞是表达可检测水平的细胞表面CD40抗原的细胞。本领域熟知检测细胞中CD40表达的方法，包括但不限于：PCR技术、免疫组化、流式细胞术、Western印迹、ELISA等。这些方法能够检测CD40mRNA、CD40抗原和细胞表面CD40抗原。可以如本文实施例3所述或者用其它合适方法检测细胞表面CD40的表达。
所述恶性细胞可以是恶性B细胞。“恶性B细胞”指任何恶性B细胞，包括但不限于衍生自淋巴瘤的B细胞，包括低级、中级和高级B细胞淋巴瘤，免疫母细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、EB病毒(EBV)诱导的淋巴瘤和AIDS相关性淋巴瘤，以及B细胞急性淋巴母细胞性白血病、骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病等。
“CD40配体”或“CD40L”主要指也分别以两种较小的生物活性可溶形式18kDa和31kDa存在的32-33kDa跨膜蛋白(Graf等(1995)Eur.J.Immunol.25：1749-1754；Mazzei等(1995)J Biol.Chem.270：7025-7028；Pietravalle等(1996)J Biol Chem.271：5965-5967)。人CD40L也称为CD154或gp39。“CD40配体”或“CD40L”也指可结合和激活一种或多种CD40信号传导途径的任何其它肽、多肽或蛋白质。因此，“CD40配体”包括但不限于：保持足够活性具有结合和刺激CD40表达细胞上CD40信号转导功能的全长CD40配体蛋白及其变体和片段。对天然CD40配体如人CD40L的修饰包括但不限于：取代、缺失、截短、延长、融合蛋白、片段、肽模拟物等。
“CD40信号转导”指由细胞表面CD40与CD40配体或其它激动剂如激动型抗体的相互作用而产生的任何生物活性。CD40信号转导的例子是导致CD40表达细胞增殖和存活以及刺激CD40表达细胞内一种或多种CD40-信号传导途径的信号。CD40“信号传导途径”或“信号转导通路”指由CD40受体与CD40配体如CD40L相互作用产生并且能产生信号的至少一种生化反应，或一组生化反应，这些信号通过信号通路传递时，导致信号转导级联反应中的一种或多种下游分子被激活。信号转导通路包括许多信号转导分子的参与，将信号由细胞表面CD40受体跨越细胞质膜传递，和通过一系列信号转导分子中的一种或多种，跨越细胞质传递，在某些情况下传入细胞核内。本发明特别感兴趣的是CD40信号转导通路，包括AKT信号传导途径，导致AKT激活，最终通过NF-κB信号传导途径激活NF-κB；还有促***原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径，包括MEK/ERK信号传导途径和MEK/p38信号传导途径，它们分别导致ERK和p38激活。
如上所述，本发明提供了治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症患者的方法，其中所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)，所述方法包括给予所述病人治疗或预防有效量的抗CD40抗体。
“病人”指患有细胞表达CD40的任何癌症或癌前病症、处于发生该疾病风险中或该疾病复发的病人。
“细胞表达CD40的癌症或癌前病症”指已知其细胞表达CD40的任何B细胞谱系癌症、非B细胞血液恶性肿瘤和实体瘤。
本发明方法可用于治疗性治疗B-细胞谱系癌症。细胞表达CD40的B-细胞谱系癌症包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、毛细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病和淋巴瘤，包括但不限于：弥散性小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡、DLBCL、粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、血管内淋巴瘤病、免疫母细胞淋巴瘤、AIDS相关性淋巴瘤等。
因此，本发明方法可用于治疗患有不可控制的B细胞异常增殖或累积相关的非霍奇金淋巴瘤的对象。出于本发明目的，按照工作分类法(WorkingFormulation classification)将这类淋巴瘤分类为B细胞淋巴瘤，再分为低级、中级和高级(参见“The Non-Hodgkin’s Lymphoma Pathologic Classification Project”(非霍奇金淋巴瘤病理分类计划)，Cancer 49(1982)：2112-2135)。因此，低级B细胞淋巴瘤包括小淋巴细胞、滤泡性小***细胞和滤泡混合性小***细胞和大细胞淋巴瘤；中级淋巴瘤包括滤泡性大细胞、弥散性小***细胞、弥散混合性小细胞和大细胞以及弥散性大细胞淋巴瘤；高级淋巴瘤包括大细胞免疫母细胞、淋巴母细胞以及伯基特和非伯基特类型的非***小细胞淋巴瘤。
本发明方法可用于治疗性治疗按照修正的欧洲和美国淋巴瘤分类(REAL)***分类的B细胞淋巴瘤。这类B细胞淋巴瘤包括但不限于以下分类的淋巴瘤：前体B细胞瘤，如B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤；外周B细胞瘤，包括慢性B细胞淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤/免疫细胞瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)(包括弥散性小细胞、弥散混合性小细胞和大细胞以及弥散性大细胞淋巴瘤)、边缘区B细胞淋巴瘤(包括结外、结和脾内类型)、浆细胞瘤/骨髓瘤、原发性纵隔(胸腺)亚型的弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和伯基特样高级B细胞淋巴瘤；不可分类的低级或高级B细胞淋巴瘤。
本发明方法可用于治疗性治疗称为MGUS(显著性不确定的单克隆丙种球蛋白病)的癌前病症。约25％MGUS患者最终发生多发性骨髓瘤(MM)或相关性浆细胞疾病(Kyle(1993)Mayo Clinic.Proc.68：26-36)。骨髓中恶性浆细胞增殖、在血清或尿中检测到单克隆蛋白(M蛋白)、贫血、高钙血症、肾功能不全和溶骨性病变是MM的临床表现，而MGUS在临床上表现为血清或尿中存在M蛋白，而没有MM的其它临床特征(参见例如，Kyle和Lust(1989)Semin.Hematol26：176-200；Greipp和Lust Stem细胞(1995)13：10-21)。MGUS患者无症状，具有稳定的M蛋白测定值(Kyle(1993)Mayo Clinic.Proc.68：26-36)。一旦在对象中鉴定到MGUS后，采用合适抗CD40抗体如拮抗性抗CD40抗体维持治疗可阻断这些患者发生多发性骨髓瘤。
本发明方法还可用于治疗性治疗细胞表达CD40的非B细胞相关性血液恶性肿瘤，如急性髓细胞性白血病等。
本发明方法也可用于治疗性治疗实体瘤。细胞表达CD40的实体瘤包括但不限于：卵巢癌、肺癌(如鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌类型的非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、乳腺癌、结肠癌、肾癌(包括例如，肾细胞癌)、膀胱癌、肝癌(包括例如，肝细胞癌)、胃癌、***、***癌、鼻咽癌和甲状腺癌(如甲状腺***状癌)、皮肤癌如黑色素瘤和肉瘤，包括例如骨肉瘤和尤因肉瘤。
细胞表达CD40的癌症或癌前病症可以是与CD40表达细胞上CD40信号转导水平不良有关的癌症或癌前病症，或者癌症或癌前病症可能仅仅与CD40表达细胞间接相关联。“CD40信号转导水平不良的癌症或癌前病症”指其发生或进展与与CD40信号转导水平不良有关的癌症或癌前病症。
“CD40信号转导水平不良”指癌症或癌前病症病人的CD40表达细胞中可能发生的任何生理学上不良水平的CD40信号转导。
癌症或癌前病症可以是细胞表达CD20的癌症或癌前病症。这类癌症或癌前病症包括但不限于：本文所述的B细胞恶性肿瘤。
对于细胞同时表达CD40和CD20二者的癌症和癌前病症，本发明特别有利，因为本文所述抗CD40抗体如CHIR-12.12的新用法解决了使用抗-CD20抗体如利妥昔
Figure S2006800462131D00171
的相关问题。具体说，就FcγRIIIa-158F纯合或杂合子患者(基因型V/F或F/F)而言，本发明能够治疗患有用其它癌症治疗剂，包括抗CD20如利妥昔
Figure S2006800462131D00172
抗体难以治疗的癌症或癌前病症患者，如本文其它地方的详述。
在本发明的治疗方法中，采用如本文其它地方所述的至少一种抗CD40抗体促进对癌症或癌前病症的正面治疗反应。
癌症或癌前病症的“正面治疗反应”指与抗CD40抗体治疗活性有关的癌症或癌前病症的改善，和/或癌症或癌前病症有关症状的改善。即，可观察到抗增值作用、防止肿瘤进一步生长、肿瘤减小、癌细胞数量减少和/或与CD40表达细胞有关的一种或多种症状减轻。因此，例如，正面治疗反应指该疾病的以下一种或多种改善：(1)肿瘤减小；(2)癌细胞数量减少；(3)肿瘤细胞死亡增加；(4)抑制肿瘤细胞存活；(4)抑制(即减缓至某种程度，优选中止)肿瘤生长；(5)抑制(即减缓至某种程度，优选中止)癌细胞浸润到周围器官中；(6)抑制(即减缓至某种程度，优选中止)肿瘤转移；(7)防止肿瘤进一步生长；(8)患者存活率提高；和(9)在一定程度上缓解癌症相关的一种或多种症状。
可采用对恶性肿瘤特异性标准化反应的标准来确定任何给定恶性肿瘤的正面治疗反应。可以利用以下技术确定肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)改变，从而评估肿瘤反应，这些技术是筛选技术如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包括骨髓吸出(BMA)并对循环***中的肿瘤细胞计数。除这些正面治疗反应外，用抗CD40治疗剂治疗的对象可获得该疾病相关症状改善的有益效果。因此对B细胞肿瘤而言，对象可能获得所谓的B症状减轻，即盗汗、发热、体重降低和/或荨麻疹减轻。就癌前病症而言，用抗CD40治疗剂治疗可阻断和/或推迟发生相关性恶性疾病，例如，推迟显著性不确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)患者发生多发性骨髓瘤。
疾病改善的特征是恢复完全反应。“完全反应”指以前异常放射研究、骨髓和脑脊液(CSF)或骨髓瘤的异常单克隆蛋白恢复正常，没有临床上可检测的疾病。按照本发明方法治疗后，这一反应必须持续至少4-8周，或者有时在某些疾病中持续6-8周。或者，疾病改善可分类为部分反应。“部分反应”指在没有新病变的情况下所有可测定的肿瘤负荷(即对象中存在的恶性细胞数量，或检测的肿瘤质量大小或异常单克隆蛋白量)降低至少约50％，并且需要持续4-8周。在骨髓瘤中，正常反应(尿中骨髓瘤蛋白减少25-50％)也被认为是一种反应。这类反应仅可应用于可测定的肿瘤。
“治疗或预防有效剂量”或“治疗或预防有效量”指治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症患者时，给药后产生正面治疗反应的抗CD40抗体量。本文其它地方更详细地描述了合适剂量。治疗方法可包括一次给予治疗有效剂量或多次给予治疗有效剂量的抗CD40抗体，如本文其它地方更详细的描述。
本文所用“肿瘤”指所有肿瘤细胞生长和增殖(无论是恶性或良性)，以及所有癌前细胞、癌细胞、癌前组织和癌组织。本文所用“肿瘤”指导致异常组织生长的任何形式的细胞生长调节异常或不受调节(无论是恶性或良性)。因此，“肿瘤细胞”包括调节异常或不受调节的恶性和良性细胞生长。
术语“癌症”和“癌”指或描述了特征一般是细胞生长不受控制的哺乳动物的生理病症。癌症的例子包括但不限于：淋巴瘤、白血病和实体瘤。“B细胞相关性癌症”或“B-细胞谱系癌症”指细胞生长调节异常或不受调节与B细胞有关的任何类型的癌症。
在本文中，“治疗”定义为将抗CD40抗体施用或给予患者，或将抗CD40抗体施用或给予患者的分离组织或细胞系，其中所述患者患有疾病、有疾病症状或对疾病易感，其目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、消除或影响患者的疾病、疾病的症状、或疾病的易感性。“治疗”也指将含有抗CD40抗体的药物组合物施用于或给予患者，或将含有抗-CD40抗体的药物组合物施用于或给予患者的分离的组织或细胞系，所述患者患有疾病，疾病的症状，或疾病的易感性，其目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、消除或影响该疾病、疾病的症状、或疾病的易感性。
“抗肿瘤活性”指降低表达CD40的恶性细胞增殖或积累的速率从而降低已存在的肿瘤或在治疗期间产生的肿瘤的生长速率，和/或破坏已存在的恶性(肿瘤)细胞或新形成的恶性细胞从而减小治疗期间肿瘤的总体积。用至少一种抗-CD40抗体治疗可导致与激活CD40表达细胞的CD40信号转导相关疾病的有益生理反应。
本发明方法特别可用于治疗用一线癌症疗法难以治疗的癌症和癌前病症，包括上述癌症和癌前病症。术语“癌症疗法”指任何癌症治疗，如化疗、手术、放疗、抗癌抗体治疗和它们的组合。本文其它地方更详细地描述了癌症治疗的例子。“难治”指具体癌症对具体癌症疗法剂有抗性或不反应。癌症可能是在具体治疗剂一开始治疗时即用该具体治疗剂难以治疗(即对初次接触该治疗剂无反应)，或者先用该治疗剂治疗一段时间或在该治疗剂的后续治疗期间对该治疗剂产生抗性。因此，病人对抗癌剂的治疗有抗性或无反应时，可利用本发明治疗用该抗癌剂难以治疗的病人。
本发明方法包括使用抗CD40抗体。“抗体”通常是约150,000道尔顿的异质四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链经一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目视不同免疫球蛋白同种型的重链而不同。每条重链和轻链也含有规律性隔开的链内二硫桥。每条重链的一端为可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端为可变区(VL)，在另一端为恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区相对，轻链可变区与重链的可变区相对。认为由特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变”指抗体之间可变区的某些部分序列差别很大。可变区赋予抗原结合特异性。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但具有各种效应物功能，如Fc受体(FcR)结合、参与抗体依赖性细胞毒性、启动补体依赖性细胞毒性和肥大细胞脱粒。
可根据恒定区氨基酸序列将脊椎动物种类的抗体(免疫球蛋白)“轻链”分为两种明显不同的类型称为κ和λ轻链。
根据“重链”恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类型。人免疫球蛋白主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类免疫球蛋白对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型已知。不同同种型具有不同的效应物功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。IgG1抗体，具体是人IgG1抗体，特别可用于本发明方法。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并具有效应物功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达FcγRIII，并具有抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应物功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性白细胞和中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。具有ADCC活性的抗体一般是IgG1或IgG3同种型。需要注意，除分离得到IgG1和IgG3抗体以外，可通过工程改造非ADCC抗体的可变区或可变区片段与IgG1或IgG3同种型恒定区相连来制备这类ADCC介导抗体。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述能结合抗体Fc区域的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR可结合IgG抗体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体或者另路剪接形式。FcγRII受体包括具有相似氨基酸序列、主要在于胞质结构域不同的FcγIIA(“活化性受体”)和FcγIIB(“抑制性受体”)。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。FcR综述见Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，(1994)Immunomethods 4：25-34和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126：330-341。本文的术语“FcR”包括其它FcR，包括将来鉴定到的FcR。该术语也包括负责将成熟IgG转移给胎儿的新生受体，FcRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117：587和Kim等，(1994)J.Immunol.24：249(1994))。
术语“抗体”广义包括全装配的抗体、能特异性结合CD40抗原的抗体片段(如Fab、F′(ab)2、Fv和其它片段)、单链抗体、双抗体、抗体嵌合物、杂交抗体、双特异性抗体、人源化抗体等)和含有上述物质的重组肽。术语“抗体”涵盖多克隆和单克隆抗体。
本文所用“抗CD40抗体”包括能特异性识别CD40抗原的任何抗体。在一些实施方式中，用于本发明方法的抗CD40抗体，特别是单克隆抗CD40抗体对CD40抗原具有强烈的单位点结合亲和力。用标准试验如BiacoreTM测定时，这类单克隆抗体与CD40的亲和力(KD)为至少10-5M、至少3×10-5M，优选至少10-6M或至少10-7M，更优选至少10-8M或至少10-12M。本领域已知Biacore分析，“BIA应用手册”中提供了详细内容。可采用WO 01/27160所述的方法调节结合亲和力。
