CN101351477B - 具有降低的免疫原性的抗cd19抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有改变的可变区的抗CD19鼠单克隆B4抗体。该改变的抗CD19可变区多肽具有改变的一个或者多个重链可变区或者轻链可变区的构架区或者互补决定区，因此降低T细胞应答。

Description

具有降低的免疫原性的抗CD19抗体
技术领域
本发明一般地涉及改变抗CD19鼠单克隆抗体B4轻链和重链的可变区，以降低其免疫原性。
发明背景
CD19是在B细胞和某些衍生自B细胞的癌性细胞(例如许多B细胞淋巴瘤)上发现的表面蛋白质。已经在小鼠中产生抗CD19单克隆抗体，其在B细胞衍生的癌症的临床前动物模型中显示出一些希望。然而，鼠源的抗体通常在人中是有免疫原性的。已经开发了许多改变鼠源抗体以最小化其在人中的免疫原性的策略。一个这样的策略是嵌合化(chimerization)，涉及将小鼠的可变区融合到人的恒定区。然而，嵌合化之后保留的鼠源的可变区序列经常是有免疫原性的。另一个这样的策略是人源化，涉及使用最紧密相关的人源序列置换可变区中的鼠源构架区(FR)，为了保留结合活性，任选地将某些氨基酸回复突变为对应的小鼠氨基酸。然而，即使是人源化的抗体也可能是有免疫原性的，因为抗体互补决定区(CDR)通常含有非自身的B细胞表位和T细胞表位。事实上，即使是完全的人抗体，也是有免疫原性的；这是在免疫应答过程中形成抗独特型抗体的基础。所有的这些问题同样可以适用于鼠源抗CD19抗体，正如其适用于任何其它类型的抗体。因此，针对抗CD19抗体，存在降低其免疫原性的需要。
发明内容
本发明涉及抗CD19鼠单克隆B4抗体，相比较于野生型的B4抗体，其已被改变以降低免疫原性。更特别地，本发明的B4抗体的可变区被改变以除去潜在的T细胞表位。作为结果，相比较于野生型B4抗体，本发明的B4抗体具有改良的生物学性质。
因此，一方面，本发明的特征是包括SEQ ID NO：22的1-30位氨基酸残基的、定义改变的免疫球蛋白重链构架区的氨基酸序列，其中在X5、X12、X19、X20、X23和X24位的一个或者多个氨基酸残基如下所述：X5是Q或E；X12是V或K；X19是R或K；X20是L或V；X23是K、E或D或X24是T或A。根据本发明的这个方面，在X5、X12、X19、X20、X23或X24位的氨基酸残基中至少一个氨基酸残基不同于如SEQ 1DNO：13的1-30位氨基酸残基所示的未改变的免疫球蛋白重链构架区中对应位置的氨基酸残基。在一个实施方案中，X23是E或D。
在另一个方面，本发明的特征是包括SEQ ID NO：23的1-14位氨基酸残基的、定义改变的免疫球蛋白重链构架区的氨基酸序列，其中在X3、X5、X7和X8位的一个或者多个氨基酸残基如下所述：X3是K或R；X5是R、T或A；X7是G、D或E或X8是Q或K。根据本发明的这个方面，在X3、X5、X7或X8位的氨基酸残基中至少一个氨基酸残基不同于如SEQID NO：13的36-49位氨基酸残基所示的未改变的免疫球蛋白重链构架区中对应位置的氨基酸残基。在一个实施方案中，X7是E或D。
在另一个方面，本发明的特征是包括SEQ ID NO：24的1-39位氨基酸残基的、定义改变的免疫球蛋白重链构架区的氨基酸序列，其中在X6、X10、X26、X29和X34位的一个或者多个氨基酸残基如下所述：X6是K、D或E；X10是K、E或D；X26是S、D或E；X29是S或A或X34是V或T。根据本发明的这个方面，在X6、X10、X26、X29或X34位的氨基酸残基中至少一个氨基酸残基不同于如SEQ ID NO：13的60-98位氨基酸残基所示的未改变的免疫球蛋白重链构架区中对应位置的氨基酸残基。在一个实施方案中，X10是E或D。
根据另一个方面，本发明的特征是包括SEQ ID NO：32的1-23位氨基酸残基的、定义改变的免疫球蛋白轻链构架区的氨基酸序列，其中在X1、X3、X7、X10、X11和X19位的一个或者多个氨基酸残基如下所述：X1是Q或D；X3是V或A；X7是S或E；X10是I或T；X11是M或L或X19是V或A。根据本发明的这个方面，在X1、X3、X7、X10、X11或X19位的氨基酸残基中至少一个氨基酸残基不同于如SEQ ID NO：25的1-23位氨基酸残基所示的未改变的免疫球蛋白轻链构架区中对应位置的氨基酸残基。在一个实施方案中，X3是A且X7是E。在另一个实施方案中，X1是D；X10是I且X11是L。
在另一个方面，本发明的特征是包括SEQ ID NO：28的24-33位氨基酸残基的、定义改变的免疫球蛋白轻链互补决定区的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的特征是包括SEQ ID NO：28的56-87位氨基酸残基的、定义改变的免疫球蛋白轻链构架区的氨基酸序列。
根据另一方面，本发明的特征是包括选自SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：30或SEQ ID NO：31的氨基酸序列的抗体可变区，其中抗体可变区特异地结合CD19。
根据另一方面，本发明的特征是与B4抗体重链可变区具有至少90％或者至少95％的同一性的多肽，该多肽在对应于Val12、Leu20、Lys23、Thr24、Lys38、Gly42、Gln43、Lys65、Lys69、Ser85、Ser88或Val93的一个或者多个残基位置包含氨基酸替代。在一个实施方案中，多肽包括一个或者多个如下替代：Gln5Glu、Val12Lys、Arg19Lys、Leu20Val、Lys23Glu、Lys23Asp、Thr24Ala、Lys38Arg、Arg40Thr、Gly42Asp、Gly42Glu、Gln43Lys、Lys65Asp、Lys65Glu、Lys69Glu、Lys69Asp、Ser85Asp、Ser85Glu、Ser88Ala或Val93Thr。
根据另一方面，本发明的特征在于与B4抗体轻链可变区具有至少90％或者至少95％的同一性的多肽，该多肽在对应于Val3、Ser7、Ile10、Met11、Val19、Val29、Ser51、Leu53、Ala54或Ser75的一个或者多个残基位置包含氨基酸替代。在一个实施方案中，多肽包括一个或者多个替代：Gln1Asp、Val3Ala、Ser7Glu、Ile10Thr、Met11Leu、Val19Ala、Val29Ala、Ser51Asp、Leu53Thr、Ala54Asp或Ser75Glu。
另一方面，本发明的特征是编码根据本发明的任何一个实施方案的多肽的核酸。
另一方面，本发明的特征是治疗患者的方法，该方法包括向患者给予治疗有效量的根据本发明任何一个实施方案的多肽的步骤。
另一方面，本发明的特征是靶向表面上具有CD19的细胞的方法，该方法包括施用根据本发明的任何一个实施方案的抗体可变区的步骤。在该方法的一个实施方案中，细胞是肿瘤细胞。
总之，本发明涉及：
●改变的B4抗体，当向人施用时，其比未改变的B4抗体具有较小的免疫原性，但是其仍然有能力特异结合CD19，并且有能力靶向表达CD19的细胞，所述改变的抗体包括至少一个下述的免疫球蛋白重链构架区：
(i)QVQLX5QPGAEVX12KPGASVX19X20SCX23X24SGYTFT(SEQ ID NO：22)，其中X5是Q或E；X12是V或K；X19是R或K；X20是L或V；X23是K、E或D且X24是T或A，条件是在所述位置上至少一个氨基酸残基不同于SEQ ID NO：13的1-30位氨基酸残基中的对应位置上的氨基酸。
(ii)WVX3QX5PX7X8GLEWIG(SEQ ID NO：23)，其中X3是K；X5是R、A或T；X7是G且X8是Q或K，条件是在位置X5或X8的氨基酸残基之一不同于SEQ ID NO：13的36-49位氨基酸残基中的对应位置上的氨基酸。
(iii)YNQKFX6GKAX10LTVDKSSSTAYMEVSX26LTX29EDSAX34YYCAR(SEQ ID NO：24)，其中X6是K、D或E；X10是K、E或D；X26是S、D或E；X29是S或A且X34是V或T，条件是在所述位置上至少一个氨基酸残基不同于SEQ ID NO：13的60-98位氨基酸残基中的对应位置上的氨基酸。
●包括重链构架区(i)、(ii)和(iii)的相应的改变的抗体。
●相应改变的B4抗体，当向人施用时，其比未改变的B4抗体具有较小的免疫原性，但是其仍然有能力特异结合CD19，并且有能力靶向表达CD19的细胞，所述改变的抗体包括下述的免疫球蛋白轻链构架区：
(iv)X1IX3LTQX7PAX10X11SASPGEKX19TMTC(SEQ ID NO：32)其中X1是Q或D；X3是V或A；X7是S或E；X10是I或T；X11是M或L且X19是V或A，条件是在这些位置的氨基酸残基中至少一个不同于SEQ ID NO：25的1-23位氨基酸残基中对应位置的氨基酸。
●相应改变的B4抗体，其中X3是A且X7是E。
●相应改变的B4抗体，其中X1是D；X10是I且X11是L。
●相应改变的B4抗体，包括重链构架区(i)、(ii)和(iii)和轻链构架区(iv)。
●相应改变的B4抗体，包括下述免疫球蛋白轻链互补决定区(CDR)：SASSGANYMH(SEQ ID NO：28的24-33位氨基酸残基)。
●改变的B4抗体，当向人施用时，其比未改变的B4抗体具有较小的免疫原性，但是仍然有能力特异结合CD19以及有能力靶向表达CD19的细胞，所述改变的抗体包括至少一个选自SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21的重链可变区氨基酸序列。
●改变的B4抗体，当向人施用时，其比未改变的B4抗体具有较小的免疫原性，但是仍然有能力特异结合CD19以及有能力靶向表达CD19的细胞，所述改变的抗体包括至少一个选自SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31的轻链可变区氨基酸序列。
●相应的改变的B4抗体，包括至少一个选自SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21的重链可变区氨基酸序列，和至少一个选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQID NO：30和SEQ ID NO：31的轻链可变区氨基酸序列。
●相应改变的B4抗体，包括从下述组中选择的重链和轻链：
(i)SEQ ID NO：14的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区；
(ii)SEQ ID NO：15的重链可变区和SEQ ID NO：27的轻链可变区；
(iii)SEQ ID NO：16的重链可变区和SEQ ID NO：28的轻链可变区；
(iv)SEQ ID NO：17的重链可变区和SEQ ID NO：29的轻链可变区，其是优选的；
(v)SEQ ID NO：18的重链可变区和SEQ ID NO：29的轻链可变区，其是优选的；
(vi)SEQ ID NO：20的重链可变区和SEQ ID NO：30的轻链可变区；
(vii)SEQ ID NO：21的重链可变区和SEQ ID NO：31的轻链可变区.
