CN101379192B

CN101379192B - ***的抗Met单克隆抗体及其片段和载体及相应产品

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Publication number: CN101379192B
Application number: CN2007800047097A
Authority: CN
Inventors: 保罗·玛丽亚·科莫格里奥; 伊利萨·维格拉; 西尔维亚·乔达诺
Original assignee: METHERESIS TRANSLATIONAL RES S
Current assignee: Medex Precision Pharmaceutical Co ltd; Vertical Biology Co ltd
Priority date: 2006-02-06
Filing date: 2007-02-05
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2027-02-05
Also published as: DK1981981T3; WO2007090807A1; PL1981981T3; EA200870234A1; SG169383A1; BRPI0707480A8; US8388958B2; ES2368864T3; AU2007213804B2; EA015580B1; BRPI0707480A2; MX2008009833A; JP5306828B2; SI1981981T1; CN101379192A; PT1981981E; AU2007213804A8; KR20090013745A; EP1981981B1; EP1981981A1

Abstract

本发明公开了靶向于肝细胞生长因子胞外域的单克隆抗体用于制备***和/或转移的药物和检测赘生细胞的诊断工具的用途，以及包含至少一部分编码抗Met单克隆抗体的核苷酸序列的载体，含有抗Met单克隆抗体和/或其至少一个片段和至少一个激酶抑制剂的产品。

Description

***的抗Met单克隆抗体及其片段和载体及相应产品

发明领域

本发明涉及单克隆抗体、其片段和/或部分的用途，及编码单克隆抗体、其片段和/或部分的核苷酸序列用于制备***和转移的药物和体内或体外检测赘生细胞的诊断装置的用途。本发明特别涉及靶向于肝细胞生长因子受体的胞外域的抗Met单克隆抗体的用途。

发明背景

癌免疫疗法的科学探索始于20世纪50年代并且首先应用多克隆抗体。在经过了50多年的今天，使用单克隆抗体的免疫疗法继续给癌症治疗提供了有希望的选择(1、2)。数个以癌症中的酪氨酸激酶受体(RTKs)为靶的抗体现在用于临床实践(3)。在不同情况下这些抗体的作用机制不同并且尽管有成功使用的实例，通常并不能充分了解其机制(4)。贝伐单抗和西妥昔单抗分别靶向于血管内皮生长因子-血管内皮生长因子受体(VEGF-VEGFR)和表皮生长因子-表皮生长因子受体(EGF-EGFR)，通过阻止配体-受体的相互作用来起作用(5，6)。赫赛汀(Herceptin)是对人表皮生长因子受体2(HER2)特异的单克隆抗体，HER2是EGFR家族中的一员。赫赛汀起效的作用机制还不明确，但是已显示它促进HER2降解从而降低癌细胞表面的受体水平(7)。

编码肝细胞生长因子(HGF)的酪氨酸激酶受体的MET致癌基因控制导致细胞生长、侵入和免于细胞凋亡的遗传程序。不受调控的肝细胞生长因子受体(HGFR)的活化状态对获得致瘤性质和侵入表型均十分重要(8)。人肿瘤中的MET的作用从多种实验中揭示出来并通过发现癌遗传形式中的MET激活突变(9，10)被毫无疑义的证实。此外，HGFR组成型激活还常常存在于散发性癌中，并且从本实验室和其他实验室的研究已证明MET致癌基因在特殊组织分型的肿瘤中过表达或由自身内分泌机制被激活。此外，MET基因在结肠直肠癌的血原性转移中被扩增(11)。因此干扰Met激活成为阻止肿瘤发生和转移过程的有挑战性的方法。过去数年中已提出许多策略来阻断变异HGFR信号***、靶向HGFR自身或其配体。这些方法包括使用HGF拮抗剂、HGF中和抗体、HGFR诱饵、HGFR或小分子如格尔德霉素的小分子ATP结合位点抑制剂、SH2域多肽和核酶(12中综述)。

发明概述

本发明涉及靶向于肝细胞生长因子(HGFR)的胞外域的单克隆抗体用于***病人肿瘤和/或转移以及在体内或体外检测赘生细胞的诊断装置中的用途。

因此，本发明的目的是i)抗-Met单克隆抗体、ii)含有抗-Met单克隆抗体的表位结合区的片段和/或iii)含有抗-Met单克隆抗体的表位结合区或互补决定区(CDRs)的基因工程抗体用于制备***病人肿瘤和转移的药物和体内或体外检测赘生细胞的诊断装置的用途，其中命名为抗MET-R的抗-Met单克隆抗体由保存于Adanced BiotechnologyCenter(ABC)，Interlab Cell Line Collection(ICLC)，S.S.Banca Cellule e Colture in GMP、Largo Rosanna Benzi 10，Genva，Italy、登记号为ICLC PD 05006的杂交瘤细胞系制备。

本发明的另一目的是包含至少编码抗Met单克隆抗体的表位结合区或CDRs的核苷酸序列的部分的载体的用途，其中由ICLC PD 05006杂交瘤细胞系制备的抗Met单克隆抗体用于制备***病人肿瘤和转移的药物。

本发明的另一目的是i)抗-Met单克隆抗体、ii)含有抗-Met单克隆抗体的表位结合区的片段和/或iii)含有抗-Met单克隆抗体的表位结合区或CDRs的基因工程抗体和至少一种激酶抑制剂作为组合制剂在肿瘤和/或转移治疗中同时、分别或连续使用的用途。

本发明的另一目的是筛选能够与至少一部分肝细胞生长因子受体(HGFR)胞外域结合的化合物以鉴别在预防和/或***和/或转移中具有药理学活性的化合物的方法。

本发明的另一目的是抗MET-R抗体、其片段和/或含有抗MET-R抗体的表位结合区或CRDs的遗传工程抗体作为体内或体外检测赘生细胞的诊断工具的用途。

根据本发明，这些目的通过以下所附的权利要求来完成，这些权利要求是在此公开的本发明的技术教导不可缺少的部分。

附图简述

图1.抗MET-R阻碍HGFR的激活和信号转导：(A)HGFR激活的评价。在所指示的时间使GTL16细胞接触抗MET-R。HGFR从细胞裂解产物中免疫沉淀，用指示的抗体(Abs)进行蛋白质印迹检测。抗MET-R处理得到比受体衰减调节更明显的受体激活的降低，如条带密度定量所显示的。(B)HGFR信号***分析。细胞用疹型口炎病毒壳G糖蛋白(VSV-G)或抗MET-R预处理然后在指示的时间用HGF刺激。评价细胞总裂解产物中的Akt磷酸化。如上图所显示的，抗MET-R减少了基本的和HFG诱导的AKt激活。

图2.抗MET-R在体外抑制癌细胞的转化表型。(A)GRL16细胞的非停泊性生长。预处理细胞接种于0.5％琼脂中。然后细胞在指示量的抗MET-R或VSV-G抗体的存在下生长，10天后生长的菌落染色。即使在低剂量抗MET-R下非停泊性生长被彻底抑制。(B)侵入检测。在接种到基质胶涂层的Transwell小室前，用指示抗体预处理MDA-MB-435β424小时。下层小室中充满DMEM 2％FBS和100ng/ml HGF。24小时后，移行细胞染色计数。响应HGF的侵入能力表达与未刺激细胞相比成倍增加。如图所示，抗MET-R处理显著降低细胞侵入。

图3.抗MET-R在体内抑制癌细胞的转化表型。(A、B)肿瘤发生检测。裸小鼠皮下注射1.5×10⁶GTL16细胞。肿瘤出现后，选择显示同样大小肿瘤的小鼠每周两次在相同位置注射2μg/gr VSV-G或抗MET-R。在不同时间点测量肿瘤体积(A)。如图所示，抗MET-R减少移入人肿瘤细胞的裸小鼠的肿瘤生长。处理8周后处死小鼠并且测量肿瘤重量(B)。在抗MET-R处理的小鼠中，肿瘤显著小于对照小鼠(p＜0.05)。(C)HGFR激活评价。来自VSV-G(A图)、或抗MET-R(B图)处理的小鼠的肿瘤切片用抗人磷酸HGFR染色。

肿瘤的免疫组化分析显示活化的HGFR水平在抗MET-R处理的小鼠中大大降低。

图4.抗MET-R的处理在体内阻碍肿瘤的进程。裸小鼠皮下接种2.5×10⁶MDA-MB-435β4细胞。评价未处理小鼠(A)和用10微克/喱(gr)VSV-G腹腔注射(IP)给药(B)、1微克/喱抗MET-R腹腔注射(C)、10微克/喱腹腔注射(D)和2微克/喱抗MET-R动脉注射(IS)(E)的小鼠的肿瘤生长。如图(K)所示，抗MET-R在移入人肿瘤细胞的裸小鼠中抑制肿瘤生长。在左图显示的肿瘤切片进行抗人磷酸HGFR免疫组化染色。在未处理小鼠(F)和对照抗体处理小鼠(G)中均出现强HGFR激活。施用抗MET-R导致损伤肿瘤生长相关的HGFR抑制。(L)肺转移分析。苏木素/伊红染色后显微镜观察肺切片计数转移。在抗MET-R处理的小鼠中明显见到转移数目剂量依赖的减少。(M-N)肿瘤血管化作用评价。使用抗小鼠CD31抗体进行肿瘤组织化切片的免疫荧光染色。荧光显微镜检查评价血管数量和区域。如图所示，血管的数量和大小响应抗MET-R处理而减少。

