PL202058B1

PL202058B1 - Wielofunkcyjne białko fuzyjne cytokin i przeciwciała

Info

Publication number: PL202058B1
Application number: PL353348A
Authority: PL
Inventors: Stephen D. Gillies; Kin Ming Lo
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2009-05-29
Also published as: EP1200479B1; DE60025832D1; AU778611B2; NO20020641D0; KR20020026368A; NO20020641L; CN1235911C; ZA200200789B; MXPA02001417A; CA2380331C; BR0013231A; US20070258944A1; HUP0202442A2; ES2256027T3; WO2001010912A1; US20040072299A1; US7582288B2; CN1382158A; EP1200479A1; US7141651B2

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest wielofunkcyjne bia lko fuzyjne cytokiny i przeciwcia la, zawieraj ace region immunoglobulinowy oraz cytokinowe bia lko fuzyjne zawieraj ace dwie ró zne cytokiny, gdzie pierwsz a cytokin a jest IL-12 w postaci heterodimeru lub lancucha pojedynczego, a drug a cytokin a, kowalencyjnie zwi azan a z ko ncem aminowym lub karboksylowym podjednostki p35 lub p40 IL-12, jest IL-2 albo GM-CSF, przy czym cytokinowe bia lko fuzyjne jest sprz ezone z ko ncem aminowym lub kar- boksylowym regionu immunoglobulinowego. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wielofunkcyjne białko fuzyjne cytokin i przeciwciała, zawierające region immunoglobulinowy oraz cytokinowe białko fuzyjne zawierające dwie różne cytokiny, gdzie pierwszą cytokiną jest interleukina-12 (IL-12) w postaci heterodimeru lub łańcucha pojedynczego, a drugą cytokiną kowalencyjnie związaną z końcem aminowym lub karboksylowym podjednostki p35 lub p40 IL-12, jest IL-2 albo czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), przy czym cytokinowe białko fuzyjne jest sprzężone z końcem aminowym lub karboksylowym regionu immunoglobulinowego.

System regulujący układ odpornościowy ssaków opiera się na wydzielanych do ustroju cząsteczkach białek sygnałowych nazywanych cytokinami, które aktywują lub dezaktywują komórki układu immunologicznego, jak również wpływają na ich namnażanie. Odpowiedzi układu odpornościowego obejmują na ogół wydzielenie wielu różnych cytokin, które działają wspólnie, prowadząc do uzyskania odpowiedniego efektu biologicznego. Niektóre cytokiny, takie jak interleukina-2 (IL-2), mogą same indukować namnażanie komórek odpornościowych, jak również aktywować inne funkcje, włącznie z wtórnym wydzielaniem cytokin. Inna cytokina, interleukina-12 (IL-12) (opisana w pracy przeglądowej Trinchieri'ego, 1994, Blood 84:4008-4027), może indukować namnażanie niektórych komórek odpornościowych oraz aktywować inną kluczową cząsteczkę regulatorową układu immunologicznego, interferon γ (IFN- γ). Indukowanie IFN- γ jest główną aktywnością IL-12, mimo, że IL-12 również wpływa na inne ważne funkcje, które są niezależne od IFN- γ. Ponieważ sama IL-12 ulega indukcji na wczesnym etapie odpowiedzi związanych z chorobą zakaźną to uważa się, że stanowi ona łącznik pomiędzy wrodzonym i nabytym układem odpornościowym.

W wielu badaniach in vitro z użyciem mysich i ludzkich komórek odpornościowych wykazano, jak ważne jest wspólne działanie cytokin w uzyskaniu optymalnej odpowiedzi odpornościowej. Na przykład większość typów limfocytów T nie wykazuje ekspresji receptorów IL-12 (IL-12R), jeśli limfocyty te nie zostaną aktywowane przez mitogeny albo nie będą hodowane przy wysokich stężeniach IL-2 (Desai i wsp. (1992), J. Immunol. 1478:3125-3132). Wystąpienie ekspresji receptora, powoduje, że limfocyty stają się o wiele bardziej wrażliwe na IL-12. IL-12 indukuje ponadto transkrypcję IFN-γ, przy czym mRNA kodujące IFN-γ szybko ulega degradacji. W obecności IL-2, mRNA ulega stabilizacji, prowadząc do dramatycznego wzrostu wytworzonego IFN-γ (Chan i wsp. (1992) J. Immunol. 148:92-98). W innych badaniach ustalono, że połączenie cytokiny IL-3 z IL-11 albo IL-3 z czynnikiem Steela działały synergistycznie z IL-12 na namnażanie prekursorowych wczesnych komórek krwiotwórczych (Trinchieri, 1994, jak wyżej). Połączenie interleukiny-4 i GM-CSF jest szczególnie użyteczne do stymulowania komórek dendrytycznych (Palucka i wsp. (1998) J. Immunology 160:4587-4595). Do stymulacji odpowiedzi odpornościowej, w której pośredniczą komórki, użyteczne jest połączenie IL-12 z IL-18, odkrytą obecnie cytokiną wzmacniającą limfocyty Th1 pod względem pewnych aktywności, które są komplementarne z IL-12 (Hashomoto i wsp, (1999) J. Immunology 163:583-589, Barbulescu i wsp, (1998) J. Immunology 160:3642-3647). Ponadto w pewnych okolicznościach IL-2 i interferon γ działają synergistyczne (Palladino, M.A., amerykański opis patentowy nr US 5082658).

W wielu badaniach nad efektem synergistycznym ustalono, że bardzo ważny jest względny poziom każdej z cytokin, natomiast dodanie IL-12 w obecności suboptymalnych ilości IL-2 prowadziło do synergistycznej indukcji namnażania komórek, aktywności cytolitycznej i indukcji IFN-γ, przy czym ustalono, że połączenie IL-2 i IL-12 przy wysokim poziomie jednej z cytokin prowadziło do działań antagonistycznych (Perussia i wsp., J. Immunol. 149:3495-3502 (1992), Mehrotra i wsp., J. Immunol. 151:2444-2452 (1993)). Podobne zjawisko obserwowano także w przypadku połączenia IL-12 i IL-7.

W badaniach działań synergistycznych IL-12 z innymi cytokinami w wywoływaniu odpowiedzi przeciwnowotworowych u myszy uzyskiwano również niejednoznaczne wyniki. W pewnych modelach działanie synergistyczne obserwowano przy suboptymalnych dawkach każdej cytokiny, wyższe dawki prowadziły do zwiększonej aktywności, natomiast w innych modelach połączenie IL-12 i IL-2 prowadziło do nieznacznego efektu synergistycznego albo jego braku (patrz na przykład Nastała i wsp. J. Immunol. 153:1697-1706 (1994)). Przedstawione wyniki odzwierciedlają trudność połączenia dwóch potencjalnie synergistycznych środków in vivo, zwłaszcza gdy istnieje konieczność utrzymywania stałego stosunku aktywności dwóch środków o różnych właściwościach farmakologicznych, np. różny czas półtrwania w układzie krążenia i rozmieszczenie środków w ustroju.

W doświadczeniach prowadzonych na hodowlach komórek in vitro, regulowanie poziomów cytokin jest łatwe, lecz in vivo na względne rozmieszczenie środków w ustroju oraz lokalizację cytokin

PL 202 058 B1 może wpływać wiele czynników, co związane jest z wpływem na zdolność pobudzania odporności przez te cytokiny. Najważniejszym z tych czynników jest okres półtrwania. Czas półtrwania IL-2 w układzie krążenia po podaniu przez wstrzyknięcie jednej dużej dawki wynosi w przybliżeniu 10 minut. Ogromnym kontrastem do tej wartości jest opisany w literaturze okres półtrwania IL-12 w krwioobiegu myszy wynoszący ponad 3 godziny (Wysocka i wsp. (1995) Eur. J. Immunol. 25:672) i od 5 do 10 godzin u ludzi (Lotze i wsp. (1996) Ann NY Acad Sci 795:440-454).

Uważa się, że powyżej opisana różnica wynika ze stosunkowo niewielkiej cząsteczki zarówno IL-2, jak i GM-CSF (15-25 kD w porównaniu do 75 kD w przypadku IL-12), co umożliwia usunięcie IL-2 i GM-CSF przez nerki. Biał ka o masach czą steczkowych mniejszych niż okoł o 50 kD są usuwane przez nerki. Prawie wszystkie cytokiny są mniejsze niż 50 kD i podlegają podobnemu, szybkiemu usuwaniu przez nerki. Jeżeli konieczne jest leczenie za pomocą dwóch małych, szybko usuwanych cytokin, wystarczające jest po prostu łączne podawanie cytokin, jednak w przypadku cytokin o znacząco różnych czasach półtrwania łączne podawanie nie jest optymalne.

Układowe podawanie cytokin jest trudne ze względu na ich szkodliwe działania uboczne. Na przykład wysokie poziomy α-interferonu prowadzą do znacznych szkodliwych skutków ubocznych, obejmujących toksyczny wpływ na skórę, toksyczność neurologiczną immunologiczną i endokrynologiczną. Można było spodziewać się, że białko fuzyjne (sprzęganie) wielu cytokin mogłaby wykazywać szczególnie niepożądane skutki uboczne.

W celu zmniejszenia skutków ubocznych przy układowym podawaniu cytokin, jedna ze strategii polega na sprzęganiu cytokiny z cząsteczką ukierunkowującą. Białka fuzyjne, w których obszar Fc znajduje się na końcu N innego białka (nazywane „immunofuzynami” albo białkami fuzyjnymi „Fc-X”, gdzie X oznacza ligand, np α-interferon), mają szereg korzystnych właściwości biologicznych (Lo i wsp., amerykańskie opisy patentowe nr US 57260.44 i US 5541087, Lo i wsp., Białek Engineering 11:495). Bardziej szczegółowo, opisane białka fuzyjne mogą nadal wiązać się ze swoimi receptorami Fc na powierzchni komórek. Jednakże po związaniu ligandu z receptorem na powierzchni komórki, następuje zmiana ustawienia obszaru Fc i zablokowanie sekwencji, które pośredniczą w zależnej od przeciwciała cytotoksyczności w której pośredniczą komórki (ADCC), oraz wiązania dopełniacza. W wyniku, tego obszar Fc w cząsteczce Fc-X nie pośredniczy skutecznie w ADCC albo wiązaniu dopełniacza. Działanie cytotoksyczne w wyniku sprzężenia końca N cytokiny i końca C obszaru Fc jest dobrze znane. Na przykład sprzężenie IL-2 z końcem N obszaru Fc prowadzi do cząsteczki, która jest zdolna do wiązania się z komórkami noszącymi receptor IL-2, wiązania dopełniacza, co prowadzi do lizy komórek (Landolfi, M.F. (1993), amerykański opis patentowy nr US 5349053). Przeciwnie, białka fuzyjne Fc-IL-2 nie wykazują tego działania. Zatem należy spodziewać się, że białka fuzyjne Fc-X będą zdolne do zwiększenia okresu półtrwania środka w surowicy i względnego stężenia w wątrobie, bez szkodliwego działania w wyniku skutków ADCC i wiązania dopełniacza.

Wykazano, że w konfiguracji Fc-X możliwe jest sprzężenie z obszarem Fc wiele różnych białek o krótkich okresach półtrwania w surowicy, w wyniku czego otrzymane białka fuzyjne zyskają znacznie dłuższe okresy półtrwania w surowicy, przy czym jednak okresy półtrwania dwóch różnych białek fuzyjnych Fc nie będą na ogół identyczne. Zatem, jeśli leczenie obejmuje podawanie dwóch różnych czynników X, to na ogół łączne podawanie różnych białek fuzyjnych Fc-X nie będzie dawać optymalnych rezultatów.

W pewnych warunkach lepszym podejściem jest skierowanie działania cytokiny na antygen powierzchniowy komórki, przez jej sprzężenie z przeciwciałem (albo pochodzącym z niego fragmentem), które wykazuje specyficzność i powinowactwo do tego antygenu (Gillies, amerykański opis patentowy nr US 5650150, Gillies i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428) przez związanie wiązaniem peptydowym antygenu białkowego i stymulującej cytokiny w białko fuzyjne (Hatnaza i wsp., Vaccine 11:629). Podczas gdy przeciwciała per se mogą wydłużać okres półtrwania sprzężonej cytokiny, występują jednak różnice pomiędzy różnymi sprzężonymi cytokinami z tym samym przeciwciałem (patrz na przykład Gillies i wsp., Bioconjugate Chem. 4:230-235 (1993), Gillies i wsp., J. Immunol. 160:6195-6203), co może utrudniać kolokalizację w miejscu docelowym. Jak omówiono wyżej, może to prowadzić do naruszenia równowagi w aktywności cytokin i zmniejszenia pożądanych działań synergistycznych. Ponadto stosowanie dwóch różnych białek fuzyjnych wymaga testowania każdego z tych białek fuzyjnych oddzielnie pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności, oraz dalszego badania mieszanin.

Przedmiot wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wielofunkcyjne białko fuzyjne cytokiny i przeciwciała, zawierające region immunoglobulinowy oraz cytokinowe białko fuzyjne zawierające dwie różne cytokiny, gdzie pierw4

PL 202 058 B1 szą cytokiną jest IL-12 w postaci heterodimeru lub łańcucha pojedynczego, a drugą cytokiną kowalencyjnie związaną z końcem aminowym lub karboksylowym podjednostki p35 lub p40 IL-12, jest IL-2 albo GM-CSF, przy czym cytokinowe białko fuzyjne jest sprzężone z końcem aminowym lub karboksylowym regionu immunoglobulinowego.

Korzystnie w wielofunkcyjnym białku fuzyjnym podjednostki p35 i p40 IL12 są sprzężone poprzez linker polipeptydowy.

W korzystnym rozwiązaniu wielofunkcyjnego biał ka fuzyjnego, IL-12 i druga cytokina w cytokinowym białku fuzyjnym są sprzężone poprzez linker polipeptydowy. Korzystniej region immunoglobulinowy i cytokinowe białko fuzyjne są sprzężone poprzez linker polipeptydowy.

Korzystnie w wielofunkcyjnym białku fuzyjnym drugą cytokiną jest IL-2.

W korzystnym rozwią zaniu wielofunkcyjnego biał ka fuzyjnego region immunoglobulinowy obejmuje stały region ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego, zawierający domenę regionu zawiasowego, domenę CH2 i domenę CH3. Korzystniej region immunoglobulinowy jest regionem Fc albo region immunoglobulinowy zawiera dodatkowo domenę CH1. Najkorzystniej region immunoglobulinowy zawiera dodatkowo domenę VH, która jest reaktywna immunologicznie względem antygenem specyficznym nowotworowo lub antygenem wirusowym. W korzystniejszym rozwiązaniu region immunoglobulinowy zawiera dodatkowo lekki łańcuch immunoglobulinowy związany z ciężkim łańcuchem immunoglobulinowym, tworząc nietknięte przeciwciało.

Krótki opis rysunków

Wynalazek został przedstawiony bliżej na rysunkach, w których wspólne odnośniki liczbowe odnoszą się do takich samych struktur.

Figura 1A przedstawia schematycznie białko fuzyjne zawierające dwie cytokiny w najprostszej postaci, w której jedną cytokinę sprzęga się z drugą cytokiną, ewentualnie poprzez linker.

Figury 1B-1I pokazują różne sposoby, według których drugą cytokinę (oznaczoną tutaj „cyt”) sprzęga się z heterodimeryczną cytokiną IL-12. Drugą cytokinę specyficznie z końcem C p40 (fig. 1B), końcem N p40 (fig. 1C), końcem C p35 (fig. ID) albo końcem N p35 (fig. 1E). Ponadto na fig. 1 pokazano, w jaki sposób drugą cytokinę sprzęga się z jednołańcuchową odmianą IL-12. Szczegółowo, cząsteczki jednołańcuchowej IL-12 mogą zawierać p35 na końcu N p40 oraz drugą cytokinę na końcu C (fig. 1F) albo końcu N (fig. 1G). W innym rozwiązaniu cząsteczki jednołańcuchowej IL-12 mogą zawierać p40 na końcu N p35, z drugą cytokiną na końcu C (fig. 1H) albo końcu N (fig. 1I).

Na fig. 2A-2C przedstawiono schemat blokowy, sposobu sprzęgania białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin (prostokąty) przedstawionych na fig. 1, które można dalej sprzęgać z obszarem Fc przeciwciała, pokazanego tu w postaci zawiasu (H), domeną CH2 i domeną CH3 (elipsy). Szczegółowo, każda z ośmiu cząsteczek przedstawionych na fig. 1 może być sprzęgana z końcem C (fig. 2A) albo z końcem N (fig. 2B) obszaru Fc. Ponadto pierwsza i druga cytokina (prostokąt) nie muszą być połączone bezpośrednio, lecz poprzez region Fc (fig. 2C).

Na fig. 3A-3G przedstawiono schematycznie podzbiór sposobów dalszego sprzęgania białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin z niemodyfikowaną immunoglobuliną taką jak IgG. Obszar V ciężkiego łańcucha pokazano jako elipsę i oznaczono VH, natomiast obszar V lekkiego łańcucha pokazano jako elipsę i oznaczono VL, a obszary stałe oznaczono elipsą. Białko fuzyjne, zawierające wiele cytokin przedstawione na fig. 1 może być umieszczone na końcu C ciężkiego łańcucha (fig. 2A), końcu N ciężkiego łańcucha (fig. 2B), końcu N lekkiego łańcucha (fig. 2C) albo końcu C lekkiego łańcucha (fig. 2D). Ponadto istnieje wiele sposobów, oddzielnego połączenia pierwszej i drugiej cytokiny z koń cami N i C ciężkiego i lekkiego ł a ń cucha, z których trzy sposoby przedstawiono na fig. 3E-3G.

Na fig. 4A-4C przedstawiono schematycznie, w jaki sposób dwie cytokiny sprzęga się z „jednołańcuchowym” przeciwciałem, w którym sprzęga się zmienne lekkie i zmienne ciężkie łańcuchy, a białko ulega ekspresji w postaci pojedynczego polipeptydu, który następnie ulega homodimeryzacji. Białko fuzyjne zawierające wiele cytokin można umieścić specyficznie na końcu C (fig. 4A) albo końcu N (fig. 4B). Ponadto nie jest konieczne aby cytokiny były połączone bezpośrednio, lecz mogą być połączone poprzez region przeciwciała jednołańcuchowego (fig. 4C).

Na fig. 5A-5C przedstawiono schematycznie, sposób sprzęgania dwóch cytokin z jednołańcuchowym obszarem Fc składającym się ze sprzężonych zmiennych obszarów pochodzących z ciężkiego łańcucha i lekkiego łańcucha. Białko fuzyjne zawierające pierwsze białko fuzyjne cytokina-cytokina można umieścić specyficznie na końcu C (fig. 5A) albo na końcu N (fig. 5B). Ponadto cytokiny nie muszą być połączone bezpośrednio, lecz mogą być połączone poprzez jednołańcuchowy region Fv (fig. 5C).

PL 202 058 B1

Na fig. 6A i 6B przedstawiono działanie synergistyczne IL-12 i IL-2 przy indukowaniu IFN-γ przez jednojądrowe komórki ludzkiej krwi obwodowej (PBMCs) w odpowiedzi na same cytokiny albo białka fuzyjne. Fig. 6A przedstawia wyniki dla komórek traktowanych ludzką IL-12 przed (kwadraty) albo po (X-y) aktywacji fitohemaglutyniną albo białkiem fuzyjnym IL-12-IL-2 przed (szare romby) albo po (trójkąty) aktywacji fitohemaglutyniną. Na fig. 6B przedstawiono wyniki doświadczenia, w którym komórki traktowano mieszaniną IL-12 z IL-2 dodaną w stosunku molowym 1:1 (czarne romby), białkiem fuzyjnym ludzki-Fc-IL-12-IL-2 (szare kwadraty) i białkiem fuzyjnym ludzkie-przeciwciało-IL-12-IL-2 (jasnoszare trójkąty). Na osi X odłożono stężenie IL-12 w pg/ml, zarówno w postaci niemodyfikowanego białka, czy w postaci białka fuzyjnego. Oś Y pokazuje stężenie IFN-y (w ng/ml), które oznaczano za pomocą ELISA.

Na fig. 7 przedstawiono typowe badanie biologiczne, w którym mierzy się oddzielnie aktywność białka fuzyjnego i porównuje się z aktywnością niesprzężonej cząsteczki IL-12, fig. 7 przedstawia faktyczną stymulacją pobierania przez ludzkie komórki PBMC ³H-tymidyny w odpowiedzi na podanie mysiej IL-12 (białe kółka), mieszaniny mysiej IL-12 z IL-2 dodanej w stosunku molowym 1:1 (czarne kwadraty), mysiej IL-2 (białe trójkąty) i białka fuzyjnego przeciwciało-mysia IL-12-IL-2 (czarne romby). Oś X pokazuje stężenie (pM) cytokiny (cytokin) w postaci monomeru, niezależnie czy jest obecna w postaci niezmodyfikowanego białka, czy w postaci białka fuzyjnego, natomiast na osi y wykreślono zliczenia w cpm wbudowanej trytowanej tymidyny.

Na fig. 8 przedstawiono standardowe badania aktywności biologicznej IL-2. Wykres pokazuje stymulację namnażania komórek CTLL z myszy w odpowiedzi na podanie mysiej IL-2 (kółka), białka fuzyjnego przeciwciało-mysia IL-12-IL-2 (romby) i mysiej IL-12 (kwadraty). Oś X stanowi stężenie (pM) cytokiny (cytokin) w postaci monomeru, niezależnie czy jest obecna w postaci niezmienionego białka, czy w postaci białka fuzyjnego. Komórki poddawano inkubacji przez 48 godzin w środowisku zawierającym różne ilości cytokiny albo białka fuzyjnego, a następnie zliczano żywe komórki w teście MTT/MTS. Oś y pokazuje absorbancję przy 490 nanometrach jako jednostki gęstości optycznej (OD).

Na fig. 9 przedstawiono stymulację wbudowywania ³H-tymidyny przez ludzkie PBMC w odpowiedzi na mysią IL-12 (białe kółka), na mieszaninę mysiej IL-12 z IL-2 dodaną w stosunku molowym 1:1 (czarne kółka), na białko fuzyjne mysi Fc-jednołańcuchowa IL-12-IL-2 (czarne trójkąty) i na mysią jednołańcuchową IL-12 sprzężoną z mysią IL-2 (czarne romby). Oś x pokazuje stężenie (pM) cytokiny (cytokin) w postaci monomeru, niezależnie czy jest obecna w postaci niemodyfikowanego białka, czy w postaci białka fuzyjnego. Oś y pokazuje zliczenia w cpm wbudowanej trytowanej tymidyny.

