CN103570616B

CN103570616B - N′‑直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物及其制法和药物组合物与用途

Info

Publication number: CN103570616B
Application number: CN201210249757.5A
Authority: CN
Inventors: 冯志强; 陈晓光; 王克; 李燕; 秦爱芳; 唐克
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2032-07-18
Also published as: CN103570616A

Abstract

本发明涉及式I所示的N′‑直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物，其可药用盐，其水合物和溶剂化物，及其制备方法，含有一个或多个这化合物的组合物，和该类化合物在治疗与蛋白激酶有关的疾病如免疫失调和肿瘤疾病方面的用途。

Description

N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物及其制法和药物组合物与用途

发明领域

本发明涉及式I所示的N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物，其可药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体或衍生物，及其制备方法，含有一个或多个这化合物的组合物，和该类化合物在治疗与蛋白激酶有关的疾病如免疫失调和肿瘤疾病方面的用途。

发明背景

最近几年，由于对酶和其它一些与疾病相关的生物分子的认识的提高，极大地促进了治疗疾病的新药的发现或发展，蛋白激酶就是一种广泛研究的重要的一类，它是一个大家族，与细胞内各种信号转导过程的控制有关。由于它们的结构和催化功能的保守性它们被认为从一个共同的祖先基因进化而来。几乎所有激酶都含有一个相似的250-300个氨基酸催化域。这些蛋白激酶按照磷酸化底物的不同被分成多个家族，如蛋白酪氨酸激酶，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，类脂等。一般，蛋白激酶通过影响一个磷酰基从一个核苷三磷酸转移到一个与信号转导途径相关的蛋白受体来介导细胞内信号转导。这些磷酰化事件作为分子开关调节靶蛋白的生物功能，最终被激发对各种细胞外和其它刺激作出反应。激酶存在于多层信号转导路径中，受体酪氨酸激酶位于肿瘤血管生成信号转导路径的上游及肿瘤细胞信号转导路径的上游。丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶位于肿瘤及肿瘤血管生成细胞的信号转导路径的下游。研究表明通过在上游阻滞VEGFR及PDGF受体，在下游阻滞Raf／MEK／ERK，能够同时减少肿瘤的血管生成并抑制肿瘤细胞的复制，从而阻碍肿瘤的生长。

Raf激酶是由原癌基因raf编码的蛋白产物，由648个氨基酸组成，分子量为70000～74000D，其结构中含有3个保守区，分别为CR1(61～194D)、CR2(254～269D)、CR3(335～627D)。CR1位于其分子氨基端，富含半胱氨酸，含有锌指样结构，与蛋白激酶C的配体结合区结构相似，是活化的Ras与Raf-1蛋白激酶结合的主要部位。CR2亦靠近氨基端，富含丝氨酸和苏氨酸。CR3位于其分子的羧基端，是蛋白激酶的催化功能区。作为Ras／Raf／MEK／ERK通路中的一个关键激酶，Raf可通过依赖或不依赖Ras的方式发挥其信号传导调节作用。作为Raf激酶的下游底物，激活的MEK磷酸化ERK，调节各种细胞功能。一旦该通路发生过度激活，则引起细胞增殖加速与细胞生存期延长，从而导致肿瘤的生成。

研究表明，80%以上的癌基因和原癌基因存在于人的癌编码蛋白酪氨酸激酶（PTK）中，人类各种癌症的产生和发展是和来自于蛋白酪氨酸激酶的异常细胞信号传导有关的，恶性细胞的一个主要特点是酪氨酸激酶活性的增加。因此，抑制酪氨酸激酶的活化或阻断其信号传导路径成为控制肿瘤的新途径。

内皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体(RTK)，位于第7号染色体p13～q22区，全长200kb，由28个外显子组成，编码1 186个氨基酸，其糖蛋白分子量约170kDa，广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。EGFR家族有4个结构相似的受体分子：ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbtM(HER4)，同属于受体酪氨酸激酶(RTKS)。它们都含有1个胞外配体结合结构域，1个跨膜结构域和1个具有酪氨酸激酶活性的胞浆结构域。其胞内区域与erbB癌基因产物高度同源。EGFR的活化可以通过配体诱导的受体二聚化作用实现。ErbB受体家族中，除了HER2外，其他成员都有其相应配体，各种各样的配体是由对应的跨膜蛋白前体经过蛋白水解而来的，都有1个EGF样结构域。与EGFR特异性结合的配体包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、双向调节蛋白(AR)、β-细胞素(BTC)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(EPR)等。胞外配体EGF(内皮生长因子)与ErbB2特异性结合后引起ErbB2构型改变，导致受体二聚化从而活化它们的胞浆位点。ErbB2的胞内区域酪氨酸磷酸化后进而活化第二信使转导，通过MAPK(丝裂原蛋白激酶)途径诱导细胞外信号的活化(调节激酶Erkl和Er1)：通过PDK(磷脂酰肌醇激酶)途径活化信号转导子JAK；进一步启动STAT1、STATS3的转录活化子；另一方面，细胞内信号通过Grb2(生长因子受体结合蛋白)活化下游的ERK(细胞外调节蛋白激酶)，进而介导ATF，NF-kB，Ap-1，C-fos和C-Jun的转录活化。这些都是EGFR所介导的生长作用或致癌的基本下游途径。异常的EGFR活化机制包括受体本身的扩增、受体配体的过表达、活化突变以及负性调节途径的缺乏，因此EGFR诱导癌症至少通过3种机制：EGFR配体的过表达，EGFR的扩增或EGFR的突变活化。在这3种机制中，EGFR的突变活化是导致肿瘤细胞异常生物学行为的最主要因素。EGFR基因的某些突变会导致受体效果增强和持续时间的延长。Lynch等证明变异受体并不影响受体蛋白质的稳定性，通过Tyr1068磷酸化测定EGFR活化发现，野生型受体的活化15min即下调，而变异受体表现出比正常EGFR高2倍的效应，且超过3h的持续活化。

EGFR突变并没有影响肿瘤细胞与TKI(酪氨酸激酶抑制剂)结合的能力。TKI对那些因突变而导致EGFR活化的原因可以通过oncogeneaddiction模型来解释。通过Ras．Raf-MEK．ERK1/ERK2、PI3K．Akt、STAT3/STAT5通路，EGFR突变高度激活下游信号，启动EGFR调节抗凋亡和生存信号，导致癌症细胞变得依赖此信号以维持其生存--即具有癌基因(突变的EG依赖的特征；当使用特异性TKI阻断EGFR信号后，将消除其增殖性影响和输出生存信号，导致肿瘤细胞死亡。因此认为，癌症细胞中信号转导通路的变异是出现药物高敏感的基础。相反，正常细胞或非EGFR依赖的肿瘤细胞(对Gefitinib、Erlotinib无反应)不受影响。因为生存还受其他基因驱使，或者在EGFR抑制后能被其他的RTK所弥补。在癌基因依赖模型中，细胞癌症依赖的癌基因可以同时产生凋亡和生存2个信号的输出。一般隋况下，癌基因被激活。生存信号占主导地位，而凋亡信号处于相对低水平，使癌症细胞维持生长和增殖。当癌基因急性失活后，在关键的窗口期，首先是生存迅速大幅度减弱。而凋亡信号缓慢下降。因此导致信号不平衡(凋亡信号占主导)，启动细胞发生不可逆的凋亡。研究发现用酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(gefitinib)／厄洛替尼(Erlotinib)治疗NSCLC患者，大约10％患者表现出迅速而满意的临床效果，进一步研究发现这些患者绝大部分存在EGFR基因突变。在目前已知与EGFR—TKI(内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂)有关的基因突变局限于如下几种：G719X(18外显子)，E746-A450缺失(19外显子)，L858R(21外显子)，L861Q(21外显子)，T790M(20外显子)和D770-N771(20外显子)。其中E746A450缺失和L858R的突变与TKI的疗效高度相关。Mitsudomi T，Yatabe Y对568例非小细胞肺癌患者的分析结果：在所有非小细胞肺癌患者中大约90％的EGFR基因突变集中于19或21外显子中，其中19外显子的缺失突变及21外显子中的点突变的患者服用EGFR-TKI的有效率均达到70％以上。近来的研究提示，EGFR外显子20的插人性突变(D770-N771)可以使受体对EGFR—TKI的敏感性降低100倍，临床上也发现具有此突变的患者对EGFR—TKI治疗反应不明显。对外显子20的扩增产物进行亚克隆分析发现，T79OM突变是一个碱基对发生从胞嘧啶核苷(C)到胸腺嘧啶核苷(T)的改变，在蛋白水平就是EGFR酪氨酸激酶功能域790位点的苏氨酸被蛋氨酸取代(T790M)，这种突变可使EGFR重新处于被激活状态，从而导致TKI的获得性耐药，耐药的原因是突变导致EGFR结构发生变化，使TKI与其结合出现位阻效应。