“特异性识别”或“特异性结合”指抗CD40抗体不结合无关抗原，如CD20抗原。
在一些实施方式中，用于本发明方法的抗CD40抗体，具体是单克隆抗体，与人FcγRIIIa-158V有强烈的结合亲和力。优选地，用标准试验如BiacoreTM测定时，用于本发明方法的抗CD40抗体能结合人FcγRIIIa-158V，其亲和力(KD)为至少约0.5μM。如本文实施例6所述，CHIR-12.12抗体能结合人FcγRIIIa-158V，亲和力(KD)为492nM。
在一些实施方式中，用于本发明方法的抗CD40抗体，具体是单克隆抗体，与人FcγRIIIa-158F有强烈的结合亲和力。优选地，用标准试验如BiacoreTM测定时，用于本发明方法的抗CD40抗体能结合人FcγRIIIa-158F，其亲和力(KD)为至少约12μM。优选地，本发明方法所用的抗CD40抗体能结合人FcγRIIIa-158F，亲和力(KD)为至少约10μM、至少约8μM、至少约6μM、至少约5μM、至少约4μM或至少约3μM。如本文实施例6所述，CHIR-12.12抗体能结合人FcγRIIIa-158F，亲和力(KD)为2.8μM。
在一些实施方式中，用于本发明方法的抗CD40抗体，具体是单克隆抗体，与人FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F有强烈的结合亲和力。优选地，用标准试验如BiacoreTM测定时，用于本发明方法的抗CD40抗体能结合人FcγRIIIa-158V，其亲和力(KD)为至少约0.5μM；还能结合人FcγRIIIa-158F，其亲和力(KD)为至少约12μM。
可以采用本领域技术人员已知的合适抗体生产方法产生用于本发明方法的抗体。
用于本发明方法的抗CD40抗体可以是多克隆抗体。因此，可通过常规方法制备多克隆血清。通常，先用含有感兴趣抗原(在这种情况下是CD40抗原)的溶液免疫合适动物，优选小鼠、大鼠、兔或山羊。由于可获得的血清体量和标记的抗-兔和抗-山羊抗体的可获得性，优选采用兔或山羊制备多克隆血清。
可筛选免疫动物血清对接种抗原的抗体反应。可由***或脾细胞中分离淋巴细胞，还可选择CD138-阴性和CD19-阳性的B细胞。在一个方面，可以如本文所述将这类B细胞培养物(BCC)与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤。
可在转基因动物，优选在携带人免疫球蛋白基因座的小鼠中制备多克隆血清。在一优选的实施方案中，表达感兴趣蛋白(在这种情况下是CD40抗原)的SF9细胞用作免疫原。也可用盐水，优选用佐剂如弗氏完全佐剂混合或乳化含有抗原的溶液，经胃肠外(通常是皮下或肌肉内)注射该混合液或乳液进行免疫。每次注射50-200μg的剂量一般足够。通常在2-6周后注射用盐水配制，优选用不完全弗氏佐剂配制的蛋白质加强免疫一次或多次。或者可用本领域已知的方法体外免疫产生抗体，就本发明目的而言体外与体内免疫等效。将免疫动物的血液放入玻璃或塑料容器25℃孵育1小时，然后4℃孵育2-18小时分离多克隆抗血清。离心(例如，1,000xg 10分钟)回收该血清。每次放血可自家兔获得约20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞的制备方法见纳入本文作为参考的美国专利号6,004,552中所述。在CD40的情况下，简言之，将编码人CD40的序列用转移载体重组引入杆状病毒中。将质粒与野生型杆状病毒DNA共同转染入Sf9细胞。鉴定感染重组杆状病毒的Sf9细胞并克隆纯化。
用于本发明方法的抗CD40抗体可以是单克隆抗体。本文所用术语“单克隆抗体”(和“mAb”)指获自基本均一的抗体群体的抗体，即，该群体中的各个抗体相同，除了可能存在少量天然产生的突变。该术语不限制产生抗体的物种，并且不需要通过任何具体方法产生抗体。
与一般包含不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各种单克隆抗体只针对抗原上的一个决定簇(表位)。
“表位”指诱导产生抗体和抗体结合的抗原分子的那部分。表位可包含线性氨基酸残基(即表位中的残基以线性方式依次排列)、非线性氨基酸残基(本文中称为“非线性表位”；这些表位不是依次排列的)、或包含线性和非线性氨基酸残基。适用于本发明方法的抗CD40单克隆抗体能特异性结合人细胞表面上表达的人CD40抗原上的表位，即接触细胞外部的表位。
用于本发明的单克隆抗体可先用Kohler等(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法制备，或者可用重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。也可从例如McCafferty等(1990)Nature 348：552-554(1990)和美国专利号5,514,548所述技术产生的抗体噬菌体文库分离单克隆抗体。Clackson等(1991)Nature 352：624-628和Marks等(1991)J Mol.Biol.222：581-597分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续发表物描述了通过链改组(Marks等(1992)Bio/Technology 10：779-783)，以及组合感染和体内重组产生高亲和力(nM级)人抗体，作为构建非常大的噬菌体文库的方案(Waterhouse等(1993)Nucleic.Acids Res.21：2265-2266)。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方式。
在Kohler等(1975)Nature 256：495-496的传统方法中，一般用含有抗原的溶液免疫小鼠。可在盐水中，优选在佐剂如弗氏完全佐剂中混合或乳化含有抗原的溶液，并经胃肠道外注射该混合液或乳液进行免疫。可采用本领域已知的任何免疫方法获得本发明单克隆抗体。免疫动物后，取出脾脏(和任选的几个大***)，并分离成单个细胞。可将细胞悬浮液加入用感兴趣抗原包被的平板或孔来筛选脾细胞。表达抗原特异性膜结合免疫球蛋白的B细胞能结合该平板，而不会被冲洗掉。然后，诱导得到的B细胞或所有分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，在选择性培养基中培养。用连续稀释法接种得到的细胞，测定是否产生了特异性结合感兴趣抗原(且不结合无关抗原)的抗体。然后在体外(例如，用组织培养瓶或中空的纤维反应器)或体内(如小鼠腹水)培养所选的单克隆抗体(mAb)-分泌性杂交瘤。
在另一方面，优选进一步筛选B细胞培养物对原始抗原的反应性。这类筛选包括采用靶蛋白/抗原蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA)，它是结合感兴趣抗原和体外结合于表达靶抗原的瞬时转染CHO或其它细胞的已知抗体的竞争性试验。
采用重组DNA法制备用于本发明方法的抗CD40抗体时，用常规方法不难分离和测序编码单克隆抗体的DNA(例如，采用能够特异性结合小鼠抗体重链和轻链的编码基因的寡核苷酸探针)。本文所述的杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。一旦分离后，可将该DNA放入表达载体中，然后转染到本身不产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。有关在含有编码抗体的DNA的细菌中重组表达的综述文献包括Skerra等(1993)Curr.Opinion in Immunol.5：256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130：151。或者，可以在细胞系如CHO细胞系中产生抗体，如纳入本文作参考的美国专利号5,545,403；5,545,405；和5,998,144所述。简言之，用能够表达轻链和重链的载体分别转染该细胞系。可将两种蛋白质转染不同载体而产生嵌合抗体。另一优点是抗体可正确糖基化。
本文所用“宿主细胞”指培养成单细胞实体的微生物或者真核细胞或细胞系，它们可能是、或已经用作重组载体或其它转运多核苷酸的接受体，包括已转染的原始细胞的后代。应理解，由于存在天然、偶发性或有意的突变，单个细胞的后代与其初始亲本细胞的形态或者基因组或总DNA组成不一定完全相同。
在一些实施方式中，可采用以谷胺酰胺合成酶作为标记的GS基因表达***(伦泽生物科技公司(Lonza Biologies)，新罕布什尔州朴次茅斯(Portsmouth，New Hampshire))在CHO细胞中生产抗CD40抗体，如CHIR-12.12抗体。也参见美国专利号5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216；将其全部内容纳入本文作参考。
本领域已知CD40的单克隆抗体。参见例如，McMichael编(1987；1989)Leukocyte Typing III and IV(白细胞分型III和IV)(牛津大学出版社，纽约)中关于B细胞抗原的章节；美国专利号5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；WO 00/63395；国际公开号WO 02/28905和WO 02/28904；Gordon等(1988)J.Immunol.140：1425；Valle等(1989)Eur.J.Immunol.19：1463；Clark等(1986)PNAS 83：4494；Paulie等(1989)J.Immunol.142：590；Gordon等(1987)Eur.J.Immunol.17：1535；Jabara等(1990)J.Exp.Med.172：1861；Zhang等(1991)J.Immunol.146：1836；Gascan等(1991)J.Immunol.147：8；Banchereau等(1991)Clin.Immunol.Spectrum 3：8；和Banchereau等(1991)Science 251：70；将所有这些文献纳入本文作参考。
如上所述，本文所用术语“抗体”包括嵌合抗体。“嵌合”抗体指最优选用重组脱氧核糖核酸技术产生的包含人(包括免疫“相关”物种，如黑猩猩)和非人组分的抗体。因此，嵌合抗体恒定区最优选与天然人抗体恒定区基本相同；嵌合抗体可变区最优选衍生自对感兴趣抗原(CD40)有所需抗原特异性的非人来源的抗体。非人来源可以是可用来产生CD40抗原的抗体的任何脊椎动物来源。这种非人来源包括但不限于：啮齿类(例如，家兔、大鼠、小鼠等；参见，例如，纳入本文作为参考的美国专利号4,816,567)和非人灵长类(例如，古猴(OldWorld Monkey)、类人猿等；参见例如纳入本文作为参考的美国专利号5,750,105和5,756,096)。
如上所述，本文所用术语“抗体”包括人源化抗体。“人源化”指含有的非人免疫球蛋白序列最少的抗体形式。人源化抗体的大部分序列是人免疫球蛋白(接受者抗体)，但该接受者抗体的超变区(也称为互补决定区或CDR)残基被具有所需特异性、亲和力或活性的非人动物(供者抗体)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的超变区残基取代。短语“互补决定区”指共同确定了天然免疫球蛋白结合位点Fv区结合亲和力和特异性的氨基酸序列。参见例如，Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Kabat等，(1991)美国健康与人类服务部(U.S.Dept.of Health and人Services)，NIH公布号91-3242)。短语“恒定区”指抗体分子中赋予效应器功能的那部分。在以前制备用于治疗人疾病的无免疫原性抗体的研究中，小鼠恒定区被人恒定区取代。这些人源化抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。然而，这些人源化抗体仍能在人中引发不良且可能危险的免疫应答并且损失了亲和力。
人源化可根据Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等，(1988)Science 239：1534-1536)的方法用啮齿类或突变型啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。也参见纳入本文作为参考的美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一个或多个可变区的框架区内的残基为对应的非人残基所取代(参见，例如美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗体可含有在受者抗体或供者抗体中没发现的残基。制备这些修饰可进一步精制抗体的性能(例如，获得所需的亲和力)。总体上，人源化抗体所含的所有可变区、至少一个，通常两个可变区中所有或基本上所有的超变区是对应的非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架区是对应的人免疫球蛋白序列。人源化抗体也任选包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多的细节见引作参考的Jones等，(1986)Nature331：522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。因此，这种“人源化”抗体可包括基本上不是整个人可变区被非人种类的相应序列取代的抗体。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。参见，例如美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370，和国际公布号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和如何产生对预定抗原具有改进亲和力的人源化抗体的方法。
也可采用人类工程改造(人EngineeringTM)技术(索马公司(Xoma Ltd.)，加州伯克利(Berkeley，California))产生人源化抗CD40抗体。
人源化抗CD40单克隆抗体包括抗体如SGN-40(Tai等(2004)Cancer Res.64：2846-52；美国专利号6,838,261)，它是鼠抗CD40抗体SGN-14的人源化形式(Francisco等(2000)Cancer Res.60：3225-31)和美国专利申请公开号2004/0120948所述的抗体；将其全文纳入本文作参考。
也可采用非人哺乳动物宿主，更具体说是以灭活的内源性免疫球蛋白(Ig)基因座为特征的转基因小鼠产生的异种或修饰的抗-CD40抗体来实施本发明。这种转基因动物原先表达宿主免疫球蛋白轻链和重链的活性内源性基因失去功能而被同类人免疫球蛋白基因座取代。这些转基因动物产生基本上没有宿主免疫球蛋白轻或重链亚基的人抗体。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号5,877,397和5,939,598。
因此，在一些实施方式中，通过(例如)免疫转基因小鼠获得抗CD40的完全人抗体。用捷诺小鼠(XenoMouse
Figure S2006800462131D00271
)技术(阿布吉尼克斯公司(Abgenix)；加州弗里蒙特(Fremont，California))获得一只这类小鼠，参见美国专利号6,075,181、6,091,001和6,114,598，将所有内容纳入本文作参考。例如，为了产生CHIR-12.12抗体，用表达人CD40的Sf9细胞免疫含有人IgG1重链基因座和人κ轻链基因座的转基因小鼠。小鼠也可转入其它同种型的基因。用于本发明方法的完全人抗CD40抗体的特征是结合特性与CHIR-12.12单克隆抗体相似。
如上所述，本文所用术语“抗体”也包括可结合抗原的抗体片段。“抗体片段”指完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等(1995)Proein Eng.10：1057-1062)；单链抗体分子；和抗体片段形成的多特异性抗体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生了各自含有一个抗原-结合位点的两种相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留的“Fc”片段，此名称反映了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生含有两个抗原结合位点仍能交联抗原的F(ab′)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区由非共价紧密结合的一条重链可变区和一条轻链可变区的二聚体组成。每个可变区的3个CDR正是以这种构型相互作用而确定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个CDR共同赋予了该抗体的抗原结合特异性。然而，即使一个可变区(或仅含有3个抗原特异性CDR的半个Fv)也能识别并结合抗原，虽然亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段也含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)。Fab片段因在重链CH1结构域的羧基末端多几个残基(包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸残基)而不同于Fab’片段。本文称为Fab′-SH的是恒定区半胱氨酸残基带有一个游离巯基的Fab′。通过还原F(ab′)2片段的重链二硫桥键产生Fab′片段。抗体片段的其它化学偶联反应也是已知的。
抗CD40抗体片段适用于本发明方法，只要它们保持全长抗体的所需亲和力。因此，例如，抗CD40抗体片段将保持结合CD40抗原的能力。这类片段的特征是特性类似于对应的全长抗体。因此，例如，全长拮抗性抗CD40抗体的片段优选能够特异性结合人细胞表面上表达的人CD40抗原，并且在结合于人CD40表达细胞上的CD40抗原时没有显著的激动活性，但具有拮抗活性。在本文中将这类片段称为“抗原结合”片段。用于本发明方法的抗CD40抗体片段优选保持了结合相关FcR的能力。因此，例如，抗CD40抗体片段可以保持结合FcγRIIIa的能力。因此，例如，全长抗CD40抗体的片段既能够特异性结合细胞表面CD40抗原，也能结合人效应细胞，如自然杀伤(NK)细胞上的FcγRIIIa。在本文中将这类片段称为“FcR结合”片段。这类片段通常包含重链恒定区的至少一部分。
