CN106566795A

CN106566795A - 用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒dna的培养基及培养方法

Info

Publication number: CN106566795A
Application number: CN201610877655.6A
Authority: CN
Inventors: 丘力功; 倪世明; 罗志煌; 邱壮伟; 孙希海; 何倩怡; 叶淑薇; 赵海莲; 符美娟; 李润明
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN BAIDI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-04-19

Abstract

本发明提供用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基及培养方法，培养基包括基础培养基和补料培养基。其中，基础培养基的组分为：甘油7.75 ml/L、硫酸铵3.0g/L、磷酸氢二钾6.0 g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、柠檬酸1.7 g/L、硫酸镁1.2 g/L、三氯化铁30 mg/L、酵母提取物5.00 g/L、D‑生物素1.00mg/L、微量元素溶液 9.70 ml/L。补料培养基组分为：甘油10 ml/L、硫酸铵3.0g/L、磷酸氢二钾6.0 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、柠檬酸1.7 g/L、硫酸镁1.2 g/L、三氯化铁30 mg/L、酵母提取物20.00 g/L、D‑生物素 1.00mg/L。培养方法上采用fed‑batch模式，在保持较高的单位菌体质粒含量的基础上，能显著提高发酵的质粒总含量。

Description

用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基及培养方法

技术领域

本发明属于生物领域，涉及用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基和培养方法。

背景技术

随着近年来重组DNA技术和基因组测序的发展，基因治疗和DNA疫苗研究领域取得重大进展。而携带有外源基因的质粒DNA为基因治疗和DNA疫苗研究开发中使用的主要药物载体。目前，治疗性的质粒DNA每位患者的临床用量已达到了mg级，因此大量制备的质粒DNA需要工业规模的大肠杆菌工程菌发酵技术来制备。在发酵工艺方面,早期的质粒发酵培养基配来源于重组蛋白基因工程菌培养基。但由于与表达重组蛋白为目标的工程菌不同,以表达质粒DNA为目标的大肠杆菌工程菌的发酵工艺不需要考虑其蛋白表达产物的影响因素,而仅需为细菌的大量增殖和内含质粒的高效扩增提供最适的发酵条件，因此运用于蛋白发酵的培养基不一定适用于质粒DNA的发酵工艺。此后不断有学者进行这方面的研究，如根据化学计量模式(stoichiometric model)的方法重新对培养基配方进行设计和优化。在发酵策略方面，为了提高细菌发酵密度，与重组蛋白工程菌发酵工艺相似，现有的质粒DNA发酵工艺普遍采用补料-分批发酵(fed-batch)的方法进行，即在发酵过程中基础培养基碳源、氮源等营养成分衰竭时，通过限制性流加补料的方式提高菌体生长密度和目标产物的表达总量。

到目前为止，现有文献公开的质粒DNA工程菌发酵工艺目标主要以提高质粒总产量或单位体积质粒产量为目标。而良好的质粒DNA发酵工艺除了能生产较高的质粒DNA总量外，还应能提高单位菌量的质粒DNA含量。提高单位菌量的质粒DNA含量不仅减轻下游的纯化负担，还可减少试剂的消耗，节约成本。如现有的大规模质粒纯化制备是主要以发酵获得的工程菌在碱裂解法的基础上以色谱纯化技术纯化而得。由于一定的菌量对应一定比例的碱裂解试剂，因此提高单位菌量的质粒DNA含量则意味着相同消耗量的碱裂解试剂可以得到更高含量质粒原液，而且由于相应降低了质粒提取液中的宿主DNA、RNA、蛋白以及内毒素的比例，意味减轻了下游分子筛排阻层析和离子交换色谱纯化的负担。

已知增加单位菌量质粒DNA含量的方法有“饥饿效应法”，如公开的发明专利申请申请号：2009102137258一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基，即在优化培养基的基础上和在非细菌菌体增殖的最适条件下，通过减少RNA和蛋白质的合成，从而将营养底物趋向于转化成质粒，最终提高单位菌体质粒拷贝数。

发明专利申请2009102137258一种提高质粒DNA在大肠杆菌工程菌中比含量的培养基能够显著提高单位体积质粒总含量和单位菌体质粒含量，但也存在补料阶段操作步骤复杂和收获的单位体积的质粒含量依然有待提高的问题。