Na fig. 10 przedstawiono stymulacje pobierania ³H-tymidyny przez ludzkie PBMC w odpowiedzi na mysią IL-12 (białe kółka), na mieszaninę mysiej IL-12 z GM-CSF dodaną w stosunku molowym 1:1 (czarne kółka), na mysi GM-CSF (czarne trójkąty) i na białko fuzyjne mysi Fc-mysia IL-12-GM-CSF (X-y). Oś x pokazuje stężenie (pM) cytokiny (cytokin) postaci monomeru, niezależnie czy jest obecna w postaci niemodyfikowanego białka, czy w postaci białka fuzyjnego. Oś y pokazuje zliczenia w cpm wbudowanej trytowanej tymidyny.

Na fig. 11 przedstawiono wpływ leczenia myszy Balb/C białkiem fuzyjnym przeciwciało-cytokina-cytokina, które cierpią na podskórne nowotwory wytworzone z komórek CT26 raka okrężnicy, które zmodyfikowano genetycznie, uzyskując ekspresję ludzkiego EpCAM, antygenu KS-1/4. Czarne romby pokazują średnie objętości nowotworu u myszy, którym wstrzykiwano w dniu 0, 1, 2, 3 i 4 PBS jako kontrole. Trójkąty pokazują średnie objętości nowotworu u myszy leczonych za pomocą 6 mikrogramów KS-IL-12-IL-2. Kwadraty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy leczonych za pomocą 3,4 mikrograma KS-IL-2 i 5,3 mikrograma KS-IL-12, przy czym białko wprowadzono poprzez zastrzyki donowotworowe. Oś x pokazuje liczbę dni, które upłynęły od pierwszego zastrzyku. Oś y pokazuje średnią objętość nowotworu w milimetrach sześciennych.

Na fig. 12 pokazano wpływ leczenia myszy SCID białkiem fuzyjnym przeciwciało-cytokina-cytokina, cierpiących na podskórne nowotwory wytworzone z komórek rakowych CT26 okrężnicy, które zmodyfikowano genetycznie w celu uzyskania ekspresji ludzkiego EpCAM. Romby pokazują średnie objętości nowotworów u myszy, którym wstrzykiwano w dniu 0, 1, 2, 3 i 4, PBS jako kontrole. Trójkąty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy leczonych za pomocą 6 mikrogramów KS-IL-12-IL-2. Kwadraty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy leczonych za pomocą 3,4 mikrograma KSIL-2 i 5,3 mikrograma KS-IL-12, przy czym białko wprowadzono poprzez zastrzyki donowotworowe. Oś x pokazuje liczbę dni, które upłynęły od pierwszego zastrzyku. Oś y pokazuje średnią objętość nowotworu w milimetrach sześciennych.

PL 202 058 B1

Na fig. 13 porównano wpływ leczenia za pomocą białka fuzyjnego przeciwciało-cytokina i przeciwciało-cytokina-cytokina myszy, które cierpią na nowotwory podskórne wytworzone z komórek raka płuc Lewisa (LCC), które modyfikowano genetycznie w celu uzyskania ekspresji ludzkiego EpCAM. Romby pokazują średnie objętości nowotworów u myszy, którym białko podawano poprzez zastrzyki donowotworowe PBS w dniach 0, 1, 2, 3 i 4. Kwadraty pokazują średnie objętości nowotworu u myszy, którym białko podawano poprzez zastrzyki donowotworowe 20 mikrogramów KS-IL-2 w dniu 0, 1, 2, 3 i 4. Trójkąty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy, którym białko podawano poprzez zastrzyki donowotworowe 20 mikrogramów KS-IL-12 w dniu 0, 1, 2, 3 i 4. X pokazują średnie objętości nowotworów u myszy, którym białko podawano poprzez zastrzyki donowotworowe 20 mikrogramów KS-IL-2 w dniu 0, 1, 2, 3 i 4. Oś x pokazuje liczbę dni, które upłynęły od pierwszego zastrzyku. Oś y pokazuje średnią objętość nowotworów w milimetrach sześciennych.

Na fig. 14 przedstawiono wpływ leczenia białkiem fuzyjnym przeciwciało-cytokina-cytokina myszy, które cierpią na podskórne nowotwory wytworzone z komórek raka płuc Lewisa, zmodyfikowanych genetycznie w celu uzyskania ekspresji ludzkiego EpCAM. Romby pokazują średnie objętości nowotworów u myszy, którym wstrzykiwano PBS jako kontrole w dniu 0, 1, 2, 3 i 4. Trójkąty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy leczonych za pomocą 20 mikrogramów KS-IL-12-IL-2. Kwadraty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy leczonych za pomocą 11,5 mikrograma KS-IL-2 i 18 mikrogramów KS-IL-12, przy czym bia ł ko podawano poprzez zastrzyki donowotworowe. Oś x pokazuje liczbę dni, które upłynęły od pierwszego zastrzyku. Oś y pokazuje średnią objętość nowotworu w milimetrach sześ ciennych.

Na fig. 15 przedstawiono efekt leczenia za pomocą białka fuzyjnego przeciwciało-cytokina-cytokina myszy, które cierpią na nowotwory, podskórne wytworzone z komórek raka płuc Lewisa, które prowadzą albo nie prowadzą do ekspresji ludzkiego EpCAM. Czarne kwadraty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy z nowotworami pochodzącymi od LLC/KSA. Czarne romby pokazują średnie objętości nowotworów u myszy z nowotworami pochodzącymi od LLC. Myszom podawano 20 mikrogramów KS-IL-12-IL-2 w dniu 0, 1, 2, 3 i 4, przy czym białko podawano poprzez zastrzyki donowotworowe. Oś x pokazuje liczbę dni, które upłynęły od pierwszego zastrzyku. Oś y pokazuje średnią objętość nowotworów w milimetrach sześciennych.

Na fig. 16 przedstawiono efekt leczenia za pomocą białka fuzyjnego przeciwciało-cytokina-cytokina myszy, które cierpią na podskórne nowotwory wytworzone z komórek raka płuc Lewisa. W dniu 0 wstrzykiwano podskórnie około 10⁶ komórek. Romby pokazują średnie objętości nowotworów u myszy nie poddanych leczeniu. Kwadraty pokazują średnie objętości nowotworów u myszy, cierpiących uprzednio na podskórne nowotwory wytworzone z komórek raka płuc Lewisa, zmodyfikowane genetycznie w celu uzyskania ekspresji ludzkiego EpCAM, które wyleczono z nowotworu przez podawanie KS-IL-12-IL-2. Oś x pokazuje liczbę dni, które upłynęły od zastrzyku. Oś y pokazuje średnią objętość nowotworów w milimetrach sześciennych.

Na fig. 17A i 17B przedstawiono wpływ u zwierzęcia z normalnym układem odpornościowym wydzielania białka jednej cytokiny albo wielu cytokin przez komórki nowotworowe na zdolność komórek do tworzenia nowotworów. Na fig. 17A porównano cztery grupy myszy: myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 1x10⁶ komórek nowotworowych LLC (czarne romby), myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 5x10⁶ komórek nowotworowych LLC (białe romby), myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 1x10⁶ komórek nowotworowych LLC prowadzących ekspresję sclL-12 (czarne trójkąty) i myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 5x10⁶ komórek nowotworowych dających ekspresję sclL-12 (białe trójkąty). Na fig. 17B porównano myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 1x10⁶ komórek nowotworowych LLC (czarne romby), myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 5x10⁶ komórek nowotworowych LLC (białe romby), myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 1x10⁶ komórek nowotworowych LLC prowadzących ekspresję sclL-12-IL-2 (X) i myszy C57BL/6, którym wstrzykiwano podskórnie 5x10⁶ komórek nowotworowych LLC dają cych ekspresję sclL-12 (czarne kółka). Oś x pokazuje liczbę dni po zastrzyku komórek nowotworowych. Oś y pokazuje objętość nowotworów w milimetrach sześciennych.

Na fig. 18 przedstawiono wpływ wydzielania białka z pojedynczą albo wielokrotną cytokiną przez komórki nowotworowe na zdolność komórek do tworzenia nowotworów u zwierzęcia z niedoborem odpornościowym. Na tej figurze porównuje się myszy SCID, którym wstrzykiwano podskórnie 1x10⁶ komórek nowotworowych LLC (czarne romby), myszy SCID, którym wstrzykiwano podskórnie 1x10⁶ komórek nowotworowych LLC dających ekspresję sclL-12 (czarne trójkąty), i myszy SCID, którym wstrzykiwano podskórnie 1x10⁶ komórek nowotworowych LLC dających ekspresję sclL-12 (białe

PL 202 058 B1 kółka). Oś x pokazuje liczbę dni po zastrzyku komórek nowotworowych. Oś y pokazuje objętość nowotworów w milimetrach sześciennych.

Szczegółowy opis wynalazku

Zgodnie z wynalazkiem opracowano cząsteczki białek, w których sprzęga się albo tworzy się kompleks dwóch albo więcej różnych białek. Kompleksy białek albo białka fuzyjne mogą ewentualnie zawierać dodatkowe regiony białek, również te zdolne do tworzenia multimerów albo ukierunkowujące, np. obszary Fc przeciwciał i obszary przeciwciał, które zawierają miejsca wiązania antygenu. Uzyskanie białek fuzyjnych możliwe jest dzięki zastosowaniu kwasów nukleinowych kodujących takie białka fuzyjne, zawierające wiele cytokin. Zgodnie z wynalazkiem opracowano także sposoby uzyskiwania konstruktów z kwasów nukleinowych kodujących białka fuzyjne zawierające wiele cytokin, sposoby wytwarzania białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin oraz sposoby stosowania białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin do leczenia chorób i stanów chorobowych.

Stosowane tu określenie „cytokina” dotyczy wydzielanego białka albo jego aktywnego fragmentu albo mutanta, modulującego aktywność komórek układu odpornościowego. Przykłady cytokin obejmują interleukiny, interferony, chemokiny, czynniki martwicy nowotworu, czynniki stymulujące kolonie prekursorów komórek odpornościowych, itp.

Stosowane tu określenie „cytokina heterodimeryczna” dotyczy cytokiny składającej się z dwóch różnych podjednostek białkowych. Obecnie IL-12 jest jedyną znaną naturalnie występującą cytokiną heterodimeryczną przy czym jednak można konstruować sztuczne cytokiny heterodimeryczne. Na przykład sprzężona IL-6 z rozpuszczalnym fragmentem IL-6R tworzy cytokinę heterodimeryczną, podobnie CNTF i -CNTF-R (Trinchieri (1994) Blood 84:4008).

Stosowane tu określenie „interleukina-12” (IL-12) odnosi się do cytokiny z dwóch podjednostek, a mianowicie podjednostki p35 i p40, albo aktywnej jednoła ń cuchowego biał ka fuzyjnego p35 i p40, albo ich odmian w zależności od gatunku, fragmentów albo pochodnych.

Stosowane tu określenie „interleukina-2” (IL-2) odnosi się do każdej IL-2 ssaka, takiej jak ludzka IL-2, mysia IL-2, albo ich aktywnej gatunkowej albo allelowej odmiany, fragmentu albo pochodnej.

Stosowane tu określenie „GM-CSF” odnosi się do białka cytokinowego, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów, takiego jak ludzki GM-CSF, mysi GM-CSF albo ich aktywna gatunkowa albo allelowa odmiana, fragment albo pochodna.

Stosowane tu określenie „obszar Fc immunoglobuliny” oznacza koniec karboksylowy stałego regionu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny albo jego analogu albo części. Na przykład obszar Fc immunoglobuliny IgG może zawierać przynajmniej część obszaru zawiasowego, domenę CH2 i domenę CH3. W korzystnym rozwią zaniu obszar Fc zawiera przynajmniej część obszaru zawiasowego i domenę CH3. W innym korzystnym rozwią zaniu obszar Fc zawiera przynajmniej domenę CH2, a zwł aszcza zawiera także przynajmniej część obszaru zawiasowego,

Stosowane tu określenie „linker peptydowy” oznacza jeden albo więcej peptydów stosowanych do sprzęgania ze sobą dwóch białek (na przykład białka i obszaru Fc). Linker peptydowy jest często szeregiem aminokwasów, takich jak na przykład głównie glicyna i ewentualnie seryna. Linker peptydowy jest korzystnie mieszanym szeregiem przeważnie reszt glicynowych i serynowych, i ma długość około 10-15 aminokwasów.

Stosowane tu określenie „multimeryczny” odnosi się do trwałego połączenia dwóch albo więcej podjednostek białkowych poprzez oddziaływanie kowalencyjne albo niekowalencyjne, na przykład wiązanie disiarczkowe.

Stosowane tu określenie „dimeryczny” odnosi się do specyficznej cząsteczki multimerycznej, w której dwie podjednostki białkowe są trwale związane poprzez oddziaływania kowalencyjne albo niekowalencyjne. Trwały kompleks jest kompleksem o szybkości dysocjacji albo szybkości zanikania co najmniej kilku minut (tak aby kompleks był dostatecznie trwały, aby umożliwić w zastosowaniu in vivo osiągnięcia tkanki docelowej i dawałby efekt biologiczny). Sam fragment Fc tworzy typowo dimer fragmentów ciężkiego łańcucha, zawierających część obszaru zawiasowego, domenę CH2 i ewentualnie domenę CH3. Jednak znane jest wiele ligandów białkowych, które wiążą się ze swoimi receptorami w postać dimeru. Jeżeli cytokina X dimeryzuje w sposób naturalny, to ugrupowanie X w cząsteczce Fc-X będzie dimeryzować w o wiele większym stopniu, ponieważ proces dimeryzacji zależy od stężenia. Bliskość fizyczna dwóch ugrupowań X połączonych poprzez Fc czyniłaby dimeryzację procesem wewnątrzcząsteczkowym, przesuwając znacznie równowagę na korzyść dimeru i wzmacniając jego wiązanie z receptorem.

PL 202 058 B1

Stosowane tu określenie „wektor” oznacza każdą cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową odpowiednią do wprowadzenia do komórki gospodarza i rekombinacji oraz integracji z genomem komórki gospodarza albo do autonomicznej replikacji w postaci episomu. Takie wektory obejmują liniowe kwasy nukleinowe, plazmidy, fagemidy, kosmidy, wektory RNA, wektory wirusowe, itp. Przykłady wektora wirusowego obejmują między innymi retrowirus, adenowirus i wirus związany z gruczolakiem.

Stosowane tu określenie „ekspresja genu” albo „ekspresja białka” oznacza transkrypcję sekwencji DNA, translację transkryptu mRNA i wydzielanie produktu proteinowego albo wytwarzanie produktu proteinowego w dającej się wydzielać postaci.

Stosowane tu określenie „immunocytokina” oznacza białko fuzyjne zawierające przeciwciało i cytokinę , jak opisano w dokumencie patentowym nr US 5650150.

Stosowane tu określenie „sekwencja wiodąca/sekwencja liderowa” oznacza sekwencję białka, która przyłączona, zwykle na końcu N, do drugiej sekwencji aminokwasowej, kieruje wydzielaniem tej sekwencji białkowej z komórki. Sekwencja wiodąca zwykle jest odcinana i oddzielana od drugiej sekwencji aminokwasowej, która staje się dojrzałym białkiem. Określenie „sekwencja wiodąca” jest na ogół synonimiczne z „sekwencją sygnałową”.

Stosowane tu określenie „EpCAM” dotyczy cząsteczki odpowiedzialnej za adhezję komórki nabłonkowej (Cirulli i wsp. (1998) 140:1519-1534) i jest synonimem „KSA”, oznaczającym antygen związany przez monoklonalne przeciwciało KS-1/4. EpCAM jest powierzchniowym białkiem komórki, które ulega silnej ekspresji na powierzchni komórek rakowych pochodzących z komórek nabłonkowych.

Stosowane tu określenie „KS-1/4 dotyczy szczególnego monoklonalnego przeciwciała, które wiąże się z EpCAM.

Stosowane tu określenia „KS-IL2”, „KS-IL12” i „KS-IL12-IL2”, itp., odnoszą się do białek fuzyjnych składających się odpowiednio z KS-1/4 i interleukiny-2, KS-1/4 i interleukiny-12 oraz KS-1/4 zarówno z interleukiną-12, jak i interleukiną-2. Analogiczne nazwy stosowane są tu także dla konstruktów kodujących białka fuzyjne. Ponieważ jest możliwe sprzęganie białek w kilku położeniach względem cząsteczki przeciwciała, to określenie „KS-IL12-IL2”, dotyczy klasy białek zawierających KS-1/4 zarówno z interleukiną 12, jak i interleukiną 2, sprzężonych w dowolnym poł o ż eniu, jeż eli wyraź nie nie stwierdzono inaczej.

Stosowane tu określenie „14.18” dotyczy szczególnego przeciwciała monoklonalnego, które wiąże się z antygenem GD2 specyficznym dla nowotworu.

Kilka przykładowych rozwiązań konstruktów białkowych według wynalazku, przedstawiono na fig. 1-5. Części cząsteczek przedstawionych schematycznie na fig. 2-5 oznaczone jako 1A-1I, odnoszą się do białek fuzyjnych pokazanych na fig. 1A-1I oraz ilustrują możliwość sprzęgania każdego z biał ek fuzyjnych z fig. 1, dalej z innymi biał kami. Cytokiny przedstawiono jako prostoką ty, stał e obszary przeciwciał przedstawiono jako elipsy, a zmienny obszar ciężkiego łańcucha i zmienny obszar lekkiego łańcucha są pokazane w postaci znaczonych elips.

W wynalazek obejmuje kompleksy biał kowe zawierają ce dwie róż ne cytokiny i ewentualnie dodatkowe grupy białkowe. Homodimeryczna cytokina, mimo że zawiera wiele podjednostek, jest jednak cytokiną pojedynczą. Podobnie heterodimeryczna cytokina, taka jak IL-12, mimo że zawiera różne podjednostki, jest cytokiną pojedynczą. Ponadto pojedynczą cytokiną jest heterodimeryczna postać normalnie homodimerycznych cytokin, takich jak heterodimer MCP-l/MCP-2, albo dwa allele normalnie homodimerycznej cytokiny (patrz na przykład Zhang, J. Biol. Chem. (1994) 269:15918-24). Kompleksy według niniejszego wynalazku zawierają dwie różne cytokiny, z których każda (na przykład IL-2 i IL-12, IL-4 i GM-CSF, MCP-1 i eotaksyna, itd.) jest zdolna do modulowania aktywności komórki układu odpornościowego.

Na fig. 1A przedstawiono korzystne rozwiązanie wynalazku: w białku fuzyjnym 10 koniec C pierwszej cytokiny 12 sprzęga się z końcem N drugiej cytokiny 14, ewentualnie stosując grupę linkerową (nie pokazaną). W niektórych rozwiązaniach według wynalazku kompleks białkowy zawiera co najmniej dwie cytokiny o znacznie różniących się okresach półtrwania w surowicy krwi. Stosowanie na przykład małego i dużego białka prowadzi często do białka fuzyjnego z charakterystyczną cechą okresu półtrwania w układzie krążenia zgodnie z większym białkiem. Stąd w sytuacjach, w których pożądane jest połączenie działania IL-12 z inną cytokiną byłoby korzystne uzyskanie ekspresji dwóch cytokin w postaci białka fuzyjnego o wzorze ogólnym IL-12-K albo K-IL-12, w którym X oznacza inną cytokinę. Widać tu dwie szczególne zalety. Po pierwsze, okres półtrwania w surowicy szybciej usuwanej

PL 202 058 B1 cytokiny jest dłuższy. Po drugie okresy półtrwania w surowicy obydwóch cytokin stają się do siebie bardzo podobne.

Dwułańcuchową cytokinę, taką jak IL-12, można sprzęgacz inną cytokiną na końcu N albo C dowolnego łańcucha cytokiny dwułańcuchowej. W jednym z rozwiązań inną cytokinę sprzęga się z dowolnym końcem N albo C dowolnej podjednostki p35 albo p40 IL-12 (fig. 1B-1E). W białku fuzyjnym 16 z fig. 1B koniec N pierwszej cytokiny 12 sprzęga się z końcem C podjednostki p40 18 IL-12. Podjednostka p40 18 jest połączona z podjednostką p35 IL-12 wiązaniem kowalencyjnym 22. W białku fuzyjnym 24 z fig. 1C koniec N podjednostki p40 18 sprzęga się z końcem C pierwszej cytokiny 12 i łączy się z podjednostką p35 20 wiązaniem kowalencyjnym 22. Na fig. 1D przedstawiono białko fuzyjne 26, w którym koniec N pierwszej cytokiny 12 sprzęga się z końcem C podjednostki p35 20, która jest połączona wiązaniem kowalencyjnym 22 z podjednostką p40 18. Na fig. 1E białko fuzyjne 28 zawiera podjednostkę p35 20 sprzężoną na swoim końcu N z końcem C pierwszej cytokiny 12 i połączoną wiązaniem kowalencyjnym 22 z podjednostką p40 18.

W drugim rozwiązaniu podjednostki IL-12 sprzęga się z utworzeniem jednołańcuchowego białka sclL-12, z podjednostką p35 albo pod jednostką p40 w położeniu N-końcowym. Druga cytokina może łączyć się z końcem N albo końcem C otrzymanego białka sclL-12 (fig. 1F-1I). Stąd w korzystnym rozwiązaniu przedstawionym na fig. 1F białko fuzyjne 30 zawiera jednołańcuchową IL-12, której koniec N podjednostki p40 18 sprzęga się z końcem C podjednostki p35 20, ewentualnie linkerem peptydowym. W tym rozwiązaniu koniec N cytokiny 12 sprzęga się z końcem C podjednostki p40 18. W rozwiązaniu przedstawionym na fig. 1G koniec N podjednostki p35 20 sprzęga się z końcem C cytokiny 12, ewentualnie linkerem peptydowym. Na fig. 1H i 1l przedstawiono białka fuzyjne 34 i 36 zawierające inną jednołańcuchową odmianę IL-12, której koniec N podjednostki p35 sprzęga się z końcem C podjednostki p40, ewentualnie linkerem peptydowym. W białku fuzyjnym 34, przedstawionym na fig. 1H, koniec N cytokiny 12 sprzęga się z końcem C podjednostki p35 20. W białku fuzyjnym 36, pokazanym na fig. 11, koniec N podjednostki p40 18 sprzęga się z końcem C cytokiny 12. W korzystnym rozwiązaniu IL-12 sprzęga się z IL-2.

Wytwarzanie takich cząsteczek zilustrowano poniżej na przykładach.