已经开发了产生抗体片段的各种技术。传统上，通过蛋白酶水解消化完整抗体产生这些片段(参见例如，Morimoto等(1992)Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等(1985)Science 229：81)。然而，现在可通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可由上述抗体噬菌体文库分离这种抗体片段。或者，可由大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，并化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等(1992)Bio/Technology 10：163-167)。按照另一种方法，可由重组宿主细胞培养物直接分离F(ab′)2片段。本领域技术人员明白产生抗体片段的其它技术。
抗体的合适抗原结合片段包含全长抗体的一部分，通常是它的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括但不限于：Fab、F(ab′)2和Fv片段和单链抗体分子。“Fab”指由轻链和部分重链组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。F(ab′)2指含有两条轻链和两条重链的一部分的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。“单链Fv”或“sFv”抗体片段指含有抗体的VH和VL结构域的片段，其中这些结构域以一条多肽链的形式存在。参见，例如纳入本文作为参考的美国专利号4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL结构域之间还含有一多肽接头使sFv形成能与抗原结合所需的结构。sFv的综述见Pluckthun(1994)《单克隆抗体的药理学》(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，269-315页。如下文所述，本文公开的拮抗性抗-CD40抗体的抗原结合片段也可与细胞毒素偶连以杀伤靶癌细胞，如本文以下的描述。
在本发明的一些实施方式中，抗CD40抗体是拮抗性抗CD40抗体。当这种抗体结合人细胞如人B细胞表面上展示的CD40时，它们不会产生显著的拮抗活性。在一些实施方式中，它们与人细胞表面上展示的CD40结合导致抑制了这些人细胞的增殖和分化。适用于本发明方法的抗CD40抗体包括可能对细胞表面表达CD40抗原的正常和恶性人细胞有拮抗活性的抗体。
“激动活性”指某物质的功能是激动剂。激动剂与细胞上的受体结合，并启动与受体天然配体相似或相同的反应或活性。CD40激动剂能诱导以下反应(但不限于此)中的任何或所有反应：B细胞增殖和/或分化；通过诸如ICAM-1、E-选择素、VCAM等分子上调细胞间粘附；分泌促炎细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF等；通过CD40受体经由TRAF(如TRAF2和/或TRAF3)、MAP激酶如NIK(NF-κB诱导激酶)、I-κB激酶(IKKα/β)、转录因子NF-κB、Ras和MEK/ERK途径、PI3K/AKT途径、P38MAPK途径等进行信号转导；通过诸如XIAP、mcl-1、bcl-x等分子转导抗凋亡信号；产生B和/或T记忆细胞；B细胞产生抗体；B细胞同种型转换，II类MHC和CD80/86的细胞表面表达上调等。
“显著性”激动活性指经过B细胞应答试验测定，比中性物质或阴性对照诱导的激动活性高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的激动活性。优选地，“显著性”激动活性是经过B细胞应答试验测定，比中性物质或阴性对照诱导的激动活性高至少2倍或至少3倍的激动活性。因此，例如，当感兴趣的B细胞应答是B细胞增殖时，“显著性”激动活性是诱导比中性物质或阴性对照诱导的B细胞增殖水平高至少2倍或至少3倍的B细胞增殖水平。在一个实施方式中，不结合CD40的非特异性免疫球蛋白如IgG1用作阴性对照。经过B细胞应答试验测定，“无显著激动活性”的物质的激动活性比中性物质或阴性对照诱导的激动活性高不超过约25％，优选不超过约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至比中性物质或阴性对照诱导的激动活性高不超过约0.1％。
“拮抗活性”指某物质的功能是拮抗剂。CD40的拮抗剂防止或降低了CD40受体与激动剂配体(具体是CD40L)结合所诱导的任何反应。拮抗剂可能使对激动剂结合所诱导的任何一种或多种应答降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％，优选40％、45％、50％、55％、60％，更优选降低70％、80％、85％，最优选90％、95％、99％或100％。测定抗CD40治疗剂如本领域已知抗CD40抗体的CD40配体结合特异性和拮抗活性的方法包括但不限于：标准竞争性结合试验、监测B细胞分泌免疫球蛋白的试验、B细胞增殖试验、Banchereau样-B细胞增殖试验、抗体产生的T辅助细胞试验、共同刺激B细胞增殖试验和上调B细胞激活标记的试验。参见例如，纳入本文作参考的WO 00/75348和美国专利号6,087,329所述的试验。也参见WO 2005/044854、WO 2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044307和WO 2005/044294WO，将其全部内容纳入本文作参考。
可通过证明CHIR-12.12缺少激动活性的试验评估拮抗剂/缺少激动活性。US 5677165(希龙公司(Chiron Corporation))描述的试验中显示了合适的试验。
在本发明的一个实施方式中，拮抗性抗CD40抗体在一种细胞应答中没有显著的激动活性。在本发明的另一实施方式中，拮抗性抗CD40抗体在一种以上细胞应答(例如，增殖和分化，或者增殖、分化和B细胞的抗体生产)反应试验中没有显著的激动活性。
特别感兴趣的是结合人B细胞CD40抗原时没有本文所述的显著性激动活性，但具有拮抗活性的拮抗性抗CD40抗体。在本发明的一个实施方式中，拮抗性抗CD40抗体在一种B细胞应答中没有显著的激动活性。在本发明的另一实施方式中，拮抗性抗CD40抗体在一种以上B细胞应答(如增殖和分化，或者增殖、分化和抗体生产)的试验中没有显著的激动活性。
可采用本领域已知的任何试验确定抗CD40抗体是否可用作一种或多种B细胞应答的拮抗剂。在一些实施方式中，抗CD40抗体用作选自以下至少一种B细胞应答的拮抗剂：B细胞增殖、B细胞分化、抗体生产、细胞间粘附、产生记忆B细胞、同种型转换、上调II类MHC和CD80/86的细胞表面表达和分泌促炎细胞因子如IL-8、IL-12和TNF。特别感兴趣的是结合于人B细胞表面CD40抗原时对B细胞增殖无显著激动活性的拮抗性抗CD40抗体。
抗CD40抗体可能是经B细胞增殖试验测定，可溶性或细胞表面CD40L诱导的B细胞增殖的拮抗剂。本领域了解合适的B细胞增殖试验。下面也描述了合适的B细胞增殖试验。在一些实施方式中，拮抗性抗CD40抗体刺激B细胞增殖的水平不到中性物质或阴性对照诱导的B细胞增殖的约25％，优选不到约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不到中性物质或阴性对照诱导的B细胞增殖高的约0.1％。
在其它实施方式中，所述抗CD40抗体是经过B细胞增殖测定，另一抗CD40抗体，如S2C6抗CD40抗体诱导的B细胞增殖的拮抗剂，在拮抗性抗CD40抗体存在下其它抗CD40抗体刺激的B细胞增殖水平不到没有拮抗性抗CD40抗体时其它抗CD40抗体诱导的B细胞增殖的约25％(即至少抑制75％)，优选不到约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不到没有拮抗性抗CD40抗体时其它抗CD40抗体诱导的B细胞增殖的约0.1％。
在其它实施方式中，抗CD40抗体是经B细胞活化试验测定，细胞系EL4B5诱导的B细胞增殖的拮抗剂，在拮抗性抗CD40抗体存在下EL4B5细胞系刺激的B细胞增殖水平不到没有拮抗性抗CD40抗体时此细胞系诱导B细胞增殖的约25％(即至少抑制75％)，优选不到约20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至不到没有拮抗性抗CD40抗体时这一细胞系诱导的B细胞增殖的约0.1％。
在其它实施方式中，所述抗CD40抗体如用人T细胞辅助人T细胞产生抗体试验测定那样，是人T细胞诱导抗体产生的拮抗剂。以此方式，不存在拮抗性抗CD40抗体时，IgG抗体产生IgM抗体或者产生IgG和IgM抗体的水平不到缺乏该拮抗性抗CD40抗体时T细胞刺激B细胞产生各种抗体的约50％(即至少抑制了75％)，优选不到约25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.5％，或者甚至更优选不到缺乏该拮抗性抗CD40抗体时T细胞刺激B细胞产生各种抗体的约0.1％。其它拮抗性抗CD40抗体包括称为5D12、3A8和3C6的单克隆抗体，分别由ATCC登录号HB 11339、HB 12024和HB 11340的杂交瘤分泌。参见例如，美国专利号6,315,998，将其全文纳入本文作参考。
例如，可采用以下试验评估抗CD40抗体的拮抗活性。可由(例如)获自扁桃腺切除术个体的扁桃腺分离获得这些试验用的人B细胞，基本上如De Groot等(1990)Lymphokine Research(1990)9：321所述。简要说，用手术刀切割分散扁桃腺组织，用5rnM L-亮氨酸甲酯处理以消除吞噬细胞和NK细胞，通过一轮2-氨基乙基异硫脲鎓溴处理绵羊红细胞(SRBC)形成花结去除T细胞。可通过间接免疫荧光标记法和FACS分析核查得到的B淋巴细胞制品的纯度，间接免疫荧光标记法采用抗-(CD20)mAb B1(康特克隆公司(Coulter Clone)，佛罗里达州海尔勒阿(Hialeah，FA))或抗-(CD3)mAb OKT3(奥索公司(Ortho)，新泽西州拉里坦(Raritan，NJ))和FITC偶联的兔抗-(小鼠Ig)的F(ab′)2片段(甾麦公司(Zymed)，加州旧金山(San Francisco，CA))。
B-细胞增殖试验
在平底96孔微量滴定板中，用补充有10％胎牛血清的200μl IMDM培养B细胞(每孔4×104个)。加入固定的抗-(IgM)抗体(免疫珠(Immunobeads)；5μg/ml；伯乐公司(BioRad)，加州里士满(Richmond，California))刺激B细胞。需要时，加入100U/ml重组IL-2。在开始微量培养时加入不同浓度的测试单克隆抗体(mAb)，第3天测定18小时脉冲后(3H)-胸苷的掺入评估细胞增殖。在固定的抗-IgM存在下或者固定的抗-IgM和IL-2存在下拮抗性抗CD40抗体不会显著地共同刺激人B-细胞增殖。
Banchereau-样B-细胞增殖试验
为了用类似于Banchereau等(1991)Science(1991)251：70所述的培养***中测定抗CD40单克隆抗体刺激B-细胞增殖的能力，在平底微孔板中培养表达人FcγRII的HR等位基因形式的小鼠3T6转染细胞。在补充有10％胎牛血清和100U/ml重组IL-4的200μl IMDM中培养1×104个此转染细胞(每孔2×104个，用5000镭辐射过的细胞)。加入B细胞之前，使3T6细胞贴附于塑料培养板至少5小时。加入的抗CD40mAb的浓度为15ng/ml至2000ng/ml，测定第7天用[3H]胸苷脉冲处理18小时后的胸苷掺入评估B细胞的增殖。
用拮抗性抗CD40mAb抑制S2C6-刺激的B细胞增殖
也可采用上述B-细胞增殖试验，通过抑制抗CD40抗体如S2C6(也称为SGN-14，据报道它是CD40刺激正常B细胞增殖的激动剂；Francisco等(2000)Cancer Res.60：3225-3231)刺激B-细胞增殖的能力鉴定拮抗性抗CD40单克隆抗体(mAb)。在偶联于琼脂糖珠的抗-IgM(5μg/ml)和抗CD40mAb S2C6(1.25μg/ml)存在下，在200μl微孔中培养人扁桃腺B细胞(每孔4×104个)。加入不同浓度的感兴趣抗CD40mAb，3天后评估[3H]-胸苷掺入。作为对照，可加入相似浓度的抗-(葡糖脑苷脂酶)mAb 8E4。Barneveld等(1983)Eur.J.Biochem.134：585。拮抗性抗CD40抗体可将抗-IgM和mAb S2C6共同刺激诱导的人B-细胞增殖抑制(例如)至少75％或更多(即拮抗性抗CD40抗体存在下S2C6-刺激的增殖不到没有拮抗性抗CD40抗体时观察值的25％)。相反，用等量无关mAb8E4(抗β-葡糖脑苷脂酶抗体)没有观察到显著抑制。Barneveld等，同上。这一结果表明，抗CD40mAb不能为人B细胞增殖递送刺激信号，但相反，可抑制用另一种mAb引发CD40产生的刺激信号。
用EL4B5细胞激活B-细胞试验
Zubler等(1985)J.Immunol.(1985)134：3662观察到，小鼠胸腺瘤EL-4细胞系(称为EL4B5)的突变亚克隆可以强烈抑制鼠和人来源的B细胞在体外增殖和分化成免疫球蛋白-分泌性浆细胞。发现这种激活是抗原非依赖性，和不受MHC限制的。为了最优地刺激人B细胞，需要存在活化人T细胞的上清液，但用佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)或IL-I预激活EL4B5细胞时，也发生B-细胞应答。Zubler等(1987)Immunological Reviews 99：281；和Zhang等(1990)J.Immunol.144：2955。在这一培养***中能有效激活B细胞—有限稀释实验证明，可激活大多数人B细胞以增殖和分化成抗体-分泌性细胞。Wen等(1987)Eur.J.Immunol.17：887。
在平底微量滴定板中用补充有10％热灭活胎牛血清、5ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(西格玛公司(Sigma))和5％人T细胞上清液的200μl IMDM培养B细胞(每孔1000个)与辐射(5000镭)的EL4B5细胞(每孔5×104个)。在开始培养时加入不同浓度的mAb，在第6天用[3H]-胸苷脉冲处理18小时后评估胸苷掺入。为了制备T-细胞上清液，在1μg/ml PHA和10ng/ml PMA存在下以106个/ml的密度培养纯化的T细胞36小时。Wen等(1987)Eur.J.Immunol(1987)17：887。通过离心细胞获得T-细胞上清液，储存于-20℃。检测了T细胞上清液提高人B细胞在EL4B5-B细胞培养物中增殖的有效性，合并最有效的上清液用于实验。评估抗CD40抗体对EL4B5诱导的人B-细胞增殖的影响时，可加入单克隆抗体如MOPC-141(IgG2b)作为对照。
拮抗性抗CD40抗体能抑制EL4B5细胞系刺激的B-细胞增殖抑制(例如)至少75％或更多(即在拮抗性抗CD40抗体存在下EL4B5诱导的B细胞增殖不到没有拮抗性抗CD40抗体时观察值的25％)。相反，对照抗体如MOPC-141对EL4B5诱导的B细胞增殖无显著影响。
T细胞辅助B细胞产生抗体的试验
拮抗性抗CD40抗体可用作B细胞产生免疫球蛋白的拮抗剂。可通过在T细胞辅助试验中评估抗体抑制活化T细胞以接触依赖性方式刺激B细胞产生免疫球蛋白的能力，来检测抗CD40抗体的这种类型的拮抗活性。以此方式，用1∶500稀释的抗-CD3mAb CLB-T3/3腹水(CLB，荷兰阿姆斯特丹(荷兰阿姆斯特丹))包被96孔组织培养板。加入如下所示共同刺激的mAb：抗CD2mAbCLB-T1 1.1/1和CLB-T1 1.2/1(CLB，荷兰阿姆斯特丹)，两种为1∶1000稀释的腹水和抗CD28mAb CLB-28/1(CLB，荷兰阿姆斯特丹)。随后，加入扁桃腺T细胞(经辐射，3000镭；每孔105个)、扁桃腺B细胞(每孔104个)和rIL-2(20U/ml)。各细胞培养物的最终体积为200μl。8天后，离心细胞，收获无细胞上清液。如下所述通过ELISA评估(稀释)样品中人IgM和IgG的浓度。
在一个实施方式中，在包被有抗-CD3mAb和含有或不含用于共同刺激T细胞的不同mAb的96孔板中一起培养人扁桃腺B细胞(104个/孔)与辐射的纯化T细胞(3000镭，105个/孔)。培养8天后，收获上清液，以测定B细胞产生的免疫球蛋白。通过下述ELISA试验评估B细胞产生的免疫球蛋白。从培养开始时，加入不同浓度的感兴趣的抗CD40抗体。作为对照，可加入mAbMOPC-141。
拮抗性抗CD40抗体可将人T细胞刺激下B细胞产生IgG和IgM抗体抑制至少50％或更多(即在拮抗性抗CD40抗体存在下T细胞诱导的B细胞抗体产量不到没有拮抗性抗CD40抗体时观察值的50％)。相反，对照抗体如MOPC-141对T细胞诱导的B细胞抗体产生没有显著影响。
用于免疫球蛋白定量的ELISA试验
用ELISA评估人IgM和IgG的浓度。用0.05M碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)配制的4μg/ml小鼠抗人IgG mAb MH 16-01(CLB，荷兰阿姆斯特丹)或1.2μg/ml小鼠抗-人IgM mAb 4102(太勾公司(Tago)，加州伯林盖姆(Burlingame，CA))包被96孔ELISA平板，4℃培育16小时。用PBS-0.05％吐温-20(PBS-吐温)洗涤平板3次，用BSA饱和1小时。洗涤2次后，用不同稀释度的测试样品37℃培育该平板1小时。洗涤3次后，用1μg/ml过氧化物酶标记的小鼠抗-人IgGmAb MH 16-01(CLB)或小鼠抗-人IgM mAb MH 15-01(CLB)37℃培育1小时以检测结合的Ig。洗涤平板4次，加入邻苯二胺作为底物，揭示出结合的过氧化物酶活性。用人标准血清(H00，CLB)建立各试验的标准曲线。
本领域已知拮抗性抗CD40抗体。参见例如，美国专利申请公开号20020142358和20030059427公开的称为F4-465的杂交瘤产生的人抗CD40抗体；将其全文纳入本文作参考。F4-465获自HAC小鼠(Kuroiwa等(2000)NatureBiotech 10：1086(2000))，因此表达人λ轻链。也参见WO 2005/044854、WO2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO2005/044307和WO 2005/044294WO，将其全部内容纳入本文作参考。
除拮抗活性外，用于本发明方法的抗CD40抗体优选具有另一种作用于靶细胞的机制。例如，抗CD40抗体优选具有ADCC活性。或者，可以在具有ADCC活性的另一抗体同种型上表达抗CD40抗体的可变区。也可能将抗CD40抗体的天然形式、重组形式或抗原结合片段偶联于细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子或同位素，如本文其它地方所述的那样。