图5.抗MET-R诱导HGFR衰减调节。GTL16细胞(A)和MDA-MB-435β4细胞(B)用抗MET-R在指示时间处理。相同量的总细胞裂解产物用于蛋白质印迹检测和抗HGFR作为探针(上图)或，用抗Hsp70(下图)抗体作为对照。如图所示，抗MET-R能够在过表达细胞(GTL16)和表达正常水平HGFR的细胞(MDA-MB-435β4)中均诱导HGFR衰减调节。(C)细胞荧光测量术定量细胞表面的HGFR。在单独培养基(黑条)或HGF(绿条)或抗MET-R(白条)中培养MDA-MB-435β4细胞。在指示时间点细胞用抗外HGFR抗体(Ab)(DO24)染色。如图所示，30小时处理后AntiMET-R能够有效降低表面HGFR的量达到最大降低。

图6.不同途径下的抗体诱导的和配体依赖的衰减调节。在用HGF或抗MET-R处理前，(A)HeLa(上图)和GTL16(下图)细胞用乳胞素(lactacystine)(lact)或刀豆素(conc)任一或两者处理2小时。在总细胞裂解产物中评价HGFR衰减调节。在蛋白酶体抑制剂存在下，配体诱导的HGFR衰减调节受损，而抗体诱导的不受损。在此条件下，仅被靶向于胞内部分的抗体检测(抗内Met)的60Kd片段(箭头)在细胞内累积。此外，抗泛素抗体(B，上图)探测显示此片段标记泛素部分，说明为导致蛋白酶体降解的分子。

图7.抗MET-R诱导HGFR的蛋白水解断裂和细胞外区域(外功能区)的脱落。(A)GTL16细胞用³⁵S甲硫氨酸和³⁵S半胱氨酸代谢标记然后用HGF或抗MET-R处理4小时。收集上清液，用靶向于胞外域的抗HGFR抗体免疫沉淀。在非还原(上图)或还原(下图)条件下跑胶。没有还原剂时，HGFR α和β链以复合物迁移，而在β-巯基乙醇存在时，则分别跑出两条带。如图所示，抗MET-R而不是HGF可诱导HGFR外功能区的脱落。(B)抗MET-R还在上皮细胞中诱导外功能区脱落。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞在指示时间接触抗体。收集培养基，用识别HGFRβ链的细胞外部分的抗体免疫沉淀。用相同的抗外HGFR进行蛋白质印迹实验。(C、D)HGFR脱落是剂量和时间依赖的。用渐增量(C)的抗MET-R或在不同时间(D)刺激细胞。培养基如(B)中处理。

图8.信号转导的激活不需要HGFR脱落。Cos-7细胞用不同HGFR突变体转染，48小时后用抗MET-R处理4小时。相同量的总细胞裂解产物和条件培养基进行蛋白质印迹实验。如图所示，抗MET-R能够诱导所有HGFR突变体的衰减调节和外功能区脱落。HGFR KD＝HGFR激酶死亡，没有激酶活性；HGFR双体(Double)＝没有1349、1356这2个结合酪氨酸从而不能形成信号转导蛋白的HGFR突变体；HGFR-GFP＝整个细胞内部分被GFP序列置换的HGFR突变体。

图9.HGFR脱落外功能区作为“诱饵”。用抗MET-R预处理的细胞在培养基中用有或没有HGFR外功能区(Met外功能区)存在的HGF刺激。如图所示，脱落的HGFR外功能区损伤Akt激活作用和作为“诱饵”。

图10.细胞通过慢病毒载体介导的基因转移表达抗MET-R进行基因修饰。(A)双向慢病毒载体(整合形式)的概略图用于表达抗MET-R；LTR：HIV-1长末端重复序列；R区中从-18位删除U3区。SD：拼接供体。SA：拼接受体。多聚腺苷酸(polyA)SV40：猿猴病毒40的多腺苷酸化位点。Cte：从Mason-Pfizer猴病毒获得的组成型转运元件。P_分钟CMV：从细胞巨化病毒获得最小启动子。hPGK：人磷酸甘油酸激酶(Phophoglycerato)基因的启动子。PRE：土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件。FLAG标签：编码3次重复DYKDDDK表位的序列。His标签：编码7个组氨酸残基的序列。(B)从两个用携带抗MET-R cDNAs的慢病毒载体转导的典型细胞系收集的无血清培养基上清液(每个样品75μl)的蛋白印迹分析。样品在还原性条件下进行SDS-PAGE，相应滤器用抗鼠Ig探测。(C)报告培养基上清液中抗MET-R量的表格，培养基上清液是从用携带抗MET-R cDNAs的慢病毒载体转导的一组细胞系中获得的。

图11：重组抗MET-R与Met胞外域以高亲合力结合。(A)含有用获得自不同来源(杂交瘤或基因修饰的癌细胞系)的抗MET-R免疫沉淀的Met受体的细胞裂解产物的蛋白印迹分析。用来自1：产生无关MAb的杂交瘤；2：产生抗MET-R MAb的杂交瘤；3：感染携带抗MET-R MAb的cDNAs的慢病毒载体的MDA-MB 435细胞；4：未感染MDA-MB 435细胞的细胞培养基上清液培养Seph.Prot.G进行免疫沉淀。样品在还原性条件下进行SDS-PAGE，相应滤器用靶向于受体C末端的抗Met抗体探测。(B)抗MET-R和重组抗MET-R与Met受体胞外域的结合检测。渐增浓度的纯化抗MET-R或重组抗MET-R(0-5.5nm)在与人Ig来源的Fc域融合的纯化MET胞外域包被(100ng/孔)的96孔板中孵育。用抗鼠Ig-HRP连接抗体描绘结合曲线。为了控制结合的特异性，我们用Fc-Ron(它是将人Ig Fc域融合至Ron受体的胞外域产生的嵌合体蛋白质，属于Met受体家族的蛋白质)包被的孔进行同样检测。

图12：重组抗MET-R诱导HGFR的溶蛋白性裂解和胞外域(外功能区)脱落。HCT-116细胞，一种结肠直肠癌源的细胞系，在无血清条件下用指示量的纯化抗MET-R(A)或重组抗MET-R(B)培养24小时。总细胞裂解产物(上图)和细胞培养基上清液(下图)进行SDS-PAGE和蛋白质印迹实验。细胞中形成的成熟Met(p145)的减少和培养基上清液中Met外功能区(p80)的相应增加用识别位于Metβ链细胞外部分的区域的DL-21抗MetmAb探测滤器来监测。

图13：用编码抗MET-R的慢病毒载体转导在体外或体内抑制癌细胞的转化表型。(A)非停泊性生长检测。用编码抗MET-R的慢病毒载体转导(抗MET-R)或未转导(WT)的HCT-116细胞接种于0.5％琼脂上。然后细胞在补充了2％FCS+80ng/ml HGF的培养基中培养。14天后计数菌落；上部显示了典型孔；底部图表示菌落的数量(三次计算)。(B)侵入检测。用编码抗MET-R的慢病毒载体转导(抗MET-R)或未转导(WT)的HCT-116细胞平铺在包被基质胶的Transwell小室上。下层小室充满2％FBS+80ng/ml HGF的培养基。24小时后，计数接触到滤器下部的细胞。图为滤器的典型区域。(C)体内肿瘤潜伏期。用编码抗MET-R的慢病毒载体转导(抗MET-R)或未转导(WT)的HCT-116细胞皮下(sub-cute)注射至无胸腺裸小鼠的侧腹(3×106个细胞/鼠，每组中n＝6)。每两天用测径器测量肿瘤块。当肿瘤块超过15mm3时认为小鼠肿瘤存在阳性。(D)体内肿瘤生长。用编码抗MET-R的慢病毒载体转导(抗MET-R)或未转导(WT)的HCT-116细胞皮下注射至无胸腺裸小鼠的侧腹(3×106个细胞/鼠，每组中n＝6)。每三天用测径器测量肿瘤块来评价肿瘤生长动力学。在第65天处死所有小鼠。

图14：编码抗MET-R的慢病毒载体的肿瘤内直接运输抑制肿瘤生长。HCT-116细胞(4×106个细胞/鼠)皮下注射至无胸腺裸小鼠的侧腹。当肿瘤块大约10mm3时在第0天和第3天瘤内注射肿瘤慢病毒载体颗粒(1μg p24/鼠)。一组(对照组CTRL)是编码GFP的载体颗粒，而另一组是编码抗MET-R(抗MET-R)的载体颗粒。每三天用测径器测量肿瘤块来评价肿瘤生长动力学。