Często dogodne jest uzyskiwanie ekspresji heteromultimerycznych cząsteczek, takich jak IL-12 albo przeciwciało, w postaci cząsteczek jednołańcuchowych, w których nieidentyczne podjednostki są połączone krótkimi linkerami aminokwasowymi (Huaton i wsp. (1988) Proc. Natl. Sci. 85:5879, Lieschke i wsp. (1997) Nat Biotechnol. 15:35, Lieschke, G. J, i Mulligan, R.C., amerykański opis patentowy nr US 5891680). Konstruuje się gen kodujący białko fuzyjne, po czym uzyskuje się pożądane białko w komórkach niosących jeden konstrukt rekombinowanego DNA. Takie jednołańcuchowe odmiany heteromultimerycznej cytokiny można następnie sprzęgać z drugą cytokiną co nadal umożliwia ekspresję białka fuzyjnego o pożądanej aktywności z pojedynczego konstruktu rekombinowanego DNA. Ekspresję opisanych cząsteczek przedstawiono w przykładach.

Przykładem białka fuzyjnego może być IL-4 sprzężona z GM-CSF. Białko to jest szczególnie korzystne w eksponowaniu komórek dendrytycznych na działanie antygenu stymulującego. Innym użytecznym białkiem fuzyjnym może być IL-12 i IL-18. Wspomniane cytokiny zarówno wzmacniają odpowiedź Th1, lecz ich aktywności komplementarne są nieco inne.

Wynalazek obejmuje również białka fuzyjne, w których wiele różnych, sprzężonych cytokin poddaje się dalszemu sprzęganiu z białkiem zdolnym do tworzenia multimerów, takich jak homodimery albo heterodimery. Zaletą takiej cząsteczki jest to, że skuteczność jednej albo więcej cytokin można zwiększyć przez dimeryzację. W pewnych przypadkach zwiększenie skuteczności przez dimeryzację jest wynikiem wiązania z receptorem cytokiny w postaci dimeru. W jednym z rozwiązań sprzęga się wiele cytokin z częścią cząsteczki przeciwciała, np. obszar Fc (fig. 2). W innym rozwiązaniu sprzęga się IL-12 i drugą cytokinę uzyskując homodimeryczny fragment białkowy. W korzystnym rozwiązaniu drugą cytokiną jest IL-2 albo GM-CSF. Białka fuzyjne można wytwarzać wieloma sposobami, prowadzącymi do uzyskania różnych sekwencji poszczególnych fragmentów białek, połączonych z końcem N lub C w białku fuzyjnym. Gdy na przykład interleukinę-12 i inną cytokinę sprzęga się z obszarem Fc, to cytokiny mogą być sprzęgane w dowolnej kolejności: na końcu N lub C obszaru Fc, albo jedna cytokina może zostać przyłączona do końca N, a druga - C.

Niektóre z tych permutacji przedstawiono na fig. 2, na przykład w rozwiązaniu pokazanym na fig. 2A białko fuzyjne 44 według wynalazku sprzężone jest z końcem C obszaru Fc zawierającego obszar zawiasowy 38, obszar CH2 40 i obszar CH3 42. Białko fuzyjne 44 może mieć różne struktury, na przykład między innymi struktury białek fuzyjnych 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 albo 36, przedsta10

PL 202 058 B1 wionych na fig. 1A-1I. Jeżeli białko fuzyjne 44 ma więcej niż jeden koniec N i koniec C, jak w białkach fuzyjnych 16, 24, 26 i 28, to obszar Fc można sprzęgać z którymkolwiek końcem N białka fuzyjnego 44. Jak przedstawiono na fig. 2B, białko fuzyjne 44 może być sprzężone z końcem N obszaru Fc. W rozwiązaniu pokazanym na fig. 2C pierwsza cytokina 12 może być sprzężona z końcem N obszaru Fc, a druga cytokina może być sprzężona z końcem C obszaru Fc.

Rozważania strukturalne

Warte jest odnotowania, że cytokiny, należące do wspólnej klasy białek, są podobne pod względem wielkości i ogólnych właściwości składania. Zatem opisane tu specyficzne właściwości ilustrują sposób tworzenia białek fuzyjnych złożonych z wielu cytokin należących do rodziny białek cytokinowych. Na przykład, wiele cytokin należy do klasy białek, które ulegają składaniu zgodnie z tzw. „wiązką czterohelisową”. Białka tego typu obejmują czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), interleukinę 6 (IL-6), czynnik hamujący białaczkę (LIF), hormon wzrostu, rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF), leptynę, erytropoetynę, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), interleukinę 5 (IL-5), stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), IL-2, IL-4, interleukinę 3 (IL-3), IL-10, interferon beta, α-interferony i ściśle spokrewniony interferon tau oraz interferon gamma (IFN-gamma).

Z wyjątkiem IL-5 i IFN-gamma wszystkie te białka składają się jako monomery z czterema zasadniczo równoległymi helisami alfa i dwoma połączeniami sieciującymi. W każdym przypadku, z wyjątkiem IL-5 i IFN-gamma, koniec N i koniec C znajdują się na tej samej płaszczyźnie białka. Ponieważ białka ulegające składaniu typu wiązki czterohelisowej, z wyjątkiem IL-5 i IFN-gamma, wykazują taki sam sposób składania, to opisane dla IL-2, IL-4 i GM-CSF sposoby stosują się także do innych białek tego typu, jak i innych małych białek cytokinowych, które składają się jako monomery.

Chemokiny są specyficzną klasą cytokin i jak się uważa tworzą one gradienty zewnątrzkomórkowe oraz pośredniczą w chemotaksji specyficznych klas komórek odpornościowych. Na przykład MCP-1 jest chemoatraktantem dla monocytów, makrofagów i aktywowanych limfocytów T, eotaksyna jest chemoatraktantem dla eozynofilów, a interleukina-8 jest chemoatraktantem dla neutrofilów. Oprócz swojej funkcji chemoatraktanta chemokiny, podobnie jak cytokiny, jest zdolna do indukowania ekspresji specyficznych genów w specyficznych komórkach docelowych. Na przykład uważa się, że MCP-1 indukuje ekspresję czynnika tkankowego w naczyniowych komórkach mięśni gładkich (Schecter i wsp., J. Biol. Chem. (1997) 272:28568-73).

Wynalazek obejmuje białka fuzyjne, zawierające cytokinę-cytokinę i białka fuzyjne zawierające przeciwciało-cytokinę-cytokinę, w których jedna albo więcej cytokin jest chemokiną. Przedstawiono tutaj także konstrukty białkowe zawierające trzy albo więcej cytokin, z których jedna albo więcej cytokin jest chemokiną. Na przykład w białku fuzyjnym mogą być wykorzystane chemokiny IP-10, RANTES, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, makrofagowe białka chemoatrakcyjne, eotaksyna, limfotaktyna, BLC sprzężone z drugą cytokiną z albo bez innych rejonów, takich jak fragment przeciwciała.

Na przykład ludzki genom koduje co najmniej 50 chemokin. Znane chemokiny mają podobną trójwymiarową strukturę monomeryczną i sposób składania białka. Zgodnie z powyższym przedstawione w opisie ogólne typy konstruktów białkowych oraz sposoby ich otrzymywania mogą być stosowane do szeregu innych chemokin.

Chemokiny mają odmienny wzorzec składania z trzema strukturami beta i jedną helisą alfa. Chemokiny składają się jak monomery i w niektórych, lecz nie we wszystkich przypadkach, po składaniu dimeryzują. W przypadku wszystkich chemokin wzorzec składania podjednostki monomerycznej jest identyczny i ogólne struktury są nadzwyczaj podobne. Na przykład trójwymiarowe struktury interleukiny-8, czynnika płytkowego 4, aktywności stymulującej wzrost czerniaka (MGSA), białka zapalnego makrofaga, MIP, RANTES (regulowane w wyniku aktywacji, ekspresja i wydzielanie przez normalne limfocyty T), monocytowe chemoatrakcyjne białko 1 (MCP-1, MCAF), eotaksyny, monocytowego chemoatrakcyjnego białka-3 (MCP-3), chemokinowej domeny fraktalkiny, aktywującego neutrofil peptydu-2 (NAP-2), czynnika 1 pochodzącego z komórki zrębowej (SDF-1), makrofagowego zapalnego białka 2, chemokiny hcc-2 (makrofagowe białko zapalne 5), Gro beta, indukowanego przez cytokinę chemoatraktanta neutrofilowego i CICN/Gro zostały wyznaczone drogą krystalografii rentgenowskiej i metodami NMR, przy czym wszystkie te struktury wykazują ten sam wzorzec składania i są na ogół podobne. Ponieważ chemokiny mają ten sam wzorzec składania, to sposoby opisane tu dla limfotaktyny stosują się także do innych białek chemokinowych.

Aktywność chemokiny często jest determinowana przez jej wolny koniec N. Stąd w niektórych rozwiązaniach korzystne jest skonstruowanie białka fuzyjnego, w którym drugą cytokinę, fragment przePL 202 058 B1 ciwciała albo inny fragment białkowy sprzęga się z końcem C chemokiny. Przy konstruowaniu kompleksu białkowego, zawierającego dwie aktywne chemokiny, użyteczne jest na przykład sprzęganie dwóch różnych chemokin z końcami N ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała. Niektóre chemokiny, takie jak IL-8, są w warunkach fizjologicznych dimerami. W przypadku niektórych zastosowań użyteczna jest wspólna ekspresja białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin-przeciwciało, takiego jak białko fuzyjne IL-8-przeciwciało-cytokina, razem z niesprzężonym ugrupowaniem IL-8 albo ugrupowaniem IL-8 z innym składnikiem białka fuzyjnego, który nie oddziaływuje z przeciwciałem. Dzięki temu różne fragmentu IL-8 mogą homodimeryzować bez naprężeń przestrzennych albo polimeryzacji, która mogłaby wystąpić, gdyby wszystkie fragmenty IL-8 były sprzężone z przeciwciałem lub jego fragmentem. Pożądane białko fuzyjne zawierające wiele cytokin można zatem oddzielić ze względu na wielkość cząsteczki albo wiązanie jej z białkiem wiążącym przeciwciało, takim jak białko A ze Staphylococcus.

W przypadku białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin, zawierających chemokinę, korzystne jest rozwiązanie, w którym białko fuzyjne zawiera także etykietę lokalizującą/ukierunkowującą taką jak przeciwciało lub jego fragment, które wiąże się z odpowiednim antygenem. Nie wiążąc się teorią uważa się, że rozmieszczenie chemokiny w obrębie całego organizmu nie będzie mieć żadnego wpływu ani prowadzić do ogólnego zniesienia wrażliwości komórek na chemokinę. Ponadto uważa się, że aktywność chemoatrakcyjna chemokiny może przejawiać się tylko wtedy, gdy istnieje różnica stężeń chemokiny.

Wydłużenie okresu półtrwania wielu cytokin o krótkich okresach półtrwania w surowicy krwi

Białka fuzyjne według wynalazku, które zawierają dwie cytokiny, obydwie z krótkim okresem półtrwania w surowicy, sprzężone są z trzecim ugrupowaniem z długim okresem półtrwania w surowicy.

Obszar Fc, samodzielnie albo w postaci części nietkniętego przeciwciała, może nadawać szereg właściwości białkom fuzyjnym zawierającym wiele cytokin, które mogą być korzystne albo niekorzystne w zależności od specyficznego zastosowania. Właściwości te obejmują dimeryzację, wydłużenie okresu półtrwania w surowicy, zdolności do wiązania się z dopełniaczem, zdolności do pośredniczenia w zależnej od przeciwciała cytotoksyczności (ADCC) z pośrednictwem komórek oraz wiązania się z receptorem Fc. Jeżeli główną pożądaną cechą jest wydłużenie okresu półtrwania w surowicy, a właściwości przeciwciała-obszaru Fc nie są istotne albo są niepożądane, to korzystne jest zastosowanie obszaru Fc, będącego naturalną odmianą albo mutantem pozbawionym przynajmniej jednej właściwości przeciwciała. Jeżeli na przykład jest pożądane zrównanie i wydłużenie okresów półtrwania w surowicy dwóch albo więcej cytokin o krótkich okresach półtrwania, to konieczne jest skonstruowanie białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin, zawierającego obszar Fc ludzkiej lgG2 albo lgG4, o odpowiednio mniejszym powinowactwie albo nie wykazującym powinowactwa względem receptorów Fc. Może być również zastosowany obszar Fc zawierający mutację w miejsce cięcia wiążącym receptor Fc. W rzeczywistości wykazano, że sprzężenie kilku cytokin z przeciwciałem prowadzi do zwiększenia powinowactwa białka fuzyjnego do receptorów Fc, a w wyniku tego przyśpieszenie usuwania przez nerki u zwierząt. Wykazano, że zastosowanie obszarów Fc o zmniejszonym powinowactwie względem receptorów Fc znacznie wydłuża okres półtrwania tych cząsteczek w surowicy (Gillies i wsp. (1999) Cancer Res. 59:2159-2166). W pewnych okolicznościach i w zależności od zastosowanych cytokin związanie obszaru Fc z receptorem Fc, spowoduje internalizację białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin i rozkład jednego albo więcej składników cytokinowych.

Ukierunkowanie

Białka fuzyjne według wynalazku zawierające dwie albo więcej cytokin sprzęga się z białkiem, zdolnym do doprowadzenia cytokin do określonej docelowej cząsteczki, komórki albo miejsca w organizmie. Korzystną cząsteczką ukierunkowującą jest przeciwciało albo sekwencja zawierająca zmienne obszary przeciwciała wiążąca się z antygenem. Można jednak stosować i inne cząsteczki ukierunkowujące albo ich domeny, takie jak specyficzne ligandy albo receptory, naturalnie występujące białka wiążące, enzymy, które wiążą się ze szczególnymi substratami, sztucznie wytwarzane peptydy, które wybrano na podstawie ich selektywnego wiązania albo zdolności lokalizowania, peptydy o różnych właściwościach fizykochemicznych, które nadają zdolność doprowadzenia do określonego celu, białka, które lokalizują określony cel dzięki wiązaniu się z inną cząsteczką, która jest wykrywalna, albo inne rodzaje białek. W przypadku sprzęgania dwóch cytokin z cząsteczką ukierunkowującą korzystną pierwszą cytokiną jest IL-12. W przypadku IL-12 korzystną drugą cytokiną jest IL-2 albo GM-CSF.

W przypadku przeciwciała istnieje wielka liczba sposobów sprzęgania dwóch albo więcej cytokin, ponieważ istnieje szereg możliwych miejsc przyłączenia. Na przykład przeciwciało IgG składa się z dwóch ciężkich i dwóch lekkich łańcuchów. Dwie cytokiny sprzęga się ze sobą a następnie sprzęga się z koń12

PL 202 058 B1 cem N albo końcem C któregokolwiek z ciężkich albo lekkich łańcuchów. Alternatywnie każdą cytokinę można poddawać oddzielnie sprzęganiu z jednym z końców N albo C cząsteczki przeciwciała.

Na fig. 3 przedstawiono podzbiór sposobów, w jakie dwie cytokiny można sprzęgać z cząsteczką przeciwciała. Na przykład w odniesieniu do fig. 3A białko fuzyjne 44 według wynalazku sprzęga się z końcem C ciężkiego łańcucha 46 immunoglobuliny, który jest związany z lekkim łańcuchem 48 immunoglobuliny. Jak przedstawiono na fig. 2, białko fuzyjne 44 może mieć różne struktury, na przykład struktury białek fuzyjnych 10, 16, 24, 26, 28, 30, 32, 34 albo 36, przedstawione na fig. 1A-1I. Jak przedstawiono na fig. 3B, białko fuzyjne 44 sprzęga się z końcem N ciężkiego łańcucha 46 immunoglobuliny, związanego z lekkim łańcuchem 48 immunoglobuliny. W rozwiązaniach przedstawionych na fig. 3C i 3D białko fuzyjne 44 sprzęga się z końcem N (fig. 3C) albo końcem C (fig. 3D) lekkiego łańcucha 48 immunoglobuliny, związanego z ciężkim łańcuchem 46 immunoglobuliny. Jak przedstawiono na fig. 3E i 3F, pierwszą cytokinę 12 sprzęga się z lekkim łańcuchem 48 immunoglobuliny, związanym z ciężkim łańcuchem 46 immunoglobuliny, sprzężonym z drugą cytokiną 14. Cytokiny 12 i 14 sprzęga się z końcami N (fig. 3E) albo końcami C (fig. 3F) łańcuchów immunoglobuliny. Alternatywnie, jak przedstawiono na fig. 3G, pierwszą cytokinę 12 sprzęga się z końcem N lekkiego łańcucha 48 immunoglobuliny, natomiast drugą cytokinę 14 sprzęga się z końcem C ciężkiego łańcucha 46 immunoglobuliny.

Fuzje z przeciwciałami jednołańcuchowymi

Czasami dogodne jest uzyskiwanie ekspresji przeciwciał w postaci jednego łańcucha polipeptydowego. Zgodnie z wynalazkiem opracowano także białka fuzyjne, w których dwie albo więcej cytokin sprzęga się z przeciwciałem jednołańcuchowym. Zaletą tego układu jest zmniejszenie liczby stosowanych konstruktów DNA stosowanych do ekspresji żądanego białka fuzyjnego, co może być szczególnie użyteczne w terapii genowej. W szczególności, jeżeli cytokiny są cząsteczkami jednołańcuchowymi, to do ekspresji białka fuzyjnego zawierającego cytokiny z przeciwciałem jednołańcuchowym w postaci jednej nici białkowej.

Jak przedstawiono na fig. 4A-4C, w niektórych rozwiązaniach cytokiny sprzęga się z przeciwciałem jednołańcuchowym na jego końcu N, końcu C albo na obydwóch końcach. Na przykład, jak pokazano na fig. 4A, białko fuzyjne 44 sprzęga się z końcem C przeciwciała jednołancuchowego 50, które ma zmienny obszar 52 lekkiego łańcucha i zmienny obszar 54 ciężkiego łańcucha. Jak pokazano na fig. 4B, białko fuzyjne 44 także sprzęga się z końcem N przeciwciała jednołancuchowego 50. W rozwiązaniu przedstawionym na fig. 4C pierwszą cytokinę 12 sprzęga się z końcem N przeciwciała jednołancuchowego 50, a drugą cytokinę 14 sprzęga się z końcem C przeciwciała jednołancuchowego 50.

Korzystne rozwiązanie obejmuje białko fuzyjne zawierające IL-12 i drugą cytokinę z przeciwciałem jednołańcuchowym. Jeszcze korzystniejsze rozwiązanie polega na stosowaniu IL-2 albo GM-CSF jako drugiej cytokiny.

Stałe obszary przeciwciał pośredniczą w szeregu funkcji efektorowych. Na przykład lgG1 pośredniczy w wiązaniu dopełniacza, ADCC i wiązaniu z receptorem Fc. Miejsce przyłączenia cytokiny może zmieniać efektorową funkcję stałego obszaru przeciwciała, co jest użyteczne, jeżeli pożądana jest modyfikacja funkcji efektorowych.

W niektórych przypadkach może być pożądane skonstruowanie białka fuzyjnego zawierającego dwie albo więcej cytokin z ukierunkowującą sekwencją przeciwciała, lecz bez obszarów stałych. Takie białko fuzyjne jest mniejsze niż białko fuzyjne zawierające całe przeciwciało z dwiema albo więcej cytokinami, co w pewnych sytuacjach może być korzystniejsze. Ponadto takie białko fuzyjne nie będzie wykazywać co najmniej jednej z funkcji efektorowych nietkniętego przeciwciała, lecz jednocześnie zachowa zdolność ukierunkowującą przeciwciała.

Zatem zgodnie z wynalazkiem opracowano białka fuzyjne, w których dwie albo więcej cytokin sprzęga się z jednołańcuchowym obszarem Fv. Jak przedstawiono w rozwiązaniach pokazanych na fig. 5A-5C, dwie cytokiny sprzęga się z końcem N albo końcem C obszaru Fv albo jedną cytokinę z każdym końcem. Na przykład, jak przedstawiono na fig. 5A, białko fuzyjne 44 według wynalazku sprzęga się z końcem C jednołancuchowego obszaru Fv zawierającego zmienny obszar 52 lekkiego łańcucha immunoglobuliny i zmienny obszar 54 ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. Jak przedstawiono na fig. 5B, białko fuzyjne 44 możne także sprzęgać się z końcem N obszaru Fv. Jak przedstawiono na fig. 5C, pierwszą cytokinę 12 sprzęga się z końcem N obszaru Fv, a drugą cytokinę 14 sprzęga się z końcem C obszaru Fv.

Przeciwciała jako heterodimeryczne nośniki wielu cytokin

W niektórych okolicznościach pożądane jest skonstruowanie białka fuzyjnego zawierającego dwie albo więcej cytokin, w którym, w przypadku dwóch cytokin, dla aktywności jest istotny ten sam

PL 202 058 B1 koniec białka. Na przykład może okazać się, że naturalnie występujący koniec N dwóch różnych cytokin jest istotny dla każdej cytokiny. Nie jest możliwe skonstruowanie białka fuzyjnego będącego pojedynczym łańcuchem peptydowym, w którym aktywne byłyby obydwie cytokiny.

Przeciwciała są heterodimerycznymi białkami składającymi się z ciężkich i lekkich łańcuchów, które są połączone kowalencyjnie wiązaniami disiarczkowymi. Jeżeli jest pożądane skonstruowanie białka fuzyjnego zawierającego cytokiny, gdzie aktywność obu cytokin wymaga nietkniętego, nie sprzężonego końca N, to korzystne jest oddzielne sprzęganie cytokin z końcem N ciężkiego i z końcem N lekkiego łańcucha przeciwciała (fig. 3E). Podobnie, jeżeli jest pożądane skonstruowanie białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin, w którym dwie cytokiny wymagają nietkniętego, niesprzężonego końca C, to jest korzystne oddzielne sprzęganie dwóch cytokin z końcem C ciężkiego i z końcem C lekkiego łańcucha przeciwciała (fig. 3F). Jeżeli przeciwciało jest stosowane wyłącznie jako nośnik łączący w ten sposób dwie cytokiny, to moż e być uż yteczne wprowadzenie mutacji albo delecji tych części przeciwciała, które nadają dodatkowe właściwości, związane z funkcją odpornościową. Na przykład może okazać się korzystne wykorzystanie jako nośnika obszaru Fab, ponieważ obszar Fab zachowuje cechę heterodimeryzacji przeciwciała, lecz jest pozbawiony właściwości charakterystycznych dla obszaru Fc. Użyteczne może być także stosowanie przeciwciała albo fragmentu przeciwciała, w którym miejsce cięcia wiążące antygen nie jest aktywne.