如本文其它地方所述，本发明者惊讶地发现，与其它抗体相反，抗CD40抗体如CHIR-12.12能够通过结合于病人自然杀伤(NK)细胞上两种FcγRIIIa氨基酸158同种异型(V或F)之一介导对表达CD40的靶细胞强效抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。因此，除FcγRIIIa-158V纯合子病人(基因型V/V)外，抗CD40抗体如CHIR-12.12可用于治疗FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)细胞表达CD40的癌症和癌前病症。对利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00351
)治疗无反应的癌症和癌前病症的治疗而言，本发明特别有利，因为已证明NHL中利妥昔单抗的临床活性与患者的FcγRIIIa基因型相关联。
因此，用于本发明方法的特别优选的抗CD40抗体是除拮抗活性以外，能够介导表达FcγRIIIa的人效应细胞如自然杀伤细胞(NK细胞)对CD40表达细胞的ADCC作用的抗CD40抗体。最优选如本文其它地方所述能够以高亲和力结合FcγRIIIa-158F和FcγRIIIa-158V的抗CD40抗体。
特别优选如WO 2005/044854、WO 2005/044304、WO 2005/044305、WO2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044307和WO 2005/044294WO所述的抗CD40抗体，将其全部内容纳入本文作参考。
本发明特别感兴趣的是共享WO 2005/044854、WO 2005/044304、WO2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044307和WO2005/044294所述的CHIR-12.12单克隆抗体结合特性的拮抗性抗CD40抗体。这类抗体包括但不限于：
a)单克隆抗体CHIR-12.12；
b)杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体；
c)包含选自以下氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示序列以及SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示序列；
d)具有含有选自以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示序列；
e)能够与杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体表位结合的单克隆抗体；
f)结合含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的人CD40序列残基82-87的表位的单克隆抗体；
g)结合含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的人CD40序列残基82-89的表位的单克隆抗体；
h)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；
i)前述项目a)所述的单克隆抗体或前述项目c)-h)中任一项所述的单克隆抗体，所述抗体是重组产生的；和
j)作为前述项目a)-i)中任一项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，所述片段保持了特异性结合人CD40抗原的能力。
单克隆抗体CHIR-12.12特别优选用于本发明方法。
单克隆抗体CHIR-12.12的详细描述见WO 2005/044854、WO2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO2005/044307和WO 2005/044294。CHIR-12.12抗体是杂交瘤细胞系153.8E2.D10.D6.12.12(称为细胞系12.12)产生的IgG1同种型的完全人抗CD40单克隆抗体。利用含有人IgG1重链基因座和人κ链基因座的免疫的异种型小鼠(捷诺小鼠技术；阿布吉尼克斯公司；加州弗里蒙特)的脾细胞产生该细胞系。将此脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞(斯拉生物来源公司(Sierra BioSource))融合。多次亚克隆得到的杂交瘤，才得到稳定的单克隆细胞系12.12。如本文其它地方所述，类似地可采用经人免疫球蛋白基因座转基因的小鼠制备适用于本发明方法的其它抗体。
通过流式细胞术测定，在ELISA型试验中CHIR-12.12单克隆抗体能结合可溶性CD40，防止CD40-配体与细胞表面CD40结合，并取代预先结合的CD40-配体。抗体CHIR-5.9和CHIR-12.12互相竞争性结合CD40，但不与15B8竞争，15B8是2000年10月2日提交的题为“人抗CD40抗体”(Human Anti-CD40Antibodies)的美国临时申请序列号60/237,556和2001年10月2日提交的题为“人抗CD40抗体”(Human Anti-CD40Antibodies)并公开为WO 2002/028904的PCT国际申请号PCT/US01/30857(律师案卷号PP 16092.003)所述的抗CD40单克隆抗体，将上面两篇文献全文纳入本文作参考。体外检测对正常人B细胞增殖的影响时，CHIR-12.12用作拮抗性抗CD40抗体。而且，CHIR-12.12不诱导正常人淋巴细胞强烈增殖。该抗体能够通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)杀伤表达CD40的靶细胞。经BiacoreTM试验测定，CHIR-12.12对人CD40的结合亲和力为5×10-10M。
本文提供了CHIR-12.12抗体可变区的核苷酸和氨基酸序列。更具体说，mAb CHIR-12.12的轻链和重链的前导区、可变区和恒定区的氨基酸序列见SEQ ID NO：2(mAb CHIR-12.12轻链的完整序列)、SEQ ID NO：4(mAbCHIR-12.12重链的完整序列)和SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：4所列的mAbCHIR-12.12重链变体的完整序列，该变体中用丝氨酸取代了SEQ ID NO：4位置153上的丙氨酸残基)。编码mAb CHIR-12.12轻链和重链的核苷酸序列见SEQ ID NO：1(mAb CHIR-12.12轻链的编码序列)和SEQ ID NO：3(mAbCHIR-12.12重链的编码序列)。表达CHIR-12.12抗体的杂交瘤保藏在ATCC，专利保藏号为PTA-5543。
用于本发明方法的抗CD40抗体包括与CHIR-12.12单克隆抗体不同但仍保持CDR的抗体，和加入、缺失或取代了一个或多个氨基酸的抗体。用于本发明方法的抗CD40抗体也可以是去免疫的(de-immunized)抗体，特别是去免疫的拮抗性抗CD40抗体，可以如纳入本文作参考的国际公开号WO 98/52976和WO 0034317所述制备这种抗体。以此方式修饰本发明拮抗性抗CD40抗体内的残基，以使该抗体对人无免疫原性或免疫原性较低，同时保持其对人CD40表达细胞的拮抗活性，这种活性可通过本文其它地方描述的试验测定。本发明范围还包括含有感兴趣抗体，如拮抗性抗CD40抗体或拮抗性抗CD40L抗体或其片段的融合蛋白，本领域众所周知，可以合成该融合蛋白或由对应的多核苷酸载体表达。本文其它地方有关抗体偶联的描述中介绍了这种融合蛋白。
可能含有用以下文献所述方法产生具有感兴趣结合特异性的序列变异的任何已知抗体，这些文献是(例如)专利公开号EP 0983303 A1、WO 00/34317和WO 98/52976，纳入本文作参考。例如，已证明CDR内的序列可导致抗体结合于II类MHC并引发不良的T辅助细胞反应。保守取代可能使抗体保持结合活性，但除去其引发不良T细胞反应的能力。可以用本领域公知的方法进行这类保守或非保守取代，如本文其它地方所述，得到的抗体也可用于本发明方法。通常可用本文所述方法检测变异抗体有无特定活性，例如，拮抗活性、亲和力和特异性。
例如，可通过突变编码感兴趣抗体的克隆的DNA序列制备拮抗性抗CD40抗体，如CHIR-12.12单克隆抗体的氨基酸序列变体。本领域熟知诱变和改变核苷酸序列的方法。参见例如，Walker和Gaastra编(1983)Techniques inMolecular Biology(分子生物学技术)(麦克米兰出版公司(MacMillan PublishingCompany)，纽约)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：试验室手册)(冷泉港，纽约)；美国专利号4,873,192；和其中引用的参考文献；纳入本文作参考。不影响感兴趣多肽的生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见纳入本文作为参考的Dayhoff等，(1978)《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，华盛顿特区)中的模型。优选保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于
Figure S2006800462131D00391
和
Figure S2006800462131D00392
。
在构建感兴趣抗体，如感兴趣拮抗性抗-CD40抗体多肽的变体过程中，进行修饰使变体继续具有所需活性，即相似的结合亲和力并且对于拮抗性抗CD40抗体而言是能否特异性地结合人细胞表面表达的CD40抗原，当与人CD40表达细胞的CD40抗原结合时无明显激动活性而显示拮抗活性。显然，编码这种变体多肽的DNA中的任何突变都必须不能将其序列置于读码框外并且优选不生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利公布号75,444。
此外，可以许多方式使拮抗性抗-CD40抗体的恒定区突变而改变其效应器功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公布号2004/0132101A1所述Fc突变能优化抗体与Fc受体结合。
优选地，参比抗体如拮抗性抗CD40抗体的变体的氨基酸序列与参比抗体如拮抗性抗CD40抗体分子(如本文所述CHIR-12.12单克隆抗体)或者参比抗体分子的较短部分的序列相同性为至少70％或75％，优选至少80％或85％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％。更优选地，这些分子共享至少96％、97％、98％或99％的序列相同性。出于本发明的目的，可使用Smith-Waterman所述的同源性检索算法以相关空格(affine gap)检索确定序列相同性百分比，所用参数为空格开放罚分12、空格延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2：482-489。例如，变体与参比抗体如拮抗性抗-CD40抗体有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基的不同。
就两条氨基酸序列的最佳比对而言，与参比氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的毗连区段可具有添加的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于和参比氨基酸序列比较的毗连区段包括至少20个毗连氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可对与保守残基取代或空格相关的序列相同性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。
能特异性结合CD40并保留拮抗活性的多肽(特别是当与恶性B细胞上的CD40抗原结合时)的精确化学结构取决于许多因素。由于分子中存在可电离的氨基和羧基，获得的特定多肽可以是酸性盐或碱性盐，或中性盐形式。能在合适的环境中保留它们的生物活性的所有这种制剂包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗体的定义中。此外，可通过使用糖组分衍生(糖基化)或其它补充分子，例如脂质、磷酸、乙酰基等加强该多肽的一级氨基酸序列。也可通过与糖偶联来增加。这种增加的某些方面内容可通过生产宿主的翻译后加工***来实现；可在体外引入其它这种修饰。在任何情况中，只要抗-CD40抗体的拮抗性能未遭破坏，这种修饰就包括在本文所用的抗-CD40抗体的定义中。在各种试验中，期望这种修饰可通过提高或降低该多肽的活性来定量或定性地影响其活性。此外，可通过氧化、还原或其它衍生方式来修饰链中的各个氨基酸残基，可切割该多肽得到保留活性的片段。这种不破坏拮抗活性的改变未将该多肽序列排除在本文所用感兴趣的抗-CD40抗体的定义之外。
本领域提供了关于多肽变体的制备和使用的基本指南。在制备抗-CD40抗体变体过程中，本领域的技术人员不难确定对天然蛋白核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰将导致产生适合本发明方法药物组合物中所用的治疗性活性组分的变体。
用于本发明方法的抗CD40抗体在体外和/或体内优选具有至少一种以下生物学活性：抑制T细胞刺激的正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制CD40L表达细胞或可溶性CD40配体(sCD40L)刺激的正常人外周B细胞的存活和/或增殖；抑制Jurkat T细胞刺激的正常人外周B细胞的存活和/或增殖；抑制sCD40L或固相CD40L刺激的任何细胞产生“存活”性抗-凋亡胞内信号；抑制与sCD40L或固相CD40L连接、缺失、无反应(anergy)和/或诱导携带CD40的靶细胞或携带CD40相关配体的细胞(包括但不限于T细胞和B细胞)耐受时任何细胞中的CD40信号转导，诱导CD4+CD25+调节性T细胞的扩增和激活(参见例如，供者同种抗原通过CD40-CD40L干扰的-特异性组织排斥，van Maurik等(2002)J.Immunol.169：5401-5404)，通过任何机制(包括但不限于：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、下调增殖、和/或靶细胞凋亡)发生的细胞毒性、调节靶细胞细胞因子分泌和/或细胞表面分子表达和它们的组合。
可以如本文所述和以下文献所述，进行这些生物学活性的试验，这些文献是(如)2003年11月4日、2003年11月6日和2004年4月27日提交的题为“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 MonoclonalAntibodies and Methods for Their Use)的临时申请，以及美国专利申请60/517,337(律师案卷号PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(律师案卷号PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(律师案卷号PP20107.003(035784/277214))；以及2004年11月4日提交的题为“拮抗性抗CD40单克隆抗体和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methodsfor Their Use)公开为WO 2005/044854的国际专利申请PCT/US2004/037152(律师案卷号PP20107.004(035784/282916))；将这些文献的全部内容纳入本文作参考。也参见纳入本文作参考的Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：8200-8204；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.2：6-15；Evans等(2000)J.Immunol.164：688-697；Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等(1991)Current Protocols inImmunology 13：12；Kwekkeboom等(1993)Immunology 79：439-444；和美国专利号5,674,492和5,847,082所述的试验。
检测本文鉴定的CD40-抗原表位的特异性拮抗性抗CD40抗体的代表性试验是“竞争性结合试验”。竞争性结合试验是通过未知物抑制标记的已知配体和其特异性抗体结合的能力来检测和定量未知物的血清学试验。也称为竞争性抑制试验。在代表性的竞争性结合试验中，标记的CD40多肽被样品中的候选抗体沉淀，例如与针对本发明单克隆抗体的一种或多种表位而制备的单克隆抗体结合而沉淀。可通过筛选针对CD40蛋白或含有感兴趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制备的一系列抗体来鉴定能与感兴趣表位发生特异性反应的抗-CD40抗体。例如，就人CD40而言，感兴趣表位包括含有以下同种型的线性和/或非线性氨基酸残基的表位：人CD40的短同种型(参见由SEQ ID NO：9所列序列编码的SEQ ID NO：10所列的GenBank登录号NP_690593；也参见GenBank登录号NM_152854)，或人CD40的长同种型(参见由SEQ ID NO：11所列序列编码的SEQ ID NO：12所列的GenBank登录号CAA43045和NP_001241；参见GenBank登录号X60592和NM_001250)。或者，可用以前鉴定的合适的拮抗性抗-CD40抗体进行竞争性结合试验来选择与以前鉴定的抗体相当的单克隆抗体。
这种免疫试验采用的抗体可以是标记的或未标记的。未标记的抗体可用于凝结试验；采用各种各样标记物的标记抗体可用于各种试验。使抗体与可检测物质结合有助于检测抗-CD40抗体与感兴趣表位之间形成的抗体-抗原复合物。合适的检测方式包括使用例如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等标记。酶的合适例子包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物例子包括：链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子是鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。这种标记的试剂可用于各种熟知的试验，例如放射性免疫试验，酶免疫试验如ELISA、荧光免疫试验等。参见，例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