●相应改变的B4抗体，包括下述免疫球蛋白轻链互补决定区(CDR)：SASSGANYMH，(SEQ ID NO：28的24-33位氨基酸残基)。
●与B4抗体的重链可变区具有至少90％的同一性的多肽，当向人施用时，其比未改变的B4抗体具有较小的免疫原性，但是仍然有能力特异结合CD19以及有能力靶向表达CD19的细胞，该多肽在一个或者多个对应于Val12、Leu20、Lys23、Thr24、Gly42、Lys38、Lys65、Lys69、Ser85或Val93的残基位置包括氨基酸替代。
●相应的多肽，其中该多肽与B4抗体重链可变区具有至少95％的同一性。
●相应的多肽，其中该多肽包括一个或者多个如下替代：Gln5Glu、Val12Lys、Arg19Lys、Leu20Val、Lys23Glu、Lys23Asp、Thr24Ala、Lys38Arg、Gly42Asp、Gly42Glu、Lys65Asp、Lys65Glu、Lys69Glu、Lys69Asp、Ser85Asp、Ser85Glu或Val93Thr。
●与B4抗体的轻链可变区具有至少90％的同一性的相应多肽，当向人施用时，其比未改变的B4抗体具有较小的免疫原性，但是仍然有能力特异结合CD19以及有能力靶向表达CD19的细胞，该多肽在一个或者多个对应于Val3、Ser7、Ile10、Met11、Val19、Val29、Ser51、Leu53、Ala54或Ser75的残基位置包括氨基酸替代。
●相应的多肽，其中该多肽与B4抗体轻链可变区具有至少95％的同一性。
●相应的多肽，其中该多肽包含一个或者多个如下替代：Gln1Asp、Val3Ala、Ser7Glu、Ile10Thr、Met11Leu、Val19Ala、Val29Ala、Ser51Asp、Leu53Thr、Ala54Asp或Ser75Glu。
●改变的B4抗体，含有包括Gln5Glu、Val12Lys、Arg19Lys、Leu20Val、Lys23Glu、Lys23Asp、Thr24Ala、Lys38Arg、Gly42Asp、Gly42Glu、Lys65Asp、Lys65Glu、Lys69Glu、Lys69Asp、Ser85Asp、Ser85Glu或Val93Thr氨基酸替代的重链多肽和包括Gln1Asp、Val3Ala、Ser7Glu、Ile10Thr、Met11Leu、Val19Ala、Val29Ala、Ser51Asp、Leu53Thr、Ala54Asp或Ser75Glu氨基酸替代的轻链多肽。
●编码如上和如下描述的改变的B4抗体或者相应多肽的DNA分子。
●包括相应DNA分子的表达载体。
●表达如描述的改变的B4抗体或者相应多肽的宿主细胞。
●用于治疗癌症和自身免疫病的药物组合物，包括如上和如下描述的抗体或者多肽的药物有效量，以及任选的药学上可接受的稀释剂、载体或者赋形剂。
●相应的药物组合物在制备用于治疗自身免疫病或者癌症的药物中的用途。
附图简要说明
图1描述编码B4抗体重链可变区(B4 VH0)的核酸序列(SEQ IDNO：1)。
图2描述编码实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv1)的核酸序列(SEQID NO：2)，其掺入了突变K23E、G42D、K69E和S85D的密码子。
图3描述编码实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv2)的核酸序列(SEQID NO：3)，其掺入了突变K69E和S85D的密码子。
图4描述编码实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv3)的核酸序列(SEQID NO：4)，其掺入了突变Q5E、V12K、R19K、L20V、T24A、S85D和S88A的密码子。
图5描述编码实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv4)的核酸序列(SEQID NO：5)，其掺入了突变Q5E、R19K、L20V、R40T、Q43K、K65D、S85D、S88A和V93T的密码子。
图6描述编码实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv5)的核酸序列(SEQID NO：6)，其掺入了突变Q5E、V12K、R19K、L20V、T24A、K38R、R40A、Q43K、K65D、S85D和V93T的密码子。
图7描述编码实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv6)的核酸序列(SEQID NO：7)，其掺入了突变Q5E、R19K、L20V、K65D、S85D和V93T的密码子。
图8描述编码B4抗体轻链可变区(B4 VK0)的核酸序列(SEQ IDNO：8)。
图9描述编码实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv1)的核酸序列(SEQID NO：9)，其掺入了突变V3A、S7E和A54D的密码子。
图10描述编码实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv2)的核酸序列(SEQ ID NO：10)，其掺入了突变Q1D、I10T、M11L和A54D的密码子。
图11描述编码实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv3)的核酸序列(SEQID NO：11)，其掺入了突变I10T、M11L、V19A、V29A和S75E的密码子。
图12描述编码实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv4)的核酸序列(SEQ ID NO：12)，其掺入了突变I10T、M11L、V19A、S51D和L53T的密码子。
图13描述B4抗体重链可变区(B4 VH0)的氨基酸序列(SEQ IDNO：13)。
图14描述具有突变K23E、G42D、K69E和S85D的实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。
图15描述具有突变K69E和S85D的实例性B4抗体重链可变区(B4VHv2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
图16描述具有突变Q5E、V12K、R19K、L20V、T24A、S85D和S88A的实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv3)的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。
图17描述具有突变Q5E、R19K、L20V、R40T、Q43K、K65D、S85D、S88A和V93T的实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv4)的氨基酸序列(SEQID NO：17)。
图18描述具有突变Q5E、V12K、R19K、L20V、T24A、K38R、R40A、Q43K、K65D、S85D和V93T的实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv5)的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。
图19描述具有突变Q5E、R19K、L20V、K65D、S85D和V93T的实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv6)的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。
图20描述具有突变V12K、K23E、G42D、K65D、K69E和S85D的实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv11)的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。
图21描述具有突变Q5E、V12K、R19K、L20V、T24A、R40T、Q43K、K65D、S85D、S88A和V93T的实例性B4抗体重链可变区(B4 VHv34)的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。
图22描述具有未限定的氨基酸残基X5、X12、X19、X20、X23和X24的实例性B4抗体重链构架区(B4 VHfr1)的氨基酸序列(SEQ IDNO：22)。
图23描述具有未限定的氨基酸残基X3、X5、X7和X8的实例性B4抗体重链构架区2(B4 VHfr2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。
图24描述具有未限定的氨基酸残基X6、X10、X26、X29和X34的实例性B4抗体重链构架区3(B4 VHfr3)的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。
图25描述B4抗体轻链可变区(B4 VK0)的氨基酸序列(SEQ IDNO：25)。
图26描述具有突变V3A、S7E和A54D的实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)。
图27描述具有突变Q1D、I10T、M11L和A54D的实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。