Białka fuzyjne zawierające wiele cytokin z przeciwciałami łączą w sobie wiele nowych cech wynalazku. W białkach fuzyjnych przeciwciało-wiele cytokin okres półtrwania cytokin w surowicy jest wyrównany i wydłużony, aktywność obydwu cytokin jest doprowadzona do określonej lokalizacji, a zwłaszcza unika się działań toksycznych na skutek systemowego podawania wielu synergistycznie działających cytokin, przy czym każda cytokina ulega skutecznie dimeryzacji albo multimeryzacji i cytokiny nie muszą być sprzęgane bezpośrednio, lecz mogą być sprzęgane z różnymi centrami w obrębie ciężkich i lekkich łańcuchów cząsteczki przeciwciała.

Przy konstruowaniu białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin i przeciwciało, istnieje szereg opcji i konfiguracji, które można odróżnić drogą rutynowego eksperymentowania. Wskazane jest również przeprowadzenie analizy biologii strukturalnej. Na przykład wiele cytokin odpowiada klasie nazywanej wiązkami 4-helisowymi. Te struktury składają się z czterech helis alfa i mają sąsiadujący koniec N z końcem C. Ogólnie płaszczyzna cytokiny dookoła koń ca N i C na ogół nie jest wykorzystywana przy wiązaniu cytokiny z jej receptorem, zatem do połączenia z przeciwciałem albo drugą cytokiną można wykorzystać dwolny koniec. Czasami jednak ze względów sferycznych trudne jest bezpośrednie połączenie końca N z końcem C cytokiny należącej do klasy wiązki 4-helisowej z innymi białkami. Jeżeli jest pożądane sprzężenie dwóch różnych cytokin należących do klasy wiązek 4-helisowych z przeciwciałem, to wskazane jest sprzężenie każdej cytokiny z innym miejscem cięcia przeciwciała. Alternatywnie, jeżeli jest konieczne skonstruowanie łańcucha polipetydowego o postaci łańcuch Ig-cytokina-cytokina, to rozwiązaniem problemów ze strukturą przestrzenną jest zastosowanie jednego albo więcej elastycznych linkerów.

Zamiast przeciwciała jako nośnik wielu cytokin można zastosować inne wyodrębnione heterodimeryczne cząsteczki. Na przykład można zastosować kompleks zawierający antygen specyficzny dla stercza i inhibitor proteazy, z którym tworzy kompleks, ciężki łańcuch IgA i łańcuch J, przedstawiciele rodziny beta TGF i wiążące je związki typu astacyny albo IL-12.

Kwasy nukleinowe

Opracowano także kwasy nukleinowe zdolne do ekspresji każdego z opisanych białek fuzyjnych. Obejmują one kwasy nukleinowe kodujące białka fuzyjne zawierające dwie albo więcej cytokin, białka fuzyjne zawierające dwie albo więcej cytokin i domenę dimeryzacyjną taką jak obszar Fc, białka fuzyjne zawierające dwie albo więcej cytokin sprzężonych z przeciwciałem, oraz dwie albo więcej cytokin sprzężonych z obszarem Fv. Korzystnymi postaciami kwasów nukleinowych są wektory DNA, które po wprowadzeniu do komórek bakterii albo ssaków umożliwiają ekspresję żądanych białek fuzyjnych. W przypadku białek fuzyjnych, które zawierają wiele ła ńcuchów polipeptydowych, można zastosować więcej niż jeden kwas nukleinowy. Alternatywnie może być korzystne umieszczenie na pojedynczej cząsteczce kwasu nukleinowego dwóch albo więcej sekwencji kodujących żądane białko fuzyjne. W przykł adach przedstawiono szczególne rozwią zania konstruktów kwasów nukleinowych kodują cych wiele cytokin.

Kwasy nukleinowe są szczególnie użyteczne w przypadku ekspresji białek fuzyjnych, zawierających wiele cytokin, do wytwarzania tych białek albo do celów terapii genowej.

PL 202 058 B1

W przykładach opisano sposoby syntezy korzystnych rozwiązań według wynalazku oraz sposoby badania ich aktywności farmakologicznych.

Białka fuzyjne według wynalazku mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych, przy leczeniu i zapobieganiu bardzo wielu chorobom, między innymi wielu infekcji i raka. Białka fuzyjne według wynalazku mogą być stosowane również jako szczepionka.

Białka fuzyjne zawierające wiele cytokin można stosować do leczenia infekcji bakteryjnych, pasożytniczych, grzybowych albo wirusowych oraz raka. Na przykład wiadomo, że IL-12 wykazuje efekt ochronny w wielu rodzajach infekcji takich jak między innymi infekcje bakteryjne Listeria monocytogenes, pasożytami Toxoplasma gondii, Leishmania major i Schistosoma mansoni, grzybami Candida albicans oraz wirusami zapalenia opon i splotów naczyniowych oraz wirusami cytomegalii. Ponieważ cytokiny działają na ogół łącznie, to często jest użyteczne stosowanie białek fuzyjnych zawierających dwie albo więcej cytokin, o których wiadomo, że działają synergistycznie. Ponieważ na przykład IL-2 zwiększa działanie IL-12, to korzystne jest łączenie tych cytokin przy leczeniu chorób bakteryjnych, pasożytniczych, grzybowych i wirusowych.

Korzystny sposób leczenia chorób zakaźnych polega na stosowaniu białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin, które dalej sprzężone są ze środkiem ukierunkowującym, który lokalizuje cytokiny w miejsce cię cia infekcji. Róż ne sposoby ukierunkowywania biał ek opisano poniż ej.

Kompozycje farmaceutyczne można stosować w postaci preparatów stałych, półstałych albo ciekłych, takich jak na przykład pigułki, kapsułki, proszki, ciecze, zawiesiny, itp., korzystnie w postaci dawek jednostkowych odpowiednich do podawania dokładnych ilości. Kompozycje zawierają typowe farmaceutyczne nośniki albo rozczynniki, a ponadto mogą zawierać inne środki lecznicze, środki farmaceutyczne, nośniki, środki wspomagające, itp. Takie rozczynniki obejmują ewentualnie inne białka, takie jak na przykład albuminę z surowicy ludzkiej krwi albo białka z surowicy. Sposoby otrzymywania postaci preparatów farmaceutycznych są znane albo są oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. Podawana kompozycja będzie zawierać pewną ilość aktywnego składnika (składników) w ilości skutecznej do uzyskania pożądanego efektu u pacjenta.

Podawanie kompozycji może mieć miejsce dowolną drogą podawania środków farmaceutycznych, która zapewni zachowanie aktywności. Drogi te obejmują podawanie doustne, pozajelitowe albo miejscowe albo inne tryby podawania układowego, przy czym korzystnym sposobem podawania jest iniekcja.

Ilość podawanego związku czynnego będzie zależeć oczywiście od leczonego pacjenta, ostrości choroby, sposobu podawania i oceny przepisującego środek lekarza.

Jak opisano wyżej, wiadomo, że cytokiny, takie jak IL-2, IL-12, GM-CSF, IL-4 i inne, mogą być użyteczne do leczenia raka. W niektórych warunkach korzystne jest stosowanie białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin, do leczenia raka dzięki prostszemu podawaniu, dłuższemu okresowi półtrwania w surowicy jednej z cytokin składnikowych i wyjątkowo skutecznej modyfikacji aktywności dwóch cytokin.

Korzystny sposób leczenia raka polega na doprowadzaniu cytokin do określonego organu albo tkanki, tak że cytokiny działają lokalnie i unika się skutków ubocznych rozprowadzenia cytokin po całym organizmie. Na przykład należy spodziewać się, że białka fuzyjne zawierające wiele cytokin z obszarem Fc będą kierowane do wątroby i mogą być użyteczne do leczenia raka zlokalizowanego w wątrobie. Korzystniejszy sposób polega na stosowaniu białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin, które sprzęga się dalej ze środkiem ukierunkowującym, takim jak przeciwciało. Przeciwciała KS-1/4 i 14.18 skierowane są zwłaszcza przeciw antygenom specyficznym dla nowotworów (Varki NM i wsp., Cancer Res (1984) 44:681-7, Gilles i wsp., Journal of Immunological Methods 125:191 (1989), amerykańskie opisy patentowe nr US 4975369 i US 5650150). Gdy stosuje się białko fuzyjne zawierające przeciwciało-wiele cytokin, to często korzystne jest zbadanie typu nowotworu i wybranie przeciwciała skierowanego przeciw antygenowi, który jest charakterystyczny dla tego typu nowotworu. Na przykład może okazać się wskazane scharakteryzowanie nowotworu drogą analizy FACS, analizy Westerna, badania DNA nowotworu albo po prostu zidentyfikowanie rodzaju komórki nowotworowej. Sposoby określenia typu nowotworów są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, takim jak onkolodzy i biolodzy specjalizujący się w nowotworach. Możliwe jest także doprowadzenie białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin do określonego miejsca dzięki zastosowaniu szeregu innych środków, takich jak połączenie ze specyficznymi ligandami albo receptorami, aptamerami peptydowymi o wstępnie wybranych aktywnoPL 202 058 B1 ściach wiązania, sprzężenie chemiczne z małymi cząsteczkami o właściwościach lokalizacyjnych, itd. Wspominane sposoby ukierunkowania można wykorzystać także do leczenia innych chorób, np. infekcji.

Leczenie raka i innych zaburzeń komórkowych drogą terapii genowej

Kwasy nukleinowe ujawnione w wynalazku można stosować jako środki terapii genowej przy leczeniu raka i innych chorób, w których jest pożądane dotarcie do specyficznego rodzaju komórek układu odpornościowego. Na przykład pobrane od człowieka albo zwierzęcia komórki rakowe poddaje się transfekcji przynajmniej jednym kwasem nukleinowym kodującym białko fuzyjne zawierające wiele cytokin, po czym transfekowane komórki wprowadza ponownie do organizmu człowieka albo zwierzęcia. Alternatywnie można wprowadzać DNA do komórki rakowej in situ. Wtedy u człowieka albo zwierzęcia występuje reakcja odpornościowa względem komórek rakowych, która może doprowadzić do wyleczenia albo zmniejszenia nowotworu. Gen kodujący białko fuzyjne zawierające wiele cytokin, sprzężonych z odpowiednimi elementami regulatorowymi, zapewniający ekspresję białka fuzyjnego w komórkach ssaków, można podać do komórek rakowych za pomocą jednej z wielu technik, między innymi stosując fosforan wapnia, „działo genowe”, adenowirusy, liposomy kationowe, wektory retrowirusowe albo innymi skutecznymi metodami transfekcji. Kwas nukleinowy może kodować białko fuzyjne zawierające wiele cytokin, które dalej sprzęga się z innymi cząsteczkami.

Przeciwnowotworową terapię genową z użyciem kwasu nukleinowego zapewniającego ekspresję białka fuzyjnego zawierającego cytokiny można łączyć z innymi sposobami leczenia raka, takimi, które mogą zwiększyć immunostymulacyjne właściwości poddanych w postaci białka fuzyjnego cytokin. Kwas nukleinowy według wynalazku może kodować inne białka, które mogą wspomagać rozwój reakcji odpornościowej na antygeny, ulegające ekspresji w komórkach rakowych. Można również przeprowadzić kotransfekcję innymi kwasami nukleinowymi, kodującymi te białka. W szczególności przez kotransfekcję można poddawać do komórek rakowych kwasy nukleinowe kodujące białko powierzchniowe kostymulujące B7 (Robinson i wsp., amerykański opis patentowy nr 5738852). Transfekcji komórek rakowych kwasem nukleinowym umożliwiającym ekspresje białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin może towarzyszyć także leczenie za pomocą przeciwciał albo immunocytokin, które namierzają komórki rakowe (Lode i wsp. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95:2475). Ponadto transfekcji komórek rakowych kwasem nukleinowym powodującym ekspresję białka fuzyjnego zawierającego wiele cytokin może towarzyszyć także leczenie za pomocą środka blokującego rozwój naczyń (Lode i wsp. (1999) Proc. Nat. Acad. Sci, 9:1591).

Terapie, w których stosuje się dodatkowe stymulatory odpornościowe i ewentualnie środki blokujące rozwój naczyń, można łączyć także z układowym leczeniem za pomocą białek fuzyjnych zawierające wiele cytokin. Zaletą leczenia skojarzonego z użyciem dodatkowych środków stymulujących układ odpornościowy i blokujących rozwój naczyń jest fakt, że inaczej niż w przypadku środków uszkadzających DNA albo blokerów cyklu komórkowego, komórki odpornościowe, które mogą namnażać się dzięki pobudzaniu przez białko fuzyjne zawierające wiele cytokin, nie są niszczone.

Korzystne rozwiązanie tego sposobu terapii genowej polega na wprowadzaniu jednego albo więcej kwasów nukleinowych kodujących IL-12 i drugą cytokinę do komórek rakowych, a następnie ponownym wprowadzaniu komórek rakowych do organizmu człowieka albo zwierzęcia, przy czym drugą cytokiną jest korzystnie IL-2 albo GM-CSF.

Wielofunkcyjne białka fuzyjne cytokiny i przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane w szczepionkach oraz w układach wspomagania szczepionek, do uzyskiwania ochronnej odpowiedzi odpornościowej za pośrednictwem komórek przeciw niektórym czynnikom chorobotwórczym u szczepionego ssaka. W rozwiązaniu tym jako środek wspomagający stosuje się cytokiny w postaci białka fuzyjnego. Jeżeli na przykład pożądana jest reakcja odpornościowa Th1, to sprzęga się wiele cytokin wzmacniających Th1 i otrzymane białko fuzyjne w połączeniu z antygenem podaje się zwierzęciu.

Białka fuzyjne, zwłaszcza IL-12 i IL-2, podaje się z antygenem. Alternatywnie IL-12 i IL-2 sprzęga się następnie z białkiem antygenowym i stosuje się do stymulowania reakcji odpornościowej. Rozwiązanie to jest korzystne zwłaszcza w szczepionkach, których działanie opiera na odporności z udziałem komórek gospodarza, to jest na usunięciu cytotoksycznych limfocytów T i aktywacji fagocytów w celu uzyskania ochrony przed infekcją przez szczególny czynnik chorobotwórczy. Szczególnie użyteczne jest przeprowadzenie szczepień za pomocą białek fuzyjnych zawierających IL-12, IL-2 i antygen, ponieważ takie połączenie kieruje odpowiedź Th1 przeciwko antygenowi. Typowe środki wspomagające stosowane u ludzi, np. ałun, mają skłonność do indukowania odpowiedzi Th2.

Opracowano także nowe kompozycje terapeutyczne i sposoby wspomagania zapewniające uzyskanie działania synergistycznego z niektórymi kompozycjami terapeutycznymi, obejmującymi tak

PL 202 058 B1 zwane „szczepionki rakowe”, które zawierają wybrany antygen występujący na komórce rakowej. Na przykład białko zawierające dwie albo więcej sprzężonych cytokin można poddawać bezpośrednio odpowiednią drogą razem z odpowiednio przygotowanymi komórkami rakowymi.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Konstrukcja genów kodujących białka fuzyjne zdolne do ekspresji białek fuzyjnych cytokina-cytokina

Do utworzenia wielofunkcyjnych białek zawierających kilka cytokin syntetyzowano geny kodujące białka fuzyjne zawierające p40 IL-12 i IL-2 oraz p40 IL-12 i GM-CSF. Ponadto sekwencję kodującą dojrzałe mysie p35 (SEQ ID NO: 1) sprzęgano z promotorem i sekwencją liderową które zapewniają wysokie poziomy ekspresji i wydajne wydzielanie. Sekwencje kodujące mysie p40-IL-2 i p40-GM-CSF przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3. Wykonano konstrukt białka fuzyjnego ludzkiej p4-IL-2 (SEQ ID NO: 4). Geny kodujące białka fuzyjne obejmujące obszar Fc mysiej lgG2a z mysim p35 (SEQ ID NO: 5) i ludzki p35 z obszarem Fc ludzkiej lgG1 (SEQ ID NO: 6) konstruowano stosując poprzednio opisane plazmidy ekspresyjne (Lo i wsp., Protein Engineering 11:495-500 (1988), Lo i wsp., amerykański opis patentowy nr US 5726087).

Białko fuzyjne obejmujące dojrzałe mysie i ludzkie białko p35 połączone z końcem C łańcucha ciężkiego przeciwciała KS-1/4 opisali Gillies i wsp. (J. Immunology (1998) 160:6195-6203). Białko fuzyjne obejmujące dojrzałe mysie i ludzkie białko p35 połączone z końcem C ciężkiego łańcucha przeciwciała 14.18 konstruowano w sposób analogiczny (Zgłoszenie międzynarodowe PCT nr WO 99/29732).

Przedstawiona tu strategia sprzęgania p40 z IL-2 i z GM-CSF stosuje się typowo do sprzęgania dwóch albo więcej cytokin. Specyficznie sekwencja kodująca region najbliższy końcu N zawiera sekwencję sygnałową umożliwiającą wydzielanie, natomiast na końcu C nie jest konieczne wprowadzenie sekwencji sygnałowej. W niektórych okolicznościach może okazać się korzystne umieszczenie sekwencji kodującej krótki linker peptydowy, korzystnie o długości 10-15 aminokwasów, o dużej zawartości reszt glicyny i seryny, pomiędzy sekwencjami kodującymi dwie cytokiny. Przygotowanie cząsteczki DNA związane z wytwarzaniem białka fuzyjnego mieszczą się w ramach umiejętności specjalisty w tej dziedzinie.

Poniżej przedstawiono przykładowo szczegółowy opis otrzymywania białka fuzyjnego zawierającego podjednostkę p40 mysiej IL-12 i mysią IL-2. Pełnej długości cDNA kodujące podjednostkę p40 mysiej IL-12 klonowano drogą PCR, cDNA uzyskiwano z komórek śledziony myszy aktywowanych konkawaliną A (5 μg/ml w pożywce hodowlanej w ciągu 3 dni). Starter „forward” miał sekwencję AA GCT AGC ACC ATG TGT CCT CAG AAG CTA ACC (SEQ ID NO: 7), w której miejsce cięcia Nhel GCTAGC (reszty 3-8 w SEQ ID NO: 7) umieszczano przed kodonem inicjacji translacji ATG, a starter odwrotny miał sekwencję CTC GAG CTA GGA TCG GAC CCT GCA GGG (SEQ ID NO: 8), w której miejsce cięcia Xhol CTCGAG (reszty 1-6 SEQ ID NO: 8) umieszczano bezpośrednio za kodonem stop translacji (anty-kodon CTA). Po sprawdzeniu sekwencji fragment Nhel-Xhol zawierający cDNA kodujący mu-p40 razem z jego naturalnym liderem poddawano ligacji do wektora ekspresyjnego pdCs trawionego Xbal-Xhol (Lo i wsp, (1998) Protein Engineering 11:495-500). Miejsca restrykcyjne Nhel i Xbal mają lepkie końce, a miejsce cięcia Nhel wykorzystano do klonowania mu-p40, ponieważ mu-p40 ma wewnętrzne miejsce cięcia Xbal.

W przypadku konstruktu DNA kodującego mu-p40-mulL-2 zastosowano linker oligonukleotydowy do połączenia DNA kodującego mu-p40 w miejscu cięcia Pstl (C TGC AG) z fragmentem Smal-Xhol cDNA kodującym dojrzałą mysią IL-2. Sekwencja DNA połączenia w sekwencji kodującej białko fuzyjnej była następująca: C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGT AAA GCA CCC (SEQ ID NO: 9), w której C TGC AG (reszty 1-6 w SEQ ID NO: 9) stanowi miejsce cięcia Pstl, C CCG GG (reszty 15-20 w SEQ ID NO: 9) stanowi miejsce cięcia Smal, TCC koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu C mysiego białka p40, a GCA koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu N dojrzałej mysiej IL-2, DNA kodujący białko jednołańcuchowe muIL12-muGM-CSF uzyskano z konstruktu DNA kodującego opisane powyżej białko jednołańcuchowe mulLI2-mulL2 przez zastąpienie cDNA kodującego mulL2 przez cDNA kodujący muGMCSF w miejscu cięcia Smal. Sekwencja DNA kodująca połączenie jednołańcuchowej mulL12 i muGMCSF była następująca: C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA AAA GCA (SEQ ID NO: 10), w której C TGC AG (reszty 1-6 w SEQ ID NO: 10) stanowi miejsce cięcia Pstl, C CCG GG (reszty 17-22 w SEQ ID NO: 10) stanowi miejsce cięcia Smal, TCC koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu C mysiego białka p40, a GCA koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu N mysiego białka GMCSF.

PL 202 058 B1

P r z y k ł a d 2

Ekspresja białek fuzyjnych IL-12

Białka fuzyjne IL-12-IL-2 uzyskiwano w wyniku ekspresji w sposób następujący. Ludzkie komórki raka naskórka 293 transfekowano różnymi kombinacjami wektorów kodujących białka fuzyjne p40 i wektorów kodujących białka zawierające region p35, aby otrzymać czasową ekspresję białek fuzyjnych. DNA oczyszczano stosując zestawy preparatywne (Wizard, Promega Inc.), strącano etanolem w celu sterylizacji i ponownie zawieszano w sterylnej wodzie.

Aby uzyskać ekspresję biologicznie aktywnych heterodimerów białek fuzyjnych IL-12, ludzkie komórki raka naskórka 293 kotransfekowano różnymi kombinacjami wektorów kodujących białka fuzyjne zawierające podjednostki i odrębne podjednostki poddawano, aby otrzymać czasową ekspresję białek. DNA oczyszczano stosując zestawy preparatywne (Wizard, Promega Inc.), strącano etanolem w celu sterylizacji i ponownie zawieszano w sterylnej wodzie. Osad z fosforanem wapnia przygotowano standardowymi sposobami stosując 10 μg DNA na ml (5 μg każdej formy, jeśli kotransfekcji poddawano dwa plazmidy) i dodawano 0,5 ml/płytkę do komórek 293 hodowanych w 60 mm szalkach przy konfluencji w przybliżeniu 70% (Molecular cloning: a laboratory manual, wydanie 2, redaktorzy Sambrook, Fritsch i Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Po 16 godzinach pożywkę zawierającą osad usuwano i zastępowano świeżą pożywką. Po 3 dniach supernatant usuwano i analizowano techniką ELISA pod kątem ekspresji wprowadzonych drogą transfekcji genów, oznaczano biologicznie aktywność IL-12 lub immunoprecypitację oraz przeprowadzono analizę w żelu SDS białek znakowanych radioaktywnie. Znakowanie przeprowadzono zastępując na drugi dzień hodowli pożywkę hodowlaną, pożywką nie zawierającą metioniny, po czym dodano ³⁵S-metioninę (100 μθί/ml). Po kolejnych 16 godzinach inkubacji zebrano pożywkę, klarowano drogą wirowania (5 minut przy prędkości 13000 obrotów na minutę w mikrowirówce labolatoryjnej) i poddawano inkubacji z perełkami Sefarozy z białkiem A (objętość perełek 10 μl na ml supernatantu hodowli). Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej perełki przemywano wielokrotnie wirując i zawieszając w buforze PBS zawierającym 1% Nonidet-P40 (NP-40). Końcowy osad zawieszono ponownie w buforze do analizy w żelu SDS i gotowano przez 2 minuty. Po usunięciu perełek drogą wirowania supernatant podzielono na dwie równe części. Następnie do jednej z próbek dodano środek redukujący (5% 2-merkaptoetanol) i gotowano obydwie próbki przez 5 minut, po czym wprowadzono w poliakryloamidowy żel SDS. Po elektroforezie błonę rentgenowską wystawiano na żel (autoradiografia).