有研究提示KRAS突变可能是Gefitinib、Erlotinib原发耐药的原因。Helenalinardou的Meta分析中总结了1008例NSCLC患者的TKI治疗效果，在发生K-ras突变的165名患者中，94％的患者对TKI治疗无明显反应。一般来讲，KRAS和EGFR突变NSCLC是相互排斥的．在不同的肿瘤亚型中存在明显差异：EGFR突变主要见于不吸烟者，而KRAS突变更常见于吸烟相关的癌症。因为KRAS突变总是发生于具有野生型EGFR的NSCLC中，所以难以区分对EGFR-TKI不敏感到底是因为KRAS突变，还是因为无EGFR突变。

血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)家族包含有3种亚型，即:VEGFR-1(同时也可以写作Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt一4)，此外，还有神经菌毛蛋白(neuropilin)1和2两个协同受体。其中VEGFR-1主要分布在血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞，可与VEGF-A、VEGF-B和P1GF结合，主要与造血干细胞的生长调节有关。VEGFR-2主要分布在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，可以与VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E结合。VEGF刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通过结合和激活VEGFR-2来实现．与VEGFR-2相比，VEGFR-1与VEGF的亲和力高10倍，但调节内皮细胞的活性低很多，可能是对VEGFR-2活性具有负向调节作用。VEGFR-3主要表达在***内皮细胞，能与VEGF-C和VEGF-D结合，调控淋巴内皮细胞的生长。

研究表明：当肿瘤直径大于2mm时，需要有新生血管来提供营养物质和***代谢废物。VEGF／VEGFR信号通路在肿瘤血管的生成中起关键性作用，可以通过阻断或干扰VEGF／VEGFR信号通路抑制血管的新生，以达到控制肿瘤的生长的疗效。与传统的细胞毒性药物相比，以VEGF／VEGFR-2为靶标的抗肿瘤药物有很大的优势．在正常生理条件下，血管新生只在创伤愈合和***等生理活动中起作用，所以使用抗血管生成药物***，对人体毒性作用小，血管内皮细胞与血液直接接触，使药物更加容易到达作用位点．通过目前对VEGF／VEGFR信号通路作用机制的了解，可以得到以下几种可能的抑制剂研究方向：a．利用单克隆抗体抑制VEGF或VEGFR，使其不能特异性结合，阻断信号传导。当然也可以利用基因技术抑制它们的表达，减弱其活性。b．设计特定的小分子抑制剂，结合到VEGFR胞外VEGF结合区域，竞争性拮抗VEGF，同理，也可以是结合到VEGF上VEGFR的特定结合域，竞争性拮抗VEGFR。c．抑制VEGFR的胞内激酶域，主要是ATP的结合位点，竞争性地拮抗ATP，使其无法提供磷酸基。d．抑制胞内的VEGFR下游信号的关键性蛋白．考虑到患者的依从性，能口服的小分子抑制剂可能具有良好的前景。

血小板衍生生长因子(platelet．derived growth factor，PDGF)是诱导和促进血管形成作用最强、最专一的血管生长因子之一。PDGF主要通过与PDGF受体(PDGFR)结合，进而激活蛋白激酶信号转导通路而发挥作用。PDGFR由α和β两种亚基构成，共有3种二聚体(PDGFR-αα、αβ、ββ)，其中ββ二聚体受体(PDGFR-β)最为重要，其分子量约为180～190ku，属于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase，RTK)家族。PDGFR在肿瘤形成和发展过程中也起着重要的作用。PDGFR-β的过度表达或过度活化均能刺激肿瘤内血管生成，促进肿瘤生长。PDGFR-β是肿瘤血管内皮细胞的分子标志之一，在肿瘤新生血管内皮细胞中高表达，并与某些肿瘤的生长、转移及预后密切相关。所以PDGFR-β是一个较为理想的肿瘤靶向治疗靶标。