图15：编码抗-MET-R的质粒图谱

图16：编码抗-MET-R FLAG-His的质粒图谱

图17：来源于HGFR的细胞外部分(Met外功能区)的域的概略图。

图18：抗MET-R特异性识别位于IPTs区的表位。用编码myc标记的诱饵Met、myc标记的SEMA PSI和myc标记PSI IPT1-4的慢病毒载体颗粒转导的MDA-MB-435细胞条件培养基用抗MET-R抗体免疫沉淀，用生物素化的抗myc抗体(右图)进行蛋白质印迹实验来检测。上样相同量的条件培养基作为蛋白质表达的对照(左图)。对照：用空慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞条件培养基。诱饵Met：用表达全部HGFR胞外域的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞条件培养基。PSI-IPT：用表达HGFR的PSI、IPT-1、IPT-2、IPT-3、IPT-4域的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞条件培养基。SEMA-PSI：用表达HGFR的Sema和PSI域的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞条件培养基。右侧以KD显示分子量。

图19：抗MET-R识别位于IPT-4区的表位。用表达单独IPT-1、IPT-2、IPT-3、IPT-4区的慢病毒载体，它们全部由flag标记，转导的MDA-MB-435细胞的细胞裂解产物用抗MET-R抗体免疫沉淀，用抗flag抗体进行蛋白质印迹实验来检测(左图)；作为蛋白质表达的对照，相似量的细胞裂解产物用抗flag抗体免疫沉淀，并用相同抗flag抗体进行蛋白质印迹实验来检测(右图)。对照：来源于用空慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的细胞裂解产物。IPT1：来源于用表达HGFR的IPT-1区的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的细胞裂解产物。IPT2：来源于用表达HGFR的IPT-2区的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的细胞裂解产物。IPT3：来源于用表达HGFR的IPT-3区的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的细胞裂解产物。IPT4：来源于用表达HGFR的IPT-4区的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的细胞裂解产物。右侧以KD显示分子量。

图20：在完整细胞中抗MET-R特异性染色HGF受体。图A：用抗MET-R抗体进行流式细胞术分析GTL-16的图谱。细线：用同型对照抗体培养的GTL-16。粗线：用抗MET-R培养的GTL-16。MFI：平均荧光强度。图C：抗MET-R抗体标记的GTL-16细胞用三氟甲(fluorocrome)Alexa Fluor 488缀合的羊抗鼠Ig进行的免疫荧光分析。图B：仅用抗鼠Ig/Alexa Fluor 488标记的GTL-16细胞。(原始放大率，x63)

图21：抗MET-R重链的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。核苷酸和氨基酸序列的CDR区下均有下划线。

图22：抗MET-R轻链的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。核苷酸和氨基酸序列的CDR区下均有下划线。

发明详述

由MET原癌基因编码的肝细胞生长因子受体是一种酪氨酸激酶受体，一旦被激活，它就会发出已知为“侵袭性生长”的生物反应的复合光谱(8)。这暗示了细胞增殖、迁移、分化和生存的诱导和协调。在生理条件下，这种侵袭性生长过程在胚胎发育期间的器官生长中起中枢性作用，但是当在癌症中不受控制时，它促进肿瘤的进程和转移(13)。

人肿瘤中HGFR的涉及现在已明确确定，因为MET基因的种系错义突变会导致一些遗传类型的癌症(9、10)并且已在多数类型的实体瘤中出现不适当的HGFR激活，通常与预后不良相关(14)。人癌症中最常见的改变是受体过表达(15)，其导致组成型二聚作用和即使没有配体下的受体激活(16)。增加的HGFR表达可归结于(i)基因扩增，如在结肠直肠肿瘤中，MET使赘生细胞对肝转移有选择优势(11)、(ii)被其它致癌基因例如Ras、Ret和Ets诱导的增强的转录(17、18)、(iii)缺氧激活的转录，在此种情况下，较高量的受体使细胞对HGF过度致敏和促进肿瘤侵入(19)。

当前临床实践中使用两种策略来干扰酪氨酸激酶受体(RTKs)：(i)用抑制酪氨酸激酶活性的小分子处理；(ii)用干扰受体激活的抗体处理。

本发明涉及抗HGFR抗体特别是称为抗MET-R的抗Met单克隆抗体在肿瘤治疗中的用途，此抗体由存放于ICLC登记号为PD 05006的杂交瘤细胞系制备，令人惊讶地发现它能够诱导受体衰减调节。

在一个实施方案中，本发明涉及单克隆抗体抗MET-R用于制备治疗患有肿瘤的病人的肿瘤和转移的药物的用途。

在另一个实施方案中，本发明涉及抗MET-R抗体用于制造体内或体外检测赘生细胞的诊断装置的用途。

抗MET-R是特异于HGFR的胞外域的单克隆抗体(mAb)(20)。这个单克隆抗体不触发所有肝细胞生长因子引起的生物学效应(运动性、增殖、细胞存活、侵入、小管发生和血管发生)，但是仅诱导运动性。此外，它正调节尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂的组成型表达但是不能长期诱导和维持尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂的表达。这种单克隆抗体激活受体磷酸化，此磷酸化严格依赖二价单克隆抗体，需要受体形成二聚体。

此抗体的激动剂能力本身不足以证明其治疗活性。事实上，本发明者检测的一种不同抗MET-R单克隆抗体(DO-24)不能诱导有效的受体衰减性调节且不能促进受体细胞外部分的脱落。

抗MET-R不能阻止HGFR和HGF的相互作用，但是有效地促进HGFR衰减调节如以下实施例4所示和参考图5所讨论。这种相互作用导致HGFR介导的信号转导和特别是已知涉及抗细胞凋亡应答的AKt通路的抑制。

由于在以下描述的结果中十分明显，本发明者证明了体外用抗MET-R处理导致细胞以不依赖于贴壁的方法生长的能力的损伤(参见实施例2和图2)、这是由于缺乏支撑而需要逃离凋亡的一种性质。此外，如实施例3中详述的在动物体内用抗MET-R处理，本发明者已观察到肿瘤以增加的速率凋亡而增殖速率没有重大变化。另一方面，本发明者在体外或体内均没有观察到响应抗体的细胞生长性质的改变，这与缺乏抗MET-R激活MAPK通路的抑制作用一致。这种HGFR激活不同通路的能力的分离并不异常，其已在多种HGFR突变体(21)和应答HGFR部分激动剂(22)中显示。

抗体诱导的HGFR衰减调节涉及受体的细胞外部分的脱落。外功能区脱落是膜蛋白质的胞外域从细胞表面蛋白水解释放从而允许细胞快速改变其表面以应答环境刺激和获得可溶性调节物的过程。本发明者在实施例6和7中展示了抗MET-R这一活性的证据。

在本发明特别是实施例3中，发明者提出了抗MET-R抗体在体内有活性即损伤肿瘤生长和从移入裸小鼠的癌细胞中形成自发转移的证据。此实验说明这些效果在癌细胞和微环境中均由抗体的作用介导。事实上，上皮细胞表达HGFR(24)，我们已证实抗MET-R还在此类细胞中诱导HGFR脱落(数据未列出)。原发性肿瘤的新生血管形成对于肿瘤生长和转移都是绝对必需的(23)并且已确证HGF是有效的血管形成因子(24)。此外一旦HGFR激活，VEGF和其它血管形成因子释放增加(48，49，40)。因此，肿瘤血管化作用还可是间接的例如抑制肿瘤细胞中的Met功能可取消肿瘤中释放这些因子。本发明的发明者观察到瘤内新生血管形成的显著减少，这是由于用抗MET-R处理后微环境中的萌芽血管数量的减少。

不用说宿主细胞的抗MET-R活性不影响不同器官例如脾脏、骨髓、肝脏、心脏、骨和肾脏的功能，它们在长期接触抗体后没有显示明显的病理学改变(数据未列出)。因此，尽管在正常和赘生细胞中均识别HGF-R，抗MET-R显示了检测HGF-R过表达和诱导细胞生存力改变的能力。

总之，如本文显示的结果说明抗MET-R诱导的HGFR的衰减调节是免疫疗法的候选机理并且药学组合物中的抗MET-R或其片段的使用提供了另一种对患有肿瘤的病人***和防止转移的方法。

另外，抗MET-R可用作在体内或体外检测赘生细胞的诊断工具，例如通过用适合的标记物来标记抗MET-R。

根据本发明的抗MET-R可通过使用动物的常规方法优选通过基因工程技术来制备。

根据本发明的单克隆抗体抗MET-R的使用还包括基因工程和人化抗体以及用适合的诊断标记物标记的抗体的使用。基因工程和人化抗体以及制造它们的方法本领域公知。参见综述(25)。

抗MET-R的使用还包括包含其表位结合区的片段，例如包含表位结合区或互补决定区(CDRs)、Fv、ScFv、Fab、Fab’、F(ab’)₂片段的肽的使用。常规片段一般通过蛋白水解断裂制备，还可通过化学合成例如液相或固相合成以及重组DNA技术来制备。

抗MET-R及其片段优选以可溶性蛋白质的形式用于药学组合物，可用药物释出的常规方法来完成给药。包含抗体抗体MET-R和/或其片段的药学组合物的给药可使用任何本领域技术人员已知的方法来完成。例如，组合物可作为对患者注射或输液的水溶液来给药。适当剂量的确定取决于大量病例特殊变量，包括患者的年龄和体重以及本领域技术人员的专业意见内的例行实验。

