CN102181509A - 鸟苷的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，尤其是一种鸟苷的生产方法。鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵后本发明的优点与积极效果通过降低发酵初始葡萄糖浓度和发酵温度，使从种子培养到发酵菌体生长环境不产生大的变化，有利于菌体生长；通过前期葡萄糖与酵母粉的连续流加，在菌体生长过程中维持底物浓度不变的情况下使菌体浓度达到最大；菌体完成之后立即开始流加次黄嘌呤，促进菌体生产鸟苷，使鸟苷产量得以提高。最终使发酵液中鸟苷浓度从30g/l提高到36g/l以上，发酵液中鸟苷浓度提高了20％。

Description

鸟苷的生产方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是一种鸟苷的生产方法。

背景技术

鸟苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，可用于合成食品增鲜剂——5’-鸟苷酸二钠 以及核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造无环鸟苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鸟苷钠(GTP)等药物的主要原料。

现在国内鸟苷生产主要采用枯草芽孢杆菌发酵法。鸟苷发酵可以采用分批发酵和补料分批发酵等形式。其中补料分批发酵由于可以降低发酵产物中底物浓度以及发酵粘度，解除底物抑制，提高营养成分利用率，从而有利于鸟苷的生成。在实际生产过程中被大多数厂家所采用。

现有菌种在补料分批发酵的情况下，产苷量为每升30克左右，产品的收率比较低。

发明内容

本发明针对上述技术中补料分批发酵产鸟苷的收率低的缺点，提出一种鸟苷的生产方法，该方法可以提高产鸟苷的收率，使得产苷量为每升30克左右提升到36克左右。

实现本发明目的的技术方案如下：

鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵，其具体步骤如下：

a、配制种子培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2-4％、味精0.3-1％、蛋白胨0.5-1.5％、酵母浸出物粉0.5-1.5％、NaCl 0.2-0.3％、尿素0.1-0.3％、玉米浆0.5-1.5％，然后用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，并110℃-120℃灭菌10-20分钟，得到种子培养基；

b、培养种子，将鸟苷生产菌接入种子培养基中，接种量为8％-15％，然后在33℃-35℃的温度下，保持pH值在6.5的条件下在5L的自动控制发酵罐中培养至对数期；

c、配制发酵培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4.5-5.5％、味精0.8-1.2％、硫酸铵0.7-0.9％、酵母粉0.8-1.2％、硫酸镁0.3-0.45％、磷酸二氢钾0.15-0.25％、氯化钙0.15-0.25％、豆饼水解液1.5-3.3％、玉米浆1.5-1.9％，消泡剂0.03-0.05％，用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，，并110℃-120℃灭菌10-20分钟，得到发酵培养基；

d、接种发酵，将步骤b中培养的种子按8％-15％的接种量接入含有发酵培养基的50L自动控制发酵罐中进行发酵，时间为8h，温度为0-4h为33.9-34.1℃，4-8h为34.9-35.1℃；

e、补料发酵，在d步骤中8h以后将温度控制在35.9-36.1℃，通过流加氨水将pH控制在6.5，溶解氧控制在40％，开始流加葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的重量分别为d步骤中接种发酵后的总发酵液重量的10％、0.6％、2％，流加时间为16h，结束后开始缓慢流加次黄嘌呤促进鸟苷生产，再过24小时结束生产。

所述的葡萄糖的水溶液的浓度为60％-70％。

本发明的优点与积极效果是1、通过降低发酵初始葡萄糖浓度和发酵温度，使从种子培养到发酵菌体生长环境不产生大的变化，有利于菌体生长；

2、通过前期葡萄糖与酵母粉的连续流加，在菌体生长过程中维持底物浓度不变的情况下使菌体浓度达到最大；

3、菌体完成之后立即开始流加次黄嘌呤，促进菌体生产鸟苷，使鸟苷产量得以提高。最终使发酵液中鸟苷浓度从30g/l提高到36g/l以上，发酵液中鸟苷浓度提高了20％。