Raf激酶及其介导的Raf／MEK／ERK通路在肿瘤进展及转移过程中具有显著作用，且与诸多生长因子包括表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)及血小板生长因子(PDGF)等密切相关。人们想了多种办法来调节这一条通路，其中包括抑制Ras蛋白的法尼基化、抑制Rat"-I激酶(也称C-RAF激酶)的表达、抑制Raf激酶和MEK激酶的活性。上述的方法不仅抑制了ERK的信号转导而且成功抑制了异种移植肿瘤的生长。此外，现有证据显示，大部分肿瘤并非由单一信号传导通路所支配，针对多靶点进行抑制可能取得更大疗效。

许多疾病是和蛋白激酶介导事件引发的不正常的细胞反应相关联的。这些疾病包括，但不限于，肿瘤，炎症疾病，免疫疾病，骨疾病，代谢疾病，神经疾病，心脑血管疾病，激素相关的疾病等。因此发现和寻找蛋白激酶抑制剂作为治疗药物是非常必要的。虽然许多发明对本领域作出了很大贡献，但为改进药物治疗效果，本领域仍在继续研究。

发明内容

本发明的目的在于提供通式I所示的N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物，其可药用盐，其溶剂化物，其前药，其多晶或共晶。

本发明的另一目的在于提供通式I所示的N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种含有通式I所示的N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物的药物组合物。

本发明的又一目的在于提供该类化合物在抗癌，及与蛋白激酶相关疾病的药物中的用途。

为了完成本发明之目的，可采用如下技术方案：

本发明是涉及具有通式I所示的下列结构N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物：

或其可药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体或衍生物。

本发明还公开了制备本发明化合物的方法，包括如下路线步骤：

制备权利要求1的所述化合物的方法，包括如下步骤：

路线1

步骤（a）中以酰肼1为原料，用常见的方法与酰氯或酸酐或酸反应很容易得到N′-直链烷酰基酰肼衍生物2。

步骤（b）中,与对羟基苯胺在碱性环境下通过对酰肼2中的氯取代醚化得到化合物3。

步骤（c）中可通过CDI与4-氯-3-三氟甲基苯胺缩合生成脲衍生物I;也可与4-氯-3-三氟甲基苯基异氰酸酯通过亲核加成反应得到脲衍生物I；也可与4-氯-3-三氟甲基苯氨甲酸4-硝基苯酯通过亲核取代反应得到脲衍生物I。

路线2

步骤（a）中，以酯4或酰氯5为原料，与N′-直链烷酰肼6反应得到双酰肼衍生物2。

步骤（b）中，4-氨基苯酚在碱性环境下通过对双酰肼衍生物2中的氯取代醚化得到化合物3。

路线3

步骤（a）中，酚化合物7在碱性环境下通过对双酰肼衍生物2中的氯取代醚化得到脲衍生物I。步骤（b）中，酯化合物8与N′-直链烷酰肼6反应同样得到脲衍生物I。

路线4

该路线以酰肼9为原料，用常见的方法将其与直链脂肪酸或酰氯或酸酐反应很容易得到脲衍生物I。

另外，上述反应中的起始原料及中间体容易得到，或对本领域熟练技术人员来说可以用有机合成中的常规方法很容易合成。

式I所述N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物可以溶剂化物或非溶剂化物的形式存在，利用不同的溶剂进行结晶可能得到不同的溶剂化物。式I所述药学上可接受的盐包括不同酸加成盐，如下列无机酸或有机酸的酸加成盐：盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸，甲磺酸，对甲苯磺酸，三氟乙酸，枸杞酸，马来酸，酒石酸，富马酸，柠檬酸，乳酸。在本发明范围内的所有这些盐都可采用常规方法制备。在所述的N′-直链烷酰基邻吡啶酰肼衍生物及其溶剂化物和其盐的制备过程中，不同结晶条件可能出现多晶或共晶。