Następnie przeprowadzono transfekcję następującymi plazmidami ekspresyjnymi: mu.p35 z mu.p40-IL-2, KS-1/4-mu.p35 z mu.p40, KS-1/4-mu.p35 z mu.p40-IL-2, 14.18-mu.p35 z mu.p40-IL-2, hu.Fc-.p35 z hu.p40-IL-2, KS-1/4-hu.p35 z hu.p40-IL-2 i 14,18-hu.p35 z hu.p40-IL-2, gdzie „mu” odnosi się do białek gryzoni, a „hu” dotyczy białek ludzkich.

Po znakowaniu metabolicznym komórek z użyciem ³⁵S-metioniny i analizie wydzielonych białek drogą redukcyjnej elektroforezy w żelu SDS i autoradiografii, w każdym przypadku stwierdzono wysoki poziom ekspresji. Masy cząsteczkowe zredukowanych białek fuzyjnych oszacowano w oparciu o masy cząsteczkowe białek składowych w następujący sposób: p35 z IL-12 - 35 kD, p40 z IL-12 - 40 kD, IL-2 - 16 kD, Fc - 32 kD, ciężki łańcuch Ig - 55 kD i lekki łańcuch Ig - 28 kD. Obserwowano migracje białek w przybliżeniu zgodną z przewidywanymi masami cząsteczkowymi.

Wyodrębniono także stabilnie transfekowane linie komórkowe prowadzące ekspresję białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin. W przypadku konstruktów heterodimerycznych, wektorami ekspresyjnymi kodującymi białka fuzyjne IL-12 p40-IL-2 albo IL-12 p40-GM-CSF, podobnie jak opisano wcześniej w przypadku odrębnej podjednostki p40 IL-12 (Gillies i wsp. (1998) J. Immunol. 160:6195-62030). Poddane transfekcji linie komórkowe prowadzące ekspresję białek fuzyjnych poddawano ponownie transfekcji wektorami ekspresyjnymi kodującymi podjednostkę p35 IL-12, białko fuzyjne Fc-p35 albo, jak opisano, wektor ekspresyjny kodujący białko fuzyjne przeciwciało-p35 (Gillies i wsp. (1998) J. Immunol. 160:6195-62030).

Supernatant ze stabilnie transfekowanych linii komórkowych prowadzących ekspresję ludzkiego białka Fc-IL-12-IL-2 (to jest ekspresję KS-p35 i p40-IL-2) zebrano i produkty oczyszczano drogą wiązania i elucji z Sefarozy z białkiem A, zgodnie ze sposobami postępowania podanymi przez producenta (Replingen, Needham, MA). Czyste białka badano techniką ELISA pod kątem zawartości IL-12 i IL-2. Wyniki wykazały, że poszczególne ilości cytokin różniły się w przybliżeniu 4-krotnie pod względem masy, co koreluje z 4-krotną różnicą masy cząsteczkowej pomiędzy IL-12 i IL-2. Podobne wyniki otrzymano w badaniu ELISA produktów transfekowanych komórek produkujących ludzkie białko KS-IL-12-IL-2, uzyskując w przypadku ilości uzyskanych IL-12 i IL-2 podobne wartości. Zatem, uwzględnia18

PL 202 058 B1 jąc dokładność ELISA, zmierzone wartości wskazują że IL-12 i IL-2 są wytwarzane w stosunku molowym około 1:1. Te same wyniki uzyskiwano dla białek fuzyjnych IL-12-GM-CSF wytwarzanych albo z fragmentem Fc albo z całym przeciwciałem.

P r z y k ł a d 3

Działanie synergistyczne białek fuzyjnych w teście indukcji IFN-γ

Aktywność biologiczną białek fuzyjnych IL-12-IL-2 mierzono w teście indukcji IFN-γ stosując jednojądrowe komórki ludzkiej krwi obwodowej (PBMC), w spoczynku albo aktywowane mitogenami, pobrane od ludzkich ochotników (fig. 6). Wytwarzanie IFN-γ mierzono techniką ELISA.

Ludzkie jednojądrowe komórki krwi obwodowej (PBMC) otrzymywano od zdrowych ochotników i oczyszczano drogą wirowania w gradiencie Ficoll-Hypaque (Pharmacia) (1700 obrotów na minutę w ciągu 20 minut). „Kożuszek” zawierający PBMC rozcieńczano za pomocą pożywki hodowlanej nie zawierającej surowicy (SF-RPMI) do objętości 50 ml i zbierano drogą wirowania z prędkością 1500 obrotów na minutę w ciągu 5 minut. Po wirowaniu w gradiencie, komórki zawieszano ponownie w pożywce hodowlanej zawierającej 10% bydlęcej surowicy płodowej (RPMI-10) z albo bez fitohemaglutyniny (PHA, 10 μg/ml) o gęstości 5x10⁶ komórek/ml i hodowano przez 3 dni w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze z CO2. Komórki zbierano drogą wirowania, przemywano trzy razy równymi objętością SF-RPMI i zawieszano ponownie w świeżym RPMI-10 (1x10⁶ komórek/ml). Równe części (100 ul) umieszczono w studzienkach wielu 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych aby otrzymać końcową ilość komórek 10⁵ na jedną studzienkę. Próbki testowe pożywki hodowlanej rozcieńczano seryjnie w świeżej pożywce hodowlanej i wprowadzane do studzienek 96-dołkowej płytki. Do studzienek kontrolnych wprowadzano IL-12 (fig. 6A) albo równomolową mieszaninę handlową IL-2 i IL-12 (fig. 6B, cytokiny nabyte w firmie R&D Systems). Płytki inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze z CO₂, w tym czasie pobierano próbki (20 μθ do analizy techniką ELISA stężenia IFN-γ, postępując według instrukcji producenta (Endogen, Inc., Woburn, MA, USA).

Na fig. 6A porównywano aktywności ludzkiego białka fuzyjnego IL-12-IL-2 z aktywnością samej IL-12. Wyniki pokazały, że sama IL-12 indukowała produkcję IFN-γ do umiarkowanych poziomów, natomiast białko fuzyjne IL-12-IL-2 silnie indukowała syntezę IFN-γ. Ponieważ uważa się, że IL-2 nie wystarcza do uzyskania syntezy IFN-γ, to uzyskane wyniki wskazały, że oba składniki białka fuzyjnego, IL-12 i IL-2, wykazują aktywność, co więcej działają synergistycznie.

Następnie porównywano aktywności białka fuzyjnego Fc-IL-12-IL-2, białka fuzyjnego KS-IL-12-IL-2 i mieszaniny składającej się z białek IL-12 i IL-2 w stosunku molowym 1:1, pod kątem ich zdolności do indukowania IFN-γ. Wyniki przedstawione na fig. 6B wskazują że białko fuzyjne Fc-IL-12-IL-2 i białko fuzyjne KS-IL-12-IL-2 mają w przybliżeniu tę samą aktywność co równomolowa mieszanina IL-12 i IL-2. Te same wyniki uzyskiwano dla mysich postaci IL-2 i IL-12, uzyskanych w sposób już opisany w przykładzie 1 dla form ludzkich, które stosowano w konstrukcji białek fuzyjnych.

P r z y k ł a d 4

Aktywność biologiczna IL-2 i IL-12 w białkach fuzyjnych IL-12-IL-2

Aktywność IL-2 i IL-12 w białkach fuzyjnych porównywano z aktywnością odrębnych cytokin stosując testy oparte na namnażaniu. Aktywność cząsteczki mysiego przeciwciała 14.18-IL-12-IL-2 badano w typowej próbie namnażania z IL-12. Ludzkie komórki PBMC uzyskiwano od ochotników i hodowano z 5 mikrogramami na ml fitohemaglutyniny-P przez trzy dni, przemywano za pomocą HBSS wg Hanka i wysiewano w szalkach mikrotitracyjnych w ilości 10⁵ komórek na studzienkę, zgodnie ze standardowym sposobem postępowania (Gately, M.K., Chizzonite, R. i Presky, D.H. Current Protocols in Immunology (1995), str. 6.16.1-6.16.15). Komórki inkubowano w obecności różnych badanych białek przez 48 godzin, a następnie 10 godzin przed oznaczaniem poziomów wbudowanej promieniotwórczości dodawano 0,3 mikrocurie ³H-tymidyny. IL-12 i równomolową mieszanina IL-12 i IL-2 stymulowały wbudowanie ³H-tymidyny do komórek w sposób zależny od dawki, a stymulacja wbudowania ³H-tymidyny przez białko fuzyjne 14.18-IL-12-IL-2 była w przybliżeniu równie skuteczna. IL-2 stymulowała wbudowanie ³H-tymidyny tylko przy wyższych stężeniach molowych, co wskazuje, że obserwowane wbudowanie ³H-tymidyny stymulowane przez białko fuzyjne 14.18-IL-12-IL-2 jest spowodowana przede wszystkim aktywnością IL-12. Wyniki przedstawiono na fig. 7.

Ponadto aktywność biologiczną składnika IL-2 badano w innej próbie namnażania komórek, postępując według standardowego sposobu (Davis L.S., Lipsky, P. E. i Bottomly, K. Current Protocols in Molecular Immunology (1995), str. 6.3.1-6.3.7). Proliferacja komórek w mysiej linii komórkowej CTLL-2 zależy od IL-2. Komórki w linii komórkowej CTLL mogą namnażać się także w odpowiedzi na podanie IL-4, lecz nie IL-12. Komórki CTLL będące w aktywnej logarytmicznej fazie wzrostu przemywano dwa

PL 202 058 B1 razy pożywką bez IL-2 i wysiewano w ilości około 1x10⁴ komórek na studzienkę w szalce mikrotitracyjnej, w obecności różnych ilości handlowej mysiej IL-2, mysiego białka fuzyjnego 14.18-IL-12-IL-2 albo handlowej mysiej IL-12 i hodowano w ciągu 48 godzin. Pod koniec okresu wzrostu oceniano ilościowo liczbę żywych komórek stosując test MYY/MTS. Na fig. 8 przedstawiono doświadczenie, w którym stosowano różne poziomy IL-2, IL-12 albo białka fuzyjnego 14.18-IL-12-IL-2. Wyniki wskazały, że mysia IL-2 i mysie białko fuzyjne 14.18-IL-12-IL-2 mają w przybliżeniu jednakową moc stymulowania namnażania komórek, jednocześnie zwiększenie ilości mysiej IL-12 nie powodowało żadnej wykrywalnej stymulacji namnażania komórek. Uzyskany wynik wskazuje, że stymulacja namnażania komórek CTLL-2 przez białko fuzyjne 14.18-IL-12-IL-2 jest wynikiem działania IL-2, a nie IL-12.

P r z y k ł a d 5

Konstrukcja i ekspresja jednołancuchowych i wielołańcuchowych białek fuzyjnych TL-12-IL-2 z przeciwciałem, jego fragmentem albo bez

Jednołańcuchowe mysie białko fuzyjne IL-12-IL-2 konstruowano w sposób następujący. Sekwencję kodującą białko fuzyjne p40-IL-2 konstruowano sposobami analogicznymi do sposobów stosowanych przy konstruowaniu DNA ludzkiego białka fuzyjnego p40-IL-2 opisanych w przykładzie 1. Aby połączyć DNA kodujące podjednostki p35 i p40 z IL-12 i utworzyć pojedynczą sekwencję, DNA kodujący linker syntetyzowano z miejscem cięcia Xhol na końcu 5', i miejscem cięcia BamHI na końcu 3'. Koniec 5' sekwencji kodującej dojrzały p40-IL-2 zmodyfikowano w celu wprowadzenia miejsce cięcia restrykcyjnego, a następnie poddano ligacji z końcem 3' linkera. Koniec 3' sekwencji kodującej mysi p35 modyfikowano w celu wprowadzenia miejsca restrykcyjnego i poddano ligacji z miejscem cięcia Xhol linkera. cDNA kodujące jednołańcuchowe mulL-12 i mu-p40-mulL2, opisane w przykładzie 1, łączono stosując odpowiednie miejsce restrykcyjne w p40 otrzymując trzeci konstrukt DNA kodujący jednołańcuchowe białko mulL12-mulL2. Opisane etapy prowadzono stosując w miarę potrzeby różne wektory i wyodrębnione fragmenty DNA. Otrzymana sekwencja regionu kodującego mysi p35-linker-p40-IL-2 została przedstawiona jako SEQ ID NO: 11.

Jednocześnie podobnymi sposobami skonstruowano odpowiednią sekwencję kodującą jednołańcuchową mysią IL-I2. Sekwencja kodująca ma postać SEQ ID NO: 12.

Ponadto skonstruowano sekwencję DNA, która koduje obszar Fc mysiej lgG2a sprzężonej z końcem N białka p35-linker-p40-IL-2. Sekwencja kodująca ma postać SEQ ID NO: 13.

Kultury komórek 293 transfekowano plazmidami ekspresyjnymi kodujących mysie jednołańcuchowe białka Fc-IL-12-IL-2 i Fc-IL-12. Ekspresję białek fuzyjnych określano w sposób opisany w przykładzie 2. Białka fuzyjne Fc oczyszczano przez wiązanie z białkiem A Sefarozy i obserwowano wysokie poziomy ekspresji Fc-IL-12-IL-2 i Fc-IL-12. Białka syntetyzowano w postaci nietkniętej, jak wynika z mas cząsteczkowych określonych na podstawie migracji w żelu SDS: Fc-IL-12-IL-2-123 kD i Fc-IL-12 -107 kD.

Białko fuzyjne KS-sclL12-IL2 opisane w przykładzie 1 jest tetramerem z dwoma różnymi łańcuchami polipeptydowymi: lekkim łańcuchem KS-1/4 i ciężkim łańcuchem KS-1/4 z białkiem sclL12-IL2 na końcu C. W celu zbadania, które centra w obrębie cząsteczki przeciwciała są odpowiednie aby przyłączyć cytokiny, skonstruowano drugie białko fuzyjne, w którym przeciwciała KS-1/4, IL-12 i IL-2 miały konfigurację różną od konfiguracji KS-IL12-IL2 z przykładu 1. To drugie białko było białkiem tetramerycznym i składało się z dwóch różnych polipeptydów. Jeden z polipeptydów składał się z lekkiego łańcucha przeciwciała KS-1/4, natomiast drugi polipeptyd składał się z jednołańcuchowej mulL12 sprzężonej z końcem N ciężkiego łańcucha dojrzałego przeciwciała KS1/4, po którym następowała mysia IL-2 na karboksylowym końcu ciężkiego łańcucha.

cDNA kodujący podjednostkę p35 mysiej IL-12 klonowano techniką PCR z komórek mysiej śledziony aktywowanych konkawakaliną A (5 μg/ml w pożywce hodowlanej w ciągu 3 dni). Starter „forward” ma sekwencję AAGCTTGCTAGCAGC ATG TGT CAA TCA CGC TAC (SEQ ID NO: 14), w którym miejsce cięcia Hindlll AAGCTT (reszty 1-6 SEQ ID NO: 14) znajduje się przed kodonem start translacji ATG, a starter odwrotny ma sekwencję CTCGAG CTT TCA GGC GGA GCT GAG ATA GCC (SEQ ID NO: 15), gdzie miejsce cięcia Xhol CTCGAG (reszty 1-6 SEQ ID NO: 15) znajduje się za kodonem stop translacji TGA (antykodon TCA).

DNA kodujący jednołańcuchową IL-12 zawiera DNA kodujący mup35 połączony z oligonukleotydami kodującymi linker bogaty w reszty glicyny i seryny, po którym następuje DNA kodujący mup40. Otrzymana konstrukcja ma następującą sekwencję oligonukleotydową połączenia:

PL 202 058 B1

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

G AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG Gly Gly Ser Ala (SEQ ID NO: 17)

GGC GGA TCC GCC ATG (SEQ ID NO: 16) gdzie G AGC TC (reszty 1-6 SEQ ID NO: 16) jest miejscem restrykcyjnym Sacl bezpośrednio przed kodonem stop translacji mysiej p35, GCG koduje aminokwasową resztę na końcu C mysiego p35, GGA TCC (reszty 50-55 SEQ ID NO: 16) stanowi miejsce cięcia BamHI wprowadzone w celu ułatwienia ligacji, a ATG koduje resztę aminokwasową na końcu N dojrzałego białka mu-p40.

DNA kodujący jednołańcuchową mulL12-KS-ciężki łańcuch muGMCSF ma następującą sekwencję w obrębie połączenia mup40 z końcem N dojrzałego ciężkiego łańcucha KS:

Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

C TGC AGG GTC CGA TCC CCG GGA GGT TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT

AGC GGC GGA

Gly Gly Gly Ser Leu Ser (SEQ ID NO: 19)

GGG GGC TCC TTA AGC CAG (SEQ ID NO: 18) gdzie C TGC AG (reszty 1-6 SEQ ID NO: 18) stanowi miejsce cięcia Pstl bezpośrednio przed kodonem stop translacji mysiego białka p40, TCC koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu C mysiej p40, a CAG koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu N dojrzałego ciężkiego łańcucha KS. Otrzymany DNA kodujący jednołańcuchowe białko fuzyjne mulK12- ciężki łańcuch KS-mulL2 poddaje się następnie koekspresji z sekwencją kodującą lekki łańcuch KS.

W celu dalszego zbadania, które końce cząsteczki przeciwciała są dostępne do sprzęgania oraz zbadania, ile różnych polipeptydów można połączyć w jednym białku fuzyjnym zawierającym wiele cytokin, uzyskano ekspresję i zbadano pod kątem aktywności trzecie białko zawierające KS-1/4, IL-12 i IL-2, a mianowicie IL12-KS (lekki łańcuch) + KS (ciężki łańcuch)-IL2. Uzyskane białko fuzyjne jest białkiem heksamerycznym i zawiera trzy różne polipeptydy. Jeden polipeptyd obejmuje mysi region p35 sprzężony z lekkim łańcuchem przeciwciała KS1/4. Drugi polipeptyd składa się z ciężkiego łańcucha przeciwciała KS1/4 sprzężonego z ludzką IL-2 (Gillies i wsp. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428), a trzeci polipeptyd jest mysim regionem p40. W wyniku ekspresji uzyskano dwa łańcuchy lekkie i dwa łańcuchy ciężkie połączone wiązaniem disiarczkowym tworzące tetrameryczną strukturę przeciwciało-cytokina. Ponadto p35 na końcu N lekkiego łańcucha łączy się także wiązaniem disiarczkowym z p40.

DNA kodujący lekki łańcuch mup35-KS ma na złączu następującą sekwencję:

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

G AGC TCC GCG TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG

Gly Gly Ser Leu Ser (SEQ ID NO: 21)

GGC GGA TCC TTA AGC GAG (SEQ ID NO: 20) gdzie G AGC TC (reszty 1-6 SEQ ID NO:20) jest miejsce cięcia restrykcyjnym Sacl bezpośrednio przed kodonem stop translacji mysiej p35, GCG koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu C mysiego białka p35, GGA TCC (reszty 50-55 SEQ ID NO: 20) jest miejscem restrykcyjnym BamHI wprowadzonym w celu ułatwienia ligacji, a GAG koduje ostatnią resztę aminokwasową na końcu N lekkiego łańcucha.

Aby uzyskać ekspresję heksamerycznego białka fuzyjnego, wytworzono mysią linię komórkową prowadzącą ekspresję p40 transfekując komórki wektorem ekspresyjnym niosącym gen odporności na neomycynę i prowadząc selekcję za pomocą G418. Następnie komórki mysiej linii komórkowej prowadzącej ekspresję p40 transfekowano wektorem ekspresyjnym zawierającym jednostki transkrypcyjne kodujące lekki oraz ciężki łańcuch oraz marker selekcyjny kodujący reduktazę dihydrofolanu, co umożliwiało selekcję za pomocą metotreksanu (Gillies i wsp. (1998) J. Immunol. 160:6195).

P r z y k ł a d 6

Aktywność mysich jednołańcuchowych białek fuzyjnych IL-12-IL-2

Te same sposoby jak opisano w przykładzie 4 wykorzystano do badania aktywności jednołańcuchowej mysiej IL-12-IL-2 wytworzonej w wyniku czasowej ekspresji. Ilość każdej cytokiny w supernatancie hodowli komórkowej oznaczano najpierw techniką ELISA i wykorzystano do wyznaczenia krzywej zależności efektu od dawki. Aktywności odpowiadały ściśle wynikom uzyskanym dla opisanch wyżej Fc i białek fuzyjnych przeciwciało-IL-12-IL-2.

Szczegółowo, aktywność IL-12 cząsteczek jednołancuchowego (sc) białka mysiej IL-12-IL-2 i białka mysiego Fc-sclL-12-IL-2 badano jak opisano w przykładzie 4, stosując test namnażania ludzkich komórek PBMC. IL-12 i równomolowa mieszanina IL-12 i IL-2 stymulowały wbudowanie ³H-tymidyny do

PL 202 058 B1 komórek w sposób zależny od dawki. Biorąc pod uwagę jeden mol białka fuzyjnego, sclL-12-IL-2, jak i Fc-sclL-12-IL-2, były w przybliżeniu tak samo skuteczne jak i IL-12 w stymulacji wbudowania ³H-tymidyny (fig. 9). Jak opisano w przykładzie 4, IL-2 stymuluje wbudowanie ³H-tymidyny tylko przy znacznie wyższych stężeniach molowych, co wskazuje, że obserwowane wbudowanie ³H-tymidyny stymulowane przez białka fuzyjne sclL-12-IL-2 jest spowodowane głównie ich aktywnością IL-12.

Ponadto aktywność biologiczną składnika IL-2 w białkach fuzyjnych sclL-12-IL-2 badano w teście opartym na komórkach i ustalono, że jest ona w przybliżeniu taka sama jak handlowej IL-2 biorąc pod uwagę jeden mol i dokładność techniki. Aktywność biologiczną składnika IL-2 badano, jak opisano w przykładzie 4, w próbie namnażania komórek CTLL-2. Wyniki wykazały, ż e mysia IL-2, mysie białko sclL-12-11-2 i mysie białko Fc-IL-12-IL-2 miały w przybliżeniu taką samą skuteczność stymulowania namnażania się komórek. Dla mysiej IL-12 nie stwierdzono wykrywalnej stymulacji namnażania się komórek CTLL-2. Uzyskane wyniki wskazują że stymulacja namnażania komórek CTLL-2 przez białka fuzyjne sclL-12-IL-2 były wynikiem głównie obecności składnika IL-2, a nie IL-12.

