CN110114089A - 组合中的抗cd40抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了利用与另一种免疫调节剂组合的激动性抗CD40抗体的方法和相关组合物，所述免疫调节剂例如免疫检查点抑制剂(例如，PD‑1抑制剂、PD‑L1抑制剂、CTLA‑4抑制剂或VISTA抑制剂)和/或先天免疫活化剂(例如，TLR‑4激动剂)。所述高亲和力抗CD40抗体组合可以用于治疗癌症和其它疾病的多种治疗方法中的任何一种。特别地，公开了所述抗CD40抗体APX005M与免疫检查点抑制剂或先天免疫活化剂的组合。

Description

组合中的抗CD40抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月2日提交的美国临时申请第62/416,554号的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入说明书。含有序列表的文本文件的名称是APEX_018_01WO_ST25.txt。所述文本文件为7KB，于2017年11月2日创建，并经由EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本发明一般涉及与其它免疫调节剂(例如，免疫检查点抑制剂和先天免疫活化剂)组合的激动性抗CD40抗体及其使用方法。此类组合可用于例如治疗各种肿瘤疾病的方法中。
背景技术
T细胞的完全活化需要两种不同但却协同的信号。通过T细胞抗原受体递送的第一信号由APC上的抗原和MHC复合物提供，并且负责免疫应答的特异性。第二或共刺激信号是通过CD28与B7-1(CD80)/B7-2(CD86)和CD40与CD40L的相互作用的，这是产生满刻度T细胞应答所必需的。在不存在共刺激信号的情况下，T细胞在抗原刺激时可能经历无应答性(无反应性)或程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
CD40不仅由正常免疫细胞表达，而且由许多恶性细胞表达。特别地，CD40在B系非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金病(Uckun FM、Gajl-Peczalska K、Myers DE等人，《血液(Blood)》，1990；76:2449–2456；O'Grady JT、Stewart S、Lowrey J等人，《美国病理学杂志(Am J Pathol)》，1994；144:21–26)、多发性骨髓瘤(Pellat-Deceunynck C、Bataille R、Robillard N、Harousseau JL、Rapp MJ、Juge-Morineau N、Wijdenes J、Amiot M，《血液(Blood)》，1994；84(8):2597-603)、以及膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和恶性黑素瘤(Young LS、Eliopoulos AG、Gallagher NJ等人，《当代免疫学(Immunol Today)》，1998；19:502–6；Ziebold JL、Hixon J、Boyd A等人，《免疫实验治疗档案(Warsz)(Arch Immunol Ther Exp(Warsz))》，2000；48:225–33；Gladue R、Cole S、Donovan C等人，《临床肿瘤学杂志(J ClinOncol)》，2006；24(18S):103s)中过表达。
已显示CD40信号转导的活化直接抑制肿瘤，拯救荷瘤宿主中抗原呈递细胞的功能，并触发或恢复针对肿瘤相关抗原的主动免疫应答。据报道，CD40激动剂克服荷瘤小鼠的T细胞耐受性，引发针对肿瘤相关抗原的有效细胞毒性T细胞应答，并增强抗肿瘤疫苗的效力(Eliopoulos AG、Davies C、Knox PG等人，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》，2000；20(15):5503–15；Tong AW、Papayoti MH、Netto G等人，《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》，2001；7(3):691–703)。
然而，本领域仍然需要治疗癌症的治疗组合物和相关方法，其活化树突细胞并增强免疫监视以提供改善的抗癌特性。
发明内容
本发明提供了利用与另一种免疫调节剂组合的激动性抗CD40抗体(例如，APX005或APX005M)的方法和相关组合物，所述免疫调节剂例如免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂或VISTA抑制剂)和/或先天免疫活化剂(例如，TLR-4激动剂)。
本公开的一个方面提供了一种用于治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制癌细胞的增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制肿瘤的生长的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导针对癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患者中活化树突细胞的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于在患者中活化抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
本公开的另一方面提供了一种用于活化抗原呈递细胞的方法，其包括使树突细胞与抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂接触。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中增加T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)产生的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制癌细胞的增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制肿瘤的生长的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导针对癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患者中活化树突细胞的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于在患者中活化抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
本公开的另一方面提供了一种用于活化抗原呈递细胞的方法，其包括使树突细胞与抗CD40抗体和TLR-4激动剂接触。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中增加T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)产生的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
本公开的一个方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和PD-1抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一个实施例中，PD-1抑制剂是纳武单抗或帕博利珠单抗。
本公开的另一方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和PD-L1抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施例中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗。
本公开的一个方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和CTLA-4抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，CTLA-4抑制剂是抗CTLA-4抗体。在一个实施例中，CTLA-4抑制剂是依匹单抗。
本公开的另一方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和VISTA抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，VISTA抑制剂是抗VISTA抗体。
本公开的一个方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS或MPLA。在另一个实施例中，TLR-4抗体是NI-0101。
附图说明
图1是线图，其示出了在存在APX005M、APX005M和抗PD-1抗体、APX005M和抗PD-L1抗体、同型对照抗体和抗PD-1抗体、或同型对照抗体和抗PD-L1抗体的情况下的CD8+ T细胞的增殖。
图2示出了通过APX005M与抗PD-1或抗PD-L1抗体的组合来增强CD8+ T细胞应答。图2A示出了T细胞增殖的线图。图2B是示出了分泌的IFN-γ的线图。
图3是条形图，其示出了T细胞的IFN-γ产生。
图4是线图，其示出了用不同抗CD40抗体进行的CD8+ T细胞增殖。
图5是条形图，其示出了与1)用CD40激动性抗体或同型对照培养的DC和2)抗PD-L1抗体或对照抗体共培养之后的CD8+ T细胞的IFN-γ产生。
图6是条形图，其示出了与1)用CD40激动性抗体或同型对照培养的DC和2)抗PD-1抗体共培养之后的CD8+ T细胞的IFN-γ产生。
图7是柱状图，其示出了在存在APX005M、APX005M和抗PD-1抗体、APX005M和抗PD-L1抗体、同型对照抗体和抗PD-1抗体、或同型对照抗体和抗PD-L1抗体的情况下的CD4+ T细胞的IFN-γ产生。
图8是柱状图，其示出了用所示的病毒肽(CMV)和APX005M和/或抗PD-L1抗体体外培养五天的PBMC的IFN-γ产生。
图9是条形图，其示出了与APX005M和/或抗PD-1抗体进行混合淋巴细胞反应的CD4+ T细胞增殖。
图10是条形图，其示出了与APX005M和/或抗CTLA4抗体进行混合淋巴细胞反应的CD4+ T细胞增殖。
图11A和11B示出了由APX005M和/或TLR-4激动剂诱导的DC活化。图11A是条形图，其示出了由APX005M和/或LPS诱导的DC的IL-12产生。图11B是条形图，其示出了由APX005M和/或LPS诱导的DC的TNFα产生。
图12A和12B是线图，其示出了在存在或不存在APX005M(剂量滴定10nM，3倍稀释，8个数据点)和人抗VISTA抗体h29G7和h14D8(均为100nM)的情况下用DC培养6天的CD4+ T细胞的IFN-γ产生。还示出了IgG1同型对照抗体。示出了来自两个示例性实验的结果。
图13A和13B是柱状图，其示出了在存在或不存在抗VISTA抗体(h29G7和h14D8)(仅以指示浓度或与10ng/ml APX005M组合)的情况下用100ng/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的PBMC的IFN-γ产生。数据被呈现为同型对照的百分比。
序列的简要说明
SEQ ID NO:1是APX005和APX005M抗CD40抗体的VHCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是APX005和APX005M抗CD40抗体的VHCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是APX005和APX005M抗CD40抗体的VHCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是APX005和APX005M抗CD40抗体的VLCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是APX005和APX005M抗CD40抗体的VLCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是APX005和APX005M抗CD40抗体的VLCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是APX005和APX005M抗CD40抗体的VH区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是APX005和APX005M抗CD40抗体的VL区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是人IgG1重链恒定区的氨基酸序列，其包括具有APX005M抗CD40抗体的S267E取代的Fc区。
具体实施方式
本公开一般涉及治疗方法和相关组合物，所述治疗方法包括施用激动性抗CD40抗体(例如，APX005或APX005M)和免疫调节剂(例如，免疫检查点抑制剂或先天免疫活化剂)。
除非特别相反地指示，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中许多方法在下文中为了说明的目的而描述。此类技术在文献中有充分说明。参见例如《现代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》或《现代免疫学实验指南(CurrentProtocols in Immunology)》，John Wiley&Sons，纽约，纽约州(2009年)；Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》，第3版，Wiley&Sons，1995年；Sambrook和Russell，《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》(第3版，2001年)；Maniatis等人，《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》(1982年)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A PracticalApproach)》，第I卷和第II卷(D.Glover编辑)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(N.Gait编辑，1984年)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑，1985年)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑，1984年)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑，1986年)；Perbal，《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984年)和其它类似参考文献。
如在本说明书和所附权利要求中使用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”或变体(例如，“comprises”或“comprising”)将被理解为暗示包含所述元素或整数或元素或整数组，但不排除任何其它元素或整数或元素或整数组。
除非另外明确说明，否则本说明书中的每个实施例在做出必要的修正后可适用于每个其它实施例。
可以使用标准技术来进行重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书进行，或者如本领域所通常实现或如本文所述进行。这些和相关的技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述进行。除非提供具体的定义，否则本文所述的与分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医药化学连同使用的术语以及此类领域的实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。标准技术可用于重组技术、分子生物学/微生物学/化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送以及患者的治疗。
本发明的实施例涉及结合到CD40的抗体，例如APX005和APX005M(参见例如WO2012/149356和WO 2014/070934，其公开内容整体并入本文)。特别地，APX005和APX005M以极其高的亲和力特异性结合到CD40，增强CD40信号转导活性，活化免疫***，活化抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)并且具有治疗与异常表达CD40相关的疾病的治疗效用。APX005和APX005M是特异性结合人CD40的人源化抗体，并且由相同的兔抗CD40抗体生成。APX005和APX005M分别包括SEQ ID NO:1-6的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。APX005和APX005M的人源化VH和VL氨基酸序列分别包括SEQ ID NO:7和8。APX005M在第267位包括修饰的Fc区(EU编号；参见例如Edelman,G.M.等人，1969年，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.USA)》，63,78-85；还参见免疫遗传学(IMGT)数据库网站@imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering)。具体地，APX005M包括S267E取代(Li Fu、Ravetch JV，2011年，《科学(Science)》，333:1030；还参见《免疫学杂志(J.Immunol.)》，2011,187:1754-1763；《单抗(mAbs)》，2010,2:181-189)。APX005M重链恒定区氨基酸序列包括SEQ ID NO:9。
如本领域所熟知，抗体是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个表位识别位点特异性结合到靶标(例如，碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文使用，所述术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖其片段(例如，dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其合成变体、天然存在的变体、包括具有抗原结合片段(具有所需特异性)的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、以及包括具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型。“双抗体”，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，90 6444-6448,1993)，也是本文考虑的特定形式的抗体。本文还包含包括与CH3结构域连接的scFv的微抗体(S.Hu等人，《癌症研究(Cancer Res.)》，56,3055-3061,1996)。参见例如Ward,E.S.等人，《自然(Nature)》，341,544-546(1989年)；Bird等人，《科学(Science)》，242,423-426,1988；Huston等人，《美国科学院院报(PNAS USA)》，85,5879-5883,1988)；PCT/US92/09965；WO94/13804；P.Holliger等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，90 6444-6448,1993；Y.Reiter等人，《自然生物技术(Nature Biotech)》，14,1239-1245,1996；S.Hu等人，《癌症研究(CancerRes.)》，56,3055-3061,1996。
如本文使用的术语“抗原结合片段”是指含有与目标抗原(例如，CD40、PD-1、PD-L1和CTLA-4)结合的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段。在这方面，本文描述的抗体的抗原结合片段可以包括抗体的1个、2个、3个、4个、5个或所有6个CDR。此外，本文描述的抗体的抗原结合片段可以包括抗体VH和VL序列。本文描述的CD40特异性抗体的抗原结合片段能够结合到CD40。在某些实施例中，抗原结合片段或包括抗原结合片段的抗体阻止或抑制CD40L与CD40的结合。在某些实施例中，抗原结合片段特异性结合到人CD40和/或增强或调节人CD40的生物学活性。此生物活性包含但不限于细胞信号转导、树突细胞的活化，
术语“抗原”是指分子或分子的一部分，其能够被选择性结合剂(例如，抗体)结合，并且另外能够在动物中使用以产生能够结合到此抗原的表位的抗体的。抗原可以具有一个或多个表位。
术语“表位”包含能够特异性结合到免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇(优选多肽决定簇)。表位是被抗体结合的抗原的区域。在某些实施例中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团(例如，氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，并且在某些实施例中可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施例中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，称抗体特异性结合抗原。当平衡解离常数≤10-7或10-8M时，称抗体特异性结合抗原。在一些实施例中，平衡解离常数可以≤10-9M或≤10- 10M。
