CN101246125A - 基于纳米/微米粒子放大信号的非pcr扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法。该方法首先选择合适的两种限制性内切酶作用于样品基因组DNA，得到包含转基因特征序列的目的DNA片段；然后将其与生物素标记探针杂交，以起到筛选目的DNA片段的作用；与高效电化学发光探针杂交，实现高灵敏度电化学发光检测；最后，根据标准曲线，对样品中的转基因成分进行定量分析。本发明方法通过引入基于纳米/微米粒子放大信号原理制备的高效电化学发光探针来实现对原始样品的直接检测，该法具有灵敏、快速、简便、安全、结果准确等优点，更适合在实际检测中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种非PCR扩增的转基因产品(GMO)检测方法，特别涉及一种基于纳米/微米粒子放大信号的快速检测GMO的电化学发光(ECL)方法。
背景技术
综合目前世界各国的GMO检测技术，根据检测物不同，主要分为蛋白质检测、RNA检测和DNA检测三种类型。对于蛋白质的检测主要是采用血清学方法，由于有些GMO不表达蛋白质或表达量不稳定，还有的基因表达具有组织特异性，因此血清学检测方法仅限于个别GMO的检测；此外，由于蛋白质容易热变性，所以很难检测用转基因原料加工而成的食品，具有一定的局限性。RNA检测则由于受到RNA容易降解和对实验技术条件要求较高的限制而较难普及。而DNA是相当稳定的分子，适合多数种类样品(原材料、食品配方组成成分、加工产品)的检测，因此，DNA检测法是目前最主要的GMO检测法，它通过检测样品中是否含有外源基因成分——一般包括启动子、报告基因、目的基因和终止子(其中启动子和终止子为表达目的基因所必需)，来判断样品中是否含有转基因成分。目前，转基因植物所采用的启动子主要为来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、根瘤农杆菌的NOS启动子及玄参花叶病毒的FMV35S启动子；广泛应用的终止子分别来源于根瘤农杆菌的NOS终止子、花椰菜花叶病毒的CaMV终止子以及新霉素磷酸转移酶NptII终止子。针对上述基因的检测可涵盖95％的现有的转基因植物检测的需要。
在DNA检测法中，基于PCR扩增的检测方法是目前最主要的GMO检测手段。尽管PCR方法是高灵敏度的DNA水平检测，但常伴有各种假性结果出现：一方面，DNA提取时产生的各种反应抑制因子，可能使PCR呈假阴性；另一方面，PCR过程中容易引入非特异性扩增，从而使PCR呈假阳性。此外，PCR操作复杂、检测时间长、成本高，还容易造成定量不准确等一系列问题。因此，发展一种非PCR扩增的快速GMO检测方法是很多科学家追求的目标。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测GMO的ECL方法，它包括对绝大多数GMO基因组DNA中含有的包括转基因特征序列(如CaMV 35S启动子、NOS终止子、FMV35S启动子、NOS终止子、CaMV终止子以及NptII终止子等)的目的DNA片段进行酶切；与生物素标记探针杂交以筛选目的DNA片段；高效ECL探针的制备及其与目的DNA片段进行杂交；进行ECL检测并根据光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有转基因成分；以及根据标准曲线对转基因样品中的转基因成分进行定量分析等内容。
本发明的目的通过下述技术方案实现：基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，具体包括如下步骤：
一)提取待测样品的基因组DNA。
二)用基因分析软件(如Primer 5.0)对转基因样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，酶切产物中含有包含转基因特征序列的目的DNA片段。
三)将步骤二)中得到的酶切产物与DNA Markers(DNA分子量标准)同时进行琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段长度附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收该长度的DNA片段。
四)用基因分析软件(如Primer 5.0)根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列(该特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组DNA中其它任何序列互补)：其中，一段为生物素标记探针序列，制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列，其一端修饰上可与纳米/微米粒子连接的活性基团，制备成高效ECL探针。
五)将步骤四)制备的生物素标记探针和高效ECL探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度90～95℃、2～10分钟，然后降温至45～70℃、20～120分钟；得到杂交产物。
六)将步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在PBS缓冲液(pH7～8)或TE(pH 7～8)缓冲液中进行连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中。
七)向检测样品池中加入含有能够与三联吡啶钌(Ru(bpy)3 2+，TBR)产生ECL反应的物质的ECL分析液，给定电压1～1.5V，TBR与该物质发生ECL反应，产生光信号；检测光信号，并根据光信号值是否高于阈值(3个以上的阴性对照样品的平均光信号值加上2.5至10倍的标准偏差)，判断待测样品中是否含有转基因成分：如果光信号值高于阈值则表明该样品为转基因样品，即该样品中含有转基因成分。