图28描述具有突变I10T、M11L、V19A、V29A和S75E的实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv3)的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。
图29描述具有突变I10T、M11L、V19A、S51D和L53T的实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv4)的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。
图30描述具有突变V3A、S7E、V19A、A54D和S75E的实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv11)的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
图31描述具有突变I10T、M11L、V19A、V29A、S51D、L53T和S75E的实例性B4抗体轻链可变区(B4 VKv34)的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)。
图32描述具有未限定的氨基酸残基X1、X3、X7、X10、X11和X19的实例性B4抗体轻链构架区(B4 VKfr1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。
图33描述具有未限定的氨基酸残基X3、X5和X6的实例性B4抗体轻链互补决定区(B4 VKcdr2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。
图34描述B4抗体重链可变区的氨基酸序列。下划线标出互补决定区。粗体显示可以改变的氨基酸残基。
图35描述B4抗体轻链可变区的氨基酸序列。下划线标出互补决定区。粗体显示可以改变的氨基酸残基。
图36为B4抗体重链可变区VH0(SEQ ID NO：13)、VHv1(SEQ IDNO：14)、VHv2(SEQ ID NO：15)、VHv3(SEQ ID NO：16)、VHv4(SEQID NO：17)、VHv5(SEQ ID NO：18)、VHv11(SEQ ID NO：20)和VHv34(SEQ ID NO：21)的氨基酸序列比对。
图37是B4抗体轻链可变区VK0(SEQ ID NO：25)、VKv1(SEQ IDNO：26)、VKv2(SEQ ID NO：27)、VKv3(SEQ ID NO：28)、VKv4(SEQID NO：29)、VKv11(SEQ ID NO：30)和VKv34(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列比对。
图38显示如实施例4描述的，使用由HEK 293T细胞(空心三角)或由YB2/0细胞(实心三角)表达的B4 VHv4/VKv4抗体，以及由NS/0细胞系(空心圈)或由YB2/0细胞(实心圈)表达的B4 VHv5/VKv4抗体在Daudi Burkitt淋巴瘤细胞上实施ADCC检测的结果。
图39显示如实施例5中描述的，使用本发明的B4 VHv4/VKv4抗体(条纹柱)、Leu16抗体(白柱)或者PBS(黑柱)处理移植了人PBMC的小鼠得到的结果。
图40显示如实施例6描述的对携带那马瓦(Namalwa)淋巴瘤细胞的小鼠的处理结果，该小鼠接受本发明的B4 VHv4/VKv4抗体(空心圈)或PBS(星形)处理。
图41显示如实施例7描述的对携带Daudi Burkitt淋巴瘤细胞的小鼠的处理结果，该小鼠接受本发明的B4 VHv4/VKv4抗体(空心三角)、环磷酰胺(空心方块)、B4 VHv4/VKv4抗体和环磷酰胺的联合(空心圈)或者PBS(星形)处理。
图42显示如实施例8描述的使用本发明的抗体结合多种化疗剂处理携带那马瓦淋巴瘤细胞的小鼠的结果。图42(a)使用环磷酰胺处理(空心方块)、B4 VHv4/VKv4抗体处理(X)、B4 VHv4/VKv4抗体和环磷酰胺联合处理(实心方块)或者PBS处理(星形)。图42(b)中使用长春花新碱(空心三角)、B4 VHv4/VKv4抗体(X)、B4 VHv4/VKv4抗体和长春花新碱的联合(实心三角)或PBS(星形)处理。图42(c)中，使用阿霉素(空心圈)、B4 VHv4/VKv4抗体(X)、B4 VHv4/VKv4抗体和阿霉素的联合(实心圈)或者PBS(星形)处理。
发明详细描述
本发明涉及与野生型B4蛋白比较，具有降低的免疫原性的B4蛋白，以及涉及制备和使用所述蛋白质的方法。更具体地，本发明提供B4抗体中的突变，其具有降低B4抗体自身的免疫原性的作用，该作用主要通过去除B4中可以刺激免疫应答的T细胞表位而实况。
本发明涉及抗CD19鼠抗体B4(Nadler等人，(1983)J.Immunol.130：2947-2951；Roguska等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：969-973)的一系列改变的抗体重链(VH)和轻链(VK)可变区，在本文中其分别被统称为“B4 VHvx”和“B4 VKvy”。为了参考，在图34和图35中分别提供了原始鼠B4抗体的重链可变区(B4 VH0)的序列和原始鼠B4抗体轻链可变区(B4 VK0)的序列，并且下划线标出CDR。
相比较于原始B4 VH0和B4 VK0多肽，B4 VHvx和B4 VKvy多肽具有降低的免疫原性。更特别地，本发明提供在B4 VH和/或B4 VK中的突变，其主要通过去除在这些多肽中可以刺激免疫应答的T细胞表位，而具有降低B4可变区多肽免疫原性的作用。根据本发明，当向人施用时，含有改变形式的B4可变区的蛋白质组合物具有较小的免疫原性，但是仍然有能力特异结合CD19以及有能力靶向表达CD19的细胞。
如本文使用的，术语“互补决定区”和“CDR”应理解为指主要与抗原相互作用的免疫球蛋白可变区的高变区或者环。分别如图34和35所示，免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VK)都含有三个***构架区之间的CDR。例如，参考如图34所示的定义B4抗体免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)，CDR由下列氨基酸序列限定：从Ser31至His35(CDR1)、从Glu50至Asn59(CDR2)和从Gly99至Tyr109(CDR3)。参考如图35所示的定义B4抗体免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)，CDR由下列氨基酸序列限定：从Ser24至His33(CDR1)、从Asp49至Ser55(CDR2)和从His88至Thr94(CDR3)。
如本文使用的，术语“构架区”和“FR”应理解为指免疫球蛋白可变区中与互补决定区相邻的区域。如图34和图35所示，免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VK)各自含有四个FR。例如，参考如图34所示的定义B4抗体免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列(SEQ IDNO：13)，FR由下列氨基酸序列限定：从Gln1至Thr30(FR1)、从Trp36至Gly49(FR2)、从Tyr60至Arg98(FR3)和从Trp110至Ser120(FR4)。参考如图35所示的定义B4抗体免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)，FR由下列氨基酸序列限定：Gln1至Cys23(FR1)、从Trp34至Tyr48(FR2)、从Gly56至Cys87(FR3)和从Phe95至Lys104(FR4)。另外，在图34和35中用粗体描述的氨基酸残基是可以根据本发明的多个实施方案进行突变的氨基酸残基。
通过多种计算机或者非计算机方法可以鉴定T细胞表位，这些方法包括以基于结构的计算机模型为基础的预测，或者通过合成肽并针对结合特异MHC II类分子而进行的检测，或者在免疫原性检测方法中的检测。根据本发明，可能的T细胞表位是当将其作为分离的肽考虑时，预测将结合MHC II类分子或者非人物种中的等价物的序列。定义可能的T细胞表位时并未考虑抗原加工的其它方面，例如蛋白质被摄入抗原呈递细胞的效率，在完整蛋白质的位置剪切以产生能够结合MHC II类分子的肽的效率等等。因此，在将蛋白质施用给动物之后，实际在MHC II类分子上呈递的T细胞表位的群体是可能的T细胞表位的亚群。根据本发明，T细胞表位是蛋白质上与MHC II类分子相互作用的表位。不希望受理论的限制，可以认为T细胞表位是蛋白质中的氨基酸序列，其在T细胞发育中未能通过T细胞负选择过程，并因此预期将被MHC II类分子呈递并被T细胞受体识别。
根据一个实施方案，本发明提供涉及降低B4 VH和B4 VK区免疫原性的方法。根据本发明的一个实施方案，在B4 VH或B4 VK的序列中鉴定出可能的非自身T细胞表位。例如，通过基于模拟结合MHC II类分子的肽的计算方法，鉴定可能的非自身T细胞表位。然后进行特定氨基酸残基的替代，使得含有可能T细胞表位的肽结合MHC II类分子的能力被降低或者被消除。
本发明可变区的改变的蛋白质序列
根据一个实施方案，根据基于结构的计算机模拟，预测特定氨基酸突变(一个或多个)的效果。例如，ProPred是公众可获取的基于网络的工具，其可以被用于预测结合HLA-DR等位基因的肽(http://www.imtech.res.in/raghava/propred；Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17：1236-1237)。ProPred以Sturniolo描述的针对一组50个HLA-DR等位基因的矩阵预测算法为基础(Sturniolo等人，(1999)Nature Biotechnol.17：555-561)。使用这样的算法，在B4 VH和B4 VK中发现多个肽序列，其被预测可结合多种MHC II类分子等位基因并因此可能是免疫原性的。表1显示了这些肽序列以及预测的它们与HLA-DR等位基因结合的频率。