在某些实施例中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包含重链和轻链CDR组，其分别***重链和轻链骨架区(FR)组之间，所述重链和轻链骨架区组为CDR提供支持并限定CDR相对于彼此的空间关系。如本文使用，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含六个CDR，包括来自重链和轻链V区中的每一个的CDR组。包括单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。多个抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3接触。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
如本文使用，术语“FR组”是指构成重链或轻链V区的CDR组的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可能与结合的抗原接触；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，特别是与CDR直接相邻的FR残基。在FR内，某些氨基酸残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列含有约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当V区折叠成结合位点时，CDR被显示为突出的环基序，其形成抗原结合表面。通常认为，无论精确的CDR氨基酸序列如何，都会存在FR的保守结构区，其影响CDR环折叠成某些“规范”结构的折叠形状。此外，已知某些FR残基参与非共价结构域间接触，其稳定抗体重链和轻链的相互作用。
免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以参考Kabat,E.A.等人，《免疫相关蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第4版，美国卫生与公众服务部，1987年及其更新(现在可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得)来确定。
“单克隆抗体”是指同质性抗体群，其中单克隆抗体由参与表位的选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)构成。针对单个表位，单克隆抗体是高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且还涵盖其片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其变体，包括抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、以及包括具有所需特异性和结合到表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型。关于抗体的来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)，不旨在是限制性的。所述术语包含全免疫球蛋白以及上文在“抗体”定义下描述的片段等。
蛋白水解木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中两个(F(ab)片段)各自包括共价异二聚体，其包含完整的抗原结合位点。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包含F(ab')2片段，其包括两个抗原结合位点。根据本发明某些实施例使用的Fv片段可以通过IgM的优先蛋白水解切割产生，并且在极少数情况下可以通过IgG或IgA免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生。然而，Fv片段更常用本领域已知的重组技术取得。Fv片段包含非共价VH::VL异二聚体，包含抗原结合位点，其保留了天然抗体分子大部分的抗原识别和结合能力。Inbar等人(1972年)，《美国科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》，69:2659-2662；Hochman等人(1976年)，《生物化学(Biochem)》，15:2706-2710；和Ehrlich等人(1980年)，《生物化学(Biochem)》，19:4091-4096。
在某些实施例中，考虑了单链Fv或scFv抗体。例如，κ抗体(Ill等人，《蛋白质工程(Prot.Eng.)》，10:949-57(1997)；微抗体(Martin等人，《欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ)》，13:5305-9(1994)；双抗体(Holliger等人，《美国科学院院报(PNAS)》，90:6444-8(1993)；或Janusins(Traunecker等人，《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》，10:3655-59(1991)和Traunecker等人，《国际癌症杂志副刊(Int.J.Cancer Suppl.)》，7:51-52(1992)可以遵照本申请关于选择具有期望特异性的抗体的教导使用标准分子生物学技术制备。在其它实施例中，可以制备涵盖本公开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合体抗体可以包括来自不同抗体的CDR和骨架区，同时可以生成双特异性抗体，其通过一个结合结构域特异性结合到CD40并且通过第二结合结构域特异性结合到第二分子(例如，PD-1、PD-L1或CTLA-4)。这些抗体可以通过重组分子生物学技术产生或可以物理缀合在一起。
单链Fv(scFv)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其从包含由肽编码连接子连接的VH-和VL-编码基因的基因融合体表达。Huston等人(1988年)，《美国科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》，85(16):5879-5883。已经描述了多种方法来辨别用于将天然聚集但化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转化成sFv分子的化学结构，所述sFv分子将折叠成基本上类似于抗原结合位点的结构的三维结构。参见例如授予Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；和授予Ladner等人的美国专利第4,946,778号。
在某些实施例中，如本文所述的CD40结合抗体是双抗体的形式。双抗体是多肽的多聚体，每种多肽包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括免疫球蛋白轻链的结合区，所述第二结构域包括免疫球蛋白重链的结合区，所述两个结构域连接(例如，通过肽连接子)但不能彼此缔合形成抗原结合位点：通过多聚体内一种多肽的第一结构域与多聚体内另一种多肽的第二结构域的缔合形成抗原结合位点(WO94/13804)。抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward,E.S.等人，《自然(Nature)》，341,544-546(1989))。
在应使用双特异性抗体的情况下，这些可以是常规的双特异性抗体，其可以以多种方式制造(Holliger,P.和Winter G.，《生物技术现状(Current OpinionBiotechnol.)》，4,446-449(1993))，例如化学制备或从杂交杂交瘤制备，或可以是上述任何双特异性抗体片段。可以仅使用可变结构域在没有Fc区的情况下构建双抗体和scFv，从而潜在地降低抗独特型反应的作用。
与双特异性全抗体相反，双特异性双抗体也可能是特别有用的，因为它们可以容易地构建并在大肠杆菌中表达。可以使用噬菌体展示(WO94/13804)容易地从文库选择具有适当结合特异性的双抗体(和许多其它多肽，例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂要保持恒定，例如，具有针对抗原X的特异性，则可以制备改变另一个臂并选择具有适当特异性的抗体的文库。双特异性全抗体可以通过钮入扣工程(knobs-into-holesengineering)制备(J.B.B.Ridgeway等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》，9,616-621,1996)。
在某些实施例中，本文描述的抗体可以以的形式提供。是去除了铰链区的IgG4抗体(参见GenMab，乌特勒支，荷兰；还参见例如US20090226421)。与目前的小抗体形式相比，本专利抗体技术创建了稳定的具有更长的预期治疗窗口且更小的抗体形式。IgG4抗体被认为是惰性的，因此不与免疫***相互作用。可以通过消除抗体的铰链区来修饰全人IgG4抗体，以获得相对于相应的完整IgG4具有不同稳定性的半分子片段(GenMab，乌特勒支)。将IgG4分子减半只留下上可以结合到同源抗原(例如，疾病靶标)的一个区域，因此单价地与靶细胞上的唯一一个位点结合。对于某些癌细胞表面抗原，本单价结合可能不会刺激癌细胞生长，正如使用具有相同抗原特异性的二价抗体所见，因此技术可能为用常规抗体难以治疗的一些类型的癌症提供治疗选择。当治疗一些形式的癌症时，的小尺寸可以是一个很大的好处，从而使分子更好地分布在较大的实体肿瘤上，并可能提高效力。
在某些实施例中，本公开的抗体可以采用纳米抗体的形式。纳米抗体由单个基因编码，并且在几乎所有原核和真核宿主中有效产生，例如大肠杆菌(参见例如美国专利第6,765,087号)、霉菌(例如，曲霉属或木霉属)和酵母(例如，酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属(参见例如美国专利第6,838,254号)。生产过程是可扩展的，并且已经生产了数千克量的纳米抗体。纳米抗体可以配制成具有长保质期的即用型溶液。纳米克隆方法(参见例如WO 06/079372)是用于基于B细胞的自动化高通量选择来生成针对期望靶标的纳米抗体的专有方法。
在某些实施例中，本文使用的抗体或其抗原结合片段是人源化的。这是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有源自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包括融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅包括移植到可变结构域中的适当骨架区上的CDR。表位结合位点可以是野生型或通过一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了作为人类个体中的免疫原的恒定区，但是仍存在对外来可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等人，(1989年)，《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)》，86:4220-4224；Queen等人，《美国科学院院报(PNAS)》(1988)86:10029-10033；Riechmann等人，《自然(Nature)》(1988)332:323-327)。用于抗体人源化的说明性方法包含美国专利第7,462,697中描述的方法。根据本发明某些实施例的说明性人源化抗体包括SEQ ID NO:7和8中提供的人源化序列。
另一种方法不仅关注于提供人源恒定区域，而且还修饰可变区域以便将它们重塑，尽可能地接近人类形式。已知重链和轻链的可变区含有三个互补决定区(CDR)，其响应于所讨论的表位而不同并确定结合能力，侧翼为四个骨架区(FR)，其在给定物种中是相对保守的并假定为CDR提供支架。当针对特定表位制备非人抗体时，可以通过将源自非人抗体的CDR移植到待修饰的人抗体中存在的FR上来“重塑”或“人源化”可变区。Sato,K.等人，(1993年)，《癌症研究(Cancer Res)》，53:851-856。Riechmann,L.等人，(1988年)，《自然(Nature)》，332:323-327；Verhoeyen,M.等人，(1988年)，《科学(Science)》，239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等人，(1991年)，《蛋白质工程(Protein Engineering)》，4:773-3783；Maeda,H.等人，(1991年)，《人抗体杂交瘤(Human Antibodies Hybridoma)》，2:124-134；Gorman,S.D.等人，(1991年)，《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)》，88:4181-4185；Tempest,P.R.等人，(1991年)，《生物技术(Bio/Technology)》，9:266-271；Co,M.S.等人，(1991年)，《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)》，88:2869-2873；Carter,P.等人，(1992年)，《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)》，89:4285-4289；和Co,M.S.等人，(1992年)，《免疫学杂志(J Immunol)》，148:1149-1154已经报道了本方法在各种抗体中的应用。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其也被称为“源自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
在某些实施例中，本公开的抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体由抗体的抗原结合片段构成，所述抗体可操作地连接或以其它方式融合到不同抗体的异源Fc部分。在某些实施例中，异源Fc结构域是人源的。在其它实施例中，异源Fc结构域可以来自与亲本抗体不同的Ig类别，包含IgA(包含亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包含亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。在另外的实施例中，异源Fc结构域可以由来自一个或多个不同Ig类别的CH2和CH3结构域构成。如上文关于人源化抗体所述，嵌合抗体的抗原结合片段可以仅包括本文描述的抗体的一个或多个CDR(例如，本文描述的抗体的1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR)，或可以包括整个可变结构域(VL、VH或两者)。
在某些实施例中，CD40结合抗体包括一个或多个SEQ ID NO:1-6的CDR。在这方面，已经表明，在一些情况下，可以仅进行抗体的VHCDR3的转移，同时仍保留期望的特异性结合(Barbas等人，《美国科学院院报(PNAS)》，(1995)92:2529-2533)。还参见McLane等人，《美国科学院院报(PNAS)》，(1995)92:5214-5218，Barbas等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》，(1994)116:2161-2162。
Marks等人(《生物技术(Bio/Technology)》，1992,10:779-783)描述了产生抗体可变结构域库的方法，其中针对可变结构域区域的5'末端或与其相邻的共有引物与人VH基因的第三骨架区的共有引物一起使用，以提供缺少CDR3的VH可变结构域库。Marks等人进一步描述了此库如何与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术，本发明描述的抗体的CDR3源序列可以用缺少CDR3的VH或VL结构域库改组，并且改组的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域组合以提供结合例如CD40的抗体或抗原结合片段。然后，可以将所述库展示在合适的宿主***中(例如，WO92/01047的噬菌体展示***)，以便可以选择合适的抗体或其抗原结合片段。库可以由至少约104个以及向上几个数量级到例如约106个个体成员到108个或1010个或更多个成员组成。Stemmer(《自然(Nature)》，1994,370:389-391)也公开了类似的改组或组合技术，其描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术，但观察到所述方法可以用于生成抗体。
“特异性结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)到抗体或多肽的表位是本领域熟知的术语，并且确定此特异性或优先结合的方法也是本领域熟知的。如果相较于替代细胞或物质，分子更频繁地、更快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力与特定细胞或物质反应或缔合，则称所述分子表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果相较于其它物质，抗体以更大的亲和力/亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间与靶标结合，则抗体“特异性结合”或“优先结合”到靶标。例如，特异性或优先结合到CD40表位的抗体是相较于其它CD40表位或非CD40表位以更大的亲和力/亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合一个CD40表位的抗体。通过阅读本定义还可以理解，例如，特异性或优先结合到第一靶标的抗体(或部分或表位)可以特异性或优先结合或不特异性或优先结合到第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(尽管它可以包含)排他性结合。通常但并非必须，结合的提及是指优先结合。
免疫结合通常是指在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间发生的类型的非共价相互作用，例如(说明而非限制)由静电、离子、亲水和/或疏水引力或斥力、空间力、氢键、范德华力和其它相互作用引起。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(Kd)表示，其中越小的Kd表示越大的亲和力。可以使用本领域熟知的方法定量所选多肽的免疫结合特性。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力、以及同等地影响两个方向上的速率的几何参数。因此，“缔合速率常数”(Kon)和“接力速率常数”(Koff)都可以通过计算浓度和实际缔合和解离速率来确定。Koff/Kon的比率使得能够约去与亲和力无关的所有参数，因此等于解离常数Kd。通常参见Davies等人，(1990年)，《生物化学综合年刊(Annual Rev.Biochem.)》，59:439-473。
在某些实施例中，本文描述的抗CD40抗体具有约100、150、155、160、170、175、180、185、190、191、192、193、194、195、196、197、198或199皮摩尔的亲和力，并且在一些实施例中，抗体可以具有甚至更高的CD40亲和力。
关于表位有免疫活性或“保持免疫活性”的术语“免疫活性”是指抗体(例如，抗CD40抗体)在不同条件下(例如，在表位已经经受还原和变性条件之后)结合到表位的能力。
如本文使用，术语“与……竞争”、“抑制结合”和“阻断结合”(例如，是指对CD40L与CD40结合的抑制/阻断或者是指对抗CD40抗体与CD40结合的抑制/阻断)可互换使用，并且涵盖部分和完全抑制/阻断。抑制和阻断还旨在包含当与本文公开的抗CD40抗体接触时，相较于配体不与抗CD40抗体接触，CD40L与CD40结合的任何可测量的降低，例如CD40L到CD40的阻断为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
免疫球蛋白的恒定区显示出比可变区更少的序列多样性，并且负责结合多种天然蛋白以引发重要的生化事件。在人类中，存在五种不同类别的抗体，包含IgA(其包含亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包含亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。这些抗体类别之间的区别特征是它们的恒定区域，但是V区可能存在细微的差异。