发明内容

为此，本发明提供一种可以进行高密度培养质粒DNA大肠杆菌工程菌(OD600nm大于90)的培养基及方法。本发明的培养基及其方法在保持较高的单位菌体质粒含量的基础上，能显著提高发酵的质粒总含量。

用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基，由基础培养基和补料培养基组成：所述基础培养基包括：甘油7.75ml/L、硫酸铵3.0g/L、磷酸氢二钾6.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、柠檬酸1.7g/L、硫酸镁1.2g/L、三氯化铁30mg/L、酵母提取物5.00g/L、D-生物素1.00mg/L、微量元素溶液9.70ml/L；所述补料培养基包括：甘油10ml/L、硫酸铵3.0g/L、磷酸氢二钾6.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、柠檬酸1.7g/L、硫酸镁1.2g/L、三氯化铁30mg/L、酵母提取物20.00g/L、D-生物素1.00mg/L；基础培养基用1Mol/L NaOH等碱性溶液调pH值至6.8。

优选的，微量元素溶液由以下组分组成：硫酸锌6.0g/L、硫酸锰5.0g/L、硫酸铜0.8g/L、氯化钴0.9g/L、硼酸0.3g/L、钼酸钠2.3g/L。

本发明一种如权利要求1所述的用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的培养方法，包括以下几个步骤：

步骤A:预培养取工程菌种子液于基础培养基中,于30℃±2.5℃、200rpm的参数下培养，至OD600nm＝3.0±0.5时预培养结束；

步骤B:批式发酵培养:取预培养后的菌液至发酵罐中的基础培养基中进行高密度培养；

步骤C:补料阶段当OD600＝30±5时启动补料，在OD600nm大于90时结束发酵，离心收获菌体。

优选的，所述步骤A中，工程菌种子液与基础培养基的质量比为1：100。

优选的，所述步骤A中，培养条件：温度为30℃±2.5℃、培养速率为200rpm。

优选的，所述步骤B中，培养后的菌液与基础培养基的质量比为1：200。

优选的，所述步骤B中，培养条件：温度为36℃±0.5℃，pH值为：6.80±0.20，每分种通空气量不少于基础培养基重量的1.5倍，罐压为0.09-0.1MPa，溶氧值通过搅拌耦联控制在20％以上。

优选的，所述步骤B中，pH值通过添加质量浓度25％氨水或25％磷酸保持。

本发明的培养基能显著提高质粒DNA比含量水平，从而有利于下游质粒DNA纯化，提高大肠杆菌工程菌在增殖生长过程中质粒DNA的合成效率，可减少试剂的消耗，节约成本。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1

(1)实验材料：

真核表达质粒pcDNAS₂S由解放军458医院肝病研究所构建；宿主菌DH5α由广州白云山拜迪生物医药有限公司(以下简称拜迪)保存；质粒pcDNAS₂S转化DH5α,获得工程菌DH5α/pS₂S，拜迪公司保存；质粒小量抽提试剂盒，购自QIAGEN公司；紫外可见分光光度计，日本日立公司UV-300型。

酵母提取物(Yeast Extract)、购自OXOID公司；D-生物素购自AMERSCO公司；甘油(glycerol)、氯化钠(NaCl)、葡萄糖(glucose)、柠檬酸(citric acid)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、硫酸镁(MgSO₄)、磷酸盐(Na₂HPO₄、KH₂PO₄)、三氯化铁(FeCl₃)、硫酸锌(ZnSO₄)、硫酸锰(MnSO₄)、硫酸铜(CuSO₄)、氯化钴(CoCl₂)、硼酸(H₃BO₃)和钼酸钠(Na₂MoO₄)等，均为国产分析纯。

(2)基础培养基配制

50L基础培养基配制如下：

搅拌溶解并加纯化水至49.5L，采用1Mol/L NaOH调pH值至6.80，再加纯化水至50L，搅拌均匀后无菌过滤分装至已灭菌处理的三角摇瓶(400ml/瓶)和发酵罐中(45L)备用。

(3)补料培养基配制：

5L补料培养基配制如下：

搅拌溶解并加纯化水至4.5L，1Mol/L NaOH调pH值至6.80，加纯化水至5L，搅拌均匀后无菌过滤分装至已灭菌处理的补料瓶中(含量大于4.5L)备用。

(4)培养

采用fed-batch模式，发酵罐的工作体积为50L(德国B.Braun公司产品)