参考表1，显示了结合至少5种HLA-DR等位基因的各个9-mer肽的序列，以及其在B4 VH区(左栏)或者B4 VK区(右栏)中的位置(#)。“结合频率”指在任意的结合阈值(本情况中为20％)之上，在50个可能的等位基因中结合肽的等位基因的数目。结合频率为“+”指肽结合5-9个等位基因，“++”指肽结合10-19个等位基因，以及“+++”指肽结合20-50个等位基因。20％结合阈值是相对于如Sturniolo等人公开的算法计算的理论最大结合分值而言的。
表1预测结合人HLA-DR等位基因的B4 V区中的选定的肽。
VH T细胞表位(起始位点) 结合频率 VKT细胞表位(起始位点) 结合频率
(2)VQLQQPGAE(12)VKPGASVRL(18)VRLSCKTSG(36)WVKQRPGQG(60)YNQKFKGKA(64)FKGKAKLTV(80)YMEVSSLTS(93)VYYCARGSN +++++++++++++ (2)IVLTQSPAI(3)VLTQSPAIM(19)VTMTCSASS(29)VNYMHWYQQ(46)WIYDTSKLA(47)IYDTSKLAS ++++++++++
可以通过引入如下特定的突变而使得在B4 VH和B4 VK多肽中的这些可能的免疫原性序列减少免疫原性，所述突变减少或者消除特定的肽与人HLA-DR等位基因的结合(例如，参见WO98/52976和WO00/34317)。作为备选，非人T细胞表位可以被突变，以便其对应于存在于人种系抗体中的人自身表位(参见，例如US5,712,120)。
通过参考抗体可变区的三级和四级结构，可以获得选择合适的突变的指导。本领域已知抗体可变结构域的晶体结构，并且发现FR的结构通常彼此非常相似。可以从已经确定了结构的最密切相关的抗体重链和轻链可变区，构建抗CD19抗体B4 VH0/VK0的抗体可变区的理论模型，最密切相关的抗体重链和轻链可变区可以通过一级结构比对而被鉴定(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-415)。使用串线算法(threadingalgorithm)可以在已解析的结构上模建B4轻链和重链(Marti-Renom等人，(2000)Annu Rev Biophys Biomol Struct 29：291-325)，该串线结构可以被进一步精细化以获得立体化学有利的能量(Weiner等人，(1984)J AmChem Soc 106：765-784)。发现分别由它们的PDB数据库检索码1 FBI(单克隆抗体F9.13.7的Fab片段)和1 MIM(抗CD25嵌合抗体Sdz Chi621的Fab片段)命名的已解出的重链和轻链结构，对于此目的而言是有用的参考结构。
优选的突变不会不当地干扰蛋白质的表达、折叠或者活性。根据本发明，在B4 VH的Q5、V12、R19、L20、K23、T24、K38、R40、G42、Q43、K65、K69、S85、S88或V93位置的氨基酸以及在B4 VK的Q1、V3、S7、I10、M11、V19、V29、S51、L53、A54或S75位置的氨基酸可以被突变，而仍然保留抗体被表达的能力，以及保留以与未改变形式的B4相当的水平结合CD19的能力。因此，本发明包括在VH序列中选自Q5、V12、R19、L20、K23、T24、K38、R40、G42、Q43、K65、K69、S85、S88和V93的氨基酸位置具有至少一个修饰，和/或在VK序列中选自Q1、V3、S7、I10、M11、V19、V29、S51、L53、A54和S75的氨基酸位置具有至少一个修饰的B4抗体。
表2中公开了根据本发明发现的能耐受氨基酸替代的特定位置的非穷尽列表，以及公开了在这些位置的实例性替代。
表2在B4 V区的替代
B4 VH中的位点  取代  B4 VK中的位点  取代
Gln5Val12Argl9Leu20Lys23  GluLysLysValGlu，Asp  GlnlVal3Ser7Ile10Met11  AspAlaGluThrLeu
Thr24Lys38Arg40Gly42Gln43  AlaArgAla，ThrAsp，GluLys  Val19Val29Ser51Leu53Ala54  AlaAlaAspThrAsp
Lys65Lys69Ser85Ser88Val93  Asp，GluGlu，AspAsp，GluAlaThr  Ser75  Glu
一组实施方案包括B4 VH多肽的氨基酸替代，选自Q5E、V12K、R19K、L20V、K23E、T24A、K38R、R40T、G42D、Q43K、K65D、K69E、S85D、S88A和V93T。另外，还考虑的替代是K23D、G42E、K65E和K69D。还发现特定的突变组合也是有用的。例如，在一个特定的实施方案中，包括K23E和K69E替代。在另一个特定的实施方案中，还包括G42D和S88A替代，例如在B4 VHv1(SEQ ID NO：14)中显示的。在另一个特定的实施方案中，VHv1还包括V12K和K65D替代(B4 VHv11)(SEQ IDNO：20)。在另一个特定的实施方案中，包括Q5E、V12K、R19K、L20V、S85D和S88A替代，如通过B4 VHv3(SEQ ID NO：16)所示例的。再一个特定的实施方案中，包括Q5E、R19K、L20V、R40T、Q43K、K65D、S85D、S88A和V93T替代，如通过B4 VHv4(SEQ ID NO：17)所示例的。另一个特定的实施方案中，包括Q5E、R19K、L20V、K38R、R40A、Q43K、K65D、S85D和V93T替代，如通过B4 VHv5(SEQ ID NO：18)所示例的。再一个特定实施方案中，组合B4 VHv3和B4 VHv4替代，如序列B4 VHv34(SEQ ID NO：21)显示的。
另一组实施方案包括在B4 VK多肽中的氨基酸替代，选自Q1D、V3A、S7E、I10T、M11L、V19A、V29A、S51D、L53T、A54D和S75E。在一个特定的实施方案中，包括A54D替代。发现特定的突变组合是有用的。例如，在更特定的实施方案中，还包括V3A和S7E替代，如B4 VKv1(SEQID NO：26)中所示例的，或者包括Q1D、I10T和M11L替代，如通过B4VKv2(SEQ ID NO：27)所示例的。再一个实施方案中，B4 VK1还包括V19A和S75E替代，如在B4 VKv11(SEQ ID NO：30)所中示例的。在另一个实施方案中，包括I10T、M11L、V19A、V29A和S75E替代，如通过B4 VKv3(SEQ ID NO：28)所示例的。再一个特定实施方案中，包括I10T、M11L、V19A、S51D和L53T替代，如通过B4 VKv4(SEQ ID NO：29)所示例的。在另一个特定实施方案中，组合B4 VKv3和B4 VKv4替代，如在B4 VKv34(SEQ ID NO：31)序列中显示的。
分别在图36和37中显示了如上描述的本发明的B4 VHvx和B4 VKvx的一些实例性序列的一级结构比对。使用粗体描述的氨基酸是根据本发明可以被突变的VH0和VK0中的位置，下划线描述的氨基酸代表CDR。VHv1-VHv34和VKv1-VKv34分别代表具有可以降低免疫原性的特定氨基酸替代的重链和轻链。
本发明的可变区组合物包括至少一个本发明的重链或者轻链。例如，在一个实施方案中，可变区包括B4 VHv1(SEQ ID NO：14)和B4 VK0(SEQID NO：25)。另一个实施方案中，可变区包括B4 VHv1(SEQ ID NO：14)和B4 VKv1(SEQ ID NO：26)。在另一个实施方案中，可变区包括B4 VHv4(SEQ ID NO：17)和B4 VKv4(SEQ ID NO：29)。在另一个实施方案中，可变区包括B4 VHv5(SEQ ID NO：23)和B4 VKv4(SEQ ID NO：29)。可以理解，通过组合匹配完整一对的本发明B4 VHvx和B4 VKvy多肽，将容易地获得本发明的其它实施方案。如下文更详细的描述，有用的组合可以进一步通过分析含有这些组合的蛋白质组合物(例如B4 VHvx/VKvy抗体)的表达能力和CD19结合活性以及它们被降低的免疫原性，而用实验进行确定。
本发明可变区的降低的免疫原性的验证
为了验证本发明的突变确实导致免疫原性的降低，可以使用本领域熟知的标准实验检测方法。例如，可以使用T细胞刺激试验(例如Jones等人，(2004)，J.Interferon Cytokine Res.，24：560)。在这种试验中，根据标准条件获得并培养人外周血单核细胞(PBMC)。在任选的预刺激之后，将对应于可能的MHC II类表位的肽加入PBMC的培养物中；PBMC进一步孵育，并且随后加入氚标记的胸腺嘧啶核苷。肽可以是最小9-mer的，或者可以具有大约10-15，或者多于15个氨基酸。在进一步孵育细胞之后，通过标准的技术检测掺入DNA的氚标记的胸腺嘧啶核苷。
认为T细胞刺激试验通过下述机制工作。首先，如果使用肽作为刺激物，该肽首先必须结合存在于PBMC中的细胞上的MHC II类分子。其次，MHC II类/肽复合物必须与CD4+T细胞上的T细胞受体有效地相互作用。如果受试肽不能足够牢固地结合MHC II类分子，则没有信号产生。如果肽能够结合MHC II类分子，并且存在表达合适的能够识别特定MHC II类/肽复合物的重排T细胞受体的T细胞，则产生信号。然而，如果这样的T细胞作为负选择过程的结果已经缺失，则将没有信号产生。这些机制被认为与从给定肽造成刺激或不造成刺激所推断出的蛋白质序列的免疫原性相关。