抗体的Fc区与多种Fc受体和配体相互作用，从而赋予多种被称为效应子功能的重要功能能力。对于IgG，Fc区包括Ig结构域CH2和CH3和通入CH2的N-末端铰链。IgG类别的Fc受体的重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫***细胞臂之间的通讯(Raghavan等人，1996年，《细胞与发育生物学年鉴(Annu Rev Cell Dev Biol)》，12:181-220；Ravetch等人，2001年，《免疫学年鉴(Annu Rev Immunol)》，19:275-290)。在人类中，本蛋白质家族包含FcγRI(CD64)，包含同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包含同种型FcγRIIa(包含同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人，2002年，《免疫学快报(Immunol Lett)》，82:57-65)。这些受体通常具有介导与Fc结合的细胞外结构域、跨膜区和可以介导细胞内一些信号转导事件的细胞内结构域。这些受体在多种免疫细胞中表达，包含单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、天然杀伤(NK)细胞和T细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞募集到结合抗原的位点，通常导致细胞内的信号转导事件和重要的后续免疫应答，例如炎症介质的释放、B细胞活化、内吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。
介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶向细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的溶解的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan等人，1996年，《细胞与发育生物学年鉴(Annu Rev Cell Dev Biol)》，12:181-220；Ghetie等人，2000年，《免疫学年鉴(Annu Rev Immunol)》，18:739-766；Ravetch等人，2001年，《免疫学年鉴(AnnuRev Immunol)》，19:275-290)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的吞噬作用的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。在Cg2(CH2)结构域的N末端和前面的铰链处，所有FcγR结合Fc上的相同区域。这种相互作用在结构上得到了很好的表征(Sondermann等人，2001年，《分子生物学杂志(J Mol Biol)》，309:737-749)，并且已经解析了结合到人FcγRIIIb的细胞外结构域的人Fc的几种结构(pdb登录码1E4K)(Sondermann等人，2000年，《自然(Nature)》，406:267-273。)(pdb登录码1IIS和1IIX)(Radaev等人，2001年，《生物化学杂志(J Biol Chem)》，276:16469-16477。)
不同的IgG亚类对FcγR具有不同的亲和力，其中IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4基本上更好地结合到受体(Jefferis等人，2002年，《免疫学快报(Immunol Lett)》，82:57-65)。所有FcγR结合IgG Fc上的相同区域，但具有不同的亲和力：高亲和力结合子FcγRI具有10-8M-1的IgG1的Kd，而低亲和力受体FcγRII和FcγRIII通常分别以10-6和10-5结合。FcγRIIIa和FcγRIIIb的细胞外结构域具有96％的同一性，但FcγRIIIb不具有细胞内信号转导结构域。此外，尽管FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发的活化的正调节因子，其特征在于具有细胞内结构域，所述细胞内结构域具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，但是FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)并且因此是抑制性的。因此，前者被称为活化受体，FcγRIIb被称为抑制性受体。受体在不同免疫细胞上的表达模式和水平也不同。另一水平的复杂度是人蛋白质组中存在多种FcγR多态性。具有临床显著性的一种特定相关多态性是V158/F158FcγRIIIa。相较于人F158同种异型，IgG1以更大的亲和力结合到V158同种异型。这种亲和力差异以及可能的对ADCC和/或ADCP的影响已被证明是抗CD20抗体利妥昔单抗(IDEC Pharmaceuticals Corporation的注册商标)的效力的显著决定因素。具有V158同种异型的患者对利妥昔单抗治疗反应良好；然而，具有较低亲和力的F158同种异型的患者反应很差(Cartron等人，2002年，《血液(Blood)》，99:754-758)。大约10-20％的人是V158/V158纯合的，45％是V158/F158杂合的，35-45％的人是F158/F158纯合的(Lehrnbecher等人，1999年，《血液(Blood)》，94:4220-4232；Cartron等人，2002年，《血液(Blood)》，99:754-758)。因此，80-90％的人是不良反应者，即他们具有F158FcγRIIIa的至少一个等位基因。
Fc区还参与补体级联的活化。在经典补体途径中，C1与其C1q亚基结合到IgG或IgM的Fc片段，其已与抗原形成复合物。在本发明的某些实施例中，对Fc区的修饰包括改变(增强或降低)如本文所述的CD40特异性抗体活化补体***的能力的修饰(参见例如美国专利7,740,847)。为了评估补体活化，可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》，202:163(1996))。
因此，在某些实施例中，本发明提供了具有修饰的Fc区的抗体，所述Fc区具有改变的功能特性，例如降低或增强的CDC、ADCC或ADCP活性，或增强的对特定FcγR的结合亲和力或增加的血清半衰期。本文考虑的其它修饰的Fc区描述于例如授权的美国专利7,317,091；7,657,380；7,662,925；6,538,124；6,528,624；7,297,775；7,364,731；公布的美国申请US2009092599；US20080131435；US20080138344；和公布的国际申请WO2006/105338；WO2004/063351；WO2006/088494；WO2007/024249。
Fc中的一个或多个取代可以增加对FcγRIIB的结合亲和力，增强CD40分子的交联并导致抗CD40抗体更强的CD40活化。例如，APX005M是抗CD40抗体，其包括修饰的Fc，所述修饰的Fc包括S267E取代(EU编号；Li Fu、Ravetch JV，2011年，《科学(Science)》，333:1030；还参见《免疫学杂志(J.Immunol.)》，2011,187:1754-1763；《单抗(mAbs)》，2010,2:181-189)。APX005M重链恒定区氨基酸序列包含SEQ ID NO:9。
因此，在某些实施例中，具有期望的结合特异性的抗体可变结构域融合到免疫球蛋白恒定结构域序列。在某些实施例中，融合体具有Ig重链恒定结构域，其包括铰链、CH2和CH3区的至少一部分。优选含有轻链键合所需位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA***单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。当在构建中使用的不等比率的三种多肽链提供了期望的双特异性抗体的最佳产率时，这在调节实施例中三种多肽片段的相互比例方面提供了更大的灵活性。然而，当以相等比率表达至少两种多肽链导致高产率或当比率对期望的链组合的产率没有显著影响时，可以将两种或所有三种多肽链的编码序列***单个表达载体中。
还可以修饰抗体(及其抗原结合片段和变体)以包含表位标签或标记，例如用于纯化或诊断应用。本领域已知多种连接基团用于制备抗体缀合物，包含例如美国专利第5,208,020号或EP专利0 425 235 B1和Chari等人，《癌症研究(Cancer Research)》，52:127-131(1992)中公开的那些。连接基团包含二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，如以上标识的专利中所公开，优选二硫化物和硫醚基团。
在另一个实施例中，抗体可以与另一种治疗化合物缀合或可操作地连接，在本文中被称为缀合物。缀合物可以是细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、毒素、放射性同位素或其它治疗活性剂。上文已经描述了化学治疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它治疗剂，并且所有这些前述治疗剂可以用作抗体缀合物。
在一个替代实施例中，抗体与毒素缀合或可操作地连接，包含但不限于细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素和酶活性毒素，包含其片段和/或变体。小分子毒素包含但不限于皂草素(Kuroda K等人，《***(The Prostate)》，70:1286-1294(2010)；Lip,WL.等人，2007年，《分子药剂学(Molecular Pharmaceutics)》，4:241-251；Quadros EV.等人，2010年，《分子癌症治疗学(Mol Cancer Ther)》；9(11)；3033–40；Polito L.等人，2009年，《英国血液学杂志(British Journal of Haematology)》，147,710–718)、卡奇霉素、美登素(美国专利第5,208,020号)、单端孢霉烯和CC1065。毒素包含但不限于RNA酶、白树毒素、烯二炔、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素(PE40)、志贺氏菌毒素、产气荚膜梭菌毒素和商陆抗病毒蛋白。
在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段与一种或多种美登木素生物碱分子缀合。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝***抑制剂。美登素首先是从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离出来的(美国专利第3,896,111号)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利第4,151,042号)。合成美登醇及其衍生物和类似物公开于例如美国专利第4,137,230号；第4,248,870号；第4,256,746号；第4,260,608号；第4,265,814号；第4,294,757号；第4,307,016号；第4,308,268号；第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,362,663号；和第4,371,533号中。含有美登木素生物碱的免疫缀合物及其治疗用途公开于例如美国专利第5,208,020号；第5,416,064号和欧洲专利EP 0 425235B1中。Liu等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，93:8618-8623(1996)描述了免疫缀合物，其包括与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的命名为DM1的美登木素生物碱。发现缀合物对培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性，并且在体内肿瘤生长测定中表现出抗肿瘤活性。
通过在不显著降低抗体或美登木素生物碱分子的生物活性的情况下将抗体与美登木素生物碱分子化学连接来制备抗体-美登木素生物碱缀合物。平均每个抗体分子缀合3-4个美登木素生物碱分子已经表现出增强靶细胞的细胞毒性而不会对抗体的功能或溶解度产生负面影响的效力，但即使一个毒素分子/抗体也预期优于使用裸抗体而增强细胞毒性。美登木素生物碱是本领域熟知的，并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。合适的美登木素生物碱公开于例如美国专利第5,208,020号以及上文提到的其它专利和非专利出版物中。优选的美登木素生物碱是在芳香环中或在美登醇分子的其它位置处进行修饰的美登醇和美登醇类似物，例如各种美登醇酯。
另一种目标缀合物包括与一种或多种卡奇霉素分子缀合的抗体。抗生素卡奇霉素家族能够以亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。也可以使用卡奇霉素的结构类似物(Hinman等人，1993年，《癌症研究(Cancer Research)》，53:3336-3342；Lode等人，1998年，《癌症研究(Cancer Research)》，58:2925-2928)(美国专利第5,714,586号；美国专利第5,712,374号；美国专利第5,264,586号；美国专利第5,773,001号)。尾海兔素10类似物，例如澳瑞他汀E(AE)和单甲基澳瑞他汀E(MMAE)可以用作本发明公开的抗体的缀合物或其变体(Doronina等人，2003年，《自然生物技术(Nat Biotechnol)》，21(7):778-84；Francisco等人，2003年，《血液(Blood)》，102(4):1458-65)。有用的酶活性毒素包含但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α帚曲毒蛋白、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。参见例如PCT WO 93/21232。本公开进一步考虑了其中在CD40特异性抗体和具有核溶解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶(例如，脱氧核糖核酸酶(DNA酶)))之间形成缀合物或融合体的实施例。
在一个替代实施例中，抗体可以与放射性同位素缀合或可操作地连接以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物抗体。实例包含但不限于90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。
抗体可以与治疗部分缀合，例如细胞毒素(例如，细胞抑制剂或细胞致死剂)、治疗剂或放射性元素(例如，α-发射体、γ-发射体等)。细胞毒素或细胞毒性剂包含对细胞有害的任何试剂。实例包含紫杉醇(paclitaxel/paclitaxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素及其类似物或同系物。一个优选的示例性细胞毒素是皂草素(可购自Advanced Targeting Systems，圣地亚哥，加利福尼亚州)。治疗剂包含但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、噻替派、瘤可宁、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如，道诺霉素(原柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，放线菌素(原更生霉素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC)、和抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春碱)。
此外，抗体可以与治疗部分缀合，例如放射性材料或可用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂。在某些实施例中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)，其可以通过连接子分子与抗体附接。此连接子分子是本领域熟知的，并且描述于Denardo等人，1998年，《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》，4:2483-90；Peterson等人，1999年，《生物缀合物化学(Bioconjug.Chem.)》，10:553；和Zimmerman等人，1999年，《核医学与生物学(Nucl.Med.Biol.)》，26:943-50。
在另一个实施例中，抗体可以与“受体”(例如，链霉亲和素)缀合，用于肿瘤预靶向，其中向患者施用抗体-受体缀合物，随后使用清除剂从循环去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，亲和素)。在一个替代实施例中，抗体与酶缀合或可操作地连接，以便使用抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADEPT)。ADEPT可以通过将抗体与前药活化酶缀合或可操作地连接来使用，所述前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗剂，参见PCT WO 81/01145)转化成活性抗癌药物。参见例如PCT WO 88/07378和美国专利第4,975,278号。可用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包含能够以某一方式作用于前药以使得将其转化成其更具活性的细胞毒性形式的任何酶。在这些和相关实施例的方法中有用的酶包含但不限于用于将含磷酸盐的前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸盐的前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽前药转化成游离药物的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B和L)；用于转化含有D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化前药转化成游离药物的碳水化合物切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶；用于将用α-内酰胺衍生的药物转化成游离药物的β-内酰胺酶；和用于将胺氮分别用苯氧基乙酰基或苯乙酰基基团衍生的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。可替代地，可以使用具有酶活性的抗体(在本领域中也被称为“抗体酶”)将前药转化成游离活性药物(参见例如Massey，1987年，《自然(Nature)》，328:457-458)。可以制备抗体-抗体酶缀合物以将抗体酶递送到肿瘤细胞群。
免疫缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如，己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如，戊二醛)、双叠氮基化合物(例如，双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(例如，双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如，甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特定的偶联剂包含N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，《生物化学杂志(Biochem.J.)》，173:723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)以提供二硫键。连接子可以是促进一种或多种可切割组分的释放的“可切割连接子”。例如，可以使用酸不稳定连接子(《癌症研究(Cancer Research)》，52:127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。
本文还考虑了抗体的其它修饰。例如，抗体可以与多种非蛋白质类聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体也可以包埋在微胶囊中(例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊))，胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或粗乳液中。此类技术公开于《雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，第16版，Oslo,A.编辑(1980年)中。
如本文使用的“载剂”包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，其在所用剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒。生理学上可接受的载剂通常是含水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯20(TWEENTM)聚乙二醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICSTM)等。