Aktywności IL-12 i IL-2 opisanych w przykładzie 5 białek Fc-IL-12-IL-2, IL-12-KS-IL-2 i IL-12KS(lekki łańcuch) + KS(ciężki łańcuch)-IL2 badano w testach opartych na komórkach. Stosując test namnażania komórek PBMC/oznaczenie wbudowanej trytowanej tymidyny uzyskano dużą aktywność IL-12 dla wszystkich białek Fc-IL12-IL2, IL12-KS-IL2 i IL12-KS(lekki łańcuch) + KS(ciężki łańcuch)-IL2. Podobnie, stosując test namnażania komórek CTLL, uzyskano dużą aktywność IL-2 dla wszystkich białek Fc-IL12-IL2, IL12-KS-IL2 i IL12-KS(lekki łańcuch) + KS(ciężki łańcuch)-IL2. Ponadto analiza ELISA wykazała, że oba białka IL12-KS-IL2 i IL12-KS(lekki łańcuch) + KS(ciężki łańcuch)-IL2 wiązały się silnie z antygenem EpCAM, nawet gdy obszary V odpowiednio ciężkiego łańcucha i lekkiego łańcucha sprzęga się z innymi białkami na ich końcach N.

P r z y k ł a d 7

Aktywność białek fuzyjnych mysich IL-12-GM-CSF

Aktywność IL-12 białka mysiego Fc-IL12-GM-CSF badano testem namnażania komórek (fig. 10). Ludzkie komórki PBMC uzyskiwano od trzech ochotników i hodowano je przez trzy dni z 5 mikrogramami/ml fitohemaglutyniny P, przemywano HBSS Hanka i wysiewano na płytkach mikrotitracyjnych w iloś ci 10⁵ komórek na studzienkę, zgodnie ze standardowym sposobem postępowania (Gately, M.K., Chizzonite, R. i Presky, D.H. Current Protocols in Immunology (1995), str. 6.16.1-6.16.15). Komórki poddawano inkubacji przez 48 godzin w obecności różnych badanych białek, a następnie, 10 godzin przed oznaczaniem poziomów wbudowania promieniotwórczej tymidyny, dodawano 0,3 mikrocurie ³H-tymidyny. IL-12 i równomolowa mieszanina IL-12 i GM-CSF stymulowały wbudowanie ³H-tymidyny do komórek w sposób zależny od dawki, a stymulacja wbudowania ³H-tymidyny przez białko fuzyjne 14.18-IL-12-GM-CSF była zbliżona. Białko GM-CSF nie stymulowało wbudowania ³H-tymidyny w badanych stężeniach, co wskazuje, że obserwowane wbudowywanie ³H-tymidyny stymulowane przez białko fuzyjne 14.18-IL-12-GM-CSF, było spowodowane głównie aktywnością IL-12.

Ponadto badano testami opartymi na komórkach aktywność biologiczną regionu GM-CSF w różnych białkach fuzyjnych IL-12-Gm-CSF. Ustalono, że składnik GM-CSF jest aktywny, rozpatrując aktywność na mol, w takim samym ogólnym zakresie, jak handlowe białko GM-CSF. Na przykład aktywność biologiczną składnika GM-CSF badano innym testem namnażania komórek, postępując w sposób znany dla specjalistów w dziedzinie immunologii molekularnej (Cooper, S.C. i Broxmeyer H. E. Current Protocols in Molecular Immunology (1996), str. 6-4.1-6.4.20). Namnażanie komórek mysiej linii komórkowej 32D(GM) zależy od obecności GM-CSF. Linię tę dostosowano korzystając z wyjściowej linii komórkowej 32D, opisanej przez Coopera i Broxmeyera jako szczególnie wrażliwą na poziom GM-CSF (Faas i wsp., Eur. J. Immunol. (1993) 23:1201-14). Linia komórkowa 32D(GM) nie odpowiada na IL-12. Komórki 32D(GM) będące w aktywnej logarytmicznej fazie wzrostu przemywano dwa razy pożywką bez GM-CSF i wysiewano w ilości około 5x10³ komórek na studzienkę w szalce mikrotitracyjnej w obecności różnych ilości handlowej mysiej GM-CSF albo mysiego białka fuzyjnego IL-12-GM-CSF i hodowano je przez 48 godzin. Następnie, na szesnaście godzin przed oznaczaniem poziomów wbudowania promieniotwórczej tymidyny, dodano 0,3 mikrocurie ³H-tymidyny. Obserwowano wzrost w zależności od dawki, wbudowania ³H-tymidyny ze wzrastającymi poziomami białka fuzyjnego IL-I2GM-CSF, co wskazuje, że GM-CSF jest aktywnym składnikiem białka fuzyjnego IL-12-GM-CSF. Co więcej, aktywność biologiczna białka fuzyjnego, obliczona na podstawie ilości molowych, jest porównywalna z aktywnością handlowej mysiej GM-CSF.

PL 202 058 B1

P r z y k ł a d 8

Leczenie raka okrężnicy u ssaka o sprawnym układzie odpornościowym z zastosowaniem białka fuzyjnego zawierającego cytokiny

W celu zbadania, czy biał ka fuzyjne zawierają ce cytokiny-przeciwciało mogą być stosowane do leczenia raka okrężnicy u ssaka z wydolnym układem odpornościowym, prowadzono następujące doświadczenia. CT26 jest linią komórkową raka okrężnicy pochodzącą od myszy Balb/C. Drogą standardowych manipulacji genetycznych uzyskano ekspresję cząsteczki adhezyjnej ludzkich komórek nabłonkowych (EpCAM), która jest antygenem rozpoznawanym przez przeciwciało KS-1/4. Uzyskane komórki określono mianem CT26/KSA.

Myszom Balb/C wszczepiono 2x10⁶ komórek CT26/KSA. Gdy nowotwory osiągnęły objętość około 100-200 milimetrów sześciennych, do dalszych badań myszy podzielono na trzy grupy po 9 myszy. Poczynając od dnia 0 myszy mające nowotwór, leczono stosując PBS; około 3,4 mikrograma KS-IL2 zmieszane z około 5,3 mikrograma KS-IL12 albo około 6 mikrogramów KS-IL2-IL12. Powyższe dawki zapewniając doprowadzenie takiej samej liczby cząsteczek IL-12 i IL-2 do każdej grupy myszy. Myszom preparaty poddawano przez iniekcję donowotworową raz dziennie przez pięć dni, wielkość nowotworu mierzono za pomocą urządzeń do mierzenia średnicy.

Wyniki jednego z doświadczeń pokazano na fig. 11. W doświadczeniu tym KS-IL12-IL2 powodowała niemal całkowite zahamowanie rozwoju nowotworów. Mieszanina KS-IL12 i KS-IL2 powodowała także znaczne zahamowanie rozwoju nowotworów, lecz nie całkowicie jak KS-IL12-IL2. W grupie myszy leczonych z użyciem KS-IL12-IL2 u sześciu z dziewięciu myszy stwierdzono całkowite cofnięcie się nowotworów. Wyleczone myszy dożyły do 93 dnia, gdy zakończono doświadczenie. Nowotwory u tych myszy kurczyły się i zanikały, prowadząc w dniach od 39 do 93 do braku pod skórą nawet śladu nowotworu. U pozostałych trzech myszy nadal stwierdzono guzy, jednak ich wzrost był bardzo powolny, tak że objętość przekraczała 4000 milimetrów sześciennych dopiero po 87 dniach.

Z myszy leczonych mieszaniną KS-IL12 i KS-IL2 dwie myszy został y cał kowicie wyleczone i nie stwierdzono u nich nowotworów podskórnych, myszy te żyły do końca doświadczenia. Nowotwory u pozostałych siedmiu myszy nie zanikły i ewentualnie wzrastały do objętości 1000 milimetrów sześciennych (u 1 myszy) albo większej niż 4000 milimetrów sześciennych (u 6 myszy).

Fakt, że białko fuzyjne KS-IL12-IL2 jest bardziej skuteczne niż równomolowa mieszanina KS-IL12 i KS-IL2, jest nieoczekiwany. W doświadczeniu dostarczano 15 pikomoli białka fuzyjnego na dawkę, co odpowiada 9x10¹² cząsteczkom. Na początku leczenia każdy nowotwór miał objętość około 160 milimetrów sześciennych, co odpowiada 160 milionom komórek. Każda komórka wytwarza około 10⁶ cząsteczek EpCAM, tak że jest około 1,6x10¹⁴ cząsteczek antygenu EpCAM, z którymi mogłoby się wiązać przeciwciało KS. Zatem po zmieszaniu KS-IL12 i KS-IL2 i iniekcji myszom, które mają nowotwory, jest nieprawdopodobne, aby te dwa immunocytokinowe białka fuzyjne konkurowały ze sobą o centra wiązania antygenu. Zatem skuteczna dawka IL-12 i IL-2 w nowotworze powinna być co najmniej tak wysoka dla mieszaniny KS-IL12 i KS-IL2, jak dla białka KS-IL12-IL2.

P r z y k ł a d 9

Leczenie raka okrężnicy u ssaka z niedoborem odporności z zastosowaniem białka fuzyjnego zawierającego cytokiny

Wiele sposobów leczenia raka polega na zabijaniu dzielących się komórek, w tym także komórek układu odpornościowego. W wyniku tego pacjenci z rakiem mają często stłumioną odporność. W celu sprawdzenia, czy białka fuzyjne zawierające cytokiny można zastosować do leczenia ssaka ze niedoborem odpornościowym, myszy SCID z nowotworami CT26/KSA leczono stosując KS-IL12-IL2, mieszaninę KS-IL12 i KS-IL2 albo PBS. Myszy SCID wykazują niedobór zarówno limfocytów B, jak i limfocytów T, i pod względem zdolności do zwalczania infekcji, zależą od odgałęzień wrodzonego układu odpornościowego, takich jak komórki NK.

Myszy z podskórnymi nowotworami CT26/KSA przygotowywano w sposób opisany w przykładzie 8. Trzy grupy po osiem myszy, które miały nowotwory o objętości około 100 do 200 milimetrów sześciennych, leczono drogą donowotworowej iniekcji takich samych dawek przy takim samym harmonogramie jak opisano w przykładzie 8. Wyniki przedstawiono na fig. 12. W tym przypadku białko fuzyjne KS-IL12-IL2 i mieszanina KS-IL12 i KS-IL2 okazały się równie skuteczne. Do 25 dnia wyleczono pięć z ośmiu myszy. Jednak w przypadku myszy, które nie zostały wyleczone, pięć z sześciu nowotworów rozrastały się z szybkością charakterystyczną dla nowotworów u zwierząt nieleczonych, przy skutecznym opóźnieniu od około 14 do 21 dni. Przeciwnie niż w przypadku nowotworów u myszy o sprawnym układzie odpornościowym, opisanych w przykładzie 8. Nawet gdy nowotwory nie zostały całkowiPL 202 058 B1 cie wyeliminowane dzięki leczeniu z użyciem KS-IL12-IL2, ich agresywny wzrost rozpoczynał się później niż około 60 dnia po rozpoczęciu doświadczenia.

Opisane doświadczenia wykazały, że białko fuzyjne cytokiny-przeciwciało można stosować do leczenia raka u zwierzęcia ze stłumioną odpornością.

P r z y k ł a d 10

Leczenie raka płuc drogą donowotworowej iniekcji białka fuzyjnego zawierającego cytokiny - porównanie z leczeniem za pomocą osobnych immunocytokin

W celu ustalenia skuteczności przeciwko nowotworowi pochodzącemu z komórek płuc, białek fuzyjnych zawierających cytokiny i immunocytokin zawierających jedną cytokinę przeprowadzono następujące doświadczenie.

Rak płuc Lewisa (LLC) jest agresywnym nowotworem pochodzącym od myszy C57BL/6. Linię komórkową LLC, prowadzącą ekspresję ludzkiego białka EpCAM, konstruowano standardową techniką inżynierii genetycznej. Linię komórkową oznaczono LLC/KSA.

Myszy C57BL/6 z podskórnymi nowotworami LLC/KSA przygotowywano w sposób opisany w przykładzie 8 (kontrola # komórek za pomocą KML). Myszom, które miały nowotwory o objętości od około 100 do około 200 milimetrów sześciennych, podzielonym na cztery grupy po 5 myszy w każdej grupie, podawano przez donowotworową iniekcję przez pięć dni, odpowiednio PBS, około 20 mikrogramów KS-IL12, około 20 mikrogramów KS-IL12 albo około 20 mikrogramów KS-IL12-IL2.

Wyniki przedstawiono na fig. 13. W tym przypadku białko fuzyjne KS-IL12-IL2 było o wiele bardziej skuteczne niż KS-IL12 albo KS-IL2. U wszystkich myszy leczonych za pomocą białka fuzyjnego KS-IL12-IL2 nowotwory znikały do 27 dnia. Po 74 dniach, jak opisano w przykładzie 14, myszy, które wyzdrowiały wykorzystano w próbie z przerzutami w płucach. Pierwotne nowotwory podskórne nie pojawiały się ponownie w okresie interwencyjnym albo w czasie drugiego doświadczenia. Przeciwnie, leczenie z użyciem KS-IL2 albo KS-IL12 dało w wyniku pewne zmniejszenie objętości nowotworu i znaczące spowolnienie wzrostu, lecz ostatecznie nowotwory nadal się rozwijały. Porównanie wyników uzyskanych według obecnego przykładu i przykładów poprzednich wskazuje, że w przypadku określonych chorób i sposobów podawania podawanie mieszaniny immunocytokin zawierających różne cytokiny jest lepsze niż leczenie za pomocą jednego typu cytokiny.

P r z y k ł a d 12

Leczenie raka płuc przez donowotworową iniekcję białka fuzyjnego zawierającego cytokiny - porównanie z leczeniem za pomocą mieszaniny immunocytokin

W celu określenia skuteczności białek fuzyjnych zawierających cytokiny i mieszanin immunocytokin, zawierających różne cytokiny w leczeniu raka pochodzącego z komórek płuc, przeprowadzono następujące doświadczenie.

Myszy C57BL/6 z podskórnymi nowotworami LLC/KSA przygotowano w sposób opisany w przykładzie 11. Myszom, z nowotworami o objętości od około 100 do 200 milimetrów sześciennych, podzielonym na trzy grupy po 7 myszy, podawano przez 5 dni, przez donowotworową iniekcję, odpowiednio PBS, mieszaninę około 18 mikrogramów KS-IL12 i około 11,5 mikrograma KS-IL2 albo około 20 mikrogramów KS-IL12-IL2.

Wyniki przedstawiono na fig. 14. Białka fuzyjne KS-IL12-IL2 były o wiele bardziej skuteczne niż mieszanina KS-IL12 i KS-IL2. U wszystkich myszy leczonych z użyciem białka fuzyjnego KS-IL12-IL2 nowotwory zanikały do 27 dnia. Przeciwnie podawanie mieszaniny KS-IL12 i KS-IL2 prowadziło do pewnego zmniejszenia nowotworów i znaczące opóźnienie ich rozwoju, lecz wszystkie nowotwory w tej grupie leczenia ostatecznie rozwijały się ponownie.

P r z y k ł a d 13

Zależność od antygenów przeciwnowotworowej aktywności białka fuzyjnego zawierającego cytokiny-przeciwciało

W celu ustalenia, czy skuteczność białka fuzyjnego cytokiny-przeciwciało w leczeniu nowotworu była zależna od specyficznej dla danego nowotworu ekspresji antygenu rozpoznawanego przez przeciwciało, przeprowadzono następujące doświadczenie.

Grupę siedmiu myszy C57BL/6 z podskórnymi nowotworami LLC/KSA i drugą grupę dziewięciu myszy z nowotworami pochodzącymi od macierzystej linii komórkowej LLC przygotowano w sposób opisany w przykładzie 11. Myszom, które miały nowotwory o objętości od około 100 do 200 milimetrów, podzielonym na dwie grupy, podawano drogą donowotworowej iniekcji w ciągu pięciu dni około 20 mikrogramów KS-IL12-IL2.

PL 202 058 B1

Wyniki przedstawiono na fig. 15. W tym przypadku wszystkie myszy z nowotworami LLC/KSA zostały całkowicie wyleczone. Przeciwnie myszy z nowotworami LLC zostały wyleczone tylko dwie. Wszystkie inne myszy z nowotworami LLC wykazywały tylko przejściowe zmniejszenie objętości nowotworów, przy czym ostatecznie nowotwory rozrastały się do dużych objętości.

Przedstawione wyniki wskazują, że rozpoznanie antygenu powierzchniowego EpCAM zwiększa adhezję KS-IL12-IL2 do powierzchni komórek nowotworowych LLC/KSA i uzyskuje się znacznie większą reakcję odpornościową. Pewien efekt przeciwnowotworowy obserwowano również w stosunku do nowotworów pochodzących z LLC. Nie rozpatrując teorii, działanie przeciwnowotworowe KS-IL12-IL2 może być w tym przypadku spowodowane faktem, że białko fuzyjne wstrzykiwano bezpośrednio do nowotworu, a zatem było ono czasowo przejściowo zlokalizowana na nowotworze.

P r z y k ł ad 14

Indukowanie pamięci odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym

Występowanie przerzutów stanowi główny problem przy leczeniu raka. W celu zbadania, czy leczenie za pomocą białka fuzyjnego cytokiny-przeciwciało mogłoby prowadzić do wytworzenia stałej odpowiedzi odpornościowej przeciwko komórkom nowotworowym i mogłoby zapobiegać wystąpieniu przerzutów, przeprowadzono następujące doświadczenie.

Pięć myszy C57BL/6 z przykładu 11 traktowano KS-IL12-IL2 i uzyskując wyleczenie podskórnych nowotworów. Po 74 dniu od rozpoczęcia leczenia, jak opisano w przykładzie 14, pięciu myszom wstrzyknięto dożylnie 10⁶ komórek LLC/KSA. Jako kontrolę ośmiu myszom C57BL/6 wstrzykiwano także 10⁶ komórek LLC/KSA.

W 28 dniu myszy uśmiercano i badano płuca pod względem przerzutów. Płuca ośmiu myszy kontrolnych były pokryte w 70 do 100% przerzutami, ze średnim pokryciem powierzchni płuc 85%. Średni ciężar płuc tych myszy wynosił 0,86 grama. Przeciwnie nie znaleziono żadnych przerzutów na powierzchni płuc u pięciu poprzednio leczonych myszy, a średni ciężar płuc wynosił 0,28 grama, co odpowiadało ciężarowi normalnych mysich płuc. Przedstawione wyniki wskazują że leczenie pierwotnych komórek nowotworowych dało w wyniku długotrwałą odpowiedź odpornościową która zapobiegała wystąpieniu przerzutów tego rodzaju komórek nowotworowych.

T a b e l a X

Ochrona przed przerzutami do płuc LLC-KSA u myszy po wyleczeniu

Leczenie wstępne	Ocena wystąpienia przerzutów	Masa płuc (g)
Brak	4,4,4,4,4,4,3,3	0,88 +/- 0,27
KS-IL12/IL2	0,0,0,0,0	0,27 +/- 0,03

Średni ciężar płuc grupy kontrolnej, bez nowotworu, wynosił 0,2 g. Ocenę wystąpienia przerzutów oparto na procencie pokrycia powierzchni płuc przez zlane guzki metastatyczne, gdzie 0 = brak przerzutów, 1 = 1 - 25% pokrycia, 2 = 25 - 50% pokrycia, 3 = 50 - 75% pokrycia i 4 = 75 - 100% pokrycia.

W drugim doświadczeniu w celu zbadania wytwarzania pamięci reakcji odpornościowej stosowano sześć z siedmiu myszy z przykładu 12, którym wstrzyknięto komórki nowotworowe LLC/KSA, i u których rozwinęły się podskórne nowotwory, a następnie nowotwory zanikły. Sześćdziesiąt dwa dni po rozpoczęciu leczenia jak opisano w przykładzie 12 sześciu leczonym myszom i 10 nie nieleczonym myszom kontrolnym C57BL/6 wstrzyknięto dożylnie 10⁶ komórek LLC. Komórki te nie wytwarzają ludzkiego antygenu KS, EpCAM.

U myszy nie poddanych bodźcowi wstrzyknięte komórki LLC wytworzyły nowotwory, które rosły bardzo szybko u wszystkich myszy. Przeciwnie, nowotwory u wstępnie leczonych myszy rosły o wiele wolniej, a u jednej myszy nie wykryto żadnego nowotworu podskórnego. Wyniki przedstawiono na fig. 16. Ponieważ ludzki antygen KS, EpCAM, nie ulega ekspresji w komórkach LLC, to reakcja odpornościowa na komórki LLC opierała się na innych antygenach, które ulegały ekspresji w tych komórkach.

P r z y k ł a d 15

Zastosowanie białek fuzyjnych zawierających cytokiny w szczepionkach

Białka fuzyjne zawierające cytokiny można stosować jako szczepionki, gdy poddaje się je sprzężone z antygenem białkowym. Określona kolejność składników w białku fuzyjnym od końca N do końca C albo to, czy białko fuzyjne jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym czy oligomerem, może zmieniać się w zależności od wygody konstrukcji plazmidów zapewniających ekspresję. Białko fuzyjne można podawać różnymi drogami, np. dożylnie, podskórnie, dootrzewnowo, itd. Podobnie dawka i częstość podawania wymagają na ogół wyznaczenia doświadczalnego, co jest standardową praktyką

PL 202 058 B1 w przypadku szczepionek ludzkich i co jest dobrze znane specjalistom w dziedzinie opracowywania szczepionek.

Myszom białko fuzyjne podaje się na przykład w postaci antygen-IL-12-cytokina, gdzie cytokina w białku fuzyjnym jest cytokiną inną niż IL-12. Myszy kontrolne otrzymują tę samą ilość antygenu-cytokiny, antygenu-IL-12 albo samego antygenu. W różnych okresach, podczas i ewentualnie po podaniu białka fuzyjnego z antygenem, pobrano drogą krwawienia pozaorbitalnego, próbki krwi, przygotowano i analizowano osocze pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi. Ustalono, że przeciwko antygenowi wytworzyły się przeciwciała. Co więcej, natura reakcji odpornościowej na antygen jest charakterystyczna dla reakcji Th1. Odpowiedź przeciwciała jest silniejsza, a typ wytworzonych przeciwciał różni się pewnych immunizacji kontrolnych.