如果由于与适当的T细胞受体没能出现或者其它不相关T细胞的增殖以及随后的T细胞群体内稳态相关的随机原因，识别T细胞在PBMC群中以非常低的数目存在，那么尽管预期有信号，但是也可能没有信号实际产生。因此，有可能出现假阴性结果。基于这些考虑，使用大量不同来源的PBMC并且独立地检测这些样品是重要的。通常有用的是，检测来自具有各种人种的一组人的PBMC，并确定存在于每个PBMC群体中的MHCII类等位基因。
标准的T细胞检测方法的缺点是掺入的氚信号通常仅仅比背景掺入高两倍。本发明的蛋白质和肽也可以采用改良的T细胞检测方法进行检测，例如在该方法中，纯化的CD4+T细胞和纯化的树突细胞在存在受试肽的情况下共培养，随后暴露于氚标记的胸腺嘧啶核苷，然后检测掺入的氚标记的胸腺嘧啶核苷。此第二个检测方法的优点是氚化胸腺嘧啶核苷在不相关的细胞(例如CD8+T细胞)中的掺入基本上被消除并且因此降低背景。
第三种检测方法包括在动物(例如灵长类动物)中检测具有降低的免疫原性的候选蛋白质。这种检测方法通常涉及检测如下B4 VHvx/VKvy蛋白质组合物(例如抗体)，其中该组合物已经通过在例如上文描述的基于细胞的检测方法中检测单个组分肽的可能免疫原性后进行了设计。一旦设计并且表达了这样的B4 VHvx/VKvy蛋白质组合物候选物，即可以通过注射入动物而检测该蛋白质的免疫原性。
B4 VHvx/VKvy蛋白质组合物的注射通常以与在人的治疗应用中所预期的递送途径相同的方式实施。例如，可以使用皮内、皮下、肌内、腹膜内注射或者静脉输注。如果进行多剂施用，这些施用可以通过不同的途径进行。
对于免疫原性的测试目的，共同施用佐剂以增加信号以及最小化需要使用的动物的数目是有用的。如果使用佐剂，可以使用缺少蛋白质组分的佐剂，例如具有未甲基化的CpG二核苷酸的DNA、细菌脂质A、N-甲酰甲硫氨酸或者其它细菌非蛋白质组分。不希望受理论的限制，避免含有蛋白质的佐剂的原因是其它蛋白质可能提供将最终促成抗候选蛋白质的抗体应答的T细胞表位。
在一次或者多次施用候选B4 VHvx/VKvy蛋白质组合物之后，根据标准的技术(例如ELISA方法)检测抗独特型抗体的存在。发现相比于含有原始B4 VH/VK序列的对应分子，本发明的B4 VHvx/VKvy蛋白质组合物以较低的频率以及较小的程度诱发抗体形成。
本发明的可变区的其它构型
除了在裸抗体中使用本发明V区之外，还可以将本发明V区装配成靶向毒素、免疫刺激物和其它蛋白质的抗体融合蛋白，以及装配成Fab、单链Fv、双特异抗体以及抗体工程领域已知的其它构型。
在本发明的某些实施方案中，轻链可变区和重链可变区可以分别偶联到免疫球蛋白的轻链恒定区和重链恒定区上。免疫球蛋白轻链具有被称为κ链或者λ链的恒定区。在本发明的特定实施方案中，轻链恒定区是κ链。重链恒定区以及其多种修饰和组合在下文详细描述。
Fc部分
根据需要，将本发明的抗体可变结构域融合到Fc部分。如本文使用的，Fc部分包括衍生自免疫球蛋白(优选人免疫球蛋白)的重链恒定区的结构域，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或者衍生物。免疫球蛋白重链的恒定区被定义为天然发生的或者合成产生的多肽，同源于至少一部分的重链C端区，包括CH1、铰链区、CH2、CH3和对于一些重链类别而言CH4结构域。“铰链区”连接CH1结构域到Fc部分的CH2-CH3区。所有哺乳动物免疫球蛋白的重链恒定区表现出广泛的氨基酸序列相似性。这些免疫球蛋白区的DNA序列在本领域是已知的(参见，例如Gillies等人，(1989)J.Immunol.Meth.125：191)。
在本发明中，Fc部分典型地包括至少CH2结构域。例如，Fc部分可以包括完整的免疫球蛋白重链恒定区(CH1-铰链区-CH2-CH3)。作为备选，Fc部分可以包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域的全部或者部分。免疫球蛋白的恒定区负责许多重要的抗体效应子功能，包括通过Fc受体(FcR)结合和通过补体结合所介导的那些功能。存在五类主要的重链恒定区，为IgA、IgG、IgD、IgE和IgM，每种具有由同种型确定的特征性效应子功能。
例如，IgG被分为四个γ同种型：γ1、γ2、γ3和γ4，也分别称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG分子可以与多种细胞受体相互作用，包括特异针对IgG类抗体的3类Fcγ受体(FcγR)，即FcγRl、FcγRII和FcγRIII。据报道对于IgG结合FcγR受体重要的序列在CH2和CH3结构域中。
广泛认可的抗体效应子功能(特别是IgG类)，包括依赖于补体的细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。所有的IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)都在一定的程度上介导CDC和ADCC，且IgG1和IgG3对于两种活性是最有效的(Paul，Essential Immunology 4.sup.th Ed.，p.62，第三章，表3)。据认为CDC以多种机制发生：一种机制在抗体结合细胞表面的抗原时被起始。一旦抗原-抗体复合物形成，据认为C1q分子将结合抗原-抗体复合物。然后C1q剪切自身以起始导致其它补体蛋白质的酶促活性和剪切的级联事件，它们然后结合靶细胞表面并促使细胞通过例如细胞裂解和/或通过巨噬细胞摄入而死亡。据认为当细胞毒性细胞(例如天然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)上的Fc受体结合抗体的Fc区而该抗体结合细胞表面的抗原时发生ADCC。Fc受体的结合给细胞毒性细胞发信号以杀死靶细胞。特征性地，被认为是ADCC的主要介体的NK细胞仅仅表达Fc□RIIIa。
通常改变抗体的效应子功能是有用的。例如，为了治疗与B细胞恶性肿瘤相关的癌症或者治疗与B细胞组分相关的自身免疫病，增强抗体的ADCC活性是有用的。增强以相对低的密度存在的B细胞表面抗原(例如CD19)的抗体的ADCC活性可能是特别有用的(Niwa等人，(2005)Clin.Cancer Res.11：2327-2336)。据认为相对于B细胞表面的CD20，CD19的抗原密度大约低十倍。本领域已知可以增加抗体相对于其亲本抗体的ADCC活性的抗体改变，并且该改变通常与增加抗体变体与FcγRIII的结合亲和性的修饰有关(例如参考US Pat.No.6,737,056)。例如，以IgGγ1上的位置为参考，可以在一个或者多个选自256、290、298、312、326、330、333、334、339、360、378和430(根据Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，1991进行编号)的位置，将突变引入Fc区。优选的突变发生在选自298、333和334的一个或者多个位置。例如，可以引入丙氨酸替代。
抗体的ADCC活性还受到用于产生该抗体的特定细胞系的影响。例如在小鼠骨髓瘤细胞NS/0(或SP2/0细胞)中产生的抗体通常具有低ADCC，而在大鼠骨髓瘤YO细胞(或YB2/0细胞)中产生的抗体具有高ADCC(Lifely等人，(1995)，Glycobiology 5：813-822)。本领域已知用于抗体表达的细胞系的类型影响如下N连接的糖基链的碳水化合物结构，该链在相应于IgGγl的N297的位置附着在抗体的Fc区。在CHO细胞中产生的抗体的碳水化合物结构是岩藻糖基化的，而在YB2/0细胞中产生的抗体的碳水化合物链极大地缺乏岩藻糖(Shinkawa等人，(2003)JBC278：3466-3473)。在碳水化合物结构中缺少岩藻糖的抗体以更高的亲和力结合人Fc□RIIIa(Shields等人，(2002)JBC 277：26733-26740)。在某些实施方案中，具有本发明可变区的抗CD19抗体的特征为在抗体的Fc部分的N连接糖基化链中具有降低的岩藻糖基化。
改变抗体的血清半衰期也常常是有用的。抗体的血清半衰期(如免疫球蛋白融合蛋白的半衰期一样)受到抗体结合Fc受体(FcR)的能力的影响(Gillies等人，Cancer Research(1999)59：2159-66)。相比较于IgG1的那些CH2和CH3结构域，IgG2和IgG4的CH2和CH3结构域具有与Fc受体不可检测的或者降低的结合亲和性。因此，通过使用来自IgG2或IgG4同种型的CH2和/或CH3结构域可以增加本发明抗体的血清半衰期。作为备选，抗体可以包含来自IgG1或IgG3的CH2和/或CH3结构域，在这些结构域中有一个或者多个氨基酸的修饰，以降低针对Fc受体的结合亲和性(参见例如U.S.专利申请系列号09/256,156，以U.S.专利申请公开2003-0105294公布)。
Fc部分的铰链区一般邻近重链恒定区的CH1结构域的C末端。当包括在本发明的蛋白质中时，铰链区与天然发生的免疫球蛋白区同源，并且典型地包括如在天然免疫球蛋白中通过二硫键连接两个重链的半胱氨酸残基。在抗体工程，操作指南(ANTIBODY ENGINEERING，aPRACTICAL GUIDE)(Borrebaeck，编辑，W.H.Freeman和Co.，1992)可以发现人和小鼠免疫球蛋白的铰链区的代表性序列。
适合本发明的铰链区可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其它免疫球蛋白同种型。IgG1同种型在铰链区含有两个二硫键，允许有效的和稳定的二硫键形成。因此，本发明优选的铰链区衍生自IgG1。根据需要，IgG1铰链的第一个最N端的半胱氨酸可以被突变以增强本发明的抗体或者抗体融合蛋白的表达和组装(参见，例如U.S.专利申请系列号10/093,958，以U.S.专利申请公开2003-0044423公布)。