如本文其它地方所述，本公开的抗CD40抗体在肿瘤细胞中诱导CD40信号转导，活化树突细胞和免疫监视，活化针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，活化针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，阻断CD40与CD40L的结合；具有CD40激动活性；活化抗原呈递细胞；刺激抗原呈递细胞释放细胞因子；诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤细胞增殖；经由诱导效应子功能(包含但不限于ADCC、CDC和ADCP)杀伤肿瘤细胞；刺激抗肿瘤T细胞应答；减少确定的肿瘤；并抑制利妥昔单抗耐药性肿瘤。本文描述的抗体可以具有或诱导这些属性或活性中的任何一种或多种的组合。可以使用本领域技术人员已知的多种方法评估抗CD40抗体的功能特性，例如亲和力/结合测定(例如，表面等离子共振、竞争性抑制测定)；细胞毒性测定、细胞活力测定、细胞增殖、活化或分化测定、ADCC和CDC测定、CD40细胞信号转导事件(例如，STAT3磷酸化、细胞因子(包含IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和MIP1α)的产生)导致的其它细胞活性、和使用体外或体内模型的癌细胞和/或肿瘤生长抑制。其它测定可以测试本文描述的抗体阻断CD40L与CD40的正常结合或CD40介导的应答的能力，所述CD40介导的应答例如细胞信号转导、细胞活化(例如，免疫细胞活化、增殖；抗原呈递细胞活化(例如，树突细胞、B细胞、巨噬细胞)和成熟测定)、免疫应答(包含细胞介导和体液应答)等。还可以测试本文描述的抗体对CD40内化、体外和体内效力等的影响。可以使用本领域技术人员已知的成熟方案(参见例如《现代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)》(Greene Publ.Assoc.Inc.和John Wiley&Sons,Inc.，纽约，纽约州)；《现代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(编辑John E.Coligan、Ada M.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober，2001年，JohnWiley&Sons，纽约，纽约州)或市售试剂盒进行此种测定。
在某些实施例中，本发明进一步提供了一种编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段的分离核酸，例如编码如本文所述的CDR或VH或VL结构域的核酸。核酸包含DNA和RNA。这些和相关实施例可以包含编码如本文所述的结合CD40的抗体的多核苷酸。如本文使用的术语“分离多核苷酸”应指基因组、cDNA或合成来源或其一些组合的多核苷酸，由于其来源，所述分离多核苷酸(1)与在自然界中的发现分离多核苷酸的多核苷酸的全部或部分不相关，(2)与在自然界中并不连接的多核苷酸连接，或(3)在自然界中不作为较大序列的一部分出现。
术语“可操作地连接”是指应用所述术语的组分处于允许它们在合适条件下实现其固有功能的关系。例如，与蛋白质编码序列“可操作地连接”的转录控制序列连接到其上，以便在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
如本文使用的术语“控制序列”是指可以影响与其连接或可操作地连接的编码序列的表达、加工或细胞内定位的多核苷酸序列。这种控制序列的性质可能取决于宿主生物。在特定实施例中，原核生物的转录控制序列可以包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其它特定实施例中，真核生物的转录控制序列可以包含包括转录因子的一个或多个识别位点的启动子、转录增强子序列、转录终止序列和多腺苷酸化序列。在某些实施例中，“控制序列”可以包含前导序列和/或融合伴侣序列。
如本文提及的术语“多核苷酸”是指单链或双链核酸聚合物。在某些实施例中，包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包含碱基修饰(例如，溴尿苷)、核糖修饰(例如，***糖苷和2',3'-双脱氧核糖)和核苷酸间键修饰(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯)。术语“多核苷酸”具体包含单链和双链形式的DNA。
术语“天然存在的核苷酸”包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包含具有修饰或取代的糖基团的核苷酸等。术语“寡核苷酸键”包含例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等的寡核苷酸键。参见例如LaPlanche等人，1986年，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，14:9081；Stec等人，1984年，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》，106:6077；Stein等人，1988年，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，16:3209；Zon等人，1991年，《抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)》，6:539；Zon等人，1991年，《寡核苷酸和类似物：一种实用方法(OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH)》，第87-108页(F.Eckstein编辑)，牛津大学出版社，牛津，英格兰；Stec等人，美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman，1990年，《化学评论(Chemical Reviews)》，90:543，其公开内容出于任何目的通过引用并入本文。寡核苷酸可以包含可检测的标记，以实现寡核苷酸或其杂交的检测。
术语“载体”用来指用于将编码信息转移到宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适合转化宿主细胞并且含有指导和/或控制***的异源核酸序列的表达的核酸序列的载体。如果存在内含子，则表达包含但不限于例如转录、翻译和RNA剪接的过程。
如本领域技术人员所理解，多核苷酸可以包含表达或可以适于表达蛋白质、多肽、肽等的基因组序列、基因组外和质粒编码序列以及较小工程基因节段。此类节段可以是天然分离的，或由技术人员合成修饰的。
如本领域技术人员还将认识到，多核苷酸可以是单链的(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包含HnRNA分子和mRNA分子，所述HnRNA分子含有内含子并且以一对一的方式对应于DNA分子，所述mRNA分子不含有内含子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于根据本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其它分子和/或支持材料连接。多核苷酸可以包括天然序列或可以包括编码此序列的变体或衍生物的序列。
因此，根据这些和相关实施例，本公开还提供了编码本文描述的抗体的多核苷酸。在某些实施例中，提供了多核苷酸，其包括编码如本文所述的抗体的多核苷酸序列中的一些或全部和此类多核苷酸的补体。
在其它相关实施例中，多核苷酸变体可以与编码抗体(例如，抗CD40抗体)的多核苷酸序列具有基本同一性。例如，使用本文描述的方法(例如，使用标准参数进行BLAST分析，如下所述)与参考多核苷酸序列(例如，编码本文描述的抗体的序列)进行比较，多核苷酸可以是包括至少70％序列同一性(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高)的多核苷酸。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
通常，多核苷酸变体将含有一个或多个取代、添加、缺失和/或***，优选地使得相对于由本文具体阐述的多核苷酸序列编码的抗体，由变体多核苷酸编码的抗体的结合亲和力基本上未减少。
在某些其它相关实施例中，多核苷酸片段可以包括各种长度的连续序列段或基本上由其组成，所述序列段与编码本文描述的抗体的序列具有同一性或互补。例如，提供的多核苷酸包括编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的序列的至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、400个、500个或1000个或更多个连续核苷酸以及其间的所有中间长度，或基本上由其组成。将容易理解的是，在本上下文中，“中间长度”是指引用值之间的任何长度，例如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包含200-500；500-1,000等中的所有整数。如这里所述的多核苷酸序列可以在一端或两端延伸天然序列中未发现的另外的核苷酸。本另外的序列可以由编码本文描述的抗体的多核苷酸任一端或编码本文描述的抗体的多核苷酸两端的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸组成。
在另一个实施例中，提供了能够在中度至高度严格条件下与编码本文提供的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交的多核苷酸。杂交技术是分子生物学领域熟知的。出于说明的目的，用于测试如本文提供的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严格条件包含在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-60℃下，5X SSC杂交过夜；随后在65℃下洗涤两次，每次用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC洗涤20分钟。本领域技术人员将理解，可以容易地操纵杂交的严格性，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一个实施例中，合适的高度严格杂交条件包含上述那些，只是杂交温度升高，例如升高到60℃-65℃或65℃-70℃。
在某些实施例中，上述多核苷酸(例如，多核苷酸变体、片段和杂交序列)编码结合CD40的抗体或其抗原结合片段。在其它实施例中，此类多核苷酸编码与CD40结合至少约50％、至少约70％、并且在某些实施例中至少约90％的抗体或其抗原结合片段或其CDR，以及本文具体阐述的抗体序列。在另外的实施例中，此类多核苷酸编码以比本文阐述的抗体更大的亲和力与CD40结合(例如，定量地结合至少约105％、106％、107％、108％、109％或110％)的抗体或其抗原结合片段或其CDR，以及本文具体阐述的抗体序列。
如本文其它地方所述，可以通过常规方法确定代表性多肽(例如，如本文提供的变体CD40特异性抗体，例如具有如本文提供的抗原结合片段的抗体蛋白)的三维结构，使得可以对用所选天然或非天然氨基酸对一个或多个氨基酸的取代、添加、缺失或***进行虚拟建模，以用于确定如此衍生的结构变体是否保留了本发明公开的物种的空间填充特性。本领域技术人员已知多种计算机程序用于确定抗体内的适当氨基酸取代(或编码氨基酸序列的适当多核苷酸)，使得例如保持了亲和力，或实现了更好的亲和力。
无论编码序列本身的长度如何，本文描述的多核苷酸或其片段可以与其它DNA序列(例如，启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码节段等)组合，使得他们的总长度可能会有很大差异。因此预期可以使用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受限于预期重组DNA方案中易于制备和使用。例如，总长度为约10,000个、约5000个、约3000个、约2,000个、约1,000个、约500个、约200个、约100个、约50个碱基对的说明性多核苷酸节段等(包含所有中间长度)预期是有用的。
当比较多核苷酸序列时，如果两个序列中的核苷酸序列在最大对应性比对时是相同的，则称两个序列是“相同的”，如下所述。通常通过在比较窗口上比较序列以标识并比较序列相似性的局部区域来进行两个序列之间的比较。如本文使用的“比较窗口”是指至少约20个(通常为30个到约75个，40个到约50个)连续位置的节段，其中序列可以与相同数量的连续位置的参考序列进行比较，随后再对两个序列进行最佳比对。
用于比较的序列的最佳比对可以使用Lasergene生物信息学软件套件(DNASTAR,Inc.，麦迪逊，威斯康星州)中的Megalign程序，利用默认参数进行。本程序体现了以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.(编辑)《蛋白质序列和结构地图集(Atlas ofProtein Sequence and Structure)》，国家生物医学研究基金会，华盛顿特区，第5卷，副刊3，第345-358页中的Dayhoff,M.O.(1978年)《蛋白质进化变化的模型-用于检测远距离关系的矩阵(A model of evolutionary change in proteins–Matrices for detectingdistant relationships)》；Hein J，《比对和***发育的统一方法(Unified Approach toAlignment and Phylogenes)》，第626-645页(1990年)；《酶学方法(Methods inEnzymology)》，第183卷，Academic Press,Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.，《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》，5:151-153(1989)；Myers,E.W.和Muller W.，《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》，4:11-17(1988)；Robinson,E.D.，《组合理论(Comb.Theor)》，11:105(1971)；Santou,N.Nes,M.，《分子生物学与进化(Mol.Biol.Evol.)》，4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.，《数字分类学——数字分类学的原理和实践(Numerical Taxonomy–the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy)》，Freeman Press，圣弗朗西斯科，加利福尼亚州(1973年)；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.,Sci.USA)》，80:726-730(1983)。
可替代地，用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman，《高等应用数学(Add.APL.Math)》，2:482(1981)的局部同一性算法，通过Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，48:443(1970)的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，85:2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)的计算机化实施，或通过检查进行。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》，25:3389-3402(1977)和Altschul等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，215:403-410(1990)中。可以例如利用本文描述的参数使用BLAST和BLAST 2.0，以确定两个或更多个多核苷酸之间的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心公开获得。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，可以使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的惩罚得分；总是<0)来计算累积得分。在以下情况下，停止每个方向上的文字命中的延伸：累积对齐分数从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积评分为零或低于零；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用以下：字长(W)为11，期望值(E)为10，BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，89:10915(1989))比对使用以下：(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两个链的比较。
在某些实施例中，“序列同一性百分比”通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括相较于两个序列的最佳比对的参考序列(不包括添加或缺失)20％或更少、通常5％到15％或10％到12％的添加或缺失(即，缺口)。通过确定两个序列中存在相同核酸碱基的位置的数量以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以参考序列中的位置总数(即，窗口大小)并将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算百分比。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在多种编码如本文所述的抗体的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与编码结合CD40的抗体的天然或原始多核苷酸序列的核苷酸序列具有最小的序列同一性。尽管如此，本公开明确考虑了由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。在某些实施例中，具体考虑了针对哺乳动物表达进行密码子优化的序列。
因此，在本发明的另一个实施例中，可以使用诱变方法(例如，位点特异性诱变)来制备本文描述的抗体的变体和/或衍生物。通过本方法，可以通过诱变编码它们的基础多核苷酸来进行多肽序列中的特异性修饰。这些技术提供了一种通过将一个或多个核苷酸序列变化引入多核苷酸中来制备和测试序列变体的直接方法(例如，结合一个或多个前述考虑因素)。
位点特异性诱变允许通过使用编码期望突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来产生突变体，以提供足够大小和序列复杂度的引物序列以形成遍历缺失连接点两侧的稳定双链体。可以在选定多核苷酸序列中利用突变以改善、改变、降低、修饰或以其它方式更改多核苷酸本身的特性，和/或改变编码的多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
在某些实施例中，发明人考虑了编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的诱变，以改变编码的多肽的一种或多种特性，例如抗体或其抗原结合片段的结合亲和力、或特定Fc区的功能、或Fc区对特定FcγR的亲和力。位点特异性诱变技术是本领域熟知的，并且广泛用于创建多肽和多核苷酸的变体。例如，通常使用位点特异性诱变来改变DNA分子的特异性部分。在此类实施例中，使用通常包括约14到约25个核苷酸左右长度的引物，其中在序列连接点两侧上的约5到约10个残基被改变。
如本领域技术人员所理解，位点特异性诱变技术通常使用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包含例如M13噬菌体的载体。这些噬菌体易于商购，并且它们的使用通常为本领域技术人员所熟知。双链质粒还常规用于定点诱变，其消除了将目标基因从质粒转移至噬菌体的步骤。
通常，根据本发明的定点诱变是通过首先获得单链载体或将双链载体的两个链解链而进行的，所述双链载体在其序列内包含编码期望肽的DNA序列。通常合成制备具有期望突变序列的寡核苷酸引物。然后将本引物用单链载体退火，并受DNA聚合酶(例如，大肠杆菌聚合酶I Klenow片段)影响，以便完成具有突变的链的合成。因此，形成异源双链体，其中一个链编码原始非突变序列，第二链具有期望突变。然后，使用本异源双链体载体来转化适当的细胞(例如，大肠杆菌细胞)，并且选择包含具有突变序列排列的重组载体的克隆。
使用定点诱变制备所选肽编码DNA节段的序列变体提供了产生潜在有用物种的手段，而并不旨在是限制性的，因为还存在可以获得肽的序列变体和编码它们的DNA序列的其它方式。例如，可以用诱变剂(例如，羟胺)处理编码期望肽序列的重组载体，以获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节可以在Maloy等人，1994年；Segal，1976年；Prokop和Bajpai，1991年；Kuby，1994年；和Maniatis等人，1982年的教导中找到，每个都出于此目的通过引用并入本文。
如本文使用，术语“寡核苷酸定向诱变程序”是指模板依赖性过程和载体介导的繁殖，其导致特定核酸分子的浓度相对于其初始浓度的增加或可检测信号(例如，扩增)的浓度的增加。如本文使用，术语“寡核苷酸定向诱变程序”旨在是指涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程。术语模板依赖性过程是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列由熟知的互补碱基配对规则决定(参见例如Watson，1987年)。通常，载体介导的方法涉及将核酸片段引入DNA或RNA载体，载体的克隆扩增和扩增的核酸片段的回收。此类方法的实例由美国专利第4,237,224号提供，其通过引用明确地整体并入本文。