也可工程改造抗体，以提高其ADCC活性。具体说，CH2结构域的羧基端一半对FcRIII受体介导的ADCC至关重要。由于CH2和绞链区对效应物功能有重要作用，所以可制备含有额外CH2和/或绞链区的一系列多结构域抗体，并研究其效应物功效的改变(参见Greenwood，J.，Gorman，S.D.，Routledge，E.G.，Lloyd，LS.& Waldmann，H.，Ther Immunol.1994年10月；1(5)：247-55)。另一种方法是平行工程改造额外结构域，例如，将半胱氨酸工程改造加入到嵌合Ig的H链中以产生二聚体(参见Shopes B.(1992)J.Immunol.1992 1；148(9)：2918-22)。而且，可将突变引入Fc区(参见例如，US 6,737,056B1)、在岩藻糖基转移酶缺陷细胞系的细胞中表达(参见例如，US2003/0115614)，或对抗体糖基化实施其它改变(参见例如，US 6,602,684)经工程改造而提高ADCC活性。
本发明的优点是能治疗FcγRIIIa-158F基因型纯合或杂合子患者的细胞表达CD40的癌症和癌前病症。
本文所用“抗-CD20抗体”包括特异性识别CD20细胞表面抗原的任何抗体，包括保持了抗CD20母抗体的抗原结合功能的多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体和其片段，如Fab、F(ab′)2、Fv和其它片段。本发明方法中特别感兴趣的是具有IDEC-C2B8单克隆抗体(拜基IDEC公司(Biogen IDEC Inc.)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA))的结合特性的抗-CD20抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，在人淋巴瘤或骨髓瘤细胞系的裸小鼠异种移植瘤模型中用等量的抗体测定抗肿瘤活性时，用于本发明方法的抗CD40抗体的治疗活性高于嵌合抗-CD20单克隆抗体IDEC-C2B8。IDEC-C2B8(IDEC制药公司，加州圣地亚哥；以商品名利妥昔在市场上销售，也称为利妥昔单抗)是含有人IgG1和κ恒定区以及分离自鼠抗-CD20单克隆抗体IDEC-2B8的可变区的嵌合抗-CD20单克隆抗体(Reff等(1994)Blood 83：435-445)。利妥昔
Figure S2006800462131D00432
被批准用于治疗复发性B细胞低级瘤或滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)。发现与利妥昔
Figure S2006800462131D00433
相比治疗活性、特别是抗肿瘤活性优异的抗体可显著改进癌症和癌前病症，如B细胞淋巴瘤，特别是B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗方法。
合适的裸小鼠异种移植瘤模型包括采用人伯基特淋巴瘤细胞系(称为纳玛(Namalwa)和道迪)的模型。优选的实施方式在用人道迪淋巴瘤细胞系产生各种阶段的裸小鼠异种移植瘤模型中检测抗肿瘤活性，如下文实施例7所述。与不分阶段的模型相比，采用道迪淋巴瘤细胞系产生的各种阶段裸小鼠异种移植瘤模型能更有效地区分给定抗体的疗效，因为在分阶段模型中，只在肿瘤达到可测定大小后开始给予抗体。在不分阶段的模型中，通常约在肿瘤接种1天内至出现可触知肿瘤之前开始给予抗体。在分阶段模型中某抗体效力若优于利妥昔
Figure S2006800462131D00434
(即治疗活性提高)则强烈表明该抗体比利妥昔
Figure S2006800462131D00435
疗效更好。而且，在道迪模型中，利妥昔
Figure S2006800462131D00436
靶向的抗-CD20在细胞表面的表达水平高于CD40。
“等当量”的本发明抗CD40抗体和利妥昔
Figure S2006800462131D00437
指每单位体重给予相同毫克剂量。因此，以用于肿瘤模型的0.01mg/kg小鼠体重给予抗CD40抗体时，也以0.01mg/kg小鼠体重给予利妥昔
Figure S2006800462131D00441
。相似地，以用于肿瘤模型的0.1、1或10mg/kg小鼠体重给予抗CD40抗体时，也分别以0.1、1或10mg/kg小鼠体重给予利妥昔
Figure S2006800462131D00442
。
给予裸小鼠异种移植瘤模型时，一些抗CD40抗体导致肿瘤体积显著小于给予等量利妥昔。例如，以类似于本文实施例7所述的方式在道迪人淋巴瘤细胞系的分阶段裸小鼠异种移植瘤模型中测定时，相对于相同剂量的利妥昔，完全人单克隆抗体CHIR-12.12的抗肿瘤活性高至少20％，并且在这一试验中抗肿瘤活性可能高出多达50％-60％。抗肿瘤活性提高的表现是与相同剂量的利妥昔相比，本发明抗CD40抗体使肿瘤体积缩小更多，或诱导更完全的应答。因此，例如，根据肿瘤接种后的时间长度，采用单克隆抗体CHIR-12.12的肿瘤体积约为相同剂量利妥昔
Figure S2006800462131D00445
观察值的约三分之一至一半。
抗体效力的另一种差异是在体外测定NK细胞存在时获得肿瘤细胞最大裂解的抗体浓度。例如，本发明抗CD40抗体使道迪细胞达到最大裂解的EC50低于利妥昔
Figure S2006800462131D00446
浓度的1/2，优选低于1/4，最优选低于1/10。本文的实施例也描述了这种测定类型。
在上述试验中，效能显著高于等量利妥昔
Figure S2006800462131D00447
的抗CD40抗体可包括：
a)单克隆抗体CHIR-12.12；
b)杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体；
c)包含选自以下氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：2所示序列、SEQID NO：4所示序列、SEQ ID NO：5所示序列、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示序列以及SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示序列；
d)含有选自以下核苷酸序列的核酸分子编码的氨基酸序列的单克隆抗体：SEQ ID NO：1所示序列、SEQ ID NO：3所示序列以及SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3所示序列；
e)能够与杂交瘤细胞系12.12产生的单克隆抗体表位结合的单克隆抗体；
f)结合含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的人CD40序列残基82-87的表位的单克隆抗体；
g)结合含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的人CD40序列残基82-89的表位的单克隆抗体；
h)在竞争性结合试验中与单克隆抗体CHIR-12.12竞争的单克隆抗体；
i)前述项目a)所述的单克隆抗体或前述项目c)-h)中任一项所述的单克隆抗体，所述抗体是重组产生的；和
j)作为前述项目a)-i)中任一项所述单克隆抗体的抗原结合片段的单克隆抗体，所述片段保持了特异性结合人CD40抗原的能力。
本发明提供了鉴定可用抗CD40抗体治疗的癌症或癌前病症病人的方法，所述方法包括：
a)鉴定患有细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人；和
b)鉴定所述病人的FcγRIIIa-158基因型(V/V、V/F或F/F)；
如果所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)，则可用抗CD40抗体治疗其癌症或癌前病症。所述癌症或癌前病症可能用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00451
)难以治疗。
一旦鉴定到病人患有可用抗CD40抗体治疗的癌症或癌前病症，就可用抗CD40抗体治疗该病人。因此，所述方法还可包括步骤(c)，给予鉴定为FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)治疗或预防有效量的抗CD40抗体。
本领域技术人员采用合适的诊断试剂盒不难进行这种鉴定患有可用抗CD40抗体治疗的癌症或癌前病症病人的方法。该试剂盒应装有适合测定病人FcγRIIIa-158基因型的试剂。因此，本发明还提供了鉴定患有可用抗CD40抗体治疗的癌症或癌前病症病人的试剂盒，所述试剂盒装有测定病人FcγRIIIa-158基因型的试剂。本文其它地方更详细地描述了合适的试剂盒。
本发明还提供了选择用于治疗患有癌症或癌前病症病人的抗体疗法的方法，所述方法包括：
a)鉴定患有细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人；和
b)测定所述病人的FcγRIIIa-158基因型(V/V、V/F或F/F)；
其中如果所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)，则选择抗CD40抗体治疗所述癌症或癌前病症。用利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00452
)可能难以治疗这种癌症或癌前病症。
一旦选择了抗CD40抗体治疗癌症或癌前病症病人，则可用抗CD40抗体治疗该病人。因此，所述方法可包括额外步骤(c)，给予鉴定为FcγRIIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或F/F)治疗或预防有效量的抗CD40抗体。
本领域技术人员采用合适的诊断试剂盒也不难进行此方法选择用于治疗患有癌症或癌前病症病人的抗体疗法。该试剂盒应装有适合测定病人FcγRIIIa-158基因型的试剂。因此，本发明还提供了选择用于治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症病人的抗体疗法的试剂盒，其装有测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂。
“可用抗CD40抗体治疗”指用抗CD40抗体治疗时，病人(即患有癌症或癌前病症的个体)将获益于准备治疗的癌症或癌前病症的“正面治疗反应”(如本文其它地方所定义)。
考虑了用获自病人的生物样品测定病人的FcγRIIIa-158基因型的任何方法。
例如，本发明提供了用于测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂盒，其装有一种微阵列，该微阵列包含长度为10个或更多个核苷酸且序列适合测定病人的FcγRIIIa-158基因型的至少一种探针。将标记的RNA或DNA与该阵列上的互补探针杂交，然后用激光扫描检测。测定阵列上各探针的杂交强度，将其转变为代表相对基因表达水平的定量值。本领域技术人员不难选择探针的序列和长度。已知编码FcγRIIIa-158F和V同种异型的人基因和mRNA的核苷酸序列。因此，本领域技术人员可选择在合适的试验条件下能够测定靶序列的FcγRIIIa-158基因型的探针。
美国专利号5,384,261(全文纳入本文作参考)描述了采用机械合成法合成这些阵列的技术。虽然优选平坦阵列表面，但可以在基本上任何形状的表面，甚至多个表面上制备该阵列。阵列可以是珠、凝胶、聚合物表面、纤维如光纤、玻璃或任何其它合适基材上的肽或核酸，参见美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992，各自全文纳入本文用于所有目的。可以某种方式包装阵列，以便用于诊断或全部装置的其它操作。参见例如，美国专利号5,856,174和5,922,591，纳入本文作参考。
例如，本发明还提供了用于测定病人FcγRIIIa-158基因型的试剂盒，其装有适合用作在聚合酶催化下扩增编码FcγRIIIa氨基酸158的基因或mRNA区域的引物的寡核苷酸。本领域技术人员不难选择引物的序列和长度。编码FcγRIIIa-158F和V同种异型的人基因和mRNA的核苷酸序列已知。因此，本领域技术人员可选择在合适的试验条件下能扩增编码FcγRIIIa氨基酸158的基因或mRNA区域的引物。接着，可用已知方法测序扩增序列，以确定患者的FcγRIIIa-158基因型。
测定病人的FcγRIIIa-158基因型的另一种方法是使用基于核酸的方法检测DNA片段化，它是病人的FcγRIIIa-158基因型的特征。用琼脂糖凝胶电泳分析时，各FcγRIIIa-158基因型的DNA具有特征性图案。因此，本发明还提供了用于测定病人的FcγRIIIa-158基因型的试剂盒，其装有适用于测定病人的FcγRIIIa-158基因型的一种或多种限制性酶。本领域已知合适的限制性酶(参见例如Koene等(1997)Blood 90(3)：1109-1114)。
本发明试剂盒也可装有说明如何使用该试剂盒测定病人的FcγRIIIa-158基因型的说明书。该试剂盒也可包括(如)缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒的各个组分通常包装在单独容器中，将所有这些容器和指出如何使用该试剂盒测定病人的FcγRIIIa-158基因型的说明书一起装到一个包装中。
本发明提供了抗CD40抗体在制备治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症的药物中的应用，如本文其它地方所述。
以治疗上有效预防或治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症的浓度给予本发明抗CD40抗体。为了实现这一目标，可用本领域已知的各种可接受的运载体和/或赋形剂配制该抗体。可通过胃肠道外给药途径给予抗CD40抗体。一般通过静脉内或皮下注射给予该抗体。本领域普通技术人员已知进行这种给药的方法。
优选通过在一段时间内输注进行静脉内给药，所述时间约为小于1小时至10小时(小于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时)。可在一段时间后给予后续输注，所述一段时间约为小于1小时至6小时，包括例如，约1-4小时，约1-3小时，或者约1-2小时或小于1小时。或者，可皮下给药。
配制本发明药物组合物，以使其与所需的给药途径相容。用于胃肠道外用药的溶液或悬液可包含以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液；抗菌剂如苄基醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节强度的物质如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节pH。可将胃肠道外制剂包装到安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量药瓶中。
一般通过标准技术以药学上可接受的缓冲液，如无菌盐水、无菌缓冲液或其组合等提供抗CD40抗体。制备胃肠道外给药药物的方法参见Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(第18版；麦克出版公司(MackPublishing Company)，宾夕法尼亚州伊顿(Eaton，Pennsylvania)，1990)，纳入本文作参考。也参见例如WO 98/56418，它描述了适用于本发明方法的稳定抗体药物制剂。
普通技术人员不难确定至少一种抗CD40抗体的给药量。影响给药方式和至少一种抗CD40抗体的给药量的因素包括但不限于：疾病严重程度、所给个体的病史、年龄、身高、体重、健康状况、疾病类型和身体状况对抗体输注的反应。相似地，抗CD40抗体的给药量将取决于给药方式和单剂量或多剂量给予此种抗肿瘤药物。通常，随着所治疗的对象体重增加，优选更高剂量的抗CD40抗体。
给予抗CD40抗体的单剂量的范围是约0.3mg/kg-50mg/kg、约0.1mg/kg-40mg/kg、约0.01mg/kg-30mg/kg、约0.1mg/kg-30mg/kg、约0.5mg/kg-30mg/kg、约1mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-30mg/kg、约3mg/kg-25mg/kg、约3mg/kg-20mg/kg、约5mg/kg-15mg/kg。
因此，例如，该剂量可以是0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg，或者落入约0.3mg/kg-50mg/kg范围内的其它剂量。
用治疗有效量的抗体治疗对象包括一次治疗，或者优选包括一系列治疗。因此，在本发明的另一实施方式中，该方法包括给予多次剂量的抗CD40抗体。该方法包括给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治疗有效剂量的含有抗CD40抗体的药物组合物。本领域技术人员无需过多试验即可确定给予多剂量含抗CD40抗体的药物组合物的频率和持续时间。在疗程中可以给予相同治疗有效剂量的抗CD40抗体。或者，在疗程中可以给予不同治疗有效剂量的抗CD40抗体。
在一个实施例中，用抗CD40抗体治疗对象，剂量范围是约0.1-20mg/kg体重，在约1-10周，优选约2-8周，更优选约3-7周，更优选约4、5或6周中每周给药一次。可以每2-12个月的间隔进行治疗以防止复发，或者一旦出现复发迹象立即给药。应理解，在具体疗程中可能提高或降低用于治疗的抗体有效剂量。可改变剂量，视本文所述的诊断试验结果而改变。
因此，在一个实施方式中，给药方案包括首先在治疗期间的第1、8、15和22天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体。
在另一实施方式中，给药方案包括首先在治疗期间每天，或一周的第1、3、5和7天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体；包括首先在治疗期间一周的第1和3-4天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体的给药方案；和首先在治疗期间一周的第1天给予治疗有效剂量的至少一种抗CD40抗体的优选给药方案。治疗时间可包括1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。治疗时间可以是连续的，或者互相间隔1周、2周、1个月、3个月、6个月或1年。
在其它实施方式中，如本文所述抗CD40抗体的初始治疗有效剂量可用较低剂量范围(即约0.3mg/kg-20mg/kg)，后续剂量用较高剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)。