不同于IgG1，已知IgG4的铰链区不能有效地形成链间二硫键(Angal等人，(1993)，Mol.Immunol.30：105-8)。而且，IgG2铰链区含有四个二硫键，其倾向于在重组***中于分泌时促进寡聚化和可能地不正确的二硫键形成。对于本发明一个适合的铰链区可以衍生自IgG4铰链区，优选含有增强在重链衍生部分之间形成正确二硫键的突变(Angal等人，(1993)，Mol.Immunol.30(1)：105-8)。另一个优选的铰链区衍生自IgG2铰链区，其中前两个半胱氨酸各自突变为另外的氨基酸，例如，以一般优选的顺序排列：丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或者硒代半胱氨酸(参见，例如U.S.专利申请公开2003-0044423)。
融合到本发明的抗体可变区的Fc部分可以含有衍生自不同抗体同种型的CH2和/或CH3结构域和铰链区。例如，Fc部分可以含有IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域和IgG1的铰链区。这些杂合Fc部分的组装已经在U.S.专利申请公开2003-0044423中描述。
当融合至本发明的抗体可变区，Fc部分可以含有通常延长Fc融合蛋白的血清半衰期的一个或者多个氨基酸修饰。这样的氨基酸修饰包括基本上降低或者清除Fc受体结合或者补体结合活性的突变。例如，一类这样的突变移去免疫球蛋白重链的Fc部分的糖基化位置。在IgG1中，糖基化位置是Asn297(参见，例如U.S.专利申请序列号10/310,719，以U.S.专利申请公开2003-0166163公布)。
本发明的抗体可变区可以附着诊断剂和/或治疗剂。试剂可以被融合到抗体以产生融合蛋白。作为备选，试剂可以被化学偶联到抗体以产生免疫缀合物。试剂可以是例如毒素、放射标记、显影剂、免疫刺激部分等等。
本发明的抗体可变区可以附着细胞因子。优选的细胞因子包括白细胞介素，例如白细胞介素2(IL-2)，IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21和IL-23；造血因子例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和***；肿瘤坏死因子(TNF)例如TNFα；淋巴因子例如淋巴毒素；代谢过程调节剂例如瘦蛋白；干扰素例如干扰素α、干扰素β和干扰素γ，以及趋化因子。优选地，抗体-细胞因子融合蛋白或者免疫缀合物展示细胞因子的生物活性。在一个实施方案中，抗体可变区融合IL-2。优选地，在IL-2部分中的几个氨基酸被突变以降低毒性，如在U.S.专利申请公开2003-0166163中描述的。
任选地，蛋白质复合物可以进一步包括第二试剂，例如第二细胞因子。在一个实施方案中，B4 VHvx/VKvy抗体融合蛋白包括IL-12和IL-2。含有免疫球蛋白结构域和两个不同的细胞因子的蛋白质复合物的构建在U.S.专利号6,617,135中详细描述。
产生抗体
本发明的抗体以及其它含有可变区的蛋白质通过蛋白质工程领域中熟知的方法产生。能够表达包括本发明序列的重链和轻链的核酸载体被导入合适的细胞，并且重组蛋白质产物被表达和纯化。例如，本发明的抗体可以被工程化哺乳动物细胞系产生，例如NS/0细胞、CHO细胞、SP2/0细胞(SP2/0-Ag14；ATCC-CRL 1581)、YB2/0细胞(YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20；ATCC CRL-1662)，或者抗体生产领域熟知的其它哺乳动物细胞。在一个实施方案中，B4 VHvx/Vkvy抗体在NS/0细胞中生产。在另一个实施方案中，B4 VHvx/Vkvy抗体在YB2/0细胞中产生。作为备选，酵母、植物、昆虫细胞或者细菌可以被用于产生含有本发明可变区的蛋白质。
施用
本发明的抗体优选用于治疗具有B细胞紊乱(例如B细胞淋巴瘤)或者涉及B细胞组分的自身免疫病的患者，该自身免疫病是例如类风湿性关节炎、重症肌无力、多发性硬化、***性红斑狼疮等等。对于B细胞淋巴瘤，基于大夫的判断，治疗使用其它治疗方法失败的患者可能是有用的。例如，一些使用RituxanTM治疗的患者可能开始应答，但是RituxanTM抗性的癌症细胞可能出现。这样的患者一般应仍然对本发明的抗体产生应答。
在抗CD19抗体的情况中，由于正常的B细胞可能中和本发明的抗体，因此有时从身体清除这些细胞是有用的。RituxanTM可以根据标准的方法用于这个目的。作为备选，本发明的抗CD19抗体可以用于从身体清除正常的B细胞，例如在实施例5和实施例9中描述的。
输注是优选的施用方法。其它施用方法包括注射途径，例如皮下、皮内、肌内、腹膜内或者静脉内(推注)递送。吸入和口服递送也是可行的递送方法。
对于一个70kg的人，典型的剂量是在大约50毫克至2克的范围内，优选的剂量是在大约400-600毫克的范围。例如，可以大约每三周至六周重复一次施用，在此过程中监控正常B细胞和肿瘤细胞。
本发明的融合蛋白在治疗人疾病例如癌症中有用。当治疗癌症时，例如通过输注或者皮下注射以0.1-100毫克/平方米/患者的剂量施用包括本发明的可变区的抗体-IL-2融合蛋白是有用的。在优选的实施方案中，通过输注或者皮下注射以1-10毫克/平方米/患者的剂量施用包括本发明可变区的抗体-IL-2融合蛋白是尤其有用的，更优选以大约3-6毫克/平方米/患者的剂量施用包括本发明可变区的抗体-IL-2融合蛋白。
本发明的药物组合物可以以固体、半固体或者液体剂量形式使用，例如丸剂、胶囊、粉末、液体、悬浮液等等，优选适合精确剂量施用的单位剂量形式。组合物包括常规的药物载体或者赋形剂，另外还可以包括其它的药用试剂，药剂、载体、佐剂等等。这样的赋形剂可以包括其它的蛋白质，例如人血清白蛋白或者血浆蛋白质。制备这样的剂量形式的实际方法是本领域技术人员已知的或者将是显而易见的。待施用的组合物或者制剂在任何情况下，将含有可以在正在接受治疗的受试者中达到所期望效果的有效量的活性组分。
此组合物的施用可以通过任何对于表现出这样活性的活性剂而言可接受的施用模式进行。这些方法是局部或者全身施用。在药学上可接受的载体中的静脉注射是优选的施用方法。当然，活性化合物的施用量将取决于正在接受治疗的受试者、病情的严重程度、施用的方式和处方大夫的判断。
本发明通过下文的非限制性实施例做进一步的说明。
实施例1.含有本发明的重链和轻链可变区的抗CD19抗体的构建
使用标准的遗传工程技术将编码本发明的重链区和轻链区的核酸序列导入合适的哺乳动物表达载体。实例性的克隆策略如下描述。表达载体pdHL12是经工程化而含有单限制性内切酶位置的新近一代表达载体pdHL，所述位置用于***编码重链和轻链可变区的核酸盒子。pdHL12被设计为可以接受Nhe I/Hind III片段形式的编码重链可变区的核酸、和AfI II/Bam HI片段形式的编码轻链可变区的核酸，并且被设计为共表达完整的抗体重链和轻链(参见，例如US专利申请2003/0157054)。
从头合成本发明的重链可变区的核酸序列(其侧翼序列具有内切核酸酶限制识别序列5′-CTTAAGC-3′(上游，含有Nhe I位置)和5′-CGTAAGTGGATCC-3′(下游，含有Hind III位置))，并将该序列***pUC载体衍生的载体质粒(Blue Heron Biotechnology，Bothell，WA)。该核酸从载体质粒以Nhe I/Hind III片段切离并连接到同样酶消化的pdHL12质粒的合适的载体片段上。显示了B4 VH0(SEQ ID NO：1)、B4VHv1(SEQ ID NO：2)、B4 VHv2(SEQ ID NO：3)、B4 VHv3(SEQ IDNO：4)、B4 VHv4(SEQ ID NO：5)、B4 VHv5(SEQ ID NO：6)和B4 VHv6(SEQ ID NO：7)的核酸序列。
相似地，从头合成本发明的轻链可变区的核酸，其侧翼序列具有内切核酸酶限制识别序列5′-GCTAGCTCCAGC-3′(上游，含有AfI Il位置)和5′-GGTAAGCTT-3′(下游，含有Bam HI位置)，并将该核酸***pUC载体衍生的载体质粒(Blue Heron Biotechnology、Bothell，WA)。该核酸从载体质粒以AfI II/Bam HI片段切离并连接到同样酶消化的pdHL12质粒的合适的载体片段上。显示编码B4 VK0(SEQ ID NO：8)、B4 VKv1(SEQID NO：9)、B4 VKv2(SEQ ID NO：10)、B4 VKv3(SEQ ID NO：11)和B4 VKv4(SEQ ID NO：12)的核酸序列。
通过将编码不同重链和轻链可变区的核酸序列组合地***到pdHL12，产生编码本发明B4抗体，B4 VHvx/VKvy的一组质粒。
实施例2表达和纯化本发明的抗体
下述的一般的技术用于随后的实施例。
1A.细胞培养和转染
为了在哺乳动物细胞中瞬时表达抗体，通过将质粒DNA和磷酸钙共沉淀将质粒DNA导入人胚胎肾293细胞，或者幼仓鼠肾细胞(BHK)，在无(用于维持质粒的)选择的情况下培养细胞[Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.]。