在另一种产生多肽变体的方法中，可以使用如美国专利第5,837,458号中所述的递归序列重组。在本方法中，进行重组和筛选或选择的迭代循环以“进化”具有例如增加的结合亲和力的单个多核苷酸变体。某些实施例还提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包括至少一种如本文所述的多核苷酸。
在许多实施例中，将编码主题单克隆抗体的核酸直接引入宿主细胞中，并在足以诱导编码抗体的表达的条件下孵育所述细胞。使用本领域技术人员熟知的标准技术与本文提供的多肽和核酸序列组合制备本公开的抗体。可以使用多肽序列来确定编码本文公开的特定抗体的合适的核酸序列。可以根据本领域技术人员熟知的标准方法优化核酸序列以反映各个表达***的特定密码子“偏好”。
根据某些相关实施例，提供了一种重组宿主细胞，其包括一个或多个如本文所述的构建体；一种编码任何抗体、CDR、VH或VL结构域或其抗原结合片段的核酸；和一种产生编码产物的方法，所述方法包括从其编码核酸表达。通过在适当条件下培养含有核酸的重组宿主细胞，可以方便地实现表达。在通过表达产生之后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段，然后根据需要使用。
如本文提供的抗体或其抗原结合片段以及编码核酸分子和载体可以例如从其天然环境，以基本上纯的或同质的形式分离和/或纯化，或者在核酸的情况下，除了编码具有期望功能的多肽的序列之外，不含或基本上不含核酸或起源基因。核酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分合成的。除非上下文另有要求，否则提及本文所述的核苷酸序列涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵盖具有指定序列的RNA分子，其中U取代T。
用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的***是熟知的。合适的宿主细胞包含细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒***。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包含中国仓鼠卵巢细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞和许多其它细胞。常见的优选细菌宿主是大肠杆菌。
在原核细胞(例如，大肠杆菌)中表达抗体和抗原结合片段在本领域中已得到充分证实。对于评论，参见例如Pluckthun,A，《生物技术(Bio/Technology)》，9:545-551(1991)。本领域技术人员也可以将在培养中的真核细胞中的表达用作产生抗体或其抗原结合片段的选择，参见最近的评论，例如参考M.E.(1993年)，《生物技术现状(Curr.OpinionBiotech.)》4:573-576；Trill J.J.等人(1995年)，《生物技术现状(Curr.OpinionBiotech)》，6:553-560。
可以选择或构建合适的载体，其含有合适的调节序列，包含启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标志基因和其它序列，视情况而定。载体可以是质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。对于另外的细节，参见例如《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:a Laboratory Manual)》第2版，Sambrook等人，1989年，冷泉港实验室出版社。例如在核酸构建体制备、诱变、测序、DNA引入细胞和基因表达以及蛋白质分析中用于操纵核酸的多种已知技术和方案在《现代分子生物学实验指南(Current Protocolsin Molecular Biology)》第二版，Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons，1992年或其后续更新中详细描述。
术语“宿主细胞”用来指已经引入或能够引入编码一种或多种本文描述的抗体的核酸序列的细胞，其进一步表达或能够表达所选目标基因，例如编码任何本文描述的抗体的基因。所述术语包含亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本是否在形态上或遗传构成上相同，只要所选基因存在即可。因此，还考虑了一种方法，其包括将此核酸引入宿主细胞中。引入可以采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包含磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如，牛痘，或对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包含氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入之后可以引起或允许从核酸表达，例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。在一个实施例中，核酸整合到宿主细胞的基因组(例如，染色体)中。根据标准技术，可以通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
在某些实施例中，本发明还提供了一种方法，其包括在表达***中使用如上所述的构建体，以便表达特定多肽，例如本文所述的CD40特异性抗体。术语“转导”用来指通常通过噬菌体将基因从一种细菌转移到另一种细菌。“转导”还指通过逆转录病毒获取和转移真核细胞序列。术语“转染”用来指细胞对外来或外源DNA的摄取，并且当外源DNA已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。多种转染技术是本领域熟知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人，1973年，《病毒学(Virology)》，52:456；Sambrook等人，2001年，《分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL)》，冷泉港实验室；Davis等人，1986年，《分子生物学基本方法(BASIC METHODS 1N MOLECULAR BIOLOGY)》，Elsevier；和Chu等人，1981年，《基因(Gene)》，13:197。可以使用此类技术来将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。
如本文使用的术语“转化”是指细胞遗传特征的变化，并且当细胞被修饰以含有新DNA时，其已经被转化。例如，在细胞从其天然状态进行遗传修饰的情况下，其被转化。在转染或转导之后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加型元件瞬时维持而不被复制，或者可以作为质粒独立地复制。当DNA随细胞***复制时，认为细胞已被稳定转化。当与生物材料(例如，核酸分子、多肽、宿主细胞等)结合使用时，术语“天然存在的”或“天然的”是指在自然界中发现并且不被人操纵的材料。类似地，如本文使用的“非天然存在的”或“非天然的”是指在自然界中未发现或已经由人进行结构修饰或合成的材料。
术语“多肽”“蛋白质”和“肽”和“糖蛋白”可互换使用，并且是指氨基酸的聚合物(不限于任何特定长度)。所述术语不排除例如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或缺失的修饰。术语“多肽”或“蛋白质”是指一个或多个氨基酸链，其中每个链包括通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可以包括通过由肽键非共价和/或共价连接在一起，具有天然蛋白质(即，由天然存在(特别是非重组)的细胞或基因工程或重组细胞产生的蛋白质)序列的多个链，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖结合到本公开的CD40的抗体，或具有抗CD40抗体的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。因此，“多肽”或“蛋白质”可以包括一个氨基酸链(被称为“单体”)或多个氨基酸链(被称为“多聚体”)。
本文提及的术语“分离蛋白质”是指主题蛋白质(1)不含通常在自然界中发现的至少一些其它蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源(例如，来自相同物种)的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或在自然界中与其缔合的其它物质分离，(5)不与在自然界中与“分离蛋白质”缔合的蛋白质的部分缔合(通过共价或非共价相互作用)，(6)与在自然界中不与其缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)在自然界中不存在。此分离蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，或可以是合成来源的，或其任何组合。在某些实施例中，分离蛋白质基本上不含在其天然环境中发现的蛋白质或多肽或其它污染物，这会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它)。
术语“多肽片段”是指多肽，其可以是单体或多聚体，其具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或天然存在或重组产生的多肽的内部缺失或取代。在某些实施例中，多肽片段可以包括至少5到约500个氨基酸长的氨基酸链。应理解，在某些实施例中，片段为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸长。特别有用的多肽片段包含功能结构域，包含抗原结合结构域或抗体片段。在抗CD40抗体的情况下，有用的片段包含但不限于：CDR区，尤其是重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变区；抗体链的一部分或仅包含两个CDR的可变区；等等。
多肽可以包括在蛋白质的N-末端的信号(或前导)序列，其在翻译同时或在翻译之后指导蛋白质的转移。还考虑了本文提供的包含信号肽的任何多肽氨基酸序列在没有此信号或前导肽的情况下用于本文所述的任何用途。如本领域技术人员所认识，信号肽通常在加工过程中被切割并且不包含在活性抗体蛋白中。多肽也可以框内融合或与连接子或其它序列缀合，以便于多肽(例如，聚-His)的合成、纯化或标识，或增强多肽与固体支持物的结合。
还可以使用肽连接子/间隔子序列将多种多肽组分分开足够的距离，以确保每种多肽在需要时折叠成其二级和/或三级结构。可以使用本领域熟知的标准技术将此肽连接子序列并入融合多肽中。
可以选择某些肽间隔子序列例如基于以下选择：(1)它们能够采用柔性延伸构象；(2)它们不能采用可以与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和/或(3)缺少可能与多肽功能性表位反应的疏水或带电残基。
在一个说明性实施例中，肽间隔子序列含有例如Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala，也可以包含在间隔子序列中。
可以用作间隔子的其它氨基酸序列包含Maratea等人，《基因(Gene)》，40:39 46(1985)；Murphy等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，83:8258 8262(1986)；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中公开的那些。
在一些实施例中，当第一和第二多肽具有可以用于分离功能结构域并防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区域时，不需要间隔子序列。两个编码序列可以在没有任何间隔子的情况下直接融合或者通过使用由例如五聚体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复1到3次组成的柔性多连接子融合。此间隔子通过***VH和VL之间来用于构建单链抗体(scFv)(Bird等人，1988年，《科学(Science)》，242:423-426；Huston等人，1988年，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》，85:5979-5883)。
在某些实施例中，肽间隔子被设计成在形成单链抗体可变区的两个β-折叠之间实现正确的相互作用。
在某些说明性实施例中，肽间隔子为1到5个氨基酸、5到10个氨基酸、5到25个氨基酸、5到50个氨基酸、10到25个氨基酸、10到50个氨基酸、10到100个氨基酸或任何中间范围的氨基酸。
在其它说明性实施例中，肽间隔子的长度包括约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个氨基酸。
考虑了本文描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。例如，抗体的氨基酸序列变体可以通过将合适的核苷酸变化引入编码抗体或其链的多核苷酸中或通过肽合成来制备。此类修饰包含例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或***和/或取代。可以进行缺失、***和取代的任何组合以获得最终抗体，条件是最终构建体具有期望特征(例如，与CD40的高亲和力结合)。氨基酸变化还可以改变抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。上述针对本发明多肽的任何变化和修饰可以包含在本发明的抗体中。
可以通过常规方法确定代表性多肽(例如，CD40特异性抗体)的三维结构，使得可以对用所选天然或非天然氨基酸取代、添加、缺失或***一个或多个氨基酸进行虚拟建模，以用于确定如此衍生的结构变体是否保留本发明公开的物种的空间填充特性。参见例如Donate等人，1994年，《蛋白质科学(Prot.Sci.)》，3:2378；Bradley等人，《科学(Science)》，309:1868-1871(2005)；Schueler-Furman等人，《科学(Science)》，310:638(2005)；Dietz等人，《美国科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》，103:1244(2006)；Dodson等人，《自然(Nature)》，450:176(2007)；Qian等人，《自然(Nature)》，450:259(2007)；Raman等人，《科学(Science)》，327:1014-1018(2010)。可以用于这些和相关实施例(例如，用于如本文提供的CD40特异性抗体其抗原结合结构域的合理设计)的计算机算法的一些另外的非限制性实例包含VMD，其是使用3D图形和内置脚本来显示、动画化、分析大型生物分子***的分子可视化程序(参见伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的理论与计算生物物理学小组网站@ks.uiuc.edu/Research/vmd/。多种其它计算机程序是本领域已知的并且是技术人员可用的，并且其允许从能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径)确定原子尺寸；GRID，其寻求确定不同化学基团的高亲和力区域，从而增强结合，蒙特卡罗搜索，其计算数学比对，和CHARMM(Brooks等人(1983年)，《计算化学杂志(J.Comput.Chem.)》，4:187-217)和AMBER(Weiner等人(1981年)，《计算化学杂志(J.Comput.Chem.)》，106:765)，其评估力场计算和分析(还参见Eisenfield等人(1991年)，《美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)》，261:C376-386；Lybrand(1991年)，《比利时药学杂志(J.Pharm.Belg.)》，46:49-54；Froimowitz(1990年)，《生物技术(Biotechniques)》，8:640-644；Burbam等人(1990年)，《蛋白质(Proteins)》，7:99-111；Pedersen(1985年)，《环境健康展望(Environ.HealthPerspect.)》，61:185-190和Kini等人(1991年)，《生物分子结构与动力学杂志(J.Biomol.Struct.Dyn.)》，9:475-488)。多种适当的计算计算机程序还是市售的，例如可购自(慕尼黑，德国)。
在本发明的另一个实施例中，抗CD40抗体及其人源化形式源自兔单克隆抗体，特别是使用技术产生。这些抗体是有利的，因为它们需要最少的序列修饰，从而促进在使用突变系引导(MLG)人源化技术人源化之后功能特性的保留(参见例如美国专利第7,462,697号)。因此，制备本公开的抗CD40抗体的说明性方法包含例如在美国专利5,675,063和7,429,487中描述的兔单克隆抗体技术。在这方面，在某些实施例中，本公开的抗CD40抗体在兔中产生。在特定实施例中，使用能够与兔脾细胞融合的兔源永生B淋巴细胞来产生产生抗体的杂交细胞。永生B淋巴细胞不能可检测地表达内源性免疫球蛋白重链，并且在某些实施例中可以含有改变的免疫球蛋白重链编码基因。
CD40
大多数白血病和淋巴瘤起源于B系细胞的恶性转化。细胞表面B系限制性抗原(例如，CD20)的表达使其成为抗体疗法的有吸引力的靶标。抗体疗法已经极大地改变了患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的管理。自利妥昔单抗获得批准以来，单独的抗体或与化学疗法组合的抗体显著地改善了应答率、长期结果和生活质量(Chinn P、Braslawsky G、White C等人，《非霍奇金B细胞淋巴瘤的抗体疗法(Antibodytherapy of non-Hodgkin's B-cell lymphoma)》，《癌症免疫治疗(Cancer ImmunolImmunother)》，2003；52:257–280；Rastetter W、Molina A、White CA，《利妥昔单抗：在淋巴瘤和自身免疫性疾病疗法中扩展作用(Rituximab:Expanding role in therapy forlymphomas and autoimmune diseases)》，《医学年度评论(Annu Rev Med)》，2004；55:477–503。然而，大量患者表现出对利妥昔单抗的原发性或获得性耐药，表明目前靶向CD20的方法在临床结果方面存在局限性，并且需要通过开发具有不同作用机制的新型B细胞淋巴瘤和白血病免疫疗法来改善(Stolz C、Schuler M，《利妥昔单抗耐药的分子机制及其规避的药理策略(Molecular mechanisms of resistance to Rituximab and pharmacologicstrategies for its circumvention)》，《白血病和淋巴瘤(Leukemia and lymphoma)》，2009；50(6):873–885；Bello C、Sotomayor EM，《B细胞淋巴瘤的单克隆抗体：利妥昔单抗及其它(Monoclonal antibodies for B-cell lymphomas:Rituximab and beyond)》，《血液学——美国血液学学会教育计划(Hematology Am Soc Hematol Educ Program)》，2007；233-242；Dupire S、Coiffier B，《弥漫性大B细胞淋巴瘤的靶向治疗和新试剂(Targetedtreatment and new agents in diffuse large B cell lymphoma)》，《国际血液学杂志(Int J Hematol)》，2010年6月18日(在线))，例如抗CD40mAb、APX005。
CD40在免疫应答调节中的作用
T细胞的完全活化需要两种不同但却协同的信号。通过T细胞抗原受体递送的第一信号由APC上的抗原和MHC复合物提供，并且负责免疫应答的特异性。第二或共刺激信号是通过CD28与B7-1(CD80)/B7-2(CD86)和CD40与CD40L的相互作用的，这是产生满刻度T细胞应答所必需的。在不存在共刺激信号的情况下，T细胞在抗原刺激时可能经历无应答性(无反应性)或程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
CD40是TNF受体(TNFR)超家族的成员，主要在B细胞和其它抗原呈递细胞(APC)(例如，树突细胞和巨噬细胞)上表达。CD40配体(CD40L)主要由活化的T细胞表达。
CD40和CD40L的相互作用用作T细胞活化的共刺激信号。在静息B细胞上的CD40-CD40L接合诱导增殖、免疫球蛋白类别转换、抗体分泌，并且还在生发中心的发育和记忆B细胞的存活中起作用，所有这些都是体液免疫应答所必需的(Kehry MR，《免疫学杂志(JImmunol)》，1996；156:2345–2348)。CD40L与CD40在树突细胞上的结合诱导DC成熟，表现为共刺激分子(例如，B7家族(CD80、CD86))的增加的表达和促炎细胞因子(例如，白细胞介素12)的产生。这些导致有效的T细胞应答(Stout,R.D.、J.Suttles，1996年，《当代免疫学(Immunol.Today)》，17:487-492；Brendan O'Sullivan、Ranjeny Thomas，《免疫学重要评论(Critical Reviews in Immunology)》，2003；23:83-107；Cella,M.、D.Scheidegger、K.Palmer-Lehmann、P.Lane、A.Lanzavecchia、G.Alber.，《实验医学学报(J.Exp.Med.)》，1996；184:747-452)。