本发明方法不仅可以对含有转基因成分的待测样品进行上述定性分析，还可以在定性分析的基础上进一步进行定量分析：通过对不同转基因成分质量含量的标准样品进行ECL检测，制定出标准曲线；随后，根据标准曲线对步骤七)中确定的转基因样品中的转基因成分进行定量分析。
所述步骤二)中包含转基因特征序列的目的DNA片段可以是包含CaMV35S启动子、NOS终止子、FMV35S启动子、NOS终止子、CaMV终止子或NptII终止子等特征序列的目的DNA片段。
所述步骤四)中高效ECL探针是按下述方法制备：
(1)设计一段与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，在其一端修饰上可与纳米/微米粒子连接的活性基团，另一端修饰上氨基基团；将该寡核苷酸链与过量的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯(TBR-NHS ester)在碱性条件下10～60C避光孵育2小时以上，以使氨基基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到标记上TBR的寡核苷酸链(TBR-寡核苷酸链)；随后，用70％～100％(体积百分比)乙醇洗涤并沉淀该寡核苷酸链；最后，用纯水或TE(pH7～8)缓冲液溶解TBR-寡核苷酸链；
(2)TBR-寡核苷酸链和捕获探针以大于40∶1的摩尔比混匀；随后，利用TBR-寡核苷酸链和捕获探针上修饰的可与纳米/微米粒子连接的活性基团与纳米/微米粒子反应，将TBR-寡核苷酸链和捕获探针修饰到纳米/微米粒子表面，制备得到高效ECL探针(由于连接在纳米/微米粒子表面的TBR-寡核苷酸链的数目远大于捕获探针，因此一个被捕获探针捕获的目的DNA片段可以转化成多个光信号)。
当包含转基因特征序列的目的DNA片段是包含CaMV35S启动子序列的目的DNA片段时，所述两种限制性内切酶可以为Fok I+BsrD I；所述生物素标记探针序列：5’-TGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTT-3’，将其3’端标记生物素后即制备成生物素标记探针；所述捕获探针序列：5’-GCCTTTCCTTTATCGCAATGGCAATC-3’，其3’端修饰有可与纳米金粒子连接的巯基基团，其中，带下划线碱基GCAATC为用于连接巯基的部分，将其制备成高效ECL探针。
当包含转基因特征序列的目的DNA片段是包含CaMV35S启动子序列的目的DNA片段时，步骤(1)中与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，其序列为：5’-CCAACGGTAA-3’，在其3’端修饰上可与纳米金粒子连接的巯基基团，5’端修饰上可与TBR-NHS ester反应的氨基基团。
所述步骤四)中纳米/微米粒子可以分别为不同粒径的纳米金、硅珠或聚苯乙烯珠等等。
所述步骤四)中纳米/微米粒子连接的活性基团可以分别为巯基基团(可以与纳米金粒子连接)、氨基基团、羧基基团、生物素或链霉亲和素等等。
所述步骤七)中能够与三联吡啶钌产生ECL反应的物质可以为三丙胺(tripropylamine，TPA)或二丁基乙醇胺(2-(dibutylamino)ethanol，DBAE)等等。
所述步骤七)中含有能够与三联吡啶钌产生ECL反应的三丙胺的ECL分析液配方如下：112mM KH2PO4，88mM K2HPO4·3H2O，50μM NaCl，6.5mMNaN3，0.8μM Tirton X-100，0.4mM Tween 20，100mM TPA。
本发明的基本原理为(如图1所示)：
绝大多数GMO中都含有转基因特征序列(如大多数转基因植物中都含有CaMV35S启动子、NOS终止子、FMV35S启动子、NOS终止子、CaMV终止子以及NptII终止子等)，可以针对该转基因特征序列设计出两段特异性DNA序列，并将其制备成生物素标记探针和高效ECL探针。提取的GMO基因组DNA经过两种适当的限制性内切酶酶切后，可产生包含转基因特征序列的目的DNA片段(如大多数转基因植物基因组DNA经过Fok I和BsrD I酶切可产生包含部分CaMV35S启动子序列的目的DNA片断)。加入生物素标记探针和高效ECL探针与纯化、回收的包含目的DNA片断的酶切产物杂交，生物素随后与包被有链霉亲和素的磁珠连接，进一步被磁极选择性吸附，从而起到筛选目的DNA片断的作用；高效ECL探针可以与TPA反应，从而实现ECL检测；只有同时杂交上生物素标记探针和高效ECL探针的目的DNA片断才能被收集到检测样品池中并被检测到光信号。根据光信号值是否高于阈值来判断样品中是否含有转基因成分。随后，还可以根据标准曲线对转基因样品中的转基因成分进行定量分析。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明摆脱了目前GMO检测中对PCR的依赖，从而避免了PCR技术中存在的假性结果、定量不准确、操作复杂、耗时费钱及对PCR产物进行电泳分析时需要用到放射性元素或溴化乙锭等有害物质等一系列问题。本发明具有操作简便、快速、安全、结果准确、灵敏度高、可定量分析等优点，更适合在实际检测中推广应用。
附图说明
图1是本发明方法原理示意图；
图2是实施例一中用本发明方法检测非转基因大豆和转基因大豆中的CaMV35S启动子结果图；
图3是实施例一中用本发明方法检测不同百分含量的转基因大豆中CaMV35S启动子的标准曲线；
图4是实施例二中用本发明方法检测非转基因烟草和转基因烟草中的CaMV35S启动子结果图；
图5是实施例三中用本发明方法检测非转基因番木瓜和转基因番木瓜中的CaMV35S启动子结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。
将上述方法应用于检测转基因大豆(实施例一)、转基因烟草(实施例二)、转基因番木瓜(实施例三)：上述转基因样品中都含有CaMV35S启动子，因此，以CaMV35S启动子特征序列作为检测的目的DNA片段。
实施例一：将本发明方法用于检测转基因大豆，具体步骤如下：
一)分别提取非转基因大豆样品和转基因大豆样品的基因组DNA。