通过多种标准方法之一获得稳定转染的克隆，例如通过电穿孔或者nucleofection方法。如下实施DNA电穿孔导入小鼠骨髓瘤NS/0细胞。NS/0细胞在补加有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1x青霉素/链霉素的Dulbecco氏修饰Eagle氏培养基(DMEM，Life Technologies)中生长。使用PBS洗涤大约5×106个细胞一次，并且重悬于0.5ml磷酸缓冲液(PBS)中。然后将10毫克线性化质粒DNA与细胞在Gene PulserCuvette(0.4cm电极距，BioRad)中冰上孵育10分钟。使用设置为0.25V和microF的Gene Pulser(BioRad)实施电穿孔。允许细胞在冰上恢复10分钟，之后将细胞重悬于生长培养基中，然后铺于两个96孔板上。通过在含有100nM氨甲蝶呤(MTX)的培养基中生长而选择稳定转染的克隆，氨甲蝶呤在转染后两天加入。每3天饲喂细胞一次，进行两至三次或更多次，通常MTX抗性的克隆在2至3周内出现。通过抗人Fc ELISA检测来自克隆的上清液，以鉴定高的生产株[Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125：191]。分离高生产克隆并且在含有100nM MTX的生长培养基中增殖所述克隆。
相似地，通过基本相同的方法可以使用其它细胞系获得稳定转染克隆，例如CHO细胞，BHK细胞，SP2/0细胞和YB2/0细胞。当使用YB2/0细胞时，通常通过在存在50nM MTX的情况下的生长来选择稳定转染的克隆。
稳定转染的克隆(例如来自大鼠骨髓瘤YB2/0细胞)也通过nucleofection方法获得。生长在补加有热灭活10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1x青霉素/链霉素的Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基(DMEM)中的大约2×106个YB2/0细胞，室温90xg离心10分钟并重悬于100μl补加的Nucleofector溶液V中。100μl的细胞悬液与2μg的线性化质粒DNA(在β-内酰胺酶序列中的Fsp I位置线性化)混合，转移至杯(Amaxa)中，然后使用合适的Nucleofector(Amaxa)程序Q-20实施nucleofection。添加500μl预热的培养基，并且将样品转移到12孔板的孔中。转染后一天，在生长培养基中重悬细胞并且以大约10个细胞/孔至大约600个细胞/孔的密度铺于96孔板中。通过在存在50nM氨甲蝶呤(MTX)时的生长而选择稳定转染的克隆，氨甲蝶呤在转染后两天加入。每2或3天饲喂细胞，进行两次或更多次，MTX抗性克隆通常在2至3周内出现。通过抗人Fc ELISA检测来自克隆的上清液，以鉴定高的生产株[Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125：191]。分离高生产克隆并且在含有50nM MTX的生长培养基中增殖所述克隆。
细胞可以在本领域已知的备选的培养基中生长，例如在补加2.5％胎牛血清和100nM氨甲蝶呤的HSFM中或者在无蛋白质培养基(例如CD培养基)中生长。
1B.ELISA
可以使用不同的ELISA确定在MTX抗性克隆的上清和其它受试样品中的蛋白质产物的浓度。例如，使用抗-huFc ELISA以检测含人Fc的蛋白质(例如嵌合抗体)的量，以及使用抗-huκELISA以检测(嵌合或者人免疫球蛋白的)κ轻链的量。
下文详细描述抗-huFc ELISA。
A.包被板
使用PBS中浓度为5μg/ml的AffiniPure山羊抗人IgG(H+L)(Jacksonlmmuno Research)包被ELISA板，在96孔板中每孔使用100μl(Nunc-lmmuno plate Maxisorp)。覆盖包被的板并且在4℃过夜孵育。然后使用含有0.05％Tween(Tween 20)的PBS洗涤板四次，并使用每孔200μl含有1％BSA/1％山羊血清的PBS封闭板。在37℃与封闭缓冲液孵育2小时之后，使用含有0.05％Tween的PBS洗涤板4次，并且在吸水纸上拍干。
B.与受试样品和二抗孵育
在样品缓冲液中将受试样品稀释到合适的浓度，样品缓冲液在PBS中含有1％BSA/1％山羊血清/0.05％Tween。使用浓度已知的嵌合抗体(具有人Fc)制作标准曲线。为了制作标准曲线，在样品缓冲液中进行系列稀释以提供范围从125ng/ml至3.9ng/ml的标准曲线。将稀释的样品和标准以100μl/孔加入板中，并将板在37℃孵育2个小时。
孵育之后，使用含有0.05％Tween的PBS洗涤板8次。然后每孔加入100μl的在样品缓冲液中以大约1∶120,000稀释的二抗，即辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG(Jackson lmmuno Research)。必须针对每批次的HRP缀合的抗人IgG确定二抗的确切稀释度。37℃孵育2个小时后，使用含有0.05％Tween的PBS洗涤板8次。
C.显色
以100μl/孔将底物溶液加入板中。通过将30mg邻苯二胺二盐酸盐(OPD)(一片)溶解在15ml含有新鲜加入的0.03％H2O2的0.025M柠檬酸/0.05M Na2HPO4缓冲液(pH5)中而制备底物溶液。在室温下，暗室中，允许显色30分钟。取决于包被的板的批次差异、二抗等等，改变显色的时间。观察标准曲线中的颜色显现以确定何时停止反应。通过每孔加入100μl4N H2SO4终止反应。在平板读数器上读取板的数据，读数器设置在490nm和650nm，并且设置程序以从490nm的OD中减去650nm的背景OD。
除了使用的二抗是辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-huκ(SouthernBiotechnology Assoc.Inc.，Birmingham，Ala.)的1∶4000稀释物之外，抗-huκELISA遵循上文描述的相同的方法进行。
纯化
标准的抗体纯化方法如下。典型地，基于Fc部分对蛋白质A的亲和力，通过蛋白质A层析从细胞培养物上清中纯化本发明的B4 VHvx/VKvy抗体组合物。将来自表达B4 VHvx/VKvy抗体组合物的细胞的条件上清装载于预先平衡的Fast-Flow Protein A Sepharose柱上。使用磷酸钠缓冲液(中性pH的50mM磷酸钠，150mM NaCl)彻底洗涤柱。通过使用低pH(pH2.5-3)的磷酸钠缓冲液(如上的组成)洗脱结合的蛋白质，并且洗脱的级分立即使用1M Tris碱中和至大约pH6.5。将组合物储存在补加Tween 80至0.01％的pH6.5的50mM磷酸钠，150mM NaCl中。
通过HPLC大小排阻层析和SDS-PAGE常规检测产物的纯度和完整性。结果显示典型地大于90％的本发明的B4 VHvx/VKvy抗体是未聚集的和完整的，几乎没有降解产物的迹象。
实施例3确定本发明的B4抗体与CD-19呈递细胞的相对结合亲和性
为了确定本发明的抗体保留结合CD19的能力，使用竞争实验，在实验中检测这些抗体抑制标记的亲本B4抗体(B4 VH0/VK0)与携带CD19抗原的Daudi淋巴瘤细胞结合的强度。
使用EZ-连接Sulfo-NHS-LC-生物素酰化试剂盒(Pierce，#21430)，根据提供的方法制备生物素标记的B4 VH0/VK0抗体。使用Slide-a-lyzer(Pierce，#66425)透析产物并且使用HPLC大小排阻层析分析产物。
简而言之，生物素标记的B4 VH0/VK0抗体以100ng/ml的终浓度与在PBS/2％血清缓冲液中的800ng/ml，400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml和50ng/ml未标记的实验B4 VHvx/VKvy抗体之一预先混合而制备滴定系列。作为对照，生物素标记的抗体与如上描述的相同浓度的未标记B4VH0/VK0抗体预先混合(抑制对照)，或者仅仅与缓冲液预先混合(阳性结合对照)。将组合的抗体加入Daudi细胞在4℃孵育30分钟。1∶200稀释的FITC标记的链霉抗生物素加入细胞并且样品在4℃再孵育30分钟。通过FACS分析定量标记的B4 VH0/VK0抗体的结合量，并且结果表示为相对于阳性结合对照的“抑制的百分数”。检测的抗体是B4 VH0/VK0(C)、B4 VHv1/VKv1(1)、B4 VHv2/VKv1(2)、B4 VHv1/VKv2(3)、B4VHv2/VKv2(4)、B4 VHv3/VKv3(5)、B4 VHv4/VKv3(6)、B4 VHv3/VKv4(7)、B4 VHv4/VKv4(8)、B4 VHv5/VKv4(9)和B4 VHv6/VKv4(10)。
表3和表4显示了两个实验的代表性结果。
表3：本发明的抗体对生物素-B4 VH0/VK0结合Daudi细胞的抑制
表4：本发明的抗体对生物素-B4 VH0/VK0结合Daudi细胞的抑制
Figure S2006800498114D00312
如在表3和表4中显示的，发现B4 VHvx/VKvy抗体以与未标记的B4 VH0/VK0抗体相似的程度抑制标记的B4抗体与Daudi细胞的结合，表明B4 VHvx/VKvy抗体的亲和性与B4 VH0/VK0抗体的亲和性相似。
实施例4：本发明抗体的ADCC活性
检测了由多种细胞系产生的本发明抗体介导的ADCC活性。如本领域实践的，通过标准的51Cr释放试验确定ADCC。制备一系列的抗体稀释液(100ng/ml至0.025ng/ml的4倍稀释)，通过相对于总细胞51Cr的特异51Cr释放(针对自发释放的51Cr进行调整)，检测在抗体存在情况下，纯化的人PBMC(效应细胞)对51Cr标记的Daudi细胞(靶细胞；E∶T是100∶1)的裂解。检测了产生自人胚肾293T细胞或者YB2/0细胞的B4VHv4/VKv4抗体，以及产生自NS/0细胞系或者产生自YB2/0细胞的B4VHv5/VKv5抗体。
图38显示这样的实验的结果。从YB2/0细胞表达获得的两种抗体在介导ADCC中具有同样的活性，并且该活性比从NS/0细胞系或者293T细胞表达获得的对应抗体的活性高至少50倍。由293T细胞产生的B4VHv4/VKv4比由NS/0细胞系产生的B4 VHv5/VKv4具有更高的活性。
实施例5通过本发明的抗体耗竭移植入SCID小鼠的人B细胞