在其它实施方式中，如本文所述抗CD40抗体的初始治疗有效剂量可用较高的剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)，后续剂量用较低剂量范围(即0.3mg/kg-约20mg/kg)。因此，在本发明的一些实施方式中，可通过将“加载剂量”的抗体给予需要治疗的对象启动抗CD40抗体治疗。“加载剂量”指给予对象的抗CD40抗体的初始剂量，而所给抗体的剂量落入较高剂量范围(即约20mg/kg-50mg/kg)。可通过一次给药(例如IV给予该抗体时一次输注)或多次给药(例如IV给予该抗体时多次输注)给予“加载剂量”，只要在约24小时内给予所有“加载剂量”。给予“加载剂量”后，再向该对象给予一次或多次治疗有效剂量的抗CD40抗体。可按照每周给药方案，或者每两周一次、每三周一次或每四周一次给予后续治疗有效剂量。在这类实施方式中，后续治疗有效剂量通常落入较低剂量范围(即0.3mg/kg-约20mg/kg)。
或者，在一些实施方式中，在“加载剂量”后按照“维持方案”给予后续治疗有效剂量的抗CD40抗体，所述治疗有效剂量的抗体每月给予一次、每6周给予一次、每两个月给予一次、每10周给予一次、每三个月给予一次、每14周给予一次、每4个月给予一次、每18周给予一次、每5个月给予一次、每22周给予一次、每六个月给予一次、每7个月给予一次、每8个月给予一次、每9个月给予一次、每10个月给予一次、每11个月给予一次或者每12个月给予一次。在这类实施方式中，抗CD40抗体的治疗有效剂量为较低剂量范围(即0.003mg/kg-约20mg/kg)，特别是以频率较高的间隔(如每2周一次至每月一次)给予后续剂量时，或者落入较高剂量范围(即约20mg/kg-约50mg/kg)，特别是以频率较低的间隔(如给药间隔约为1个月-12个月)给予后续剂量时。
用于本发明方法的本文所述药物组合物中存在的抗CD40抗体可能是天然抗体，或重组技术获得的抗体，也可来自任何来源，包括哺乳动物来源，如，小鼠、大鼠、兔、灵长动物、猪和人。这类多肽优选衍生自人来源，更优选是来自杂交瘤细胞系的重组人蛋白。
用于本发明方法的药物组合物可包含本发明拮抗性抗CD40抗体的生物活性变体，如本文其它地方所述。
本发明方法可采用含有作为治疗活性组分的具有本文所述结合特性的抗CD40抗体的任何药物组合物。因此，可将含有一种或多种抗CD40抗体的液体、冻干或喷雾干燥的组合物制备成水性或非水性的溶液或悬液，以便随后按照本发明方法给予对象。这些组合物各自包含至少一种抗CD40抗体，作为治疗或预防活性组分。“治疗或预防活性组分”指将抗CD40抗体特地掺入组合物，以便产生所需的治疗或预防反应，从而在将该药物组合物给予对象时治疗、预防或诊断该对象的疾病或病症。所述药物组合物优选包含合适的稳定剂、填充剂或二者，以最大程度减少与制备和储存期间损失蛋白质稳定性和生物学活性有关的问题。
可将配制剂(formulant)加入含有本发明抗CD40抗体的药物组合物中。这些配制剂可包括但不限于：油、聚合物、维生素、糖、胺酸、盐、缓冲剂、清蛋白、表面活性剂或填充剂。糖优选包括糖或糖醇，如单糖、二糖或多糖，或者水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、右旋糖苷、支链淀粉、糊精、α和β环式糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素，或它们的混合物。“糖醇”定义为含有羟基的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和***糖醇。这些糖或糖醇可单独或联合使用。糖或糖醇浓度为1.0％-7％w/v，更优选为2.0％-6.0％w/v。氨基酸优选包括肉毒碱、精氨酸和甜菜碱的左旋(L)形式；然而，可加入其它氨基酸。优选的聚合物包括平均分子量为2,000-3,000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或平均分子量为3,000-5,000的聚乙二醇(PEG)。可加入该制剂的表面活性剂见EP号270,799和268,110。
此外，可通过共价偶联于聚合物莱化学修饰抗体，以提高其循环半衰期。例如，全文纳入本文作参考的美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546描述了使抗体与肽连接所用的优选聚合物和方法。优选的聚合物是聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下可溶于水，通式为：R(O--CH2--CH2)n O-R，其中R可以是氢，或保护基如烷基或烷醇基。保护基优选含有1-8个碳，更优选甲基。符号n是正整数，优选为1-1,000，更优选2-500。PEG的平均分子量优选为1,000-40,000，更优选2,000-20,000，最优选3,000-12,000。PEG优选含有至少一个羟基，更优选是末端羟基。优选活化这种羟基，以便与抑制剂上的游离氨基反应。然而应理解，可改变反应性基团的类型和数量，以获得本发明共价偶联的PEG/抗体。
水溶性聚氧乙烯多元醇也可用于本发明。它们包括聚氧乙烯化的山梨糖醇、聚氧乙烯葡萄糖、聚氧乙烯甘油(POG)等。优选POG。一个原因是因为聚氧乙烯甘油的甘油主链与(例如)动物和人的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯中天然产生的主链相同。因此，在体内这种分支不一定被视为外来物质。POG的优选分子量范围与PEG相同。Knauf等(1988)J Bio.Chem.263：15064-15070显示了POG的结构，关于POG/IL-2偶联物的讨论参见美国专利号4,766,106，将这两篇文献全文纳入本文作参考。
提高循环半衰期的另一种药物递送***是脂质体。制备脂质体递送***的方法参见Gabizon等(1982)Cancer Research 42：4734；Cafiso(1981)BiochemBiophys Acta 649：129；和Szoka(1980)Ann.Rev.Biophys.Eng.9：467。本领域已知其它药物递送***，参见例如Poznansky等(1980)Drug Delivery Systems(药物递送***)(R.L.Miano编，纽约州牛津)第253-315页；Poznansky(1984)Pharm Revs 36：277。
掺入药物组合物的配制剂应该为抗CD40抗体提供稳定作用。即，抗CD40抗体应该保持其物理和/或化学稳定性，并具有所需的生物学活性，即上文中定义的一种或多种拮抗活性，包括但不限于：抑制T细胞刺激正常人外周B细胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T细胞刺激正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制CD40L表达细胞或可溶性CD40配体(sCD40L)刺激正常人外周B细胞存活和/或增殖；抑制sCD40L或固相CD40L刺激任何细胞中的“存活”抗-凋亡胞内信号；抑制与sCD40L或固相CD40L连接后任何细胞中的CD40信号转导；和抑制本文其它地方所述的人恶性B细胞增殖。
本领域熟知监测蛋白质稳定性的方法。参见例如，Jones(1993)Adv.DrugDelivery Rev.10：29-90；Lee编(1991)Peptide and Protein Drug Delivery(肽和蛋白质药物递送)(马赛代克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约州纽约)；以及下文所述的稳定性试验。通常，测定蛋白质在所选温度下一段时间的稳定性。在优选实施方式中，室温(约25℃)下储存稳定的抗体药物制剂提供的抗CD40抗体稳定性至少1个月、至少3个月或至少6个月，和/或在约2-8℃稳定至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月。
配制在药物组合物中时，如果在给定时间点该药物组合物不出现沉淀、聚集和/或变性现象(如褪色或不澄清)或可检测迹象(例如，用分子大小排阻层析(SEC)或UV光散射检测)，则认为该蛋白质如抗体保持了它的物理稳定性。就化学稳定性而言，如果配制在药物组合物中时，在给定时间点上化学稳定性的测定表明该蛋白质(即抗体)在药物组合物中保持了感兴趣的生物学活性，则认为该蛋白质如抗体保持了它的化学稳定性。监测化学稳定性改变的方法是本领域众所周知的，包括但不限于：检测蛋白质化学形式改变的方法，例如采用(如)SDS-PAGE、SEC和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱检测蛋白质剪切的结果；和采用(如)离子交换色谱检测与分子电荷改变有关(例如，与脱酰胺有关)的降解。参见例如，下文所述方法。
配制在药物组合物中时，如果经过所需生物学活性的合适试验测定，在给定时间点上所需生物学活性是药物组合物制备时的所需生物学活性的约30％、优选约20％以内，则认为抗CD40抗体保持了所需的生物学活性。可以如本文实施例所述测定抗CD40抗体的所需生物学活性。也参见Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8200-8204；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.2：6-15；Evans等(2000)J.Immunol.164：688-697；Noelle(1998)Agents Actions Suppl.49：17-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.3：77-86；Coligan等(1991)Current Protocols in Immunology 13：12；Kwekkeboom等(1993)Immunology79：439-444；和美国专利号5,674,492和5,847,082所述的试验；纳入本文作参考。
在本发明的一些实施方式中，将抗CD40抗体配制成液体药物制剂。可采用本领域已知方法，包括上文公开的方法制备抗CD40抗体。在一个实施方式中，在CHO细胞系中重组产生抗CD40抗体。
在配制成制剂之前储存抗CD40抗体时，可冻存(如≤20℃)该抗体，然后在室温下融化，用于进一步配制制剂。所述液体药物组合物包含治疗有效量的抗CD40抗体。制剂中存在的抗体量需要考虑给药途径和所需的剂量体积。
以此方式，该液体药物组合物包含浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml、约0.5mg/ml-40.0mg/ml、约1.0mg/ml-30.0mg/ml、约5.0mg/ml-25.0mg/ml、约5.0mg/ml-20.0mg/ml或约15.0mg/ml-25.0mg/ml的抗CD40抗体。在一些实施方式中，该液体药物组合物包含浓度为约0.1mg/ml-5.0mg/ml、约5.0mg/ml-10.0mg/ml、约10.0mg/ml-15.0mg/ml、约15.0mg/ml-20.0mg/ml、约20.0mg/ml-25.0mg/ml、约25.0mg/ml-30.0mg/ml、约30.0mg/ml-35.0mg/ml、约35.0mg/ml-40.0mg/ml、约40.0mg/ml-45.0mg/ml或约45.0mg/ml-50.0mg/ml的抗CD40抗体。在其它实施方式中，该液体药物组合物包含浓度为约15.0mg/ml、约16.0mg/ml、约17.0mg/ml、约18.0mg/ml、约19.0mg/ml、约20.0mg/ml、约21.0mg/ml、约22.0mg/ml、约23.0mg/ml、约24.0mg/ml或约25.0mg/ml的抗CD40抗体。该液体药物组合物包含抗CD40抗体和将该制剂的pH维持在约pH 5.0-pH 7.0的范围，包括约pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0和约pH 5.0-pH 7.0范围内的其它值的缓冲剂。在一些实施方式中，该缓冲液将该制剂的pH保持在约pH 5.0-pH 6.5、约pH 5.0-pH 6.0、约pH 5.0-pH 5.5、约pH 5.5-7.0、约pH 5.5-pH 6.5或约pH 5.5-pH 6.0的范围内。
该制剂中可采用将液体抗CD40抗体制剂的pH维持在约pH 5.0-pH 7.0的范围内的任何合适缓冲剂，只要如上所述保持该抗体的物理化学稳定性和所需生物学活性。合适缓冲剂包括但不限于：常用酸和其盐，其中抗衡离子可以是(例如)钠、钾、铵、钙或镁。可用于缓冲该药物液体制剂的常用酸和其盐的例子包括但不限于：琥珀酸或琥珀酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐、乙酸或乙酸盐、酒石酸或酒石酸盐、磷酸或磷酸盐、葡糖酸或葡糖酸盐、谷氨酸或谷氨酸盐、天冬氨酸或天冬氨酸盐、马来酸或马来酸盐以及苹果酸或苹果酸盐缓冲剂。该制剂内的缓冲液浓度可以是约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或者约1mM-50mM范围内的其它值。在一些实施方式中，该制剂内的缓冲液浓度为约5mM-15mM，包括约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM，或者约5mM-15mM范围内的其它值。
在本发明的一些实施方式中，液体药物制剂包含治疗有效量的抗CD40抗体和浓度能使制剂pH维持在约pH 5.0-pH 7.0，优选约pH 5.0-pH 6.5范围内的琥珀酸盐缓冲剂或柠檬酸盐缓冲剂。“琥珀酸盐缓冲液”或“柠檬酸盐缓冲液”指分别指含有琥珀酸盐或柠檬酸盐的缓冲液。在优选实施方式中，琥珀酸或柠檬酸盐抗衡离子是钠阳离子，因此该缓冲液分别是琥珀酸钠或柠檬酸钠。然而，预计任何阳离子均有效。其它可能的琥珀酸盐或柠檬酸盐阳离子包括但不限于：钾、铵、钙和镁。如上所述，该制剂内琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲液浓度可以为约1mM-50mM，包括约1mM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或约1mM-50mM范围内的其它值。在一些实施方式中，该制剂内的缓冲液浓度为约5mM-15mM，包括约5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或约15mM。在其它实施方式中，该液体药物制剂包含抗CD40抗体，其浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml，和琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲液，如琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液，其浓度为约1mM-20mM、约5mM-15mM，优选约10mM。
理想地，该液体药物制剂接近等渗时，含有抗CD40抗体和缓冲液的液体药物制剂还可包含使该制剂接近等渗的足量等渗剂。“接近等渗”指水性制剂的渗透压为约240mmol/kg-360mmol/kg，优选约240-340mmol/kg，更优选约250-330mmol/kg，更优选约260-320mmol/kg，更优选约270-310mmol/kg。本领域技术人员了解测定溶液等渗的方法。参见例如，Setnikar等(1959)J Am.Pharm.Assoc.48：628。
本领域技术人员熟悉用于使药物组合物等渗的各种药学上可接受的溶质。等渗剂可以是能将本发明液体药物制剂的渗透压调节至接近与体液相同的值的任何试剂。需要使用生理上可接受的等渗剂。因此，含有治疗有效量的抗CD40抗体和缓冲液的液体药物制剂还可包含可用于提供等渗性的组分，如氯化钠；氨基酸如丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸；糖和糖醇(多元醇)，包括但不限于：葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、海藻糖、甘油、山梨糖醇和木糖醇；乙酸、其它有机酸或其盐，以及相对少量的柠檬酸盐或磷酸盐。本领域普通技术人员知道适用于提供液体制剂的最优等渗强度的其它物质。
在一些优选实施方式中，含有抗CD40抗体和缓冲液的液体药物制剂还含有氯化钠作为等渗剂。该制剂中的氯化钠浓度取决于其它组分对渗透性的贡献。在一些实施方式中，氯化钠浓度为约50mM-300mM、约50mM-250mM、约50mM-200mM、约50mM-175mM、约50mM-150mM、约75mM-175mM、约75mM-150mM、约100mM-175mM、约100mM-200mM、约100mM-150mM、约125mM-175mM、约125mM-150mM、约130mM-170mM、约130mM-160mM、约135mM-155mM、约140mM-155mM或约145mM-155mM。在一个这类实施方式中，氯化钠浓度为约150mM。在其它这类实施方式中，氯化钠浓度为约150mM，缓冲液是浓度约为5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液，该液体药物制剂含有治疗有效量的抗CD40抗体，该制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH 5.5-pH 6.5。在其它实施方式中，该液体药物制剂含有浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml的抗CD40抗体、约150mM氯化钠和约10mM琥珀酸钠或柠檬酸钠，pH为约pH 5.5。
可将表面活性剂掺入本发明液体药物制剂，以降低溶液-空气界面上的表面张力，从而抑制加工该制剂期间冻融或机械剪切引起的蛋白质降解。因此，在一些实施方式中，该液体药物制剂含有治疗有效量的抗CD40抗体、缓冲液，还包含表面活性剂。在其它实施方式中，该液体药物制剂含有抗CD40抗体、缓冲液、等渗剂，还含有表面活性剂。
所用的表面活性剂一般是非离子型表面活性剂，包括聚氧乙烯山梨糖醇酯，如聚山梨酯80(吐温80)和聚山梨酯20(吐温20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯如普朗尼克F68；聚氧乙烯醇如Brij 35；西甲硅油；聚乙二醇如PEG400；溶血磷脂酰胆碱；和聚氧乙烯-对-叔-辛基酚如Triton X-100。通过表面活性剂或乳化剂使药物稳定的经典方法参见例如，Levine等(1991)J Parenteral Sci.Technol.45(3)：160-165，纳入本文作参考。用于实施本发明的优选表面活性剂是聚山梨酯80。当包含表面活性剂时，加入量一般为约0.001％-1.0％(w/v)、约0.001％-0.5％、约0.001％-0.4％、约0.001％-0.3％、约0.001％-0.2％、约0.005％-0.5％、约0.005％-0.2％、约0.01％-0.5％、约0.01％-0.2％、约0.03％-0.5％、约0.03％-0.3％、约0.05％-0.5％或约0.05％-0.2％。