本发明还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量%。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、***、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括o/w型、w/o型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药***。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、***胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.01-100mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明化合物是多靶点蛋白激酶抑制剂或其前体，这些蛋白激酶按照磷酸化底物的不同被分成多个家族，如蛋白酪氨酸激酶，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，类脂等。一般，蛋白激酶通过影响一个磷酰基从一个核苷三磷酸转移到一个与信号转导途径相关的蛋白受体来介导细胞内信号转导。这些磷酰化事件作为分子开关调节靶蛋白的生物功能，最终被激发对各种细胞外和其它刺激作出反应。激酶存在于多层信号转导路径中，受体酪氨酸激酶位于肿瘤血管生成信号转导路径的上游及肿瘤细胞信号转导路径的上游。丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶位于肿瘤及肿瘤血管生成细胞的信号转导路径的下游。研究表明通过在上游阻滞VEGFR及PDGF受体，在下游阻滞Raf／MEK／ERK，能够同时减少肿瘤的血管生成并抑制肿瘤细胞的复制，从而阻碍肿瘤的生长。本发明化合物具有较高的生物利用度，可用于多种人类恶性肿瘤的治疗，包括所述的肿瘤疾病是肝癌，肾癌，肺癌、胰腺癌、结直肠癌、膀胱癌及乳腺癌，卵巢癌，扁平细胞癌，神经胶质瘤，白血病，头颈部癌。

具体实施方式

以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。测定仪器：核磁共振光谱用Vaariaan Mercury300或400型核磁共振仪。质谱用ZAD-2F和VG300质谱仪。

实施例1.1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-(4-(2-(2-(正丁酰)肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)脲

N’-正丁酰基-4-氯吡啶-2-酰肼的合成

将丁酸0.6g(7.0mmol)溶于3mLDMF中，加入原料4-氯吡啶-2-酰肼2.1g(5.8mmol),HATU2.7g(7.0mmol),三乙胺1.8g(17.4mmol),室温搅拌，TLC监测原料反应完全，加入100mL水，有大量类白色固体析出，得产物1.39g。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):10.51(s,1H,-CONH-),9.98(s,1H,-CONH-),8.66(d,1H,Ar-H),8.03(d,1H,Ar-H),7.81(dd,1H,Hz,Ar-H),2.16(t,2H,-COCH₂-),1.56(m,2H,-CH₂-Me),0.92(t,3H,-CH₃).MS(FAB):(M⁺+1=242).

N’-正丁酰基-4-(对氨基苯氧基)吡啶-2-酰肼的合成

将对氨基苯酚295mg(2.7mmol)溶于DMF5mL中，氮气保护下加入叔丁醇钾416mg(3.4mmol),室温搅拌3h后，加入中间体N’-正丁酰基-4-氯吡啶-2-酰肼0.5g(2.1mmol),碳酸钾138mg(1.3mmol),外浴80°C,TLC监测中间体反应完全后，加入100mL水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，之后过滤，滤液浓缩，得黑色固体0.47g。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):8.66(d,1H,Ar-H),8.03(s,1H,Ar-NH),7.81(dd,1H,Ar-H),7.71(d,2H,Ar-H),6.90(d,2H,Ar-H),2.16(t,2H,-CO-CH₂-),1.57(m,2H,-CH₂-Me),0.92(t,3H,-CH₃).MS(FAB):(M⁺+1=315).

1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-(4-(2-(2-(正丁酰)肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)脲

将1.12g（6.9mmol）CDI溶于7mL干燥的二氯甲烷中，开始溶液为白色浑浊，将溶有1.2g（6.2mmol）4-氯-3-三氟甲基苯胺的10mL二氯甲烷溶液，滴入上述溶液中，溶液逐渐变澄清，室温搅拌8h后，加入溶有0.66g（2.1mmol）N’-正丁酰基-4-(对氨基苯氧基)吡啶-2-酰肼的二氯甲烷溶液5mL，加热回流10h后，停止反应，柱层析分出目标物0.26g。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):10.38(s,1H,-NHCO),9.94(s,1H,-NHCO-),9.27(s,1H,-NHCO-),9.05(s,1H,-NHCO-),8.55(d,1H,ArH),8.12(s,1H,ArH),7.68~7.63(m,2H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.37(d,1H,ArH),7.21~7.19(m,3H,ArH),2.13(t,2H,-CH₂),1.59~1.49(m,2H,-CH₂),0.90(q,3H,-CH₃).MS(FAB):(M⁺+1=536).