在许多治疗中耗竭B细胞是有用的。例如，可以使用本发明的抗体治疗抗体驱动的自身免疫病和炎症疾病，以降低或者基本上清除B细胞。作为备选，当使用肿瘤靶向试剂(例如ZevalinTM或BexxarTM或Leu16-IL2融合蛋白(WO2005/016969)治疗时，首先清除正常的B细胞是有用的。
为了检测本发明的抗体是否能被用于耗竭人B细胞，实施下述实验。在第0天，基本上遵循针对转移人脾细胞而描述的方法(Yacoub-Youssef等人，Transpl.Immunol.(2005)15：157-164)，使用纯化的人PBMC移植雄性SCID CB17小鼠(n＝3)，其中腹膜内注射0.2ml的PBS中大约4.5×107个细胞。第三天，使用PBS或者50μg抗CD20抗体Leu16或者K4H4抗CD19抗体腹膜内注射小鼠。通过人IgM ELISA定量试剂盒(BethylLaboratories；Cat#E80-100)在第7天、14天和21天检测人IgM的水平。
图39显示了典型的结果。在PBS处理对照中，人IgM的滴度稳定增加，在第42天达到大约800μg/ml。在使用Leu16或B4 VHv5/VKv4抗体处理的小鼠中，基本上没有人IgM滴度存在，表明这些抗体处理耗竭了人B细胞。
实施例6使用本发明的抗体治疗携带淋巴瘤的哺乳动物
为了检测本发明的抗体是否在体内有功能，在人淋巴瘤的动物模型中检测由YB2/0细胞表达的B4 VHv4/VKv4。第0天，使用大约1×106活“那马瓦”Nalm-6-UM-1细胞静脉注射八周龄SCID CB17小鼠(n＝6)。在第1、3和5天，使用500μg抗体或者PBS腹膜内注射小鼠。大约每周一至两次检测小鼠，以观察哪只小鼠患病达到足够需要安乐死的程度。
图40显示这个实验的典型结果。使用PBS处理的所有的小鼠在注射肿瘤细胞10周内患病，而使用B4 VHv4/VKv4抗体处理的小鼠在较后的时间里患病，并且在30周的整个实验过程中，这个组6只小鼠中的3只保持健康。
实施例7：使用本发明的抗体联合化学疗法而治疗携带Burkitt淋巴瘤 的哺乳动物
为了检测本发明的抗体是否可以在体内与化学治疗联合使用，在人淋巴瘤动物模型中检测B4 VHv4/VKv4抗体，该模型比在先的实施例中的模型更严苛，对应于淋巴瘤的更晚期或者更难治疗形式。在一个代表性的实验中，使用在YB2/0细胞中表达的B4 VHv4/VKv4抗体与或者不与环磷酰胺(CPA)处理Daudi细胞系(其是Burkitt淋巴瘤细胞系)。在第0天，使用大约5×106个活Daudi细胞静脉注射八周龄SCID CB17小鼠(n＝6)。在第8天和第12天，使用100μg抗体或者PBS处理小鼠。在第7天，使用PBS或者每千克体重75μg CPA处理小鼠。处理以腹膜内施用0.2ml进行。大约每周一次至两次检测小鼠，以观察哪只小鼠患病达到足够安乐死的程度。
图41显示了典型实验的结果。在没有使用抗体或者CPA处理的对照组中，在注射淋巴瘤细胞4周内所有的小鼠都患病。在单独使用抗体B4VHv4/VKv4或者CPA处理的小鼠组中，6只小鼠中的5只在至少5周是健康的，但是在大约6周内患病。在使用B4 VHv4/VKv4抗体和CPA两者处理的小鼠组中，所有的小鼠持继至少8周保持健康。
实施例8本发明的抗体联合化学疗法治疗弥散性淋巴瘤疾病
在另一组实验中，除了使用2×106个细胞而非1×106个细胞之外，如在先实施例描述将那马瓦细胞静脉注射入小鼠。这种增加数目的细胞导致更具有攻击性的疾病过程，如通过比较图40中的PBS处理的小鼠(在5至10周内患病)和图42中的PBS处理的小鼠(所有的小鼠在三周内患病)所显示的。在第3、7和11天，使用500μg的抗体或者PBS腹膜内处理小鼠(n＝5)。也使用环磷酰胺(75mg/kg，i.p.)或者长春花新碱(0.4mg/kg，i.V.)或者阿霉素(3mg/kg，i.V.)或者PBS(i.v.)在第3、7和11天处理小鼠。结果在图42(a-c)中显示。结果表明这三种化疗剂的每种都可以与本发明的抗体联合使用。
实施例9使用本发明的抗体和方法治疗人患者
如下使用本发明的抗CD19抗体治疗人疾病和紊乱。一般地，尽管皮下注射、吸入、口服和其它方法也可以使用，但优选的施用方法是通过静脉输注或者静脉注射。尽管施用的频率可以根据患者的需要而改变，但是可以大约每2、3或者4周施用1次。典型的剂量是成人大约100至800mg。针对可能由免疫抑制导致的感染，监视治疗的患者的感染征兆。
例如，采用本发明的抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体，以大约8mg/kg的剂量，大约每两周点滴输注约1个小时而施用一次，治疗患有巨大***增生症(Castleman′s disease)的患者。
采用抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体，以大约8mg/kg的剂量，大约每四周点滴输注大约1个小时而施用一次，治疗患有类风湿性关节炎的患者。甚至当与减轻疾病的抗风湿性药物比较时，也可以发现关节破坏的进程被单一疗法显著地抑制。
采用抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体，以大约8mg/kg的剂量，大约每四周点滴输注大约1个小时而施用一次，治疗患有克隆病(crohn’s disease)的患者。
采用抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体，以大约8mg/kg的剂量，大约每三周点滴输注大约1个小时而施用一次，治疗患有多发性骨髓瘤的患者。抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体的治疗可以按大夫确定的适合患者的方式与用于治疗多发性骨髓瘤的标准护理疗法联合使用。
采用抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体，以大约8mg/kg的剂量，大约每三周点滴输注大约1个小时而施用一次，治疗患有B细胞淋巴瘤的患者，根据需要，与抗体例如RituxanTM联合使用(剂量为大约每平方米身体表面积375毫克，每周施用)，或者与抗CD22抗体epratuzumab联合使用。作为备选，在患者具有顽固性淋巴瘤的情况中，使用抗CD19 B4VHv4/VKv4抗体与放射免疫缀合物(例如BexxarTM或ZevalinTM)联合治疗。
更特别地，采用抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体，以大约8mg/kg的剂量，大约每三周点滴输注大约1个小时而施用一次，治疗患有B细胞淋巴瘤的患者，根据需要，与化疗方案联合使用，例如环磷酰胺+长春花新碱+阿霉素+***龙(“CHOP”)，或者CHOP+博来霉素，或者CHOP+依托泊苷，或者米托蒽醌+长春花新碱+噻替哌，或者依托泊苷+***龙+阿糖胞苷+顺铂，或者美司纳+异环磷酰胺+米托蒽醌+依托泊苷，或者宾达氮芥，或者fludaribin和2-CdA。
在备选的治疗策略中，首先使用剂量为大约8mg/kg的抗CD19 B4VHv4/VKv4抗体治疗B细胞淋巴瘤的患者，之后再使用例如在WO2005/016969中公开的抗CD20-IL2融合蛋白治疗。例如，第一天使用抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体，以点滴输注大约1个小时施用治疗患者，然后在第2天和第4天以大约150μg/kg的剂量，点滴输注约4小时而施用抗CD20-IL2融合蛋白，并且大约每3周重复此循环。不希望受理论的限制，抗CD19 B4 VHv4/VKv4抗体具有从患者中清除大部分的正常B细胞的效果，从而使得抗CD20-IL2融合蛋白可以通过结合剩余的肿瘤细胞而发挥其作用。
Figure IAB00000000000171411500021
Figure IAB00000000000171411500031
Figure IAB00000000000171411500051
Figure IAB00000000000171411500061
Figure IAB00000000000171411500071
Figure IAB00000000000171411500081
Figure IAB00000000000171411500091
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Figure IAB00000000000171411500161
Figure IAB00000000000171411500171

Claims (7)

1.改变的抗CD19抗体，其改变自特征在于SEQ ID NO：13的重链可变区和SEQ ID NO：25的轻链可变区的鼠抗CD19B4抗体，其中所述改变的抗体(i)当向人施用时，比所述未改变的亲本抗体具有较低的免疫原性，但是仍然有能力特异结合CD19，并且有能力靶向表达CD19的细胞，(ii)包含SEQ ID NO：17的重链可变区和SEQ ID NO：29的轻链可变区，且(iii)通过从YB2/0或HEK 293T细胞表达而获得。
2.编码权利要求1的改变的抗CD19抗体的DNA分子。
3.包含权利要求2的DNA分子的表达载体。
4.表达权利要求1的改变的抗CD19抗体的宿主细胞。
5.权利要求4的宿主细胞，其为YB2/0或HEK 293T细胞。
6.用于清除B细胞或者治疗淋巴瘤的药物组合物，其包含药学有效量的权利要求1的改变的抗体，以及任选地可药用稀释剂、载体或赋形剂。
7.权利要求6的药物组合物在制备用于清除B细胞或者治疗淋巴瘤的药物中的用途。
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