本发明的另一个实施方案涉及含有单克隆抗体抗MET-R的药物组合物的制备，其中所述的单克隆抗体抗MET-R被适合的诊断标记物标记用于体内或体外检测肿瘤病人的赘生细胞。

本发明涉及包含合成的启动子的DNA载体的制备，其中所述的启动子通过将最小核心启动子(minCMV启动子)上游反方向连接至少编码单克隆抗体抗MET-R部分的人磷酸甘油激酶基因和DNA的有效启动子来获得。载体中包含的DNA序列编码抗MET-R的轻和/或重链；本发明还包括DNA序列中的保守置换以及在5’或3’末端添加标签序列的序列修饰。编码抗MET-R的重和轻链的核苷酸序列分别用SEQ ID No.：1和SEQ IDNo.：2表示。

此外本发明者在抗MET-R重链的3’末端添加标签序列来修饰重链(SEQ ID No.：3)。这一序列允许使用镍柱来纯化单克隆抗体且被抗FLAG抗体(SIGMA)特异性识别。

虽然本发明的DNA载体的制备可通过多种本领域公知的方法来完成，实施例10中举例说明了制备方法。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码单克隆抗体抗MET-R的表位结合区的DNA的DNA载体用于制备治疗患者肿瘤和转移的药物的用途。本发明的DNA载体的给药可通过基因治疗的已知方法来完成例如参考(10)。

本发明的另一个实施方案涉及包含抗体抗MET-R和/或其片段和激酶抑制剂作为肿瘤治疗中同时、分别或连续使用的组合制剂的产品。本发明中可方便地使用的激酶抑制剂的实例是K252A星形孢菌素类似物(Calbiochem-Novabiochem Intl.；36)；PHA-665752(3z)-5-[(2，6-二氯苄基)磺酰基]-3-[(3，5-二甲基-4-{[(2R)-2-(吡咯烷-1-基甲基)吡咯烷-1-基]羰基}-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(34)；SU11274[(3Z)N-(3-氯苯基)-3-({3，5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺胺](37，38，35)；SU11271[(3Z)-5-(2，3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰基)-3-({3，5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮](38)；SU11606[(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3，5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺胺](38)。

事实上本发明者观察到抗MET-R激活的抑制机制不需要HGFR酪氨酸激酶活性。这一特点代表了治疗方法中的相关优点。在临床实践中，事实上组合不同药物以提高对靶分子的作用是十分常见的。因此对于HGFR，组合激酶抑制剂和抗体是可能的，可以对HGFR激活和浓度同时作用。这样可能会通过干扰肿瘤生长和侵入转移表型的获得来增强对Met过表达肿瘤的靶向治疗的治疗效果。

根据本发明的产品中的抗体抗MET-R及其片段如上详述制备。用于根据本发明的组合制剂的激酶抑制剂可通过常规化学合成或基因工程技术制备。

在另一个实施方案中，本发明包括筛选能够与肝细胞生长因子受体胞外域的至少一部分结合的化合物，其中这些化合物具有对肝细胞生长因子受体的拮抗剂活性且对预防和/或***和/或转移药理学上有效。特别是这些化合物能够诱导肝细胞生长因子受体的衰减调节或至少部分肝细胞生长因子受体胞外域的脱落。

本发明将通过非限制性实施例在一些相关优选实施方案中进行描述。

抗体、抑制剂和其它试剂

单克隆抗HGFR抗MET-R最初由Prat描述(20)。其它用于免疫沉淀和蛋白质印迹分析的抗体是：抗HGFR抗体DO24和DL21(20中描述识别HGFR胞外域)；抗磷酸酪氨酸PY20(Transduction Laboratories)、抗泛素(Babco)、抗Hsp70(Stressgen)、抗磷酸Akt(Ser473，Cell Signaling Techology)、抗Akt(Santa Cruz Biotechnologies)、抗HGFR胞内域(C12，Santa Cruz Biotechnologies)。免疫组化染色用：抗人磷酸HGFR(Cell Signaling)和抗鼠CD31抗体(Pharmingen)进行。体外和体内实验中抗水泡性口膜炎病毒抗体(VSV-G，Sigma)用作对照。乳胞素和刀豆素购自Calbiochem。

抗MET-R核苷酸和氨基酸序列

对应SEQ ID No.：1和图21a的抗MET-R重链核苷酸序列的翻译在图21b和SEQ IDNo.：6中报道。

在图21a和21b中对应CDR区域的核苷酸和氨基酸序列有下划线；它们的氨基酸序列是：CDR-H1：GYTFTSYW(SEQ ID No.：8)；CDR-H2：INPSSGRT(SEQ ID No.：9)；CDR-H3：ASRGY(SEQ ID No.：10)。

对应SEQ ID No.：2和图22a的抗MET-R轻链核苷酸序列的翻译在图22b和SEQ IDNo.：7中报道。

在图22a和22b中对应CDR区域的核苷酸和氨基酸序列有下划线；它们的氨基酸序列是：CDR-L1：QSVDYDGGSY(SEQ ID No.：11)；CDR-L2：AAS(SEQ ID No.：12)；CDR-L3：QQSYEDPLT(SEQ ID No.：13)。

慢病毒载体产品的293T细胞瞬时转染

转染前大约24小时接种6.0×10⁶个293T细胞于15cm盘上。转染前2小时加入22ml含有热灭活FBS(10％)、青霉素(25U/ml)、链霉素(25U/ml)和谷氨酰胺(1％)的IMDM至培养基中。加入：ENV质粒(VSV-G)，9μg；包装质粒pMDLg/pRRE，16.2μg；REV质粒，6.25μg；转移载体质粒#330或#331，37.5μg混合制备用于转染的质粒DNA。质粒溶液用0.1×TE/d水(2∶1)制为终体积1125μl。加入125μl 2.5M CaCl₂且室温保存5分钟。然后在全速涡旋下加入1250μl 2×HBS溶液，立刻滴加至细胞培养液中。磷酸钙沉淀的质粒DNA培育14-16小时，用加入了1mM丁酸钠的新鲜培养液换液(每盘18ml)。换液30-36小时后收集含有载体颗粒的细胞培养基上清液。收集后，上清液以2500RPM旋转10分钟，0.2μm滤膜过滤后保存于-80℃。

通过含有慢病毒载体的细胞上清液感染靶细胞

10⁵个细胞接种于含有10％FBS、谷氨酰胺的新鲜培养基中。为了感染，在8μg/ml聚凝胺的存在下，用如上述制备含有慢病毒载体颗粒的上清液，其中载体颗粒的终浓度在10-150ng/ml HIV-1Gag p24等量之间(ELISA测定法测量)培养细胞系。18小时后换液，使细胞生长。当培养基80％汇合时，用无血清培养基培养细胞，72小时后收集含有抗MET-R的上清液。

HGFR衰减调节测定

细胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。在无血清培养基中分别用80μg/ml和80ng/ml的抗体和HGF处理。需要指出的是，刺激前用10μM乳胞素或100nM刀豆素预处理2小时。为了分析HGFR降解，细胞用LB缓冲液(2％SDS、0.5M Tris-HCl pH＝6.8)裂解，细胞裂解产物中的蛋白质浓度用BCA蛋白质检测试剂盒(Pierce)测定。然后相同量的总蛋白质用SDS-PAGE和蛋白质印迹实验分析。对于免疫沉淀实验，细胞用EB缓冲液(20mM Tris-HCl，pH＝7.4、5mM EDTA、150mM NaCl、10％甘油、1％Triton X-100)在蛋白酶抑制剂和1mM Na-orthovaandate存在下裂解。用适当的抗体免疫沉淀后，严格清洗。然后免疫沉淀的蛋白质根据标准方法进行蛋白质印迹实验。最终检测用ECL检测***(Amersham)来进行。

HGFR脱落的代谢标记和分析

细胞无血清培养16小时，用[³⁵S]甲硫氨酸和[³⁵S]半胱氨酸(100μCi/ml，AmershamCorp.)在无甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM培养基中脉冲标记30分钟，然后用抗MET-R或VSV-G或HGF处理4小时。收集条件培养基用于用抗HGFR胞外抗体的免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白质用SDS-PAGE分离和放射自显影如(26)中前述进行。

体外生物学检测

为了评价非停泊性生长，GTL16用抗MET-R或VSV-G在培养基残渣(spent medium)中预处理48小时。然后每孔中将1500个细胞接种在含有2％FBS和0.5％软琼脂(SeaPlague琼脂糖，BMA)的DMEM且在指示量抗体和HGF的存在下培养10天。生长的菌落最终通过四唑盐染色可见(47)。侵入测定用Transwell小室(Corning)来进行。聚碳酸酯滤器(8μm孔径)用15μg/cm²基质胶基底膜(Collaborative Research)包被。在接种前用20nM抗MET-R或VSV-G抗体处理预培养细胞24小时。然后在滤器上层接种5×10⁴个细胞且在含有2％FBS的DMEM和在小室底部孔中加入100ng/ml HGF中培养。48小时后，滤器上层的细胞机械移除。移至下层的细胞固定、染色和计数。HGF刺激的移行细胞数目除以未刺激移行细胞数目获得移行指数。