或将200mg（0.43mmol）化合物1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-(4-(2-(肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)脲溶于7mlTHF中，加入0.09mL（0.64mmol）TEA，滴加入2ml溶有0.05ml（0.52mmol）丁酰氯的THF溶液，回流4h后，有白色固体生成，停止反应，过滤，少量的四氢呋喃洗，水洗，烘干，同样得到1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-3-(4-(2-(2-(正丁酰)肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)脲，白色固体80mg。

实施例2.1-(4-(2-(2-乙酰肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)-3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲

利用乙酸代替正丁酸，参照实施例1的操作进行，得到目标化合物为白色固体175mg。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):10.38(s,1H,-NHCO-CH₃),9.99(s,1H,-NHCO-),9.21(s,1H,-NHCO-),9.00(s,1H,-NHCO-),8.53(d,1H,ArH),8.11(s,1H,ArH),7.67~7.62(m,2H,ArH),7.59(d,2H,ArH),7.36(d,1H,ArH),7.20~7.17(m,3H,ArH),1.88(s,3H,-CH₃).MS(FAB)（M⁺+1=508）

实施例3.1-(4-(2-(2-丙酰肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)-3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲

利用正丙酸代替正丁酸，参照实施例1的操作进行，得到目标化合物为白色固体135mg。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):10.37(s,1H,-NHCO-CH₂-),9.94(s,1H,-NHCO-),9.22(s,1H,-NHCO-),9.01(s,1H,-NHCO-),8.55(d,1H,ArH),8.12(s,1H,ArH),7.68~7.63(m,2H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.37(d,1H,ArH),7.20~7.18(m,3H,ArH),2.16(q,2H,-CH₂-),1.04(t,3H,-CH₃).MS(FAB)（M⁺+1=522）

实施例4.1-(4-(2-(2-戊酰肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)-3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲

利用正戊酸代替正丁酸，参照实施例1的操作进行，得到目标化合物为白色固体145mg。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):10.37(s,1H,-NHCO-CH₂-),9.94(s,1H,-NHCO-),9.34(s,1H,-NHCO-),9.10(s,1H,-NHCO-),8.54(d,1H,ArH),8.12(s,1H,ArH),7.68~7.63(m,2H,ArH),7.61(d,2H,ArH),7.37(d,1H,ArH),7.20~7.18(m,3H,ArH),2.16(t,2H,-CH₂-),1.51(m,2H,-CH₂-),1.32(m,2H,-CH₂-),0.89(t,3H,-CH₃).MS(FAB)（M⁺+1=550）

实施例5.1-(4-(2-(2-辛甲酰肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)-3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲

利用正辛酸代替正丁酸，参照实施例1的操作进行，得到目标化合物为白色固体115mg。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):10.37(s,1H,-NHCO-CH₂-),9.94(s,1H,-NHCO-),9.22(s,1H,-NHCO-),9.00(s,1H,-NHCO-),8.54(d,1H,ArH),8.12(s,1H,ArH),7.67~7.63(m,2H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.37(d,1H,ArH),7.20~7.18(m,3H,ArH),2.14(t,2H,-CH₂-),1.54~1.51(m,2H,-CH₂-),1.26(brs,8H,4×-CH₂-),0.86(t,3H,-CH₃).MS(FAB)（M⁺+1=592）

实施例6.1-(4-(2-(2-己甲酰肼羰基)吡啶-4-氧基)苯基)-3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲

利用正己酸代替正丁酸，参照实施例1的操作进行，得到目标化合物为白色固体155mg。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ(ppm):10.37(s,1H,-NHCO-CH₂-),9.94(s,1H,-NHCO-),9.24(s,1H,-NHCO-),9.02(s,1H,-NHCO-),8.54(d,1H,ArH),8.12(s,1H,ArH),7.67~7.63(m,2H,ArH),7.60(d,2H,ArH),7.37(d,1H,ArH),7.20~7.18(m,3H,ArH),2.15(t,2H,-CH₂-),1.54~1.51(m,2H,-CH₂-),1.26(brs,4H,2×-CH₂-),0.86(t,3H,-CH₃).MS(FAB)（M⁺+1=564）