具体实施方式

实施事例1，鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵，其具体步骤如下：

a、配制种子培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2％、味精0.3-0.6％、蛋白胨0.5％、酵母浸出物粉0.5％、NaCl 0.2％、尿素0.1％、玉米浆0.5％，然后用NaOH和盐酸调节pH7.0，并110℃灭菌10分钟，得到种子培养基；

b、培养种子，将鸟苷生产菌接入种子培养基中，接种量为8％-10％，然后在33℃的温度下，保持pH值在6.5的条件下在5L的自动控制发酵罐中培养至对数期；

c、配制发酵培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4.5％、味精0.8％、硫酸铵0.7％、酵母粉0.8％、硫酸镁0.3％、磷酸二氢钾0.15％、氯化钙0.15％、豆饼水解液1.5％、玉米浆1.5％，消泡剂0.03％，用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，，并110℃灭菌10分钟，得到发酵培养基；

d、接种发酵，将步骤b中培养的种子按8％的接种量接入含有发酵培养基的50L自动控制发酵罐中进行发酵，时间为8h，温度为0-4h为33.9℃，4-8h为34.9℃；

e、补料发酵，在d步骤中8h以后将温度控制在35.9℃，通过流加氨水将pH控制在6.5，溶解氧控制在40％，开始流加葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的重量分别为d步骤中接种发酵后的总发酵液重量的10％、0.6％、2％，流加时间为16h，结束后开始缓慢流加次黄嘌呤促进鸟苷生产，再过24小时结束生产。

实施事例2，鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵，其具体步骤如下：

a、配制种子培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4％、味精0.6％、蛋白胨1.5％、酵母浸出物粉1.5％、NaCl 0.3％、尿素0.3％、玉米浆1.5％，然后用NaOH和盐酸调节pH7.2，并120℃灭菌20分钟，得到种子培养基；

b、培养种子，将鸟苷生产菌接入种子培养基中，接种量为15％，然后在35℃的温度下，保持pH值在6.5的条件下在5L的自动控制发酵罐中培养至对数期；

c、配制发酵培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5.5％、味精1.2％、硫酸铵0.9％、酵母粉1.2％、硫酸镁0.45％、磷酸二氢钾0.25％、氯化钙0.25％、豆饼水解液3.3％、玉米浆1.9％，消泡剂0.05％，用NaOH和盐酸调节pH7.2，，并120℃灭菌20分钟，得到发酵培养基；

d、接种发酵，将步骤b中培养的种子按15％的接种量接入含有发酵培养基的50L自动控制发酵罐中进行发酵，时间为8h，温度为0-4h为34.1℃，4-8h为35.1℃；

e、补料发酵，在d步骤中8h以后将温度控制在36.1℃，通过流加氨水将pH控制在6.5，溶解氧控制在40％，开始流加葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的重量分别为d步骤中接种发酵后的总发酵液重量的10％、0.6％、2％，流加时间为16h，结束后开始缓慢流加次黄嘌呤促进鸟苷生产，再过24小时结束生产。

实施事例3，鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵，其具体步骤如下：

a、配制种子培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2％、味精0.5％、蛋白胨1％、酵母浸出物粉1％、NaCl 0.25％、尿素0.2％、玉米浆1％，然后用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2之间，并115℃灭菌15分钟，得到种子培养基；

b、培养种子，将鸟苷生产菌接入种子培养基中，接种量为8％，然后在34℃的温度下，保持pH值在6.5的条件下在5L的自动控制发酵罐中培养至对数期；

c、配制发酵培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5％、味精1％、硫酸铵0.8％、酵母粉1％、硫酸镁0.3％、磷酸二氢钾0.15％、氯化钙0.15％、豆饼水解液1.5％、玉米浆1.7％，消泡剂0.04％，用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，，并115℃灭菌15分钟，得到发酵培养基；

d、接种发酵，将步骤b中培养的种子按10％的接种量接入含有发酵培养基的50L自动控制发酵罐中进行发酵，时间为8h，温度为0-4h为34℃，4-8h为35℃；

e、补料发酵，在d步骤中8h以后将温度控制在36℃，通过流加氨水将pH控制在6.5，溶解氧控制在40％，开始流加葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的重量分别为d步骤中接种发酵后的总发酵液重量的10％、0.6％、2％，流加时间为16h，结束后开始缓慢流加次黄嘌呤促进鸟苷生产，再过24小时结束生产。