Bardziej szczegółowo, myszom Balb/c (5 μg/dzień x 5) wstrzykiwano dożylnie humanizowane białko fuzyjne przeciwciało-mysia IL-12-IL-2 w buforze PBS. Myszy kontrolne otrzymywały takie samo przeciwciało, w tych samych ilościach, lecz nie przyłączone z IL-12-IL-2. Żaden roztwór do zastrzyku nie zawierał innego rodzaju środka wspomagającego. Po 10 dniach do probówek wirówkowych pobierano próbki krwi drogą krwawienia pozaorbitalnego i uzyskano osocze pobierając próbki krwi do probówek z tworzywa sztucznego, zawierających cytrynian sodowy, a następnie wirując z pełną szybkością w mikrowirówce laboratoryjnej Eppendorfa. Płytki ELISA (96-studzienkowych) powlekano humanizowanym przeciwciałem, które zawierało ludzki stały obszar i które stosuje się do wychwytywania wszelkich mysich przeciwciał wytworzonych w reakcji immunizacji. Po wymyciu niezwiązanego materiału związane mysie przeciwciała wykrywano za pomocą koziego przeciwciała skierowanego przeciwko Fc (Jackson ImmunoResearch) sprzężonego z peroksydazą chrzanową. Wszelkie związane przeciwciała mogły być skierowane przeciwko ludzkim stałym obszarom albo obszarowi zmiennemu, z których obydwa są wspólne dla humanizowanego przeciwciała i białka fuzyjnego.

Stwierdzono niewielką lub brak odpowiedzi na humanizowane przeciwciało jeśli nie było ono sprzężone z IL-12-IL-2. Z drugiej strony białko fuzyjne indukuje silną reakcję przeciwciała bez egzogenicznych środków wspomagających i pomimo faktu, że podawanie dożylne jest bardzo niekorzystne przy indukowaniu takich reakcji w porównaniu z podawaniem podskórnym albo dootrzewnowym. Stwierdzono obecność przeciwciał o izotypie lgG2a, które należą do typowej reakcji wzmocnionych IL-12, w grupie zwierząt, którym podano przez iniekcję przeciwciało-IL-12-IL-2, lecz nie u zwierząt z grupy otrzymującej przez iniekcję humanizowane przeciwciała.

Immunogenność białek fuzyjnych antygen-IL-12-cytokiny, podawanych różnymi drogami, badano po iniekcji roztworu białka fuzyjnego (jak opisano wyżej) w PBS albo innego odpowiedniego biologicznie buforu lub też znanego środka wspomagającego, takiego jak niepełny albo pełny adjuwant Freuda. Na przykład pojedyncze albo wielokrotne podskórne, śródskórne albo dootrzewnowe iniekcje podawano co dwa tygodnie. Alternatywnie, białko fuzyjne można podawać najpierw drogą zastrzyku podskórnego, a następnie drogą zastrzyku dootrzewnowego. Środek wspomagający Freuda nie może być stosowany u ludzi, ze względu na podrażnienie w miejscu zastrzyku. Dopuszczalne u ludzi są inne środki wspomagające, np. osad wodorotlenku glinowego (Alum) i można je stosować w niniejszym wynalazku. Do zastrzyków do skóry można stosować także nowe organiczne chemiczne środki wspomagające oparte na skwalenach i lipidach.

P r z y k ł a d 16

Terapia genowa z wykorzystaniem białek fuzyjnych zawierające wiele cytokin

Aktywność przeciwnowotworową białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin dostarczanych metodami terapii genowej wykazano także w leczeniu raka płuc. Komórki raka płuc Lewisa transfekowano stabilnie stosując opisany wyżej układ wektora wirusowego (komórki przenoszącej linii komórkowej transfekowano DNA kodującym PA317pLNCX-sclL-12-IL-2 albo pLNCX-sclL-12 DNA). Uzyskane konstrukty kodują jednołańcuchową odmianę IL-12, w której podjednostki p35 i p40 zostały połączone linkerem. Klony wybierano in vitro stosując pożywkę zawierającą G418, a klony dające trwałą ekspresję około 50 do 60 ng/ml białka identyfikowano techniką ELISA (R&D Systems).

Myszom C57BL/6 i myszom SCID podawano przez iniekcję około 1x10⁶ i około 5x10⁶ komórek LLC produkujących białka sclL-12 albo sclL-12-IL-2. Jako kontrolę myszom C57BL/6 i myszom SCID wstrzykiwano 2x10⁶ komórek LLC. Komórki LLC wytwarzające IL-12 tworzą nowotwory, które rozwijają się w przybliżeniu z tą samą szybkością jak nowotwory pochodzące od komórek LLC, które poddano manipulacji genetycznej aby uzyskać ekspresję cytokin. Jednak zarówno u myszy C57BL/6, jak i u myszy SCID, komórki LLC wytwarzające sclL-12-IL-2 albo nie tworzyły nowotworów podskórnych albo tworzyły nowotwory, które następnie zmniejszały się i zanikały (fig. 17 i 18).

PL 202 058 B1

P r z y k ł a d 17

Konstrukcja białek fuzyjnych zawierających wiele cytokin oraz IL-4 i GM-CSF

Cytokiny IL-4 i GM-CSF, stosowane w połączeniu, są silnymi aktywatorami komórek dendrytycznych. Białko fuzyjne wiele cytokin-przeciwciało, zawierające aktywne IL-4 i GM-CSF konstruowano w sposób następujący. Sekwencję kodującą GM-CSF sprzęgano w ramce odczytu z końcem 3' sekwencji kodującej ciężki łańcuch przeciwciała KS-1/4, która była poprzedzona sekwencją liderową Ponadto sekwencję kodującą IL-4, zawierającą sekwencję liderową sprzęgano w ramce odczytu z linkerem na końcu 5' sekwencji kodującej lekki łańcuch dojrzałego przeciwciała KS-1/4.

Szczegółowo, w celu skonstruowania DNA kodującego białko fuzyjne mysiej IL-4 i lekkiego łańcucha przeciwciała KS-1/4, cDNA kodujący mysią IL-4 uzyskano techniką PCR stosując starter „w przód” TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C (SEQ ID NO: 22), w którym miejsce cięcia Xbal TCTAGA (reszty 1-6 SEQ ID NO: 22) zostało umieszczone przed kodonem inicjacji translacji ATG, starter odwrotny C GGA TCC CGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G (SEQ ID NO: 23), który zawiera miejsce cięcia BamHI GGA TCC (reszty 2-7 SEQ ID NO: 23) bezpośrednio 3' względem kodonu TCG (antykodon CGA) kodującego resztę aminokwasową na końcu C mysiego białka IL-4. Po klonowaniu fragmentu drogą PCR i sprawdzeniu sekwencji fragment Xbal-BamHI zawierający cDNA kodujący mysią IL-4 poddawano ligacji z oligonukleotydowym dupleksem BamHI-Aflll kodującym elastyczny linker peptydowy bogaty w reszty glicyny i seryny. Koniec Aflll łączono z kolei ze sztucznie umieszczonym miejscem cięcia Aflll poprzedzającym koniec N lekkiego łańcucha dojrzałej KS-1/4. Sekwencje DNA i białkowe połączeń wynikających z dwóch ligacji przedstawiono niżej.

DNA: TCG GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGA GGT AGC GGC GGA

Białka: (Ser) Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

GGG GGC TCC TTA AGC GAG (SEQ ID NO: 24)

Gly Gly Ser Leu Ser (Glu) (SEQ ID NO: 25)

W przedstawionej sekwencji DNA GGATCC (reszty 4-9 z SEQ ID NO: 24) i CTTAAG (reszty 48-53 z SEQ ID NP.:24) stanowią miejsca restrykcyjne, odpowiednio BamHI i Aflll, stosowane w nowym konstrukcje, TCG koduje ostatnią resztę serynową na końcu C mysiej IL-4, GAG koduje koniec N lekkiego łańcucha dojrzałego KS-1/4, a sekwencja aminokwasowa linkera peptydowego bogatego w Gly i Ser jest kodowana przez pokazaną niżej sekwencję DNA. Pomocnicze sekwencje konieczne do uzyskania ekspresji na wysokim poziomie, obejmujące silne promotory, umieszczano odpowiednio w sąsiedztwie sekwencji DNA kodujących obydwa peptydy fuzyjne, stosując techniki opisane w poprzednich przykładach oraz inne standardowe techniki biologii molekularnej.

Komórki NS/0 transfekowano sekwencjami DNA kodującymi IL-4(lekki łańcuch) i białka fuzyjne KS(ciężki łańcuch)-GM-CSF, i uzyskiwano ekspresję żądanych peptydów na wysokim poziomie. Analiza SDS-PAGE w warunkach redukujących wykazała rozmyty prążek przy około 80 kD, co odpowiadało polipeptydowi ciężkiego łańcucha-GM-CSF, oraz kilka prążków przy około 50 kD odpowiadających białku fuzyjnemu IL-4-lekki łańcuch.

Pojawienie się rozmytego prążka i prążków wielokrotnych było spowodowane zmienną glikolizacją odpowiednio IL-4 i GM-CSF.

Podjednostki tworzyły białko tetrameryczne związane wiązaniem disiarczkowym, mającym strukturę odpowiadającą strukturze typu przedstawionego na fig. 3G. Białko fuzyjne wykazywało aktywność KS-1/4 wiązania antygenu, zdolność do wiązania białka Staph A poprzez obszary Fc oraz aktywność cytokinową IL-4 i GM-CSF. Aktywność IL-4 mierzono drogą zależnej od IL-4 stymulacji wbudowania trytowanej tymidyny przez komórki CTLL-2. Aktywność GM-CSF mierzono drogą zależnej od GM-CSF stymulacji wbudowania trytowanej tymidyny przez komórki 32(D)GM. Biorąc pod uwagę ilości molowe, aktywność IL-4 i aktywność GM-CSF KS-IL4-GMCSF były podobne do aktywności oczyszczonej IL-4 i GM-CSF. Białko fuzyjne cytokina IL-4 i GM-CSF, nie sprzężone z przeciwciałem, konstruowano w sposób następujący. RNA kodujący mysią IL-4 klonowano techniką PCR po wyodrębnieniu z komórek śledziony myszy. Starter „forward” miał sekwencję TCTAGACC ATG GGT CTC AAC CCC CAG C (SEQ ID NO: 26), w której miejsce cięcia Xbal TCTAGA (1-6 SEQ ID NO: 26) umieszczano przed kodonem inicjacji translacji ATG, a starter przeciwny miał sekwencję CGA TAT CCC GGA CGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GCT CTT TAG GCT TTC CAG G (SEQ ID NO: 27), która wprowadzała miejsce cięcia EcoRV GAT ATC (reszty 2-7 SEQ ID NO: 27) bezpośrednio 3' względem kodonu TCG (antykodon CGA) kodującego ostatnią resztę aminokwasową końca C mysiej IL-4. Po sprawdzeniu sekwencji fragment Xbal-EcoRV zawierający cDNA kodujący mulL-4 z naturalnym liderem poddawano

PL 202 058 B1 ligacji z fragmentem Smal-Xhol zawierającym cDNA kodujący muGM-CSF otrzymując następującą sekwencje łączącą kodującą białko fuzyjne pomiędzy mulL-4 a muGM-CSF: ATG GAT TAC TCG TCC GGG ATG GGA AAA GCA CCC GCC CGC (SEQ ID NO: 28), gdzie sekwencja na końcu C mulL4 i sekwencja na końcu N muGM-CSF są wytłuszczone, a G ATG GG (reszty 17-22 SEQ ID NO: 28) jest sekwencją otrzymaną z ligacji tępego końca EcoRV i tępego końca Smal. Otrzymany DNA kodujący mulL4-muGMCSF wklonowano następnie do wektora ekspresyjnego. Uzyskane w wyniku ekspresji białko analizowano techniką SDS-PAGE, w której obserwowano rozmyty prążek o masie cząsteczkowej 45 do 50 kD. Rozpatrując ilości molowe, aktywność IL-4 i aktywność GM-CSF w IL4-GMCSF były podobne do aktywności oczyszczonej IL-4 i GM-CSF.

P r z y k ł a d 18

Konstrukcja DNA kodującego białko fuzyjne limfotaktyna-KS-IL2 i ekspresja białka limfotaktyna-KS-IL2

Chemokiny stanowią odmienną klasę cytokin, jak się uważa, tworzącą gradienty i pośredniczące w chemotaksji komórek odpornościowych. Ponadto, podobnie jak inne chemokiny, mogą one indukować w komórkach docelowych ekspresję określonych genów. Jedną z charakterystycznych cech chemokin jest wpływ wolnego końca N na ich aktywność, co prowadzi do nałożenia pewnych ograniczeń w sposobach konstrukcji białek fuzyjnych.

Konstruowano białko fuzyjne cytokina-przeciwciało-cytokina, obejmujące cytokinę - limfotaktynę, będącą chemokiną przeciwciałem KS-1/4 i cytokiną IL-2. Uzyskane białko fuzyjne było białkiem tetramerycznym i składało się z dwóch różnych polipeptydów. Jeden z polipeptydów zawierał mysią limfotaktynę sprzężoną z końcem N ciężkiego łańcucha przeciwciała KS-1/4, a następnie z IL-2 na końcu C. Białko fuzyjne zawierające ciężki łańcuch KS-1/4 z IL-2 na końcu C, „ciężki łańcuch KS-IL2”, opisano uprzednio (Gillies i wsp. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1428). Drugi polipeptyd obejmował lekki łańcuch przeciwciała KS1/4.

Pełną sekwencję kodującą mysią limfotaktynę opublikowali Kelner i Zlotnik (Science 266:1395 (1988)). Do konstruktu DNA kodującego białko fuzyjne mysiej limfotaktyny i ciężkiego łańcucha KS-IL2, uzyskano techniką PCR cDNA kodujący mysią limfotaktyny stosując starter „forward” TCTAGAGCC ACC ATG AGA CTT CTC CTC CTC AC (SEQ ID NO: 29), w której miejsce cięcia Xbal TCTAGA (reszty 1-6 SEQ ID NO: 29) umieszczono przed kodonem inicjacji translacji ATG, a starter przeciwny GGA TCC CCC AGT GAG GGT TAC TGC TG (SEQ ID NO: 30), który wprowadzał miejsce cięcia BamHI GGA TCC (reszty 1-6 SEQ ID NO:30) bezpośrednio 3' względem kodonu GGG (antykodon CCC) kodującego ostatnią resztę aminokwasową końca C mysiej limfotaktyny. Po sklonowaniu fragmentu techniką PCR i sprawdzeniu sekwencji, fragment Xbal-BamHI zawierający cDNA kodujący mysią limfotaktynę poddawano ligacji z dupleksem oligonukleotydowym BamHI-Aflll kodującym elastyczny linker peptydowy bogaty w reszty glicynowe i serynowe. Koniec Aflll łączono z kolei ze sztucznym miejscem cięcia Aflll poprzedzającym koniec N ciężkiego łańcucha dojrzałej KS-IL2. Sekwencja DNA kodująca białko łączące, otrzymane w wyniku dwóch ligacji podano niżej:

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

CCC GGA TCC GGA GGT TCA GGG GGC GGA GGT AGC GGC GGA GGG GGC TCC

Leu Ser (SEQ ID NO: 32)

TTA AGC CAG (SEQ ID NO: 31) gdzie GGATCC (reszty 4-9 SEQ ID NO: 31) i CTTAAG (reszty 48-53 SEQ ID NO: 31) są dwoma miejscami restrykcyjnymi, odpowiednio BamHI i Aflll, stosowanymi do ponownej konstrukcji, CCC koduje ostatnią resztę aminokwasową końca C mysiej limfotaktyny, CAG koduje dojrzały koniec N ciężkiego łańcucha KS-IL2, a aminokwasową sekwencję linkera peptydowego bogatego w Gly-Ser została pokazana wyżej jako sekwencja DNA kodująca tę sekwencję. Następnie DNA kodujący mysią limfotaktynę-KS-ciężki łańcuch IL2 wklonowano do wektora ekspresyjnego, a następnie uzykskano koekspresję z lekkim łańcuchem KS1/4.

Białko fuzyjne limfotaktyna-KS-IL2 uzyskane w wyniku ekspresji badano pod kątem aktywności limfotaktyny w teście migracji w komorze Boydena stosując limfocyty T (Leonard i wsp. (1999) Current Protocols in Immunology, str. 6.12.3). Alternatywnie stosuje się komórki NK. W innym rozwiązaniu aktywność limfotaktyny oznaczano w standardowej analizie komórkowej przepływu wapnia w odpowiedzi na aktywację receptora sprzężonego z białkiem G (Maghazachi i wsp., FASEB J. (1997) 11:765-74). Ponadto badano białko fuzyjne limfotaktyna-KS-IL2 i stwierdzono, że wykazuje ono aktywność w teście wiązania EpCAM, jak również wykazano aktywność białka fuzyjnego w teście na aktywność IL-2, takich jak test namnażania komórek CTLL-2.

PL 202 058 B1

Równoważniki

Wynalazek można realizować w innych specyficznych postaciach bez odchodzenia od idei wynalazku albo jego charakterystycznych cech. Stąd powyższe rozwiązania należy uważać we wszystkich aspektach raczej jako ilustrujące niż ograniczające opisany tu wynalazek. Zakres wynalazku został przedstawiony za pomocą załączonych zastrzeżeń w połączeniu z powyższym opisu i obejmuje wszystkie znaczenia i równoważniki objęte zastrzeżeniami.

Lista sekwencji <110> Gillies, Stephen

Lo, Kin Ming <120> Wielofunkcyjne białko fuzyjne cytokin i przeciwciała <13Q> LEX-010PC <140>

<141 >

<150> 60/147,924 <151> 1999-08-09 <160> 32 <170> Patentłn Ver, 2.0 <210> 1 <211 >582 <212> DNA <213> Mus musculus (Mysz domowa)

PL 202 058 B1 <220>

<223>OP’^S sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca dojrzałe mysie białko p 35 <400> 1 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtccegaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattatter ctgcactgct 120 gaagacatcg ateatgaega catcacacgg gaccaaacca gcaeattgaa gacctgttta 180 ccactggaac tacacaagaa egagagttge ctggctacta gagagaette ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg cettggtage 300 atetatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc ateageagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat egatgagetg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggegagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 4BO gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 640 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agctccgcct ga 582 <210>2 <211> 1472 <212> DNA ^<213>Sekwencja sztuczna <223>°P'^{S setwenc}j' otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne mysi p40-lL-2 <400>2 atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac cetctcctgg tttgccatcg 60 ttttgetggt gtctccactc atggęęatgt gggagętgga aaaagaegtt tatgttgtag 120 aggtggactg gacteccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactgtcaaa gagtttetag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 gcgagactct gageeactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360 ctgaaattct aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420 ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480 agageagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540 cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagcgtcc tgccaggagg 600 atgtcacctg cccaactgcc gaggagaecc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660 agcagaataa atatgagaac tacagcacca gettetteat cagggacatc atcaaaccag 720 acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 780 agtaccctga cccctggagc actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa 84d tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900 tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgeaag 960 eteaggateg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020 gatccccggg taaagcaccc acttcaagct ctacagcgga agcacagcag cagcagcagc 1080 ageageagea gcagcagcag cacctggagc agctgttgat ggacctacag gagctcctga 1140 gcaggatgga gaattacagg aacctgaaac tccccaggat gctcaccttc aaattttact 1200 tgcccaagca ggccacagaa ttgaaagatc ttcagtgcct agaagatgaa cttggacctc 1260 tgcggcatgt tctggatttg actcaaagca aaagctttca attggaagat gctgagaatt 1320 teateageaa tateagagta actgttgtaa aactaaaggg ctctgacaac acatttgagt 1380 gccaattcga tgatgagtca gcaactgtgg tggactttct gaggagatgg atageettet 1440 gtcaaageat catetcaaca agcectcaat aa 1472 <21 0>3 <211> 1409

PL 202 058 B1 <212> DNA

Sekwencja sztuczna <220>

<223>Opi^s sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne mysi p40-GM-CSF <400> 3 atgtgtcctc agaagctaac atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60 ttttgctggt gtctecactc atggccatgt gggagecgga gaaagacgtt ta tgt cgt ag 120 aggtggactg gactcrccgat gcccetggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactgteaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360 ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaa&ttact 420 ccggacggtt cacgtgctea tggccggtgc aaagaaacat ggacctgaag ttcaacatca 480 agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540 cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ctcagtgtcc tgccaggagg 600 atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccactga actggcgttg gaagcacggc 660 agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720 acccgcccaa gaacttgeag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gteagctggg 780 agtaccctga ctcctggagc actccccatt cctncttctc cctcaagttc tttgttcgaa 840 tccagcgcaa gaaagaaaag atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt 900 tcctcgtaga gaagacatct accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag 960 ctcaggatcg ctattacaat tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc 1020 gatccccggg aaaagcaccc gcccgctcac ccataattgt tacccggcct tggaagcatg 10S0 tagaggccat caaagaagcc ctaaacctcc tggatgacat gcctgtcacg ttgaatgaag 1140 aggtagaagt cgtctctaac gagttetcct tcaagaagct aacatgtgtg cagacccgcc 1200 tgaagatatt cgagcagggt ctacggggca atttcaccaa actcaagggc geettgaaca 1260 tgacagccag ctactaccag acatactgcc ccccaactcc ggaaacggac tgtgaaacac 1320 aagttaccac etatgeggat tccatagaca gccttaaaac ctttctgact gatatcccct 1380 ttgaatgcaa aaaaccaagc caaaaatga 1409 <21Q>4 <211> 1389 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223>Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne ludzki p40-IL-2 <400>4 atgtgtcacc agcagttggt eatctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60