用抗MET-R的HGFR体外标记

为了流式细胞计量分析，10⁵个GTL16细胞用PBS-EDTA0.025％分离，PBS冲洗，50μg/ml抗Met-R抗体或同样量的同型对照鼠Ig室温培养15分钟。PBS冲洗两遍后，细胞用15μg/ml FITC缀合的羊抗鼠Ig(Jackson Immunoresearch laboratories)室温培养15分钟。然后冲洗细胞，重悬于PBS-5％BSA中，用流式细胞计量术(Becton Dicknson，Mountain View，CA)分析。

GTL-16细胞在冰上在甲醇∶丙酮(3∶1)中固定5分钟，然后用2％羊血清的PBS室温封闭30分钟。加入浓度为2.5μg/ml在PBS 2％羊血清中的纯化抗Met-R且室温培养1小时，然后PBS冲洗3遍，用4μg/ml缀合Alexa Fluor 488(Molecular Probes)的抗鼠Ig显示结合的抗HGFR抗体。样品分析用荧光显微镜(DM-IRB，Leica Microsystems)进行。

体内实验

体内实验用在Swiss CD1背景(Charles River Laboratories)上皮下接种1×10⁶个GTL16或2.5×10⁶个MDA-MB-435β4细胞至六周大的免疫不足的雌性裸小鼠的后侧腹来进行。肿瘤出现后，选择具有可比较大小肿块的小鼠每周两次腹腔或肋间隙(GTL16注射的小鼠仅用肋间隙)注射指示量的抗MET-R和抗-VSV-G。处理8周后，处死小鼠计算肿瘤重量。在注射MDA-MB-435β4的小鼠中分析肺部自发转移的存在。评价磷酸化HGFR的免疫组化染色原发性肿瘤在5μm石蜡肿瘤切片上用抗磷酸HGFR抗体(CellSignaling，1∶100)进行。转移数量由用于常规病理学研究的根据马森三色方法(Sigma)进行的苏木紫/伊红染色后在显微镜下观察肺来确定。肿瘤血管化作用的评价根据植入Tissue-Tek OCT化合物(Sakuraa Finetek)的样品的免疫组化实验和立即于-80℃冷冻来进行。免疫组化染色中使用大鼠单克隆抗小鼠CD31抗体(Pharmingen)。

细胞凋亡评价

细胞凋亡的形态学鉴定通过克尔标准来评价。由于大量坏死病灶附近的单独坏死细胞和局部缺血诱导的凋亡，只有离坏死区域至少1HPF(高倍视野＝0.63mm)远的组织认为可用于凋亡计数。大块肿瘤坏死的情况不评价。所有情况可归为两类之一：多于或少于10凋亡数字/10HPF。

蛋白酶抑制

抗体刺激前用以下抑制剂：4m抑制尿激酶的阿米洛利(Sigma)；5mM抑制ADAM和锌依赖的蛋白酶1，10-邻二氮菲(Sigma)；抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的20μg/ml抑肽酶和100μg/ml亮抑酶肽；抑制酸性蛋白酶(Calbiochem)的10μg/ml胃酶抑素A处理细胞2小时。用1μM TPA处理细胞24小时来抑制PKC。

筛选方法

本发明提供了一种筛选调整HGFR的表达/功能/生物活性或在HGF或其它受体激动剂存在或不存在下诱导HGFR胞外域脱落的受试化合物的方法。

受试化合物与HGFR结合优选与受体胞外部分相互作用。更优选的是，受试化合物降低HGFR介导的生物活性至少大约10，优选大约50，更优选大约75、90或100％，相对没有受试化合物下的生物活性。

另一个受试化合物优选调整HGFR的表达。更优选的是，受试化合物衰减调节HGFR转录物或蛋白质至少大约10，优选大约50，更优选大约75、90或100％，相对没有受试化合物下的生物活性。

受试化合物

受试化合物可以是本领域内已知的药理学试剂、肽或蛋白质或者可以是先前不知道具有任何药理学活性的化合物。受试化合物可以是自然存在的或在实验室中设计得到的。它们可以分离自微生物、动物或植物，可以通过本领域公知的重组技术或化学方法合成制备。如果希望的话，受试化合物可以通过使用本领域公知的大量组合库法中任何一个来获得，包括但是不限于生物库、空间寻址并行固相或液相库、需要重叠合法的合成库法、“一珠一化合物”库法和使用亲合色谱选择的合成库法。生物库方法限于多肽库，而其它四个方法可应用多肽、非肽寡聚物或小分子库化合物。

结合测定

对于结合测定，受试化合物优选结合于HGFR胞外部分的分子，其中所述分子模拟抗MET-R活性所以避免了HGFR的正常生物活性。这些分子的实例包括但是不限于小分子、肽或类肽分子。

在结合测定中，受试化合物或HGFR胞外部分均可包含检测标签，例如放射性同位素、荧光、化学发光或酶标签(例如放射标记的碘、放射标记的磷、荧光基团或荧光蛋白质、荧光素酶辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶)。然后可完成检测结合于HGFR胞外域的受试化合物，例如，通过直接放射计数、闪烁计数或通过决定可检测产物的适当底物的转变，其中HGFR或其部分胞外域结合于支持物或细胞表达或根据本领域技术人员众所周知的方法得到。

功能测定

受试化合物可检测其降低HGFR生物效应的能力。这些生物效应可使用本发明描述的功能测定法来确定。它们是非停泊性生长检测和侵入测定(均在实施例2和11中详述)和体内转化表型的评价(实施例3、11、12中详述)。因此，功能测定可在体外使用任何表达HGFR的细胞系进行或使用任何可研究实验产生或自然产生的表达HGFR的肿瘤发育的动物模型在体内进行。降低HGFR生物活性至少大约10，优选大约50，更优选大约75、90或100％的受试化合物鉴定为现在的降低HGFR生物活性的药理学药物。

实施例

实施例1.抗Met抗体抗MET-R损伤HGFR信号转导

抗MET-R是靶向于HGF受体胞外域的单克隆抗体，在HGF受体胞外域它识别不同于配体结合的表位。此单克隆抗体表现为部分激动剂，因为它不触发所有肝细胞生长因子引起的生物效应(运动性、增殖、细胞存活、侵入、小管发生和血管发生)但是仅诱导运动性。此外，它正调节尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂组成型表达但是不能诱导和维持尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂受体的长期表达。此单克隆抗体激活受体磷酸化，这种磷酸化严格依赖于二价单克隆抗体，需要受体形成二聚体。

为了回答抗MET-R抗体是否可代表在过表达肿瘤中干扰组成型HGF受体激活的工具这个问题，本发明者首先分析了其在长期接触抗体的肿瘤细胞中的生物化学和生物活性。作为模型，本发明者使用来源于人胃癌的GTL16细胞，其中HGFR过表达并因此寡聚体化和组成性激活(27)。图1A显示了HGFR表达和酪氨酸磷酸化的显著降低。

然后评价抗体在HGFR信号转导中的作用。由于HGFR已知通过刺激Akt激活来促进强抗凋亡程序，本发明者评价抗MET-R处理的Akt磷酸化的水平。如图1B所示，在基本条件下和HGF刺激的细胞中Akt磷酸化均被抑制。

另一个HGFR激活的重要通路是MAPK通路，已知与刺激细胞生长有关。本发明者检查用抗体处理的细胞中MAPKs激活水平，但是没有观察到这条通路的显著抑制(数据未列出)。

实施例2.抗MET-R体外抑制癌细胞的转化表型

抗体对细胞生长和转化表型的作用通过测量细胞非停泊性和停泊性生长以及侵入细胞外基质的能力来评价。如图2A所示，抗体处理中没有观察到停泊相关条件下细胞生长能力的区别。

非停泊性生长严格依赖于细胞克服缺乏停泊物导致的凋亡的能力，所以称为“失巢凋亡”；此性质通常通过评价细胞在软琼脂上的生长能力来分析(28)。由于许多报道已显示HGFR激活能够给予细胞这种性质，本发明者在0.5％琼脂上接种GTL16细胞且在不同量抗MET-R存在或不存在下或无关同型配对抗体(VSV-G)作为对照下的培养基中培养。如图2B所示，VSV-G处理或未处理的细胞能够形成大量菌落。相反，抗MET-R以剂量依赖方式彻底抑制癌细胞的非停泊性生长。有趣的是由于组成型HGFR激活，GTL16细胞在软琼脂测定中即使在基本条件下也能够形成菌落，并且此抗体在HGF存在或不存在下均减少这些细胞的转化表型。

为了评价抗体干扰细胞侵入力的能力，本发明者研究乳腺癌细胞系MDA-MB-435β4，它应答HGF，能够侵入再生基底膜(29)。如图2C所示，体外用抗MET-R处理这些细胞导致剂量依赖的降低应答HGF的侵入性。