CD40信号转导活化多种途径，包含NF-κB(核因子-κB)、MAPK(丝裂原活化的蛋白激酶)和STAT3(信号传导与转录活化因子-3)(Pype S等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》)，2000年1月16日；275(24):18586-93)其通过活化活化蛋白、c-Jun、ATF2(活化转录因子-2)和Rel转录因子来调节基因表达(Dadgostar H等人，《美国科学院院报(Proc Natl AcadSci U S A)》，2002年2月5日；99(3):1497-502)。TNFR-受体相关因子衔接子蛋白(例如TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5和TRAF6)与此受体相互作用并用作信号转导的介质。取决于特定的细胞类型，CD40接合导致特定的基因表达模式。响应CD40信号转导而活化的基因包含多种细胞因子和趋化因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP1α)。在某些细胞类型中，CD40的活化可以导致细胞毒性自由基(Dadgostar等人，同上)、COX2(环氧合酶-2)的产生和NO(一氧化氮)的产生。
CD40在肿瘤中的作用
CD40不仅由正常免疫细胞表达，而且由多种恶性细胞表达。特别地，CD40在B系NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金病(Uckun FM、Gajl-Peczalska K、Myers DE等人，《血液(Blood)》，1990；76:2449–2456；O’Grady JT、StewartS、Lowrey J等人，《美国病理学杂志(Am J Pathol)》，1994；144:21–26)、多发性骨髓瘤(Pellat-Deceunynck C、Bataille R、Robillard N、Harousseau JL、Rapp MJ、Juge-Morineau N、Wijdenes J、Amiot M，《血液(Blood)》，1994；84(8):2597-603)、以及膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和恶性黑素瘤(Young LS、Eliopoulos AG、Gallagher NJ等人，《当代免疫学(Immunol Today)》，1998；19:502–6；Ziebold JL、HixonJ、Boyd A等人，《免疫实验治疗档案(Warsz)(Arch Immunol Ther Exp(Warsz))》，2000；48:225–33；Gladue R、Cole S、Donovan C等人，《临床肿瘤学杂志(JClin Oncol)》，2006；24(18S):103s)中过表达。
在许多情况下，肿瘤细胞表面上的CD40连接介导直接细胞毒性作用，导致肿瘤通过细胞凋亡和坏死而消退(Grewal IS、Flavell RA，《免疫学年鉴(Annu Rev Immunol)》，1998；16:111–35；van Kooten C、Banchereau J，《白细胞生物学杂志(J Leukoc Biol)》，2000；67(1):2–17)。尽管CD40在肿瘤细胞中的确切功能尚不清楚(Tong AW、Stone MJ，《癌症基因治疗(Cancer Gene Ther)》，2003 10(1):1-13)，但CD40在体外的接合抑制了实体瘤细胞和高级B细胞淋巴瘤细胞的生长(Magi Khalil和Robert H.Vonderheide，《癌症治疗快讯(Update Cancer Ther)》，2007；2(2):61–65；Young LS、Eliopoulos AG、Gallagher NJ、Dawson CW，《当代免疫学(Immunol Today)》，1998；19(11):502–6；Funakoshi S、Longo DL、Beckwith M等人，《血液(Blood)》，1994；83(10):2787–94；Hess S、Engelmann H，《实验医学杂志(J Exp Med)》，1996；183(1):159–67；Eliopoulos AG、Dawson CW、Mosialos G等人，《致癌基因(Oncogene)》，1996；13(10):2243–54；von Leoprechting A、van der BruggenP、Pahl HL、Aruffo A、Simon JC，《癌症研究(Cancer Res)》，1999；59(6):1287–94)。这些效果与CD40在非肿瘤B细胞和树突细胞上接合后诱导的增殖形成对比。
除了直接肿瘤抑制之外，CD40信号转导的活化挽救了荷瘤宿主中抗原呈递细胞的功能，并触发或恢复针对肿瘤相关抗原的主动免疫应答。已经报道，CD40激动剂克服荷瘤小鼠中的T细胞耐受性，引起针对肿瘤相关抗原的有效细胞毒性T细胞应答，并增强抗肿瘤疫苗的效力(Eliopoulos AG、Davies C、Knox PG等人，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》，2000；20(15):5503–15；Tong AW、Papayoti MH、Netto G等人，《临床癌症研究(Clin CancerRes)》，2001；7(3):691–703)。
CD40作为分子靶标
CD40在多种恶性细胞上过表达。CD40在肿瘤抑制和免疫***刺激中的作用使得CD40成为基于抗体的免疫疗法的有吸引力的靶标(van Mierlo GJ、den Boer AT、MedemaJP等人，《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci U S A)》，2002；99(8):5561-5566；FrenchRR、Chan HT、Tutt AL、Glennie MJ，《自然医学(Nat Med)》，1999；5(5):548-553)。抗CD40抗体可以经由多种机制对抗癌细胞：(i)抗体效应子功能，例如ADCC，(ii)对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用，和(iii)抗肿瘤免疫应答的活化。
因此，本公开提供了利用抗CD40抗体(例如，APX005M)与第二试剂组合的方法，其中第二试剂是免疫调节剂。在特别优选的实施例中，第二试剂是抗体。
抗CD40治疗性抗体
已经报道，几种抗CD40抗体具有作为抗肿瘤治疗剂的潜力。CP-870,893是由Pfizer开发的全人IgG2CD40激动剂抗体。它以KD 3.48x 10-10M结合CD40，但不阻断CD40L的结合(参见例如美国专利第7,338,660号)。CP-870893未表现出ADCC效应；可能是由于其IgG2同种型。因此，此抗体用作CD40激动剂(即，不影响CD40L结合)，诱导促凋亡信号转导，并活化DC和免疫监视。然而，此抗体不介导ADCC。
HCD122是由Novartis开发的全人IgG1CD40拮抗剂抗体。它以KD 5.1x 10-10M结合到CD40，阻断CD40与CD40L的结合，抑制CD40-配体诱导的信号转导和对B细胞和某些原发性CLL和MM细胞的生物学作用(Tai YT等人，《癌症研究(Cancer Res)》，2005年7月1日；65(13):5898-906；Luqman M、Klabunde S等人：《血液(Blood)》，112:711-720,2008)。其体内抗肿瘤作用的主要作用机制是ADCC(Long L等人，2005年，《IMF口述及摘要3(IMF OralPresentation and Abstract No.3)》；《血液(Blood)》，2004年，104(11,第1部分)：摘要3281)。由于其拮抗特征，此抗体可能不直接诱导CD40介导的抗肿瘤免疫应答。
SGN-40是由Seattle Genetics从小鼠抗体克隆S2C6开发的人源化IgG1抗体，其使用人膀胱癌细胞系作为免疫原产生。它以KD 1.0x 10-9M结合到CD40，并通过增强CD40和CD40L之间的相互作用起作用，从而表现出部分激动剂作用(Francisco JA等人，《癌症研究(Cancer Res)》，60:3225-31,2000)。SGN-40向来自高级非霍奇金淋巴瘤和MM细胞的一组B淋巴瘤细胞系递送增殖抑制和凋亡信号(Tai YT、Catley LP、Mitsiades CS等人，《癌症研究(Cancer Res)》，2004；64(8):2846-2852)。体外和体内研究表明，经由ADCC的凋亡信号转导和抗体效应子功能都有助于SGN-40的抗肿瘤活性(Law CL、Gordon KA、Collier J等人：《癌症研究(Cancer Res)》，2005；65:8331-8338)。最近的一项研究表明，SGN-40的抗肿瘤活性显著依赖于Fc与效应细胞的相互作用，并且巨噬细胞是有助于其治疗活性的主要效应子(Oflazoglu E等人，《英国癌症杂志(Br J Cancer)》，2009年1月13日；100(1):113-7，2008年12月9日电子公布)。由于SGN-40是部分激动剂并且需要在T细胞上表达CD40L，因此SGN-40可能具有有限的完全增强抗肿瘤免疫应答的能力。
组合中的抗CD40抗体
本文可以使用的抗CD40抗体包含但不限于APX005(Apexigen)、APX005M(Apexigen)、CP-870,893(Pfizer)；SGN-40(Seattle Genetics)；和ADC-1013(AlligatorBioscience)。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。
本文提供了使用结合CD40的抗体与第二治疗剂组合的治疗方法，如下文更详细描述。在一个实施例中，向患有涉及CD40不适当表达的疾病的患者施用本发明的组合，所述涉及CD40不适当表达的疾病在本公开的上下文中旨在包含以异常CD40表达或活性为特征的疾病和病症，例如由于存在的蛋白质的量的改变(例如，统计学上显著的增加或减少)，或突变蛋白质的存在，或两者皆有。过多可能是由于任何原因引起的，包含但不限于分子水平的过表达，作用部位的长时间或累积存在，或CD40相对于正常可检测活性增加(例如，以统计学上显著的方式)的活性。可以相对于CD40信号转导事件的正常表达、存在或活性测量这种过多的CD40，并且所述测量可以在本文描述的抗体的开发和/或临床测试中起重要作用。
本组合可用于治疗多种癌症。在某些实施例中，本文描述的抗体通过活化抗肿瘤免疫应答来发挥抗肿瘤活性。在某些实施例中，本发明的抗体可用于治疗与CD40异常表达相关的多种癌症。在本发明的一个实施例中，提供了一种用于通过向癌症患者施用治疗有效量的本文公开的CD40特异性抗体组合来治疗癌症的方法，所述癌症包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。在施用之后，以统计学上显著的方式(即，相对于本领域技术人员已知的适当对照)抑制、预防或延迟癌症的进展和/或转移的量被认为是有效的。
另一个实施例提供了一种用于通过向癌症患者施用治疗有效量的本文公开的CD40特异性抗体组合(例如，在施用之后，以统计学上显著的方式(即，相对于本领域技术人员已知的适当对照)抑制、预防或延迟癌症的转移的量)来预防癌症转移的方法，所述癌症包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
另一个实施例提供了一种用于通过向癌症患者施用治疗有效量的本文公开的CD40特异性抗体组合来预防癌症的方法，所述癌症包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
另一个实施例提供了一种用于通过向患有以下疾病中的一种或多种的患者施用治疗有效量的本文公开的CD40特异性抗体组合来治疗疾病、改善其症状、抑制其进展或预防疾病的方法，所述疾病为非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
另一个实施例提供了一种用于通过向患有这些疾病中的一种或多种的患者施用治疗有效量的本文公开的抗CD40抗体组合来治疗自身免疫性疾病、改善其症状、抑制其进展或预防自身免疫性疾病的方法。在这方面，自身免疫性疾病包含但不限于关节炎(包含类风湿性关节炎、反应性关节炎)、***性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣和炎性肠病(IBD)、脑脊髓炎、葡萄膜炎、重症肌无力、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、艾迪生氏病、乳糜泻、慢性疲劳综合征、自身免疫性肝炎、自身免疫性脱发、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、纤维肌痛、寻常型天疱疮、干燥综合征、川崎病、甲状腺功能亢进/格雷夫斯病、甲状腺功能减退/桥本病、子宫内膜异位、硬皮病、恶性贫血、肺出血-肾炎综合征、格林-巴利综合征、韦格纳病、肾小球肾炎、再生障碍性贫血(包含多输血再生障碍性贫血患者)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、伊文氏综合征、因子VIII抑制剂综合征、***性血管炎、皮肌炎、多肌炎和风湿热、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性大疱性类天疱疮、帕金森病、结节病、白癜风、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性心肌炎。
另一个实施例提供了一种用于通过向患有炎性疾病中的一种或多种的患者施用治疗有效量的本文公开的抗CD40抗体组合来治疗炎性疾病、改善其症状、抑制其进展或预防炎性疾病的方法。炎性疾病包含但不限于克罗恩病、结肠炎、皮炎、牛皮癣、憩室炎、肝炎、肠易激综合征(IBS)、红斑狼疮、肾炎、帕金森病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默病、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘和各种心血管疾病(例如，动脉粥样硬化和血管炎)。在某些实施例中，炎性疾病选自以下组成的组：类风湿性关节炎、糖尿病、痛风、隐热蛋白相关周期综合征和慢性阻塞性肺病。
抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂
CD40是一种重要的刺激性免疫检查点分子，而例如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)、程序性死亡配体1(PD-L1或CD274或B7同系物1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4或CD152)和T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA或PD-1H或Dies1或血小板受体Gi24或SISP1或C10orf54或B7-H5)的分子是抑制性免疫检查点分子。也就是说，这些分子抑制或下调免疫应答。
本发明的一个方面涉及使用免疫检查点抑制剂激动CD40和拮抗抑制性免疫检查点分子的方法。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂是抗体。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。PD-1抑制剂的实例包含但不限于纳武单抗和帕博利珠单抗。PD-L1抑制剂的一个实例包含但不限于阿特珠单抗。CTLA-4抑制剂的一个实例包含但不限于依匹单抗。抗VISTA抗体的一个实例包含但不限于h29G7和h14D8。
抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂的组合在治疗癌症中特别有用。在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
因此，本公开的一个方面提供了一种用于治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制癌细胞的增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制肿瘤的生长的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导针对癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的另一方面提供了一种用于在患者中活化树突细胞的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的一个方面提供了一种用于在患者中活化抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
另外，提供了活化APC和/或T细胞的体外和离体方法，其包括使细胞与抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂接触。
本公开的另一方面提供了一种用于活化抗原呈递细胞的方法，其包括使树突细胞与抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂接触。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中增加T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)产生的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂组合物
本发明提供了组合物，其包括抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的一个方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和PD-1抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一个实施例中，PD-1抑制剂是纳武单抗或帕博利珠单抗。
本公开的另一方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和PD-L1抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施例中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗。
本公开的一个方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和CTLA-4抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，CTLA-4抑制剂是抗CTLA-4抗体。在一个实施例中，CTLA-4抑制剂是依匹单抗。
本公开的另一方面提供了一种组合物，其包括抗CD40抗体和VISTA抑制剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，VISTA抑制剂是抗VISTA抗体。在一个实施例中，抗VISTA抗体是h29G7或h14D8。
抗CD40抗体和先天免疫活化剂
本公开的另一方面提供了激动CD40和先天免疫活化剂(例如，toll样受体4(TLR-4或CD284))的方法。在一个实施例中，先天免疫活化剂激动剂是抗体。在某些实施例中，先天免疫活化剂是TLR-4。TLR-4激动剂的一个实例是脂多糖(LPS)。单磷酰脂质A(MPLA)是比LPS毒性更低的TLR-4激动剂。因此，TLR-4激动剂包含例如MPLA和合成MPLA(MPLA)。在某些实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些体外方法中，LPS用作TLR-4激动剂。示例性抗TLR-4抗体是NI-0101。
所述方法特别适用于治疗癌症。在某些实施例中，癌症与异常CD40表达相关。在一个实施例中，癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
本公开的一个方面提供了一种用于治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制癌细胞的增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中抑制肿瘤的生长的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导针对癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的另一方面提供了一种用于在患者中活化树突细胞的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
本公开的一个方面提供了一种用于在患者中活化抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
本公开的另一方面提供了一种用于活化抗原呈递细胞的方法，其包括使树突细胞与抗CD40抗体和TLR-4激动剂接触。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
本公开的一个方面提供了一种用于在患有癌症的患者中诱导T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