因此，在一些实施方式中，该液体药物制剂含有治疗有效量的抗CD40抗体，和浓度为约1mM-50mM、约5mM-25mM或约5mM-15mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠缓冲液；该制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0或约pH 5.5-pH 6.5；该制剂还包含含量为约0.001％-1.0％或约0.001％-0.5％的表面活性剂，如聚山梨酯80。这类制剂可任选地含有等渗剂，如浓度为约50mM-300mM、约50mM-200mM或约50mM-150mM的氯化钠。在其它实施方式中，该液体药物制剂含有浓度为约0.1mg/ml-50.0mg/ml或约5.0mg/ml-25.0mg/ml，包括约20.0mg/ml的抗CD40抗体；约50mM-200mM氯化钠，包括约150mM氯化钠；约5mM-20mM的琥珀酸钠或柠檬酸钠，包括约10mM琥珀酸钠或柠檬酸钠；浓度为约50mM-200mM，包括约150mM的氯化钠；和任选的表面活性剂，如含量为约0.001％-1.0％，包括约0.001％-0.5％聚山梨酯80；该液体药物制剂的pH为约pH 5.0-pH 7.0、约pH 5.0-pH 6.0、约pH 5.0-pH 5.5、约pH 5.5-pH 6.5或约pH 5.5-pH 6.0。
该液体药物制剂可基本不含如上所述的任何防腐剂和其它运载体、赋形剂或稳定剂。或者，该制剂可含有一种或多种防腐剂，例如，上文所述的抗菌剂、药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂，只要它们不会对抗CD40抗体的物理化学稳定性造成不良影响。可接受的运载体、赋形剂和稳定剂的例子包括但不限于：其它缓冲剂、助溶剂、表面活性剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)、螯合剂如EDTA、金属络合物(如锌-蛋白质络合物)和可生物降解的聚合物如聚酯。关于药学上可接受的运载体、稳定剂和等渗剂(isomolyte)的配方和选择的充分讨论可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(第18版；麦克出版公司(Mack Publishing Company)，宾夕法尼亚州伊顿，1990)，纳入本文作参考。
本文所用的“运载体”包括在所用剂量和浓度下对接触的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的运载体常常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的运载体的例子包括缓冲剂如磷酸、柠檬酸、琥珀酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如吐温、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克。
与一种或多种其它治疗剂“联合”给药包括同时和以任何顺序依次给药。
制备本文所述的液体药物制剂或其它药物组合物后，可将其冻干以防止降解。
本领域普通技术人员已知冻干液体组合物的方法。临用前，可用无菌稀释液(如林格氏溶液、蒸馏水或无菌盐水)重建该组合物，所述无菌稀释液可能含有其它成分。重建后，优选用本领域技术人员已知的方法将该组合物给予对象。
在一些实施方式中，抗CD40抗体可与至少一种其它癌症疗法联用，所述其它癌症疗法包括但不限于：手术、放疗、化疗、细胞因子治疗或考虑用于治疗感兴趣实体瘤的其它单克隆抗体，在抗CD40抗体治疗之前、期间或之后给予其它癌症疗法。因此，当联合治疗包括给予抗-CD40抗体时联合给予另一种治疗剂，例如化疗、细胞因子治疗或其它单克隆抗体，本发明方法包括用分开的制剂或单独的药物制剂共同给药，和以任一顺序依次给药，优选在一段时间使两种(或所有)活性药物同时发挥其治疗活性。当本发明的方法包括联合治疗方案时，这些治疗可同时进行，即抗-CD40抗体与其它癌症疗法同时给予或在相同的时间框内给予(即，同时进行治疗，但抗-CD40抗体不需要与其它癌症疗法在正好相同的时间给予)。或者，本发明的抗-CD40抗体也可在其它癌症疗法之前或之后给予。可依次进行不同的癌症疗法而不论受治疗的对象是否对第一疗程有所反应而降低缓解(remission)或复发的可能性。当联合疗法包括联合给予抗-CD40抗体和细胞毒药物时，优选在给予细胞毒药物之前给予抗-CD40抗体。
以此方式，抗CD40抗体与至少一种其它癌症疗法联用，所述其它癌症疗法包括但不限于：外科或手术方法(如脾切除术、肝切除术、***切除术、白细胞去除术(leukophoresis)、骨髓移植等)；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植联用，合适的化疗药物包括但不限于：氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、瘤可宁、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(cladribine)、环磷酰胺、阿霉素、***和它们的组合，例如含有蒽环类的联用方案，如CAP(环磷酰胺、阿霉素加***)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、***加阿霉素)、VAD(长春新碱、阿霉素加***)、MP(美法仑加***)，和用于化疗的其它细胞毒和/或治疗性药物，如米托蒽醌、道诺红菌素、依达比星、天冬酰胺酶和抗代谢药物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨(nelarabine)；其它抗癌症单克隆抗体疗法(例如，阿来组单抗(alemtuzumab)(Campath
Figure S2006800462131D00581
)或其它靶向恶性B细胞上细胞表面糖蛋白CD52的抗-CD52抗体；利妥昔单抗(利妥昔
Figure S2006800462131D00582
)、完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗(tositumomab)/I-131托西莫单抗(Bexxar
Figure S2006800462131D00583
)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(Zevalin
Figure S2006800462131D00584
)或任何其它靶向恶性B细胞上CD20抗原的治疗性抗-CD20抗体；抗-CD19抗体(例如，MT103，双特异性抗体)；抗-CD22抗体(例如，人源化单克隆抗体埃坡组单抗(epratuzumab))；贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)或其它靶向人血管内皮细胞生长因子的抗癌抗体；靶向恶性B细胞上CD22抗原的抗-CD22抗体(例如，单克隆抗体BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬细胞集落刺激因子的α-M-CSF抗体；靶向多发性骨髓瘤中过度表达的核因子-κB(RANK)及其配体(RANKL)的受体激活剂的抗体；靶向恶性B细胞上CD23抗原的抗-CD23抗体(例如，IDEC-152)；靶向CD80抗原的抗-CD80抗体(例如，IDEC-114)；靶向恶性B细胞CD38抗原的抗-CD38抗体；靶向恶性B细胞上表达的主要组织相容性复合体II类受体的抗体(抗-MHC抗体)；靶向恶性B细胞上CD40抗原的其它抗CD40抗体(例如SGN-40)；和靶向肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体受体1(TRAIL-R1)的抗体(例如，激动性人单克隆抗体HGS-ETR1)以及靶向许多实体瘤和血液来源肿瘤上表达的TRAIL-R2的抗体；小分子癌症疗法，包括但不限于：微管和/或托扑异构酶抑制剂(例如，有丝***抑制剂多拉斯他汀(dolastatin)和其类似物；微管蛋白结合药物T900607；XL119；和托扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林(midostaurin)((PKC-412、CGP41251、N-苯甲酰基十字孢碱)、pixantrone、奥沙利铂(eloxatin)(一种抗肿瘤药物)、硝酸镓(硝酸镓)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(诱导恶性淋巴细胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷类似物，如氯法拉滨(clofarabine)、癌细胞产生蛋白质Bcl-2的抑制剂(例如，反义药物奥利默森(oblimersen)和Genasense
Figure S2006800462131D00592
)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米(bortezomib)))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰酶的小分子抑制剂(例如，杂交/极性细胞分化HPC)药物，如N-辛二酰苯异羟肟酸(suberanilohydroxamic acid)(SAHA)、和FR-901228)和凋亡药物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin
Figure S2006800462131D00594
(莫特沙芬钆(motexafin gadolinium))；基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法，包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化的免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，MyVax
Figure S2006800462131D00595
个性化免疫疗法，以前命名为GTOP-99)、Promune
Figure S2006800462131D00596
(CpG 7909，一种toll-样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素-α疗法、白介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法；类固醇疗法；或其它癌症疗法；其中其它癌症疗法在拮抗性抗-CD40抗体治疗给予之前、期间或之后给予。
在一个实施方式中，抗CD40抗体与硼替佐米(VELCADE
Figure S2006800462131D00601
)联用，特别适合用于治疗多发性骨髓瘤。WO 2005/044855A2公开了CHIR-12.12与硼替佐米联合治疗能提高抑制多发性骨髓瘤试验模型的肿瘤生长的效能。
在一个实施方式中，抗CD40抗体与IL-2联用，特别适合用于治疗B细胞淋巴瘤。WO 2005/044294A2公开了CHIR-12.12与IL-2联合治疗对纳玛肿瘤产生加成的抗肿瘤活性。
因此，本发明提供了治疗或预防有效量的抗CD40抗体在制备治疗FcγRJIIa-158F杂合或纯合子病人(基因型V/F或V/F)细胞表达CD40的癌症或癌前病症的药物中的应用，其中该药物与至少一种其它癌症疗法协调治疗。
“协调”指在用至少一种其它癌症疗法治疗对象之前、期间或之后使用含有抗CD40抗体的药物。
本发明还提供了抗CD40抗体在制备治疗细胞表达CD40的癌症或癌前病症患者的药物中的应用，其中所述病人是FcγRIIIa-158F杂合或纯合子(基因型V/F或F/F)，曾用至少一种其它癌症治疗剂预先治疗过。
“预先治疗过”或“预先治疗”指在接受包含抗-CD40抗体的药物之前，对象已接受过一种或多种其它癌症疗法(即，已用至少一种其它癌症疗法治疗过)。“预先治疗过”或“预先治疗”包括在用包含抗-CD40抗体的药物治疗开始前的以下时间内：2年、18个月、1年、6个月、2个月、6周、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天，曾采用至少一种其它癌症疗法治疗过的对象。所述对象无需对先前一种或多种癌症疗法产生反应。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗体的药物的对象可以对先前癌症疗法或一种或多种先前癌症疗法(当预先治疗由多种疗法组成时)的预先治疗已产生反应或未产生反应。对象在接受包含抗-CD40抗体的药物之前曾接受过的其它癌症疗法的例子包括但不限于：手术；放疗；化疗，任选与自体骨髓移植联合，所述合适的化疗药物包括，但不限于WO 2005/044854、WO 2005/044304、WO 2005/044305、WO2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044307和WO 2005/044294所述的药物；其它抗癌单克隆抗体疗法，包括但不限于WO 2005/044854、WO2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO2005/044307和WO 2005/044294所述的抗癌抗体；基于小分子的癌症疗法，包括但不限于WO 2005/044854、WO 2005/044304、WO 2005/044305、WO2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044307和WO 2005/044294所述的小分子；基于疫苗/免疫治疗的癌症疗法，包括但不限于WO 2005/044854、WO 2005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044307和WO 2005/044294所述的癌症疗法；类固醇疗法；其它癌症疗法；或它们的任何组合。
本文将协调使用抗CD40抗体与一种或多种其它癌症疗法的“治疗”定义为将抗CD40抗体或其它癌症疗法应用于或给予患者，或应用于或给予患者的分离的组织或细胞系，所述患者患有疾病、有疾病症状或对疾病易感，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、消除或影响患者的疾病、疾病症状或疾病易感性。“治疗”也指将含有抗CD40抗体或其它癌症疗法的药物组合物应用于或给予患者，或将含有抗CD40抗体或其它癌症疗法的药物组合物应用于或给予患者的分离的组织或细胞系，所述患者患有疾病、有疾病症状或对疾病易感，给药的目的是为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、消除或影响该疾病、疾病症状或疾病易感性。
在一些实施方式中，相对于单独给予的各治疗剂，联合治疗协同改善了疗效。用术语“协同”描述两种或多种活性药物的联用的效力大于各活性药物单用之和。因此，当两种或多种药物的联用导致某活性或过程如肿瘤生长的“协同抑制”时，则指对该活性或过程的抑制作用大于各活性药物的抑制作用之和。术语“协同疗效”指两种或多种治疗联用时观察到的疗效(通过任一参数测定)大于用各自治疗观察到的各自疗效之和。
现在，只通过举例的方式更详细地描述本发明的各个方面和实施方式。应理解，可对细节进行修改，而不会背离本发明范围。
                            实验
用于以下实施例的抗CD40抗体是CHIR-12.12。CHIR-12.12抗体的产生、测序和鉴定详见国际专利申请公开号WO 2005/044854、WO 2005/044304、WO2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044307和WO2005/044294。将表达CHIR-12.12抗体的杂交瘤细胞系153.8E2.D10.D6.12.12(CMCC#12056)保藏到美国典型培养物保藏中心[ATCC；大学大道10801号，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，Virginia)20110-2209(USA)]，专利保藏号为PTA-5543。
实施例1：分析细胞系的ADCC
比较了CHIR-12.12和利妥昔单抗对同时表达CD40和CD20抗原的各种恶性B细胞系的相对ADCC活性，这些细胞系包括淋巴瘤细胞系(道迪、纳玛细胞系)、多发性骨髓瘤细胞系(ARH77、IM-9)、B-ALL细胞系(CCRF-SB)和B-CLL细胞系(EHEB)。
分别测定最大裂解百分数和ED50，比较CHIR-12.12和利妥昔单抗的ADCC效能和强度。这些试验的结果见图1A-1F。在所有靶细胞系中，与利妥昔单抗相比，CHIR-12.12是强度和效能更高的ADCC介导物。在这六种检测的细胞系中，每个细胞表面的CD20分子数比CD40分子数高2.6-30.8倍。这些数据证明，尽管与CD20相比展示的CD40分子较少，但与利妥昔单抗相比CHIR-12.12能更有效地裂解恶性B-细胞系。
实施例2：分析CLL患者细胞的ADCC
比较了CHIR-12.12和利妥昔单抗对8名患者的离体原代CLL细胞的相对ADCC活性。与利妥昔单抗相比，CHIR-12.12对所有患者CLL的ADCC活性更高(参见图2A-D和图3)。CHIR-12.12和利妥昔单抗的最大裂解百分数的平均值分别为49±16％和31±14％。如测定的ED50值(分别为14.1pM与155.5pM)所示，CHIR-12.12的效能比利妥昔单抗高10倍以上。
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验设计
靶细胞：CLL患者细胞，5000个/孔。效应细胞：纯化的正常人NK细胞，50,000个/孔。E∶T比：10。抗体浓度：0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10μg/ml。培育时间：4小时。培养基：RPMI(不含酚红)+10％FBS+1％P/S。培养装置：96孔圆底平板。读数：用485nm激发光/535nm发射光以任意荧光单位(AFU)测定释放的钙黄绿荧光AM。计算：％特异性裂解＝100×(AFU检测值-AFU自发性释放值1)/(AFU最大释放值2-AFU自发性释放值)。阴性对照：没有抗体或NK细胞时靶细胞释放的钙黄绿荧光。阳性对照：用去污剂(1％NP40)裂解后靶细胞释放的钙黄绿荧光。