实施例3.抗MET-R体内抑制转化表型

为了评价抗MET-R的体内肿瘤生长活性，本发明者皮下接种GTL16细胞至免疫不足的雌性裸小鼠的后侧腹。动物用抗MET-R或VSV-G每周两次原位给药处理(2μg/gr)。治疗在移植1周后注射部位出现肿瘤开始：仅具有可比较大小肿瘤的动物处理4周。在所有处理中监测肿瘤体积，在抗MET-R处理的小鼠中观察到生长减慢(图3A)。处理后解剖小鼠尸体，切出肿瘤并称重。如图3B所示，在用抗MET-R处理的小鼠中，肿瘤显著小于对照组(p＜0.05)。在这些肿瘤中，用针对磷酸化形式受体的特异性抗体染色显示的HGFR激活水平降低(图3C)，而凋亡细胞的百分比显著增加(图3D)。此外，本发明者用苏木紫/伊红染色肿瘤切片后评价凋亡和有丝***图。当获得自抗MET-R处理的小鼠的肿瘤组织中凋亡显著增加时，有丝***数量几乎没有改变(数据未列出)。

本发明者还在MDA-MB-435β4细胞中进行同类实验，该细胞是体内自发转移的模型***(29)。动物每周两次用不同剂量的抗MET-R或对照抗体处理，全身(腹膜内1μg/gr或10μg/gr)或肿瘤内(原位2μg/gr)给药。治疗在移植当天开始进行八周(显示转移可能的时间)。处理后，解剖小鼠尸体和分析原发性肿瘤和肺(这些细胞转移的特殊部位)。还检查不同器官(脾脏、骨髓、肝脏、心脏、骨和肾脏)以排除可能的毒性作用。目视分析显示抗MET-R处理导致原发性肿瘤肿块的生长抑制(图4A-E和K)。用识别酪氨酸磷酸化形式HGFR的抗体免疫组化染色还显示此例中受体激活的显著减少(图4F-J)。此外，肺切片的显微镜分析显示抗MET-R的肿瘤内注射给药和全身给药均阻止了肺和已检查器官中远距离转移的出现(图4L)。

由于许多工作已显示HGF是有效的血管生成因子并且HGFR信号通路有助于肿瘤血管发生，本发明者分析了抗MET-R处理的肿瘤血管化作用。本发明者发现这些肿瘤中血管(较少的和较大的)和其分支的数量显著减少(图4M、N)。因此本发明者推断这样处理的观察到的抗肿瘤和抗转移作用是由于抗体对肿瘤和微环境的萌芽血管的复合作用。

实施例4.抗MET-R诱导HGFR衰减调节

为了研究抗MET-R能够干扰HGFR激活的机制，本发明者用抗MET-R或VSV-G处理HGFR过表达细胞；这类似于在许多自然产生的肿瘤中常常观察到的情况。如图5A所示，本发明者观察到用抗MET-R而不是VSV-G处理的以时间依赖方式减少HGFR的总量。这说明抗-Met抗体特异性诱导受体衰减调节。有趣的是在这些细胞中，过表达HGFR、HGF、配体不能诱导受体衰减调节(图6，下图)。

然后本发明者验证抗MET-R抗体是否还可以在表达正常水平HGFR的细胞中触发受体衰减调节。如图5B左图所示，也是在这些细胞中，抗MET-R有效衰减调节HGFR。

细胞膜接触的抗体诱导的HGFR减少还通过FACS分析评价。细胞荧光分析显示抗体处理比HGF本身更有效减少细胞表面表达HGFR的量(图5B，右图)。在相同检测方法下，还在GTL16细胞中观察到类似减少(未列出)。

实施例5.抗MET-R诱导的HGFR衰减调节的分子机制

配体依赖的和抗体诱导的衰减调节可通过不同通路。配体依赖的RTKs衰减调节是包括内在化、泛素化、胞内分选和最后溶酶体或蛋白酶体降解的多级过程(30)。

为了评价与抗体诱导的HGFR衰减调节有关的是哪条降解通路，本发明者在抗体刺激前用特异性抑制剂刀豆素和乳胞素分别阻断溶酶体或蛋白酶体的活性。令人惊讶的是，当蛋白酶体通路的抑制严重损伤配体诱导的HGFR降解时，由于抗MET-R处理它并不影响受体衰减调节(图6A，上图)，因此说明抗体和受体通过不同分子机制促进HGFR衰减调节。此外，当蛋白酶体活性损伤时，一个几乎不能在基本条件下检测到的60Kd片段通过抗体处理在细胞中大量蓄积(图6A，下图)。这个片段仅在用抗胞内HGFR抗体进行的蛋白质印迹实验中检测到且存在于受体的胞浆区。此外，作为导致蛋白酶体降解的分子，60Kd片段用泛素部分标记(图6B)。

由于受体的胞外域(外功能区)不能在抗MET-R处理的细胞裂解产物中检测到，本发明者验证了它是否在细胞外断裂释放，即一种称为“脱落”的现象(31)。为了检测这种假设，本发明者在细胞培养基中寻找HGFR外功能区的存在。用放射性³⁵S半胱氨酸和³⁵S甲硫氨酸代谢标记细胞然后用HGF或抗MET-R处理4小时。收集培养液用于使用识别胞外域的抗HGFR抗体的免疫沉淀。如图7A所示，从代谢标记的细胞的培养液中，本发明者免疫沉淀一条非还原条件下跑的分子量近似130Kd(符合细胞外αβ链复合物)的条带；当还原性条件下跑胶时，复合物分解为两条80Kd(β链)和45Kd(α链)的条带。而HGF刺激不增强此过程，抗体结合显著增强受体脱落。根据先前数据(15)，少量HGFR胞外域已知在细胞外环境中组成性释放。有趣的是还在表达正常水平HGFR的细胞例如上皮细胞中观察到抗体诱导的胞外域脱落(图7B)。

通过用渐增量的抗体处理细胞4小时，本发明者观察到抗体介导的HGFR脱落是剂量依赖的(图7C)。为了分析抗体诱导的HGFR脱落的动力学，本发明者用相同量的抗MET-R或VSV-G在不同时间刺激细胞。在抗MET-R而不是VSV-G处理的细胞的培养液中检测到渐增浓度的外功能区，说明观察到的抗体诱导的脱落是特异性和时间依赖的(图7D)。

实施例6.抗体诱导的HGFR脱落发生在细胞表面

为了检测HGFR脱落是否需要内吞作用，本发明者使用稳定转染发动蛋白突变体形式(Dyn K44A)的细胞系，此蛋白已知损伤内涵蛋白依赖的内吞作用且其表达由四环素调控***控制。细胞在四环素存在(对照)或不存在(K44A Dyn)下培养48小时以损伤内吞作用作为突变发动蛋白表达的后果。如图7D所示，在发动蛋白依赖的内吞作用被抑制的细胞中抗体诱导的脱落没被损伤。

更常涉及膜蛋白质脱落的蛋白酶属于ADAM家族的α-分泌酶。为了鉴别导致HGFR脱落的酶，锌螯合试剂1，10-邻二氮菲(phenantroline)是一种ADAMs和锌依赖的蛋白酶的抑制剂，在抗体处理前将其加入至细胞中。在此条件下，受体脱落未受影响(数据未列出)，说明HGFR胞外域的溶蛋白性裂解不是由α-分泌酶而是锌依赖的蛋白酶介导的。

由于已知HGFR转录调控涉及抗凝血(blot clotting)的基因，本发明者还检测凝血***的蛋白酶是否会导致外功能区脱落。但是由于抑肽酶对它的抑制不改变抗体诱导的HGFR外功能区脱落，所以排除了此过程中促凝血因子的作用(数据未列出)。使用一组其它抑制剂(阿米洛利、胃酶抑素A、亮肽酶素)，本发明者还排除了其它已知水解酶例如尿激酶、酸性蛋白酶、丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的的涉及(数据未列出)。此外，本发明者还证明了外功能区的脱落独立于PKCa激活，因为佛波酯TPA高剂量(1μm)和长期处理(24小时)抑制此酶不降低外功能区的脱落(数据未列出)。

所有实验均有适当的阳性对照，此类实验表明导致HGFR外功能区脱落的酶不在明显涉及受体脱落的蛋白酶列表中。

实施例7.HGFR激活不需要抗体诱导的脱落

如本发明者先前所报道，含有吞蛋白(Endophilin)、CIN85和Cbl的三聚复合物介导配体依赖的HGFR衰减调节(32)。这个复合物通过HGFR激活募集至受体且促进内吞作用、泛素化和受体降解。为了证实受体激活和信号转导是否是抗体诱导的衰减调节和脱落所需要的，本发明者引发抗MET-R衰减调节多种HGFR突变体的能力。本发明者在COS-7细胞中表达野生型HGFR和下列突变体：i)MET KD，编码由于ATP结合口袋中Lys-Ala置换而没有酪氨酸激酶活性的“死”受体，ii)MET“双”，编码缺乏对接信号转导蛋白的酪氨酸Y1349、Y1356的HGFR，iii)MET-GFP，显性负性突变体，其编码整个受体的胞内域的序列被GTP序列置换。转染48小时后，细胞用抗MET-R处理3小时。细胞提取物和细胞外培养基用蛋白质印迹实验分析。意外的，抗MET-R能够以所有突变体触发衰减调节和诱导HGFR脱落(图8)。此实验说明抗体诱导的HGF受体衰减调节不需要受体激酶活性和细胞质转导蛋白的募集，并且整个胞内域对此过程不是必要的。这进一步证明了抗体和配体激活不同衰减调节机制。