实施事例4，鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵，其具体步骤如下：

a、配制种子培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5％、味精1％、蛋白胨1％、酵母浸出物粉1％、NaCl 0.25％、尿素0.2％、玉米浆1％，然后用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2之间，并115℃灭菌15分钟，得到种子培养基；

b、培养种子，将鸟苷生产菌接入种子培养基中，接种量为10％，然后在34℃的温度下，保持pH值在6.5的条件下在5L的自动控制发酵罐中培养至对数期；

c、配制发酵培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5％、味精1％、硫酸铵0.8％、酵母粉1％、硫酸镁0.4％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钙0.2％、豆饼水解液1.5％、玉米浆1.7％，消泡剂0.04％，用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，，并115℃灭菌15分钟，得到发酵培养基；

d、接种发酵，将步骤b中培养的种子按12％的接种量接入含有发酵培养基的50L自动控制发酵罐中进行发酵，时间为8h，温度为0-4h为34℃，4-8h为35℃；

e、补料发酵，在d步骤中8h以后将温度控制在36℃，通过流加氨水将pH控制在6.5，溶解氧控制在40％，开始流加葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的重量分别为d步骤中接种发酵后的总发酵液重量的10％、0.6％、2％，流加时间为16h，结束后开始缓慢流加次黄嘌呤促进鸟苷生产，再过24小时结束生产。

实施事例5，鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵，其具体步骤如下：

a、配制种子培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5％、味精1％、蛋白胨1％、酵母浸出物粉1％、NaCl 0.25％、尿素0.2％、玉米浆1％，然后用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2之间，并115℃灭菌15分钟，得到种子培养基；

b、培养种子，将鸟苷生产菌接入种子培养基中，接种量为15％，然后在34℃的温度下，保持pH值在6.5的条件下在5L的自动控制发酵罐中培养至对数期；

c、配制发酵培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖5％、味精1％、硫酸铵0.8％、酵母粉1％、硫酸镁0.4％、磷酸二氢钾0.2％、氯化钙0.2％、豆饼水解液1.5％、玉米浆1.7％，消泡剂0.04％，用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，，并115℃灭菌15分钟，得到发酵培养基；

d、接种发酵，将步骤b中培养的种子按8％的接种量接入含有发酵培养基的50L自动控制发酵罐中进行发酵，时间为8h，温度为0-4h为34℃，4-8h为35℃；

e、补料发酵，在d步骤中8h以后将温度控制在36℃，通过流加氨水将pH控制在6.5，溶解氧控制在40％，开始流加葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的重量分别为d步骤中接种发酵后的总发酵液重量的10％、0.6％、2％，流加时间为16h，结束后开始缓慢流加次黄嘌呤促进鸟苷生产，再过24小时结束生产。

在上述各个实施事例中葡萄糖的水溶液的浓度为60％-70％，通常采用55％、60％、65％、67％、70％或75％的葡萄糖水溶，但其中葡萄糖的总重量为接种发酵后的发酵液的总重量的10％。

Claims (2)

1.鸟苷的生产方法，包括配制种子培养基、培养种子、配制发酵培养基、接种发酵以及补料发酵，其具体步骤如下：

a、配制种子培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖2-4％、味精0.3-1％、蛋白胨0.5-1.5％、酵母浸出物粉0.5-1.5％、NaCl 0.2-0.3％、尿素0.1-0.3％、玉米浆0.5-1.5％，然后用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，并110℃-120℃灭菌10-20分钟，得到种子培养基；

b、培养种子，将鸟苷生产菌接入种子培养基中，接种量为8％-15％，然后在33℃-35℃的温度下，保持pH值在6.5的条件下在5L的自动控制发酵罐中培养至对数期；

c、配制发酵培养基，在水中按重量百分比加入葡萄糖4.5-5.5％、味精0.8-1.2％、硫酸铵0.7-0.9％、酵母粉0.8-1.2％、硫酸镁0.3-0.45％、磷酸二氢钾0.15-0.25％、氯化钙0.15-0.25％、豆饼水解液1.5-3.3％、玉米浆1.5-1.9％，消泡剂0.03-0.05％，用NaOH和盐酸调节pH7.0-7.2，，并110℃-120℃灭菌10-20分钟，得到发酵培养基；

d、接种发酵，将步骤b中培养的种子按8％-15％的接种量接入含有发酵培养基的50L自动控制发酵罐中进行发酵，时间为8h，温度为0-4h为33.9-34.1℃，4-8h为34.9-35.1℃；

e、补料发酵，在d步骤中8h以后将温度控制在35.9-36.1℃，通过流加氨水将pH控制在6.5，溶解氧控制在40％，开始流加葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的水溶液，其中葡萄糖、酵母粉、豆饼水解液的重量分别为d步骤中接种发酵后的总发酵液重量的10％、0.6％、2％，流加时间为16h，结束后开始缓慢流加次黄嘌呤促进鸟苷生产，再过24小时结束生产。

2.根据权利要求1所述的鸟苷的生产方法，其特征在于：所述的葡萄糖的水溶液的浓度为60％-70％。