PL 202 058 B1 gtggccatat gggaactgaa gaaagacgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120 gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 130 accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240 gagtttggag atgetggeea gtacacctgt cacaaaggag gcgaggteet aagceattcg 300 ctcctgćtgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360 aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcea agaattattc tggacgtttc 420 acctgctggt ggctgacgac aateagtact gatttgaeat tcagtgtcaa aagcagcaga 430 ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540 agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600 gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660 gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720 ttgcagctga agccattaaa gaatcctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780 acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggeaag 840 agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900 cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atettggagc 960 gaatgggcat ctgtgccctg cagtgcacet actteaagtt ctacaaagaa aacacagcta 1020 caactggagc atttactgct ggatttacag atgattttga atggaattaa taattacaag 1080 aatcccaaac tcaccaggat gctcacattt aagttttaca tgcccaagaa ggccacagaa 1140 ctgaaacatc ttcagtgtct agaagaagaa ctcaaacctc tggaggaagt gctaaattta 1200 gctcaaagca aaaactttca cttaagaccc agggacttaa tcagcaatat caacgtaata 1260 gttctggaac taaagggatc tgaaacaaca ttcatgtgtg aatatgctga tgagacagca 1320 accattgtag aatttctgaa cagatggatt aecttttgtc aaagcatcat ctcaacacta 1380 acttgataa 1389 <210>5 <211> 1278 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna ^^Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne mysi Fc-p35 <40G> 5 gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60 tcgggtggac catccgtcet eatctteect ccaaagatca aggatgtaet catgatctce 120 ctgagcccca tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtecag 180 atcagctggt ttgtgaecaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240 gattacaaca gtactctccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggactggatg 300 agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360 accatctcaa aacecaaagg gtcagtaaga getccacagg tatatgtctt gcetecacca 420 gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 480 gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540 gaaccagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag 600 aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tecacgaggg tctgcacaat 660 caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg tcattccagt ctctggacct 720 gccaggtgtc ttagecagtc ecgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 760 gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc 840 acacgggacc aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag 900 agttgeetgg ctaetagaga gaettcttec acaacaagag ggagctgect gcceceacag 960 aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020 cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080 ctagacaagg gcatgetggt ggccatcgat gagetgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140 gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag 1200 ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260 tatctgagct ccgcctga 1278

PL 202 058 B1 <210>6 <211> 1287 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne ludzki Fc-p35 <4C0> 6 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc ISO aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggageag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaecgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaace 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcacgg 420 gaggagatga ccaagaacea ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctateccagc 4B0 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cageoggaga acaaccacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt etfectcatge tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggaagaaacc tceccgtggc cactccagac 720 ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg 780 etccagaagg ceagacaaac tetagaattt tacccttgca ettctgaaga gattgateat 840 gaagatatca caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc 900 aagaatgaga gttgcctaaa ctccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg 960 gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattca tgaagaettg 1020 aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc ttctgacgga tcctaagagg 1080 cagatctttc tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggocctgaat 1140 ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact 1200 aaaatcaagc tctgcatacfc tcttcatgct ttcagaattc gggeagtgac tattgacaga 1260 gtgacgagct atctgaatgc etcctaa 1287 <210> 7 <211>32 <212>ONA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter forward' do uzyskania białka fuzyjnego mysi p40-IL-2 <220>

<321> Cechy różne <222> (12)..(14) <223> kodon inicjacji translacji <400> 7 aagctagcac catgtgtcct cagaagctaa cc 32 <210> S <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 202 058 B1 <220>

<223> opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter odwrotny do konstrukcji białka fuzyjnego mysi p40-IL-2 <220>

<221> Cechy różne <222> Komplementarny z ((7)..(9)) <223> kodon stop translacji <400>8 ctcgagctag gatcggaccc cgcaggg 27 <210> 9 <211 >31 <2l2> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna ^<220> Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja DNA kodująca połączenie w białku fuzyjnym ^<223> mysi p40-łL-2 <220>

<221> Cechy różne <222> (14) .(16) <223> hoduje resztę aminokwasową na końcu C mysiego p40 <220>

<221 > Cechy różne <222> (26). (28) <223> koduje resztę aminokwasową na końcu N mysiego IL-2 <400>9 ctgcagggtc cgatccccgg gtaaagcacc c 31 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> Qpj_S sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja DNA kodująca połączenie jednołańcuchowej ^<223> mysiej IL12 i GMCSF <220>

<221 > Cechy różne <222> (14)..(16) ^<223> koduje resztę aminokwasową na końcu C mysiego p40 <220>

<221 > Cechy różne <222> (26)..(28) _ <223> koduje resztę aminokwasową na końcu N dojrzałego mysiego GMCSF <400> 10

PL 202 058 B1 ctgcagggtc cgatccccgg gaaaagca 28 <21O>11 e211 >2013 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>opjg sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne ^<223> mysi p35-linker-p40-IL-2 <400> 11 agggtcattc cagtctctgg acctgcc&gg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta 180 ccactggaac Łacacaagaa cgagagttgc ctggetacta gagagaettc ttccacaaca 240 agagggagctgectgęcęcc acagaagacg tctttgatga.tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aatcacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaceatca acagggtgat gggctatctg agctccgcgt cgagcggggg cagcgggggc 600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720 gaagaagatg acatcacctg gaeetcagac cagagaeatg gagteatagg ctctggaaag 780 accctgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacaectg ccacaaagga 840 ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aatttggtcc 900 actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actttcctga agtgtgaagc accaaattac 960 tccggacggt tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca cggacttgaa gttcaacatc 1020 aagagcagta geagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctetgtct iaso gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140 gatgtcacet gcccaactgc cgaggagacc ctgcecattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200 c&gcagaaca aatatgagaa ctaeageacc agcttcttca tcagggacat catcaaacca 1260 gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320 gagtaccetg actcctggag cactceccat tcctacttct ccctcaagtt ctttgttcga 1380 atccagegca agaaagaaaa gatgaaggag aeagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440 ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500 geteaggate gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560 cgatccccgg gtaaagcacc cacttcaagc tctacagcgg aagcacagca gcagcagcag 1620 cagcagcagc ageageagea gcacctggag cagctgttga tggacctaca ggagctcctg 16B0 agcaggatgg agaattacag gaacctgaaa ctccccagga tgctcacctt caaattetac 1740 ttgcccaagc aggccaeaga attgaaagat cttcagtgec tagaagatga acttggacct 1800 ctgcggeatg ttctggattt gactcaaagc aaaagctttc aattggaaga tgctgagaat 1860 tteateagea atateagagt aactgttgta aaactaaagg gctetgacaa cacatttgag 1920 tgccaattcg atgatgagtc agcaactgtg gtggactttc tgaggagatg gatageette 19B0 tgtcaaagca tcatctcaac aagccetcaa taa 2013 <210> 12 <211> 1569 <212> DNA ^<213> Sekwencja sztuczna <223>θΡ'^ε sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne mysi p35-iinker-p40 <400> 12

PL 202 058 B1 agggtcattc cagtctctgg acctgccagg tgtcttagcc agtcccgaaa cctgctgaag 60 accacagatg acatggtgaa gacggccaga gaaaaactga aacattattc ctgcactgct 120 gaagacatcg atcatgaaga catcacacgg gaccaaacca gcacattgaa gacctgttta ISO ccactggaac tacacaagaa cgagagttgc ctggctacta gagagacttc ttccacaaca 240 agagggagct gcctgccccc acagaagacg tctttgatga tgaccctgtg ccttggtagc 300 atctatgagg acttgaagat gtaccagaca gagttccagg ccatcaacgc agcacttcag 360 aateacaacc atcagcagat cattctagac aagggcatgc tggtggccat cgatgagctg 420 atgcagtctc tgaatcataa tggcgagact ctgcgccaga aacctcctgt gggagaagca 480 gacccttaca gagtgaaaat gaagctctgc atcctgcttc acgccttcag cacccgcgtc 540 gtgaccatca acagggtgat gggctatctg agcccegegt cgagcggggg cagcgggggc 600 ggaggcagcg gcgggggcgg atccgccatg tgggtgctgg agaaagacgt ttatgttgta 660 gaggtggact ggactcccga tgcccctgga gaaacagtga acctcacctg tgacacgcct 720 gaagaagatg acatcacctg gacctcagac eagagacatg gagtcatagg etctggaaag 7Θ0 accccgacca tcactgtcaa agagtttcta gatgctggcc agtacacctg ccacaaagga 840 ggcgagactc tgagccactc acatctgctg ctccacaaga aggaaaatgg aattcggtcc 900 actgaaattt taaaaaattt caaaaacaag actctcctga agtgtgaagc accaaattac 960 tccggacggc tcacgtgctc atggctggtg caaagaaaca tggacttgaa gttcaacatc 1020 aagagcagta gcagttcccc tgactctcgg gcagtgacat gtggaatggc gtctctgtct 1080 gcagagaagg tcacactgga ccaaagggac tatgagaagt attcagtgtc ctgccaggag 1140 gatgtcacct gcccaactgc cgaggagacc ctgcccattg aactggcgtt ggaagcacgg 1200 cagcagaata aatatgagaa ctacagcacc agćttcttca tcagggacat catcaaacca 1260 gacccgccca agaacttgca gatgaagcct ttgaagaact cacaggtgga ggtcagctgg 1320 gagtaccctg actcctggag cactccccat tcccacttct ecctcaagtt ctttgttcga 1380 atccagcgca agaaagaaaa gatgaaggag acagaggagg ggtgtaacca gaaaggtgcg 1440 ttcctcgtag agaagacatc taccgaagtc caatgcaaag gcgggaatgt ctgcgtgcaa 1500 gctcaggatc gctattacaa ttcctcatgc agcaagtggg catgtgttcc ctgcagggtc 1560 cgatcctag ₁₅₆9 <210> 13 <211 >2709 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

Qpj_{s se}k_wencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca białko fuzyjne mysi <223> Fc-p35-liner-p40-IL-2 <400> 13

PL 202 058 B1 gagcccagag ggcccacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagc acctaacctc 60 ttgggtggac catccgtctt catcttccct ccaaagatca aggatgtact catgatctcc 120 ctgagccccs tagtcacatg tgtggtggtg gatgtgagcg aggatgaccc agatgtccag 180 atcagctggt ttgtgaacaa cgtggaagta cacacagctc agacacaaac ccatagagag 240 gattacaaca gtactetccg ggtggtcagt gccctcccca tccagcacca ggaccggatg 300 agtggcaagg agttcaaatg caaggtcaac aacaaagacc tcccagcgcc catcgagaga 360 accatctcaa aacccaaagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctecacca 420 gaagaagaga tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct 48o gaagacattt acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact 540 gaacaagtcc tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagetgag agtggaaaag 600 aagaactggg tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tccgcacaat 660 caccacacga ctaagagctt ctcccggacc ccgggtaggg teattccagt ctctggacct 720 gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg 780 gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acategatca tgaagacatc Θ4Θ acacgggacc aaaccagcac attgaagacc cgtttaceae tggaactaca caagaacgag 900 agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag 960 aagacgtctt tgatgatgac cetgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac 1020 cagacagagt tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt 1080 ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc 1140 gagactetgc gccagaaaec tcctgtggga gaagcagacc cttacagagc gaaaatgaag 1200 ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc 1260 tatctgagct ccgcgtcgag cgggggcagc gggggcggag gcagcggcgg gggcggatcc 1320 gccatgtggg tgctggagaa agacgtttat gttgtagagg tggactggac tcccgatgcc 1380 cctggagaaa cagtgaacct cacctgtgac acgcctgaag aagatgacat cacctggacc 1440 tcagaccaga gacatggagt cataggctct ggaaagaccc tgaccatcac tgtcaaagag 1500 tttctagatg ctggccagta cacctgccac aaaggaggcg agactctgag ccactcacat 1560 ctgctgctcc acaagaagga aaatggaatt tggtccactg aaattttaaa aaatttcaaa 1620 aacaagactt tcctgaagtg cgaagcacca aattactccg gacggttcac gtgctcatgg 1680 ctggtgeaaa gaaacatgga cttgaagttc aacaccaaga gcagtagcag ttccectgac 1740 tctcgggcag tgacatgtgg aatggcgtct ctgtctgcag agaaggtcac actggaccaa 1800 agggactatg agoagtattc agtgtcctgc caggaggatg tcacctgccc aactgccgag 1860 gagaccctgc eeattg&aet ggcgttggaa gcacggcagc egaataaata tgagaactac 1920 agcaccagct tcttcatcag ggacatcatc aaaccagacc cgcccaagaa cttgcagatg 1980 aagccettga agaactcaca ggtggaggtc agctgggagt accctgactc ctggagcact 2040 ccccattcct acttctccct eaagttettt gttegaatcc agcgcaagaa agaaaagatg 2100 aaggagacag aggaggggtg taaccagaaa ggtgcgttcc tcgtagagaa gacatctaco 2160 gaagtccaat gcaaaggcgg gaatgtctge gtgcaagctc aggatcgcta ttacaattcc 2220 tcatgcagca agtgggcatg tgttccctgc agggtccgat ccccgggtaa agcaeccact 22B0 tcaagctcta cagcggaagc acagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcac 2340 ctggagcagc tgttgatgga cctacaggag cteccgagca ggatggagaa ttacaggaac 2400 ctgaaactcc ccaggatgct caccttcaaa ttttacttgc ccaagcaggc cacagaattg 2460 aaagatcttc agtgcctaga agatgaactt ggacctctgc ggcatgttct ggatttgact 2520 caaagcaaaa gctttcaatt ggaagatgct gagaatttca tcagcaatat cagagtaact 2580 gttgtaaaac taaagggctc tgacaacaca tttgagtgcc aattegatga tgagccagea 2640 actgtggtgg actttctgag gagatggata gccttctgte aaagcatcat ctcaacaagc 2700 cctcaataa ²⁷⁰⁹ <210;» 14 <211>33 <212> DNA <213>Sekwencja sztuczna <220>_Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter iorward’ do ampfifikacji techniką PGR mysiej <223>p_Otjjednostki p35 IL-2 <220>

PL 202 058 B1 <221> iCechv różne <222> (16)..(13) <223> ikodon inicjacji translacji <400> 14 aagcttgcta gcagcatgtg tcaatcacgc tac 33 <210> 15 <211>30 <212>DNA <213> Sekwencja sztuczna

Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter odwrotny do amplifikacji techniką PCR mysiej * podjednostki p35 z IL-12 <220>

<221 > iCechy różne <222> Komplementarny z ((10)..(12)) <223> ikodon stop translacji <400> 15 ctcgagcttt caggcggagc tcagatagcc 30 <2116 <211> 61 <212>DNA <213> .Sekwencja sztuczna ^<22Q> opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca w miejscu połączenia pomiędzy ^<223> p35 a p 40, które obejmuje mysią jednołańcuchową IL-12 <220>

<221 > Cechy różne <222> (3)..(10) <223> 'koduje resztę aminokwasową na końcu C mysiego p35 <220>

<221> iCechv różne <222> (59)..(61) <223> koduje resztę aminokwasową na końcu N dojrzałego mysiego p40 <40Q> 16 gagctccgcg tcgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccgccat 60 9 61 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> .Sekwencja sztuczna <220>

PL 202 058 B1 <223>opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja białka w miejscu połączenia pomiędzy p35 a p 40, które obejmuje mysią jednołańcuchową IL-12 <400> 17

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala l S 10 15 <210> 18 <211> 73 <212> DNA <213;Sekwencja sztuczna <220>

<223=Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca połączenie w białku fuzyjnym pomiędzy mysi p40 a końcem N łańcucha ciężkiego dojrzałego KS <220>

<221:Cechy różne <222> (14) .(16) <223>koduje resztę aminokwasową na końcu C mysiego p40 <220>

<22l5Cechy. różne <222> (71),.(73) <223ikoduje resztę aminokwasową na końcu N łańcucha ciężkiego dojrzałego KS <400> 18 ctgcagggcc cgatccccgg gatccggagg ttcagggggc ggaggtagcg gcggaggggg 60 ctccttaagc cag 73 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <2i3?sekwencja sztuczna <220>

<223;Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja białka w miejscu połączenia pomiędzy p4O a końcem N łańcucha ciężkiego dojrzałego KS <400> 19

Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Leu Ser- <210>20 <211> 64 <212> DNA <213sSekwencja sztuczna

PL 202 058 B1 <223> '°^{pis SRkwenc}i‘ otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca połączenie w białku fuzyjnym ^{< >} pomiędzy mysi p35 a łańcuchem lekkim KS <220>

<221 > Cechy różne <222> (0)..(10) <223> koduje resztę aminokwasową na końcu C mysiego p35 <22 o>

<221 > Cechy różne <222> (62)..(64) <223> koduje resztę aminokwasową na końcu N łańcucha lekkiego <400> 20 gagctccgcg Ccgagcgggg gcagcggggg cggaggcagc ggcgggggcg gatccttaag 60 cgag 64 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22D>

<223> °P^is sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja białka w miejscu połączenia pomiędzy p35 a łańcuchem lekkim KS <400> 21

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 15 10 15

Ser <210> 22 <211 >27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter forward' do amplifikacji PCR mysiej IL-4 <220>

<221 > Cechy różne <222>(g)..(11) <223> kodon inicjacji translacji <400> 22 tctagaceat gggtcteaac eeccagc 27 <210> 23 <211 >47 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 202 058 B1 <220>

<223>opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter odwrotny do amplifikacji PCR mysiej JL-4 <220>

<221>Cechy różne <222>Komplementarny z ((8)..(10)) <223>koduje resztę aminokwasową na końcu C mysiej IL-4 <400> 23 cggatcccga gtaatccatt tgcatgatgc tctttagget ttccagg 47 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <2l3>Sekwencja sztuczna

<220>

<221>Cectiy różne <222> (1)..(3) <223>koduje resztę seryny na końcu C mysiej IL-4 <220>

<221>Cechv różne <222> (55)..(57) <223>koduje resztę aminokwasową na końcu lekkiego łańcucha dojrzałego KS-1/4 <400> 24 tcgggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagcgag 57 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213>Sekwencja sztuczna

„..Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja białka w miejscu połączenia pomiędzy mysią ^{< 4>}IL-4 a lekkim łańcuchem dojrzałego KS-1/4 <400> 25

Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Leu Ser Glu <210>26 <211 >27 <212>DNA

PL 202 058 B1 <213?Sekwencja sztuczna <220?

<223;Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter ‘forward’ do amplifikacji PCR mysiej IL-4 <220?

<221;cechvróżne <222? (9)..(11) <223;kodon inicjacji translacji <400? 26 tctagaccat gggtcteaac ccccagc 27 <2f0? 27 <211? 52 <212? DNA <2l3>Sekwencja sztuczna <220?

<223>Opjs sekwencji otrzymanej sztucznie: starter odwrotny do amplifikacji PCR mysiej IL-4 <220?

<221 sCechy różne <222;Komplementarny z ((13)..( 15)) ^<223skoduje resztę aminokwasową na końcu C mysiej IL-4 <400? 27 cgatatcceg gacgagtaat ccatttgcat gatgctcttt aggctttcca gg 52 <210? 28 <211? 39 <212? DNA <2i3=Sekwencja sztuczna <220?

<223?Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca w miejscu połączenia pomiędzy mysią IL-4 a mysim GM-CSF <220;

<221;Cechv różne <222? (1)..(12) <223;koduje sekwencję aminokwasową na końcu C mulL4 <220?

<221 ;Cechv różne <222? (28).. (39) <223>koduje sekwencję aminokwasową na końcu N muGM-CSF <400? 2B atggattact cgtccgggat gggaaaagca cccgcccgc 39

PL 202 058 B1 <210>29 <211 >32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter ‘forward’ do amplifikacji PCR mysiej limfotaktyny <220>

<221 > Cechy różne <222> (13)..(15) <223> kodon inicjacji translacji <400> 29 tctagagcca ccatgagact tctcctcctg ac 32 <211 >26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: starter odwrotny do amplifikacji PCR mysiej limfotaktyny <220>

<221 > Cechy różne <222> Komplementarny z ((7)..(9)) <223> koduje resztę aminokwasową na końcu C mysiej limfotaktyny <400> 30.

ggatccccca gtcagggtta ctgctg 26 <210>31 <211> 57 <212>DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<5?3>. Opis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja kodująca w miejscu połączenia pomiędzy mysią iimfotaktyną a ciężkim łańcuchem dojrzałego KS-1/4 <220>

<221> Cechy różne <222> (1)..(3) <223> koduje resztę aminokwasową na końcu C mysiej limfotaktyny <220>

<221> Cechy różne <222> (55)..(57) <223> koduje resztę aminokwasową na końcu N ciężkiego łańcucha KS-IL2 <400> 31

PL 202 058 B1 cccggatccg gaggttcagg gggcggaggt agcggcggag ggggctcctt aagccag 57 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213;Sekwencja sztuczna <220>

<223K3pis sekwencji otrzymanej sztucznie: sekwencja białka na połączeniu pomiędzy mysią limfotaktyną a ciężkim łańcuchem KS-1L-2 <400> 32

Gly ser Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 15 10 15

Ser

Claims

1. Wielofunkcyjne biał ko fuzyjne cytokiny i przeciwciał a, zawierają ce region immunoglobulinowy oraz cytokinowe białko fuzyjne zawierające dwie różne cytokiny, gdzie pierwszą cytokiną jest IL-12 w postaci heterodimeru lub łańcucha pojedynczego, a drugą cytokiną, kowalencyjnie związaną z koń cem aminowym lub karboksylowym podjednostki p35 lub p40 IL-12, jest IL-2 albo GM-CSF, przy czym cytokinowe białko fuzyjne jest sprzężone z końcem aminowym lub karboksylowym regionu immunoglobulinowego.

2. Wielofunkcyjne biał ko fuzyjne wedł ug zastrz. 1, znamienne tym, ż e podjednostki p35 i p40 IL12 są sprzężone poprzez linker polipeptydowy.

3. Wielofunkcyjne białko fuzyjne wedł ug zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, ż e IL-12 i druga cytokina w cytokinowym białku fuzyjnym są sprzężone poprzez linker polipeptydowy.

4. Wielofunkcyjne białko fuzyjne wedł ug zastrz. 3, znamienne tym, ż e region immunoglobulinowy i cytokinowe białko fuzyjne są sprzężone poprzez linker polipeptydowy.

5. Wielofunkcyjne biał ko fuzyjne według zastrz 1 albo 2, albo 4, znamienne tym, ż e drugą cytokiną w cytokinowym białku fuzyjnym jest IL-2.

6. Wielofunkcyjne białko fuzyjne według zastrz. 1 albo 2, albo 4, znamienne tym, że region immunoglobulinowy obejmuje stały region ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego, zawierający domenę regionu zawiasowego, domenę CH2 i domenę CH3.

7. Wielofunkcyjne biał ko fuzyjne wedł ug zastrz. 6, znamienne tym, ż e region immunoglobulinowy jest regionem Fc.

8. Wielofunkcyjne biał ko fuzyjne wedł ug zastrz. 6, znamienne tym, ż e region immunoglobulinowy zawiera dodatkowo domenę CH1.

9. Wielofunkcyjne biał ko fuzyjne wedł ug zastrz. 8, znamienne tym, ż e region immunoglobulinowy zawiera dodatkowo domenę VH, która jest reaktywna immunologicznie względem antygenem specyficznym nowotworowo lub antygenem wirusowym.

10. Wielofunkcyjne białko fuzyjne według zastrz. 9, znamienne tym, że region immunoglobulinowy zawiera dodatkowo lekki łańcuch immunoglobulinowy związany z ciężkim łańcuchem immunoglobulinowym, tworząc nietknięte przeciwciało.