实施例8.HGFR的脱落外功能区作为“诱饵”

由于已显示基因工程的HGFR胞外域可有效作为显性负相“诱饵”分子(33)，本发明者检测了脱落的外功能区抑制HGFR信号通路的能力。抗MET-R或VSV-G预处理72小时的细胞用HGF在HGFR胞外域存在(图9，4-6道)或不存在(7-9道)的培养基中不同时间刺激。如图所示，在HGFR胞外域存在下，HGF触发的Akt磷酸化严重受损，从而支持了脱落片段像诱饵一样(33)既作为HGF结合的竞争者也作为干扰HGFR激活的显性负相分子的想法。

实施例9.激动剂抗MFT-R抗体DO-24不诱导胞外域脱落

此抗体的激动剂能力本身不足以证明其治疗活性。事实上，我们检测的一个不同的抗MET-R单克隆抗体(DO-24)不能促进受体胞外部分的脱落但是能够完全激活受体。

实施例10.由慢病毒载体的基因转移制备的抗MET-R

本发明者将抗MET-R重和轻链序列***至双向慢病毒载体(51)(图10A、15和16)。由于将最小核心启动子(minCMV启动子)的上游以反向连接至hPGK启动子而获得的合成启动子(ACCTGGGTT，SEQ ID No.：4)的存在使慢病毒载体允许两个单独cDNAs的协同表达(51)。此合成启动子能够在两个方向加强转录活性。因此，使两个编码抗MET-R的cDNAs中的一个的反义方向位于上游区(轻链)而另一个正义方向位于下游区(重链)，这样可以同等产生两个独立的mRNAs。本发明者用描述的293T细胞瞬时转染制备载体颗粒。然后，为了永久改变靶细胞的基因组，本发明者用含有载体颗粒的上清液感染了一组癌来源的细胞系。感染后，细胞在无血清培养基中培养72小时，收集细胞培养基上清液。抗MET-R抗体的存在通过蛋白质印迹分析来评价(图10B)，ELISA定量抗MET-R(图10C)。所有转导的细胞系制备正确分泌于培养基上清液中的抗MET-R抗体。抗体的产量是变量，范围是0.2-6μg/ml，取决于分析的细胞系。重组抗MET-R的特异性由免疫沉淀检测控制(图11A)，而结合亲合力用ELISA检测评价(图11B)。重组抗MET-R能够以与杂交瘤常规制备的抗MET-R所获得的亲合力同样范围的亲合力特异性识别Met受体。此外重组抗MET-R和杂交瘤制备的抗MET-R一样，能够诱导Met溶蛋白性裂解和胞外域脱落(图12)。

实施例11.编码抗MET-R的慢病毒载体的转导在体外和体内抑制癌细胞的转化表型

本发明者用编码抗MET-R的慢病毒载体(25ng p24/ml)转导HCT-116细胞。检测转导细胞的转化表型与野生型细胞比较，分析体外和体内肿瘤发生的非停泊性生长和侵入性。对于非停泊性生长，本发明者在0.5％琼脂上接种产生抗MET-R的细胞和野生型细胞作为对照，15天后计数培养基中获得的菌落。转导细胞的非停泊性生长能力被抑制因为与野生型细胞生成的菌落相比它们得到的菌落数目减少，大小也更小(图13A)。为了检测细胞侵入力，本发明者分析了细胞侵入再生基底膜的能力。如图13B所示，转导细胞显示了其侵入性的降低。本发明者还检测了编码抗MET-R的慢病毒载体转导的细胞皮下注射入无胸腺裸小鼠侧腹导致的体内肿瘤发生。图13C和D中显示的数据表明转导细胞体内肿瘤发生性质损伤由于与野生型细胞相比肿瘤潜伏期和肿瘤生长均被抑制。

实施例12：编码抗MET-R的慢病毒载体定向肿瘤内给药抑制肿瘤生长

为了获得抗MET-R的基因转移效力的正式证据，本发明者直接将携带编码抗体的cDNAs的慢病毒载体颗粒施用于形成的肿瘤中，此肿瘤通过皮下注射HCT-116细胞至裸小鼠侧腹获得。用编码抗MET-R的载体处理的肿瘤与对照载体处理的肿瘤相比显示了较慢的生长速度(图14)。

实施例13.Met外功能区的抗MET-R的结合位点

为了定位抗-MET-R的识别的表位，使用不同肝细胞生长因子受体胞外域(还已知为Met外功能区)进行免疫沉淀实验(图17)：

-诱饵Met(氨基酸1-932)：它是对应人Met跨膜区前截短的整个胞外区的可溶性重组蛋白质(Michieli等人，2004)；

-SEMA PSI(氨基酸1-562)：它是含有SEMA域的(氨基酸1-515)(Stamos，2004；Gherardi等人，2004)和PSI区(氨基酸516-562)(Kozlov等人，2004)的诱饵Met的截短形式。

-PSI IPT(氨基酸1-24；516-932)：它是含有融合于PSI区(氨基酸516-562)的内源前导序列(氨基酸1-24)和四个IPT域(氨基酸563-932)(Bork等人，1999；Gherardi等人，2004)的诱饵Met的截短形式。

在每个分子的C末端加上多聚组氨酸(polihistidine)标签和Myc-表位标签。

诱饵Met序列来源于基因库登记号X54559(Giordano等人，1991)编码的序列；此序列对应编码正确进行和位于膜上的酪氨酸激酶蛋白质的人Met基因的主要转录物。

其它文献涉及基因库登记号J02958(Park等人，1987)编码的序列；此编号对应可选的在核苷酸2264-2318间位置含有54bp***物的剪接的小转录物。此转录物编码不正确进行和不位于膜上的酪氨酸激酶蛋白质(Rodriguez等人，1991)。根据此序列，Met胞外区对应氨基酸1-950且第三IPT域(IPT3)含有18个氨基酸的***物。

表1总结了根据序列X54559和J02958的Met的不同域的位置

表1.

MET外功能区	基因库X54559(aa-aa)	基因库J02958(aa-aa)
			诱饵Met	1-932	1-950
SEMA PSI	1-562	1-562
			PSI	1-24；516-932	1-24；516-950
IPT 1	563-656	563-656

MET外功能区	基因库X54559(aa-aa)	基因库J02958(aa-aa)
			IPT 2	657-741	657-741
IPT 3	742-838	742-856
			IPT 4	839-932	857-950

工程分子的cDNAs亚克隆至pRRL.sin.PPT.CMV.Wpre慢病毒载体(Follenzi等人，2000)；重组慢病毒颗粒大量制备且用于转导人肿瘤细胞系(Michieli等人，2004)。

Myc标记的诱饵Met、SEMA PSI和PSI IPT转导的MDA-MB-435细胞的条件培养基用抗MET-R抗体免疫沉淀且用生物素化的抗myc抗体蛋白质印迹法检测(图18，右图)。上样相同量的条件培养基作为蛋白质表达的对照(图18，左图)，其中对照是空慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的条件培养基。如图18右图所示，抗MET-R能够免疫沉淀诱饵Met和PSI IPT和而不能免疫沉淀SEMAPSI。因此，它识别IPT区的表位。

为了详细定位抗体抗MET-R识别的表位，使用单独IPT域进行免疫沉淀实验(Bork等人，1999)。每个IPT都是含有融合于IPT1(氨基酸563-656)或IPT2(氨基酸657-741)或IPT3(氨基酸742-838)或IPT4(氨基酸839-932)的内源引导序列(氨基酸1-24)的PSI-IPT的截短形式。

将多聚组氨酸标签和Flag-表位标签加至每个分子的C末端。工程分子的cDNAs亚克隆至如前报道的相同慢病毒载体，重组慢病毒颗粒用于转导人肿瘤细胞系。

所有这些重组蛋白质是可溶性因子，但是IPT2不分泌至转导细胞的条件培养基中。为此用细胞裂解产物进行免疫沉淀实验。

用flag标记的单独IPTs转导的MDA-MB-435细胞的细胞裂解产物用抗MET-R抗体免疫沉淀且用抗flag抗体蛋白质印迹实验检测(图19，左图)；相似量的细胞裂解产物用抗flag抗体免疫沉淀且用相同抗flag抗体作为蛋白质表达的对照蛋白质印迹实验检测(图19，右图)。

如左图所示，抗MET-R能够免疫沉淀IPT4，但是不能沉淀其它三种IPT域。抗MET-R识别MET胞外区的IPT4域中包含的表位。

实施例14：抗MET-R通过FACS分析或免疫荧光分析两者在完整细胞中识别HGFR

GTL-16细胞是一种人胃癌细胞系，在抗MET-R抗体下将其进行培养。流式细胞计量术分析GTL-16的图谱显示抗MET-R能够特异性染色表达HGFR的细胞。事实上，抗MET-R抗体标记的细胞的荧光强度平均值比对照细胞有所增加(图20，A图)。GTL-16细胞还在固定后在抗MET-R抗体下培养以进行免疫荧光分析。染色显示了细胞表面上对应Met受体的特异标记(图20，B、C图)。