本公开的另一方面提供了一种用于在患有癌症的患者中增加T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)产生的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，T细胞是CD8+ T细胞。在一个实施例中，T细胞是CD4+ T细胞。
抗CD40抗体和先天免疫活化剂激动剂组合物
本发明提供了组合物，其包括抗CD40抗体和先天免疫活化剂激动剂。在某些实施例中，先天免疫活化剂是TLR-4。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗TLR-4抗体。在另一个实施例中，TLR-4激动剂是脂多糖(LPS)。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在某些实施例中，抗CD40抗体是APX005M。
因此，在一个实施例中，组合物包括抗CD40抗体和TLR-4激动剂。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ ID NO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。在一个实施例中，抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005。在一个实施例中，抗CD40抗体是APX005M。在一个实施例中，TLR-4激动剂是抗体。在一个实施例中，TLR-4激动剂是MPLA。在一个实施例中，TLR-4激动剂是LPS。在另一个实施例中，TLR-4抗体是NI-0101。
施用
本公开提供了包括组合中的CD40特异性抗体的组合物以及此组合物在各种治疗环境中的施用。在某些实施例中，在施用免疫检查点抑制剂之前施用抗CD40抗体。在其它实施例中，在施用免疫检查点抑制剂之后施用抗CD40抗体。在另一个实施例中，抗CD40抗体与免疫检查点抑制剂同时施用。
以纯的形式或在合适的药物组合物中施用本文描述的抗体可以经由任何可接受的试剂施用方式进行，以用于类似的用途。药物组合物可以通过将抗体或含有抗体的组合物与适当的生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气溶胶。此外，其它药物活性成分(包含如本文其它地方描述的其它抗癌剂)和/或合适的赋形剂(例如，盐、缓冲剂和稳定剂)可以存在于组合物中，但非必须。可以通过各种不同途径实现施用，包含口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮内、皮下或局部施用。优选的施用方式取决于待治疗或预防的病状的性质。在施用之后，减少、抑制、预防或延迟癌症的进展和/或转移的量被认为是有效的。
在某些实施例中，施用的量足以导致肿瘤消退，如通过活肿瘤量的统计学显著降低(例如，肿瘤质量降低至少50％)表明或通过扫描尺寸改变(例如，有统计显著性地减少)表明。在其它实施例中，施用的量足以导致熟练临床医生已知的特定疾病适应症的临床相关性减轻。
精确的剂量和治疗持续时间随所治疗疾病而变化，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过在本领域已知的模型***中测试组合物并从中推断来确定。也可以进行受控的临床试验。剂量也可能随待缓解的病状的严重程度而变化。通常配制并施用药物组合物以发挥治疗上有用的效果，同时使不希望的副作用最小化。所述组合物可以一次施用，或者可以分成多次较小的剂量，每隔一段时间施用。对于任何特定受试者，可以根据个体需要随时间调整具体的剂量方案。
含有抗体的组合物可以单独施用或与其它已知的癌症治疗(例如，放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等)组合施用。组合物也可以与抗生素联合施用。
因此，施用这些和相关药物组合物的典型途径包含但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、***和鼻内。如本文使用的术语肠胃外包含皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。配制根据本发明某些实施例的药物组合物，以使其中含有的活性成分在将组合物施用于患者之后是生物可利用的。将施用于受试者或患者的组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单剂量单位，并且气溶胶形式的抗体的容器可以容纳多个剂量单位。制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或者将是显而易见的；例如，参见《雷明登：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》第20版(费城药学与科学学院，2000年)。在任何情况下，待施用的组合物将含有治疗有效量的本公开的抗体，以用于根据本文的教导治疗目标疾病或病状。
药物组合物可以是固体或液体形式。在一个实施例中，载剂是颗粒状的，使得组合物例如是片剂或粉末形式。载剂可以是液体，组合物是例如口服油、可注射液体或气溶胶，其可用于例如吸入施用。当旨在用于口服施用时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、混悬液和凝胶形式作为固体或液体包含在本文考虑的形式中。
作为用于口服施用的固体组合物，可以将药物组合物配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、干糊片(wafer)等。这种固体组合物通常将含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。此外，可以存在以下的一种或多种：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，例如海藻酸、海藻酸钠、普莱默胶(Primogel)、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或桔味香精；和着色剂。当药物组合物为胶囊(例如，明胶胶囊)形式时，除了上述类型的材料外，它还可能含有液体载剂(例如，聚乙二醇或油)。
药物组合物可以是液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或混悬液。作为两个实例，液体可以用于口服施用或通过注射递送。当旨在用于口服施用时，除本发明化合物外，优选的组合物还含有甜味剂、防腐剂、染料/色素和增味剂中的一种或多种。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、混悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
无论是溶液、混悬液还是其它类似形式，液体药物组合物可以包含一种或多种下列佐剂：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，固定油，例如可用作溶剂或混悬介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和调节渗透压的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射药物组合物优选是无菌的。
用于肠胃外或口服施用的液体药物组合物应含有一定量的本文公开的抗体，以便获得合适的剂量。通常，此量为组合物中至少0.01％的抗体。当旨在用于口服施用时，此量可以变化为组合物重量的0.1到约70％。某些口服药物组合物含有约4％到约75％的抗体。在某些实施例中，制备根据本发明的药物组合物和制剂，使得肠胃外剂量单位在稀释之前含有0.01到10重量％的抗体。
药物组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载剂可以适当地包括溶液、乳液、软膏或胶状基质。例如，基质可以包括以下的一种或多种：矿物脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(例如，水和醇)、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的药物组合物中。如果旨在用于透皮施用，组合物可以包含透皮贴剂或离子电渗疗法装置。药物组合物可以旨在以例如栓剂形式用于直肠施用，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有油性基质作为合适的无刺激性赋形剂。此类基质包含但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
药物组合物可以包含各种材料，其改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可以包含在活性成分周围形成涂层壳的材料。形成涂层壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。可替代地，可以将活性成分包裹在明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可以包含与本发明的抗体结合的试剂，从而有助于化合物的递送。可以以这种能力起作用的合适的试剂包含其它单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。可以作为气溶胶施用的药物组合物可以基本上由多个剂量单位组成。术语气溶胶用于表示从胶体性质的***到由加压包装组成的***的各种***。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适泵***进行递送。气溶胶可以以单相、双相或三相***递送，以便递送活性成分。气溶胶的递送包含必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，它们一起可以形成试剂盒。本领域普通技术人员无需过多实验即可确定优选的气溶胶。
药物组合物可以通过药学领域熟知的方法制备。例如，旨在通过注射施用的药物组合物可以通过将包括如本文所述的CD40特异性抗体和任选的盐、缓冲剂和/或稳定剂中一种或多种的组合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液来制备。可以加入表面活性剂以促进均相溶液或混悬液的形成。表面活性剂是与抗体组合物非共价相互作用以促进抗体在水性递送***中的溶解或均相混悬的化合物。
组合物可以以治疗有效量施用，其将取决于多种因素而变化，所述因素包含所用特定化合物(例如，CD40特异性抗体)的活性；化合物的代谢稳定性和作用长度；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的方式和时间；***率；药物组合；特定病症或病状的严重程度；和受试者接受的疗法。通常，治疗有效日剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即0.07mg)到约100mg/kg(即7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.01mg/kg(即0.7mg)到约50mg/kg(即3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约1mg/kg(即70mg)到约25mg/kg(即1.75g)。
本文描述的抗体组合物还可以在施用一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后施用。这种组合疗法可以包含含有本发明化合物和一种或多种另外的活性剂的单次药物剂量制剂的施用，以及包括本发明的抗体和在其自身单独的药物剂量制剂中的每种活性剂的组合物。例如，如本文所述的抗体和其它活性剂可以在单次口服剂量组合物(例如，片剂或胶囊)中一起施用于患者，或者每种试剂以单独的口服剂量制剂施用。类似地，如本文所述的抗体和其它活性剂可以在单次肠胃外剂量组合物中(例如，在盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液中)一起施用于患者，或者每种试剂以单独的肠胃外剂量制剂施用。当使用单独的剂量制剂时，包括抗体和一种或多种另外的活性剂的组合物可以在基本相同的时间(即同时地)或在相互错开的时间(即顺序地)并以任何顺序施用；组合疗法应被理解为包含所有这些方案。
因此，在某些实施例中，还考虑了将本公开的抗体组合物与一种或多种其它治疗剂组合施用。本领域可以接受此类治疗剂作为如本文所述的特定疾病状态(例如，类风湿性关节炎、炎症或癌症)的标准治疗。考虑的示例性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂或其它活性和辅助剂。
在某些实施例中，抗体可以与任何数量的化学治疗剂联合施用。化学治疗剂的实例包含烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；氨基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，例如苯并多巴、卡波醌、美妥多巴和乌瑞多巴；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包含六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，例如瘤可宁、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比星、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非罗霉素、嘌呤霉素、奎那霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如迪诺特宁、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫米嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝斯布西；比生群；艾达曲克；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫比达摩；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK.RTM；雷佐生；西佐喃；螺环锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；***糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，普林斯顿，新泽西州)和多西他赛(Rhne-Poulenc Rorer，安东尼，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺凡特龙；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物例如，TargretinTM(贝沙罗汀)、PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯佩拉霉素；卡培他滨；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义还包含用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，例如抗***，包含例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、三氧杂环己烯、凯奥昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
多种其它治疗剂可以与本文描述的抗CD40抗体组合组合物联合使用。在一个实施例中，抗体与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物包含但不限于类固醇和糖皮质激素(包含倍他米松、布***、***、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基***龙、***龙、***、曲安西龙)，非类固醇抗炎药物(NSAIDS)包含阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。
示例性NSAID选自以下组成的组：布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂(例如，(罗非昔布)和(塞来昔布))和唾液酸盐。示例性镇痛药选自以下组成的组：对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧芬曲马多。示例性糖皮质激素选自以下组成的组：可的松、***、氢化可的松、甲基***龙、***龙或***。示例性生物反应调节剂包含针对细胞表面标志物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂(例如，TNF拮抗剂(例如，依那西普阿达木单抗和英夫利昔单抗))、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应调节剂包含单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性DMARD包含硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟基氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。
在某些实施例中，本文描述的抗体与细胞因子联合施用。如本文使用的“细胞因子”是指由一种细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一种细胞的蛋白质的通用术语。此类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包含生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体化激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质；小鼠***相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；***-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨生成诱导因子；干扰素，例如干扰素-α、β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包含LIF和kit配体(KL)。如本文使用，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
包括抗体的组合物可以施用于患有如本文所述的疾病的个体，所述疾病包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、***癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病、自身免疫性和炎性疾病。自身免疫性疾病包含但不限于关节炎(包含类风湿性关节炎、反应性关节炎)、***性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣和炎性肠病(IBD)、脑脊髓炎、葡萄膜炎、重症肌无力、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、艾迪生氏病、乳糜泻、慢性疲劳综合征、自身免疫性肝炎、自身免疫性脱发、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、纤维肌痛、寻常型天疱疮、干燥综合征、川崎病、甲状腺功能亢进/格雷夫斯病、甲状腺功能减退/桥本病、子宫内膜异位、硬皮病、恶性贫血、肺出血-肾炎综合征、格林-巴利综合征、韦格纳病、肾小球肾炎、再生障碍性贫血(包含多输血再生障碍性贫血患者)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、伊文氏综合征、因子VIII抑制剂综合征、***性血管炎、皮肌炎、多肌炎和风湿热、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性大疱性类天疱疮、帕金森病、结节病、白癜风、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性心肌炎。
炎性疾病包含但不限于克罗恩病、结肠炎、皮炎、牛皮癣、憩室炎、肝炎、肠易激综合征(IBS)、红斑狼疮、肾炎、帕金森病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症(MS)、阿尔茨海默病、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘和各种心血管疾病(例如，动脉粥样硬化和血管炎)。在某些实施例中，炎性疾病选自以下组成的组：类风湿性关节炎、糖尿病、痛风、隐热蛋白相关周期综合征和慢性阻塞性肺病。在这方面，一个实施例提供了一种用于通过向有需要的患者施用治疗有效量的包括抗CD40抗体的本文公开的组合物来治疗炎症或炎性疾病、降低其严重程度或预防炎症或炎性疾病的方法。
对于人类疾病治疗的体内用途，本文描述的抗体通常在施用之前掺入药物组合物中。药物组合物包括一种或多种本文描述的抗体与生理学上可接受的载剂或赋形剂的组合，如本文其它地方描述。为了制备药物组合物，将有效量的一种或多种化合物与本领域技术人员已知的适合于特定施用方式的任何药物载剂或赋形剂混合。药物载剂可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部施予的溶液或混悬液可以包含例如无菌稀释剂(例如，水)、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂(例如，苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(例如，乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用，合适的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物。