图2和3所示结果表明，CHIR-12.12对CLL患者细胞介导的ADCC高于利妥昔单抗。ADCC差异的大小可能取决于靶细胞或NK供者细胞，但在所有患者样品中均能观察到。用两位不同供者的NK检测一位患者的CLL细胞时，CHIR-12.12介导的二供者NK细胞的ADCC高于利妥昔单抗，但ADCC强度差异不同(见图4)。这种优异ADCC的机制基础可能包括靶抗原(CD20和CD40)的相对表达水平、抗体内化程度和抗体对NK细胞FcγIIIa受体的亲和力。因此，研究了这些因素对CHIR-12.12和利妥昔单抗的ADCC活性的影响。
实施例3：细胞表面CD40和CD20分子的定量
定量研究了CLL细胞的CD20和CD40密度(实施例3)和抗体内化程度(实施例4)，因为它们可能是上述ADCC活性差异的原因。然后比较了CHIR-12.12和利妥昔单抗对9名患者离体原代CLL细胞的相对ADCC活性。CHIR-12.12对所有患者的CLL的ADCC大于利妥昔单抗(见图2A-D和图3)。CHIR-12.12和利妥昔单抗的最大裂解百分数平均值分别为48±15％和30±14％。如测定的ED50值(分别为13.2pM与147.2pM，图6)所示，CHIR-12.12的效能比利妥昔单抗高10倍以上。
CHIR-12.12的ADCC活性和效能较高并不依赖细胞表面CD40分子的较高密度，因为细胞表面上CD20分子数比CD40分子多1.3-14倍(参见图5和图6)。
方法
用染色缓冲液(含有1％BSA、0.1％叠氮化钠的PBS)配制的1mg/ml人IgG1预先培育细胞，以封闭非特异性结合位点。4℃(冰上)培育30分钟。然后加入100、10、1、0.1μg/ml的FITC偶联的人IgG1同种型对照、FITC偶联的CHIR-12.12或FITC偶联的利妥昔单抗，4℃(冰上)培育细胞30分钟。用染色缓冲液(PBS+1％FBS+0.1％叠氮化钠)洗涤细胞，并通过FACS Calibur进行分析。
用FACS测定荧光强度的几何平均值。然后根据校正的FITC珠建立的标准曲线计算等效可溶荧光色素分子(MESF)。
实施例4：结合细胞系的CD40后CH12.12不诱导内化
用淋巴瘤细胞道迪细胞系和MM细胞系ARH77评价CH12.12结合对内化的影响。用1μg/mL的人IgG1(对照抗体)或CH12.12在冰上培育细胞(含有0.1％叠氮化钠以阻断内化)或37℃(无叠氮化钠)培育3小时。用冰冷的染色缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％叠氮化钠)洗涤后，用山羊抗-人IgG-FITC在冰上染色细胞30分钟。通过FACS Calibur记录荧光强度的几何平均数(MFI)。在存在叠氮化钠时用CH 12.12冰上培育的细胞或没有叠氮化钠时37℃培育的细胞的MFI没有差异(图7)。这些数据证明，结合CD40后CH12.12不内化，并且继续展示在细胞表面上。
实施例5：结合CLL患者细胞后CHIR-12.12和利妥昔单抗的内化：FACS 和共聚焦显微术
共聚焦显微术
用10μg/ml Alexa 488或FITC偶联的CHIR-12.12、利妥昔单抗和IgG1 40℃(含有0.1％叠氮化钠)或37℃(不含叠氮化钠)培育细胞3小时。然后洗涤细胞，用2％甲醛室温固定5分钟。然后洗涤细胞，放在聚-L-赖氨酸包被的玻片上，固定并密封，然后通过共聚焦成像分析。
结果
这些实验的结果见图8(FACS)以及图9和10(共聚焦显微镜)。图11中小结了这些实验的结果。通过流式细胞术和共聚焦显微术，采用原代CLL细胞和B细胞研究这些抗体内化显示，37℃结合CD40后，CHIR-12.12仍然均一地分布在细胞表面上(即使经过3小时)。相反，37℃结合后，利妥昔单抗再次分布于帽内，并内化。这些数据表明，CHIR-12.12的强效ADCC活性可能与其能够将自身均一地展示在靶细胞表面上，以便与效应细胞发生最优相互作用有关。这些结果表明，CHIR-12.12可能在体内介导对CLL细胞的强效ADCC作用。
实施例6：用Biacore分析利妥昔和CHIR-12.12与FcγRIIIa的结合
通过标准Biacore
Figure S2006800462131D00651
分析比较了FcγRIIIa aa158F和aa158V等位基因对CHIR-12.12和利妥昔单抗的亲和力。CHIR-12.12与aa158F等位基因的结合亲和力比利妥昔单抗高4.6倍(KD分别为2.8μM和13μM)。下表中小结了这些试验的结果。
实施例7：FcγRIIIa多态性对NK效应细胞ADCC的影响
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是许多市售和研究的单克隆抗体的主要作用机制。认为销售的用于治疗滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的利妥昔单抗(利妥昔)对其它B细胞恶性肿瘤也有活性，其主要作用机制之一ADCC。显然，已证明利妥昔单抗在NHL中的临床活性与FcγRIIIa基因型相关联。与F/F患者相比，具有V/V或V/F的FcγRIIIa 158aa多态性的患者对利妥昔单抗的反应性更好(参见例如Cartron等，Blood(2002)，99(3)：754-758或Dall′Ozzo等，CancerRes.(2004)64：4664-4669)。
在这些实验中，用人淋巴瘤道迪细胞系作为靶细胞评价由多位人供者纯化的表达不同FcγRIIIa aa158多态性的NK效应细胞(见图12和13)。如图所示，CHIR-12.12能诱导所有三种基因型NK细胞的强效ADCC。CHIR-12.12裂解F/F、V/F和V/V的道迪细胞系的ED50分别为4、2和0.4pM(图13)。利妥昔单抗裂解F/F、V/F和V/V的道迪细胞系的ED50分别为53、21和9pM(图13)。
还用CLL患者细胞作为靶细胞评价由多位人供者纯化的表达不同FcγRIIIa aa158多态性的NK效应细胞(见图14)。发现与利妥昔单抗相比，CHIR-12.12对所有检测的CLL患者细胞是更强效的ADCC介导物(图14)。这些数据表明，利妥昔单抗相比，CHIR-12.12是更强效的ADCC介导物，即使对aa158V/F或F/F基因型的NK细胞而言也是如此。
这些发现令人惊讶，因为与V/V相比，预期使用具有F/F或V/F FcγRIIIa158aa多态性NK细胞的ADCC试验中CHIR-12.12的强度显然较低。再一次证明，利妥昔单抗在NHL中的临床活性与FcγRIIIa基因型有关。与F/F相比，具有V/V或V/F的FcγRIIIa 158aa多态性的患者对利妥昔单抗的反应更强。利妥昔单抗也是结合B细胞表面表达抗原的IgG1单克隆抗体，因此预计CHIR-12.12会同样偏爱FcγRIIIa-158V多态性。然而，发现CHIR-12.12诱导所有三种基因型NK细胞的强效ADCC。
本发明所属领域的技术人员可从前文描述和相关附图中获益进而想出这些发明的许多改进形式和其它实施方案。因此，应该理解本发明不仅限于所公开的具体实施方案，这些改进形式和其它实施方案均包括在所附权利要求书的范围内。虽然本文使用了特定的术语，但它们仅是一般性和描述性地使用并非出于限制的目的。
将说明书中述及的所有出版物和专利申请全部纳入本文作参考，如同将每篇单独的出版物或专利申请特别和单独地纳入本文用作参考一样。
  申请人或代理人的档案号： PP028162.0002(319129) 国际申请号：PCT/US2006/
关于已保藏的微生物或其它生物材料的说明
            (PCT细则13bis)
Figure S2006800462131D00671
        国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
                        国际表
根据第7.3条颁布的原始保存物的保存证明和根据第10条颁布的存活证明至：(交存人或代理人姓名和地址)
希龙公司
代理人：K V Noto
4560Horton大街
艾莫利维尔(Emeryville)，加利福尼亚州94608
代表希龙公司保存
交存人的编号：                                   专利保存号
小鼠杂交瘤131.2F8.5.9：CMCC#12047                PTA-5542
小鼠杂交瘤153.8E2.D10.D6.12.12：CMCC#12056       PTA-5543
保存物附有：科学描述；给出的以上分类表述。保存物由国际保藏单位于2003 年9月17日收到并接受。
根据你方要求：X我们通知你方要求保存菌株30年
如果签署布达佩斯条约的专利局证实某人接收的权利，或者如果引用该菌株的美国专利授权，并且ATCC收到美国专利和商标局或交存人的指令来发放所述菌株，则该菌株对公众可用。
如果在保存的有效时期内培养物死亡或破坏，你方应用相同的活培养物替换。
该菌株将自保存之日起维持至少30年，或需要最新的样品，无论哪个更长。美国和许多其它国家签署了布达佩斯条约。
上述培养物的活力于2003年9月23日测试。在该日，培养物是存活的。
国际保藏单位：美国典型培养物保藏中心，美国弗吉尼亚州马纳萨斯20110-2209。
有权代表ATCC者的签名：
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿        日期：2003年10月2日
玛利亚 哈里斯(Marie Harris)，专利专员，ATCC专利保藏处
CC：利莎 亚历山大(Lisa Alexander)
Ref：审理或案件号：P20107.001
Figure IYZ000004218136100011
Figure IYZ000004218136100021
Figure IYZ000004218136100031
Figure IYZ000004218136100041
Figure IYZ000004218136100061
Figure IYZ000004218136100071
Figure IYZ000004218136100081

Claims (29)

1.治疗有效量的人抗CD40抗体在制备治疗FcγRIIIa-158F基因型V/F或F/F的病人的细胞表达CD40的癌症或称为显著性不确定的单克隆丙种球蛋白病的癌前病症的药物中的应用，病人的FcγRIIIa-158基因型是用获自病人的生物样品测定的，所述抗体选自：
a)单克隆抗体CHIR-12.12，由保藏在ATCC藏号为PTA-5543的杂交瘤细胞系产生；
b)一种单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链具有由保藏在ATCC藏号为PTA-5543的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体CHIR-12.12的轻链各CDR，所述单克隆抗体的重链具有由保藏在ATCC藏号为PTA-5543的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体CHIR-12.12重链的各CDR；
c)单克隆抗体，含有保藏在ATCC藏号为PTA-5543的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体CHIR-12.12的轻链和重链可变区，和具有ADCC活性的抗体同种型；
d)轻链由SEQ ID NO:2中所示的可变区和恒定区构成、重链由SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5中所示的可变区和恒定区构成的单克隆抗体；和
e)轻链由SEQ ID NO:2构成、重链由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5构成的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症是B-细胞谱系的癌症。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述B-细胞谱系的癌症选自急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病(PLL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、毛细胞白血病、霍奇金病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病和淋巴瘤。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述淋巴瘤选自：弥散性小淋巴细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散性大B-细胞淋巴瘤、粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、血管内淋巴瘤病、免疫母细胞淋巴瘤或AIDS相关性淋巴瘤。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症是非B细胞血液恶性肿瘤。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非B细胞血液恶性肿瘤是急性髓细胞性白血病。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症是实体瘤。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述实体瘤选自卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、***、***癌、鼻咽癌、甲状腺癌、皮肤癌和肉瘤。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述实体瘤选自：鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌类型的非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、甲状腺***状癌、黑色素瘤、骨肉瘤和尤因肉瘤。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症或癌前病症是细胞同时表达CD40和CD20的癌症或癌前病症。
11.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，所述人抗CD40单克隆抗体包含人IgG1重链恒定区。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述人抗CD40单克隆抗体含有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
13.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，所述用于制备所述药物的人抗CD40单克隆抗体是在CHO细胞系内生产的。
14.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗CD40单克隆抗体介导病人的表达FcγRIIIa自然杀伤(NK)细胞对CD40表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
15.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验中所述抗CD40抗体比利妥昔单抗(
Figure FDA00003051471200021
)更有效，其中所述试验包括在相关抗体存在下培育分离的人自然杀伤(NK)细胞与CD40表达细胞和CD20表达细胞。
16.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，在裸小鼠异种移植瘤模型中所述抗CD40抗体比利妥昔单抗(
Figure FDA00003051471200022
)更有效。
17.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗CD40抗体与人CD40结合的亲和力(KD)为至少10-6M。
18.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗CD40抗体与人CD40结合的亲和力(KD)为至少10-12M。
19.如权利要求1至10中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗CD40抗体与人FcγRIIIa-158V结合的亲和力(KD)为至少0.5μM，并且/或者，所述抗CD40抗体与人FcγRIIIa-158F结合的亲和力(KD)为至少12μM。
20.如权利要求1-10中任一项所述的应用，其特征在于，所述病人用抗-CD20单克隆抗体难以治疗。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述抗-CD20单克隆抗体是利妥昔单抗(
Figure FDA00003051471200031
)。
22.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述用于制备所述药物的人抗CD40单克隆抗体是在CHO细胞系内生产的。
23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述病人用抗-CD20单克隆抗体难以治疗。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述抗-CD20单克隆抗体是利妥昔单抗()。
25.如权利要求11所述的应用，其特征在于，在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验中所述抗CD40抗体比利妥昔单抗(
Figure FDA00003051471200033
)更有效，其中所述试验包括在相关抗体存在下培育分离的人自然杀伤(NK)细胞与CD40表达细胞和CD20表达细胞。
26.如权利要求11所述的应用，其特征在于，在裸小鼠异种移植瘤模型中所述抗CD40抗体比利妥昔单抗(
Figure FDA00003051471200034
)更有效。
27.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗CD40抗体与人CD40结合的亲和力(KD)为至少10-6M。
28.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗CD40抗体与人CD40结合的亲和力(KD)为至少10-12M。
29.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗CD40抗体与人FcγRIIIa-158V结合的亲和力(KD)为至少0.5μM，并且/或者，所述抗CD40抗体与人FcγRIIIa-158F结合的亲和力(KD)为至少12μM。
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