①摇瓶培养：取400μl工程菌DH5α/pS₂S种子液于400mL基础培养基中,在30℃、200rpm的参数下培养，至OD600nm＝3.0时预培养结束。

②batch阶段：在局部A级层流保护下，取预培养菌液225mL至发酵罐45L基础培养基中进行高密度培养。

培养条件：温度保持在36℃±0.5℃，pH通过添加质量浓度25％氨水或质量浓度25％磷酸保持在6.80±0.20的范围内，通空气量为75L/min，通过调节尾气阀将罐压控制在0.09-0.1MPa范围之间，溶氧值通过搅拌耦联控制在20％以上。根据情况添加消泡剂。

③fed阶段

当OD600＝30±5时启动补料，通气量、罐压、pH值、溶氧值等参数保持不变。加入的补料培养基控制参数如下：

在OD600nm大于90时结束发酵，取菌液以10000g离心速度、4℃、20min离心条件收获菌体，进行相关检测。

④在发酵过程中，每隔1h取样,检测菌密度、湿菌量和质粒含量,并计算质粒含量对菌量的比值。其中，质粒抽提采用QIAGEN质粒小量抽提试剂盒按操作说明进行。菌密度的测定采用紫外分光光度计测定600nm波长的A值。质粒含量采用紫外分光光度计测定260nm波长的A值确定。质粒纯度的测定采用紫外分光光度计测定260nm、280nm波长的吸收比值确定(符合质量标准的比值应在1.75-1.85之间),并进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像***扫描,并分析超螺旋质粒的比例(符合质量标准的超螺旋比值应>90％)。

实验结果见表1。由结果可知，利用本发明培养基的发酵工艺可制得大量的合符质量标准的质粒DNA：单位菌体质粒DNA含量可达到2.4mg/g湿菌，单位发酵体积质粒含量达458mg/L，已超过现有文献报道的检测结果。

表1利用本发明的培养基进行DH5α/pS₂S工程菌进行补料—分批(fed-batch)发酵的结果

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基，其特征在于，由基础培养基和补料培养基组成：所述基础培养基包括：甘油7.75 ml/L、硫酸铵3.0g/L、磷酸氢二钾6.0 g/L、磷酸二氢钾 3.0 g/L、柠檬酸 1.7 g/L、硫酸镁 1.2 g/L、三氯化铁 30 mg/L、酵母提取物 5.00 g/L、D-生物素 1.00mg/L、微量元素溶液 9.70 ml/L；所述补料培养基包括：甘油10 ml/L、硫酸铵 3.0g/L、磷酸氢二钾 6.0 g/L、磷酸二氢钾 3.0 g/L、柠檬酸 1.7 g/L、硫酸镁 1.2 g/L、三氯化铁 30 mg/L、酵母提取物 20.00 g/L、D-生物素 1.00mg/L；基础培养基用1 Mol/L NaOH碱性溶液调pH值至6.8。

2.如权利要求1所述的用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基，其特征在于，微量元素溶液由以下组分组成：硫酸锌6.0 g/L、硫酸锰 5.0 g/L、硫酸铜 0.8 g/L、氯化钴0.9 g/L、硼酸 0.3 g/L、钼酸钠 2.3 g/L。

3.一种如权利要求1所述的用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒DNA的培养基的培养方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

步骤A:预培养取工程菌种子液于基础培养基中,于30℃± 2.5℃、 200 rpm的参数下培养，至OD600nm=3.0±0.5时预培养结束;

步骤B:批式发酵培养:取预培养后的菌液至发酵罐中的基础培养基中进行高密度培养;

步骤C: 补料阶段当OD600=30±5时启动补料，在OD600nm大于90时结束发酵，离心收获菌体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，工程菌种子液与基础培养基的质量比为1：100。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，培养条件为30℃± 2.5° C 、200 rpm。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，培养后的菌液与基础培养基的质量比为1：200。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，培养条件：温度为36°C ±0.5°C，pH值为：6.80±0.20，每分种通空气量不少于基础培养基重量的1.5倍，罐压为0.09-0.1MPa，溶氧值通过搅拌耦联控制在20%以上。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，pH值通过添加质量浓度25%氨水或25 %磷酸保持。