药理活性

体外活性评价：

MTT法测定肿瘤细胞存活率

将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为0.8~2×10⁴细胞/ml的细胞液，按1000个/孔接种于96孔板，每孔加100μl。次日加入含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μl（DMSO终浓度<0.5%），每药设5～7个剂量组，每组至少设三个平行孔，于37℃继续培养120hr后，弃上清，每孔加100μl新鲜配制的含0.5mg/ml MTT的无血清培养基，继续培养4hr，弃培养上清，每孔加200μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，用MK3型酶标仪在参考波长450nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC₅₀：

MTT筛选结果

体内活性评价：

对Renca荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

实验动物进入SPF级环境中饲养观察24小时后，无异常方可进入实验。将预先在Balb/c种小鼠腹腔复苏的Renca瘤液，以无菌的生理盐水按1：3比例稀释。将稀释液接种于实验小鼠左前肢皮下，每只注射稀释后瘤液0.2mL。所有动物注射完毕后，按实验要求随机分组，每组8只。

于接种24小时后开始给药，每日一次，灌胃，共给药12次，于末次给药后脱臼处死动物，剥取肿瘤组织，并称重。

对小鼠移植瘤Renca的生长抑制作用

*P<005;**P<001;***P<0001,与阴性对照组比较。

Claims

1.式I所示的化合物及其可药用盐，

式中:n选自2,4,6,8,10,12,14,16。

2.依据权利要求1的化合物，其特征在于，所述的可药用盐选自：盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐，乙酸盐，三氟乙酸盐，水杨酸盐，氨基酸盐，枸杞酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，富马酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐。

3.制备权利要求1的所述式I化合物的方法，包括如下步骤：

1)路线1

2)路线2

3)路线3

4)路线4

4.根据权利要求3路线1的制备方法，其特征在于，步骤(a)中以酰肼1为原料，与酰氯或酸酐或酸反应得到N′-直链烷酰基酰肼衍生物2；步骤(b)中,与对羟基苯胺在碱性环境下通过对酰肼2中的氯取代醚化得到化合物3；步骤(c)中通过CDI与4-氯-3-三氟甲基苯胺缩合生成式I所示化合物；或与4-氯-3-三氟甲基苯基异氰酸酯通过亲核加成反应得到式I所示化合物；或与4-氯-3-三氟甲基苯氨甲酸4-硝基苯酯通过亲核取代反应得到式I所示化合物。

5.根据权利要求3路线2的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，以酯4或酰氯5为原料，与N′-直链烷酰肼6反应得到双酰肼衍生物2；步骤(b)中，4-氨基苯酚在碱性环境下通过对双酰肼衍生物2中的氯取代醚化得到化合物3；步骤(c)中通过CDI与4-氯-3-三氟甲基苯胺缩合生成式I所示化合物；或与4-氯-3-三氟甲基苯基异氰酸酯通过亲核加成反应得到式I所示化合物；或与4-氯-3-三氟甲基苯氨甲酸4-硝基苯酯通过亲核取代反应得到式I所示化合物。

6.根据权利要求3路线3的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，酚化合物7在碱性环境下通过对双酰肼衍生物2中的氯取代醚化得到式I所示化合物；步骤(b)中，酯化合物8与N′-直链烷酰肼6反应同样得到式I所示化合物。

7.根据权利要求3路线4的制备方法，其特征在于，以酰肼9为原料，将其与直链脂肪酸或酰氯或酸酐反应得到式I所示化合物。

8.一种药物的组合物，其特征在于，含有权利要求1的化合物和制剂学可接受的载体。

9.权利要求1的化合物在制备预防和治疗与蛋白激酶有关的疾病的药物中的应用。

10.权利要求1的化合物在制备预防和治疗与酪氨酸激酶有关的疾病的药物中的应用。

11.权利要求1的化合物在制备预防和治疗与Raf激酶有关的疾病的药物中的应用。

12.根据权利要求11的应用，其特征在于，所述的与Raf激酶有关的疾病是肿瘤、免疫失调、神经疾病。

13.根据权利要求12的应用，其特征在于，所述的肿瘤疾病是肝癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌及乳腺癌、卵巢癌、扁平细胞癌、神经胶质瘤、头颈部癌。