自然，当本发明的原理保持不变时，构建和实施方案的细节可以与仅由实施例描述和说明的广泛不同，而不脱离本发明如附加权利要求定义的范围。

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序列表

<110>意大利都灵大学

<120>***的抗Met单克隆抗体及其片段和载体及相应产品

<130>BWO8034-CF

<150>EP06101345.5

<151>2006-02-06

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1386

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R重链

<400>1

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240

gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300

caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360

tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacagcccc atcggtctat 420

ccactggccc ctgtgtgtgg aaatacaact ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc 480

aagggttatt tccctgagcc agtgaccttg acctggaact ctggatccct gtccagtggt 540

gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ccctcagcag ctcagtgact 600

gtaacctcga gcacctggcc cagccagtcc atcacctgca atgtggccca cccggcaagc 660

agcaccaagg tggacaagaa aattgagccc agagggccca caatcaagcc ctgtcctcca 720

tgcaaatgcc cagcacctaa cctcttgggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 780

atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg 840

agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 900

gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 960

cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggagttca aatgcaaggt caacaacaaa 1020

gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca 1080

caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa gagatgacta agaaacaggt cactctgacc 1140

tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa 1200

acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 1260

tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca 1320

gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt 1380

aaatga 1386

<210>2

<211>717

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R轻链

<400>2

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180

caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa tctagaatct 240

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300

cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga ggatccgctc 360

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catctacttc accc attgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

<210>3

<211>1473

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>在3′末端具有标签序列的抗MET-R重链

<400>3

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240

gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300

caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360

tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacagcccc atcggtctat 420

ccactggccc ctgtgtgtgg aaatacaact ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc 480

aagggttatt tccctgagcc agtgaccttg acctggaact ctggatccct gtccagtggt 540

gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ccctcagcag ctcagtgact 600

gtaacctcga gcacctggcc cagccagtcc atcacctgca atgtggccca cccggcaagc 660

agcaccaagg tggacaagaa aattgagccc agagggccca caatcaagcc ctgtcctcca 720

tgcaaatgcc cagcacctaa cctcttgggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 780

atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg 840

agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 900

gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 960

cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggagttca aatgcaaggt caacaacaaa 1020

gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca 1080

caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa gagatgacta agaaacaggt cactctgacc 1140

tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa 1200

acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 1260

tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca 1320

gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt 1380

aaagctagct ctgactacaa ggacgacgat gacaagagcg attacaaaga cgatgatgat 1440

aagctgcagc atcaccacca tcatcaccat tga 1473

<210>4

<211>9

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成启动子-上游

<400>4

acctgggtt 9

<210>5

<211>13

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成启动子-下游

<400>5

attggttggt tgg 13

<210>6

<211>461

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R重链

<400>6

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg ThrAsn TyrAsn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

115 120 125

Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro

130 135 140

Val Cys Gly Asn Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val

145 150 155 160

Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu

180 185 190

Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser

195 200 205

Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val

210 215 220

Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro

225 230 235 240

Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser GluAsp AspPro Asp Val Gln

275 280 285

Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His ThrAla Gln Thr Gln

290 295 300

Thr His Arg Glu Asp TyrA sn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu

305 310 315 320

Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys

325 330 335

Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr

370 375 380

Asp Phe Met Pro GluAsp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys

385 390 395 400

Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Met TyrSer Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val

420 425 430

Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

450 455 460

<210>7

<211>238

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R轻链

<400>7

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210>8

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R重链-CDR-H1

<400>8

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R重链-CDR-H2

<400>9

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr

1 5

<210>10

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗-MET-R重链-CDR-H3

<400>10

Ala Ser Arg Gly Tyr

1 5

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R轻链-CDR-L1

<400>11

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr

1 5 10

<210>12

<211>3

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R轻链-CDR-L2

<400>12

Ala Ala Ser

1

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗MET-R轻链-CDR-L3

<400>13

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp ProLeuThr

1 5

Claims

1.i)抗-Met单克隆抗体抗MET-R，

ii)含有抗-Met单克隆抗体抗MET-R的互补决定区(CDR)的抗-Met单克隆抗体抗MET-R的片段，其中CDR-H1为SEQ ID NO.：8、CDR-H2为SEQ ID NO.：9、CDR-H3为SEQ ID NO.：10、CDR-L1为SEQ ID NO.：11、CDR-L2为SEQ ID NO.：12和CDR-L3为SEQ ID NO.：13，和/或

iii)含有抗-Met单克隆抗体抗MET-R的互补决定区(CDR)的基因工程或人源化抗体，其中CDR-H1为SEQ ID NO.：8、CDR-H2为SEQ ID NO.：9、CDR-H3为SEQ ID NO.：10、CDR-L1为SEQ ID NO.：11、CDR-L2为SEQ ID NO.：12和CDR-L3为SEQ ID NO.：13，

在制备通过诱导HGFR衰减调节来***病人肿瘤和/或转移的药物的用途，其中所述抗体抗MET-R通过杂交瘤细胞系ICLC PD05006制备。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体、所述片段和/或所述基因工程抗体是可溶性蛋白质的形式。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗体和/或所述基因工程抗体通过选自包括DNA重组技术、固相合成、液相合成的组的方法制备。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述片段选自含有抗-Met单克隆抗体抗MET-R的互补决定区(CDR)的肽，其中CDR-H1为SEQ ID NO.：8、CDR-H2为SEQ ID NO.：9、CDR-H3为SEQ ID NO.：10、CDR-L1为SEQ ID NO.：11、CDR-L2为SEQ ID NO.：12和CDR-L3为SEQ ID NO.：13。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肽选自Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv和scFv。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述片段通过选自包括所述抗体的溶蛋白性裂解、DNA重组技术、固相合成、液相合成的组的方法制备。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物通过注射或输注给药。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自结肠直肠肿瘤和肝肿瘤。

9.编码

i)抗-Met单克隆抗体抗MET-R，

的核苷酸序列在制备通过诱导HGFR衰减调节来***病人肿瘤和/或转移的药物的用途，其中所述抗-Met单克隆抗体抗MET-R通过杂交瘤细胞系ICLC PD05006制备。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的核苷酸序列如下所示：

i)SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2，

ii)相当于SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2的核苷酸序列，其中存在一个或多个沉默置换。

11.包含编码

i)抗-Met单克隆抗体抗MET-R，

的核苷酸序列的载体在制备通过诱导HGFR衰减调节来***病人肿瘤和/或转移的药物的用途，其中所述抗-Met单克隆抗体抗MET-R通过杂交瘤细胞系ICLC PD05006制备。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述载体包含的核苷酸序列选自：

i)SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2，

13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述载体是颗粒形式。

14.含有

i)抗-Met单克隆抗体抗MET-R，

和至少一种激酶抑制剂作为组合制剂同时、分别或连续使用用于通过诱导HGFR衰减调节来***和/或转移的产品，其中所述抗-Met单克隆抗体抗MET-R通过杂交瘤细胞系ICLC PD05006制备。

15.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述抗体和/或所述其至少一个片段是可溶性蛋白质的形式。

16.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述抗体和/或所述基因工程抗体通过选自包括：DNA重组技术、固相合成或液相合成的组的方法制备。

17.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述片段选自含有抗-Met单克隆抗体抗MET-R的互补决定区(CDR)的肽，其中CDR-H1为SEQ ID NO.：8、CDR-H2为SEQ ID NO.：9、CDR-H3为SEQ ID NO.：10、CDR-L1为SEQ ID NO.：11、CDR-L2为SEQ ID NO.：12和CDR-L3为SEQ ID NO.：13。

18.根据权利要求17所述的产品，其特征在于，所述肽选自Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv和scFv。

19.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述片段通过选自包括所述抗体的溶蛋白性裂解、DNA重组技术、固相合成或液相合成的组的方法制备。

20.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述至少一种激酶抑制剂选自包括K252A星形孢菌素类似物；(3Z)-5-[(2，6-二氯苄基)磺酰基]-3-[(3，5-二甲基-4-{[(2R)-2-(吡咯烷-1-基甲基)吡咯烷-1-基]羰基}-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮；[(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3，5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺胺]；[(3Z)-5-(2，3-二氢-1H-吲哚-1-基磺酰基)-3-({3，5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮]；[(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3，5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-N-甲基-2-氧代二氢吲哚-5-磺胺]的组。

21.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述产品通过注射或输注给药。

22.i)抗-Met单克隆抗体抗MET-R，

在生产检测赘生细胞的诊断制剂的用途，其中所述抗体通过杂交瘤细胞系ICLC PD05006制备，其中所述抗c-Met单克隆抗体、所述片段或所述基因工程或人源化抗体缀合标记物。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述标记物选自：放射性同位素、化学发光示踪物或分子标签。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述化学发光示踪物是荧光分子。