包括如本文所述的抗体的组合物可以用保护抗体免于从体内快速消除的载剂制备，例如定时释放制剂或包衣。此类载剂包含控释制剂，例如但不限于植入物和微囊化递送***，和可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、PEG、聚原酸酯、聚乳酸和本领域普通技术人员已知的其它聚合物。
实例
实例1
通过APX005M和抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的组合治疗增强CD8+ T细胞应答
为了检查激动性抗CD40抗体与其它免疫肿瘤治疗剂(I-O剂)组合使用时的效果，检查了激动性抗CD40抗体和免疫点抑制剂(抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)的共刺激。
将来自人外周血单核细胞(PBMC)的单核细胞源树突细胞(DC)与连续稀释的激动性抗CD40抗体一起培养24小时。使用以下抗CD40抗体：APX005M(Apexigen)；CP-870,893(Pfizer)；SGN-40(Seattle Genetics)；和ADC-1013(Alligator Bioscience)。起始浓度为10nM，使用三倍稀释生成八个总数据点。
从PBMC分离同种异体CD8+ T细胞，用eFluor 670标记并按以下方式加入DC培养物中：1)单独加入，或者与2)抗PD-L1抗体(小鼠抗人PD-L1，Biolegend)、3)小鼠同型对照抗体或4)抗PD-1抗体(人IgG1骨架上的纳武单抗，Invivogen)一起加入。以10nM加入检查点抑制剂抗体。
最初，检查了APX005M与抗PD-1或抗PD-L1的组合。通过FACS测量细胞增殖(图1和图2A)。培养6天后，收获上清液并冷冻用于IFN-γELISA分析(图2B和图3)。这些结果表明，APX005M与抗PD-1或抗PD-L1的组合增强了CD8+ T细胞应答，包含细胞增殖和INF-γ产生。
接下来，用一组激动性抗CD40抗体(包含APX005M；CP-870,893；SGN-40；和ADC-1013)培养DC。来自人PBMC的单核细胞源DC用抗CD40抗体培养24小时，然后与CD8+ T细胞一起培养。共培养6天后，通过FACS测量T细胞的增殖(图4)。
利用同一组抗CD40抗体，使用与抗PD-1或抗PD-L1的组合来检查如上所述的IFN-γ产生。与抗PD-L1抗体的组合的结果示出在图5中，与抗PD-1抗体的组合的结果示出在图6中。这些结果表明，与包含其它测试的抗CD40抗体的组合相比，APX005M与抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体组合诱导了由CD8+ T细胞进行的IFN-γ产生的显著增加。
实例2
通过APX005M和抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的组合治疗增强CD4+ T细胞应答
为了检查激动性抗CD40抗体与另一种免疫肿瘤治疗剂(I-O剂)组合使用时对CD4+T细胞的影响，检查了激动性抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂(抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)的共刺激。
将来自人外周血单核细胞(PBMC)的单核细胞源树突细胞(DC)与连续稀释的激动性抗CD40抗体一起培养24小时。APX005M(Apexigen)是使用的抗CD40抗体。APX005M的起始浓度为10nM，使用三倍稀释生成八个总数据点。
从PBMC中分离同种异体CD4+ T细胞，并按以下方式加入DC培养物中：1)单独加入，或者与2)抗PD-L1抗体(小鼠抗人PD-L1，Biolegend)、3)小鼠同型对照抗体或4)抗PD-1抗体(人IgG1骨架上的纳武单抗，Invivogen)一起加入。以10nM加入检查点抑制剂抗体。
培养6天后，收获上清液并冷冻用于IFN-γELISA分析(图7)。结果表明，APX005M与抗PD-1或抗PD-L1的组合增强了CD4+ T细胞应答。
实例3
APX005M和抗PD-L1抗体协同增强T细胞对病毒抗原的应答
为了确定APX005M和抗PD-L1抗体的组合是否改变T细胞对病毒抗原的应答，将分离的人PBMC以每孔50万个细胞(每毫升250万个)接种在96孔平底板中，并在1ug/mL(0.6nM)巨细胞病毒(CMV)pp65肽(Miltenyi Biotech，130-039-438)和抗体存在下培养5天。APX005M以1ng/mL(6.7pM)使用，抗PD-L1(Biolegend，329710)以0.1μg/mL或1μg/mL(0.67或6.7nM)使用。PBMC与仅APX005M、仅抗PD-L1、APX005M和0.67nM的抗PD-L1、或APX005M和6.7nM抗PD-L1一起培养。在没有抗体的情况下培养两个对照组，其中一组具有病毒肽池，一个没组。所有条件重复三次。5天后，收获上清液并通过ELISA(R&D Systems，DY285)评估IFN-γ(图8)。
这些结果表明，APX005M和抗PD-L1抗体协同增强了响应于病毒抗原的INF-γ产生。
实例4
APX005M和抗PD-1抗体对T细胞应答的刺激
为了确定APX005M和抗PD-1抗体的组合对T细胞增殖的影响是否分别与各种试剂不同，进行混合淋巴细胞反应(MLR)。
将用抗体(APX005M，抗PD-1(Biolegend，329912)或APX005M和抗PD-1)刺激的来自人PBMC的50,000个单核细胞源DC与用细胞示踪紫(Cell Trace Violet)标记的200,000个HLA错配应答子CD4+ T细胞共培养。将MLR在96孔平底板中培养5天。APX005M以10ng/mL(6.7nM)使用，抗PD-1抗体以100ng/mL(67nM)使用。所有条件重复三次。使用MACSQuant分析仪在第5天评估紫色染料稀释度(图9)。
这些结果表明，与单独使用的每种抗体相比，APX005M和抗PD-1抗体的组合诱导了增加的T细胞增殖。
实例5
APX005M和抗CTLA-4抗体对T细胞应答的刺激
为了确定APX005M和不同免疫检查点抑制剂的组合是否与如前一实例中所述的APX005M和抗PD-1具有相同的对T细胞增殖的影响，使用APX005M和抗CTLA-4抗体(Biolegend，349904)进行混合淋巴细胞反应(MLR)。
简而言之，将用抗体(APX005M、抗CTLA-4或APX005M和抗CTLA-4)刺激的来自人PBMC的50,000个单核细胞源DC与用细胞示踪紫标记的200,000个HLA错配应答子CD4+ T细胞共培养。将MLR在96孔平底板中培养5天。APX005M以10ng/mL(6.7nM)使用，抗CTLA-4抗体以100ng/mL(67nM)使用。所有条件重复三次。使用MACSQuant分析仪在第5天评估紫色染料稀释度(图10)。
前面的研究已经表明，APX005M作为单一试剂可以增强抗原特异性T细胞应答。此研究表明，APX005M与免疫检查点抑制剂(包含抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1)结合以进一步增强T细胞的抗原特异性活化。
实例6
APX005M和TLR-4激动剂协同刺激DC活化
前面的研究已经表明，APX005M作为单一试剂可以活化DC。为了确定APX005M是否与先天免疫活化剂结合，使用TLR-4激动剂脂多糖(LPS)。
将来自人PBMC的单核细胞源DC与APX005M、LPS或APX005M和LPS一起培养。APX005M以1nM使用，LPS以1ng/ml使用。通过ELISA检测IL-12和TNF-α的产生来确定DC活化。如图11A和11B所示，APX005M和LPS的组合协同刺激了DC活化。
实例7
APX005M和抗VISTA抗体对T细胞应答的刺激
为了确定APX005M和抗VISTA抗体的组合是否对T细胞应答有影响，进行混合淋巴细胞反应(MLR)以评价抗VISTA mAb在APX005M诱导的T细胞应答中的作用。在这些研究中使用两种实验性抗VISTA抗体h29G7和h14D8(Apexigen)。
简而言之，从获自健康志愿者的PBMC中分离人CD14单核细胞，并在GM-CSF和IL-4存在下培养一周以生成髓样树突细胞(DC)。分离同种异体人CD4T细胞，在存在或不存在APX005M(剂量滴定10nM，3倍稀释，8个数据点)和人抗VISTA抗体h29G7和h14D8(均为100nM)的情况下培养DC和T细胞6天。还使用IgG1同型对照抗体。收获培养物上清液并通过ELISA评估IFN-γ。两个示例性实验的结果示出在图12A和12B中。如图所示，抗VISTA抗体在混合淋巴细胞反应中增强了APX005M诱导的T细胞应答。
接下来，确定APX005M和抗VISTA抗体的组合是否对T细胞对葡萄球菌肠毒素B(SEB)的应答有影响。从健康供体分离PBMC，并以每孔200,000个细胞接种在96孔平底板中。在存在或不存在仅指定浓度的抗VISTA抗体(h29G7或h14D8)或其与10ng/mL APX005M的组合的情况下，用100ng/mL SEB刺激细胞。培养4天后，收集细胞上清液并通过ELISA(R&DSystems)测定IFN-γ。两个示例性实验的结果示出在图13A和13B中。数据以同型对照的百分比呈现。这些结果表明，APX005M和抗VISTA抗体的组合增强了T细胞对SEB的应答。
可以组合上述各个实施例以提供另外的实施例。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。如果需要采用各个专利、申请和出版物的概念，可以修改实施例的各个方面以提供另外的实施例。
根据以上详细描述，可以对实施例进行这些和其它更改。通常，在以下权利要求中，使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的具体实施例，而是应被解释为包含所有可能的实施例以及由此类权利要求赋权的全部范围的等同物内容。因此，权利要求不受本公开的限制。
序列表
<110> 埃派斯进有限公司
P·比约克
E·L·菲尔伯特
X·杨
<120> 组合中的抗CD40抗体及其使用方法
<130> 037050-8010CN01
<150> US 62/416,554
<151> 2016-11-02
<160> 9
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 家兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 1
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr Val Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 家兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 2
Cys Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Thr Asn Tyr Ser Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 家兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 3
Pro Asp Ile Thr Tyr Gly Phe Ala Ile Asn Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 家兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 4
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 家兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 5
Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 家兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 6
Gln Cys Thr Gly Tyr Gly Ile Ser Trp Pro
1 5 10
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> APX005的VH区
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Val Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Thr Asn Tyr Ser Ala Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Asp Ile Thr Tyr Gly Phe Ala Ile Asn Phe Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> APX005的VL区
<400> 8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Ser Ser Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys
100 105 110
Thr Gly Tyr Gly Ile Ser Trp Pro Ile Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys
130
<210> 9
<211> 322
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys

Claims (52)

1.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
2.一种用于在患有癌症的患者中抑制癌细胞的增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
3.一种用于在患有癌症的患者中抑制肿瘤的生长的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
4.一种用于在患有癌症的患者中诱导癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
5.一种用于在患有癌症的患者中诱导针对癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
6.一种用于在患者中活化树突细胞的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
7.一种用于在患者中活化抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
8.一种用于活化抗原呈递细胞的方法，其包括使树突细胞与抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂接触。
9.一种用于在患有癌症的患者中诱导T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
10.一种用于在患有癌症的患者中增加T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)产生的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。
12.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述抗CD40抗体是APX005M。
13.根据权利要求1到5、9和10中任一项所述的方法，其中所述癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
14.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
15.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
16.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
17.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
18.一种用于在患有癌症的患者中抑制癌细胞的增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
19.一种用于在患有癌症的患者中抑制肿瘤的生长的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
20.一种用于在患有癌症的患者中诱导癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
21.一种用于在患有癌症的患者中诱导针对癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
22.一种用于在患者中活化树突细胞的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
23.一种用于在患者中活化抗原呈递细胞(APC)的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
24.一种用于活化抗原呈递细胞的方法，其包括使树突细胞与抗CD40抗体和免疫检查点抑制剂和TLR-4激动剂接触。
25.一种用于在患有癌症的患者中诱导T细胞增殖的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
26.一种用于在患有癌症的患者中增加T细胞的干扰素-γ(IFN-γ)产生的方法，其包括向所述患者施用组合物，所述组合物包括生理学上可接受的载剂和治疗有效量的抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
27.根据权利要求17到26中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和抗VISTA抗体。
28.根据权利要求17到26中任一项所述的方法，其中所述抗CD40抗体是APX005M。
29.根据权利要求17到21、25和26中任一项所述的方法，其中所述癌症选自以下组成的组：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子***、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性黑素瘤和利妥昔单抗耐药性NHL和白血病。
30.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。
31.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
32.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
33.一种组合物，其包括抗CD40抗体和PD-1抑制剂。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中所述PD-1抑制剂是纳武单抗或帕博利珠单抗。
36.一种组合物，其包括抗CD40抗体和PD-L1抑制剂。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述PD-L1抑制剂是阿特珠单抗。
39.一种组合物，其包括抗CD40抗体和CTLA-4抑制剂。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述CTLA-4抑制剂是抗CTLA-4抗体。
41.根据权利要求39所述的组合物，其中所述CTLA-4抑制剂是依匹单抗。
42.一种组合物，其包括抗CD40抗体和VISTA抑制剂。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述VISTA抑制剂是抗VISTA抗体。
44.一种组合物，其包括抗CD40抗体和TLR-4激动剂。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述TLR-4激动剂是单磷酰脂质A(MPLA)。
46.根据权利要求44所述的组合物，其中所述TLR-4激动剂是LPS。
47.根据权利要求44所述的组合物，其中所述TLR-4抗体是NI-0101。
48.根据权利要求33到47中任一项所述的组合物，其中所述抗CD40抗体包括包括SEQID NO:1的VHCDR1、包括SEQ ID NO:2的VHCDR2、包括SEQ ID NO:3的VHCDR3；包括SEQ IDNO:4的VLCDR1、包括SEQ ID NO:5的VLCDR2和包括SEQ ID NO:6的VLCDR3。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:7的重链可变区。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:8的轻链可变区。
51.根据权利要求49所述的组合物，其中所述抗CD40抗体包括包括SEQ ID NO:9的重链恒定区。
52.根据权利要求33到47中任一项所述的组合物，其中所述抗CD40抗体是APX005M。
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