二)用基因分析软件Primer 5.0对转基因大豆样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列——CaMV35S启动子部分序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶——Fok I和BsrD I，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切(酶切反应条件和酶的用量参考试剂说明书)，得到酶切产物，酶切产物中含有包含部分CaMV35S启动子序列的目的DNA片段，该目的DNA片段长度为169bp(即酶切产物中包含169bp的目的DNA片段)。
三)将所有酶切产物和DNAMarkers同时进行琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段长度(169bp)附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收169bp的DNA片段。
四)用基因分析软件Primer 5.0根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列(该特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组DNA中其它任何序列互补)：一段为生物素标记探针序列：5’-TGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTT-3’，将其3’端标记生物素后即制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列：5’-GCCTTTCCTTTATCGCAATGGCAATC-3’，其3’端修饰有可与纳米金粒子连接的巯基基团(带下划线碱基为用于连接巯基的部分)，用于制备高效ECL探针。其中，高效ECL探针制备包括以下步骤：
(1)参考文献“Biophysical Journal 68：342-350(1995)”合成TBR-NHSester；
(2)设计一段与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，其序列为：5’-CCAACGGTAA-3’，在其3’端修饰上可与纳米金粒子连接的巯基基团，5’端修饰上可与TBR-NHS ester反应的氨基基团；将该寡核苷酸链与TBR-NHSester以1∶40的摩尔比置于NaHCO3溶液(0.1M，pH 9)中，37℃，避光孵育8小时，以让氨基基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR-寡核苷酸链；随后，用70％乙醇洗涤、100％乙醇沉淀该寡核苷酸链；最后，用纯水溶解TBR-寡核苷酸链；
(3)TBR-寡核苷酸链和捕获探针以70∶1的摩尔比混匀；随后，利用TBR-寡核苷酸链和捕获探针上的巯基基团与纳米金粒子反应(具体步骤参考文献“Nature Protocols 1(1)：246-252(2006)”)，将TBR-寡核苷酸链和捕获探针修饰到纳米金粒子表面，制备出高效ECL探针(由于连接在纳米金粒子表面的TBR-寡核苷酸链的数目远大于捕获探针，因此一个被捕获探针捕获的目的DNA片段可以转化成多个光信号)。
五)将生物素标记探针和高效ECL探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度95℃，5分钟，然后降温至55℃，30分钟；得到杂交产物。
六)将根据步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在PBS缓冲液(pH 7.4)中进行孵育连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中。
七)向检测样品池中加入含有TPA的ECL分析液(112mM KH2PO4，88mM K2HPO4·3H2O，50μM NaCl，6.5mM NaN3，0.8μM Tirton X-100，0.4mMTween 20，100mM TPA)，给定电压1.25V，使TBR与TPA发生ECL反应，产生光信号。检测光信号，并根据光信号值是否高于阈值(3个以上的阴性对照样品(即非转基因大豆标准样品)的平均光信号值加上3倍的标准偏差)判断大豆样品中是否含有转基因成分：如果光信号值高于阈值则表明该样品为转基因样品，即该样品中含有转基因成分。
八)通过对不同转基因成分质量百分比含量(0.1％～100％)的大豆样品进行ECL检测，制定出标准曲线(见图2)；根据标准曲线对步骤七)中确定的转基因样品中的转基因成分进行定量分析。
图2是用本发明方法检测非转基因大豆和转基因大豆中的CaMV35S启动子结果图。如图所示：转基因大豆的光信号值高于阈值，非转基因大豆的光信号值低于阈值，结果可以明显区分转基因大豆和非转基因大豆。
图3是用本发明方法检测不同质量百分比含量(0.1％～100％)的转基因大豆中CaMV35S启动子的标准曲线。如图所示，本发明方法可以检测出大豆样品中含量为0.1％的转基因成分，该检测限低于欧盟和日本对产品中转基因成分含量的限制(1％和5％)，因此，该法具有较高的灵敏度，适合在实际检测中推广应用。此外，该法在转基因成分含量为0.1％～100％之间有很好的线性度，可以根据该标准曲线对大豆样品中的转基因成分进行定量分析。
实施例二：将本发明方法用于检测转基因烟草。
一)分别提取非转基因烟草样品和转基因烟草样品的基因组DNA。
二)用基因分析软件Primer 5.0对转基因烟草样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列——CaMV35S启动子部分序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶——Fok I和BsrD I，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切(酶切反应条件和酶的用量参考试剂说明书)，得到酶切产物，酶切产物中含有包含部分CaMV35S启动子序列的目的DNA片段，该目的DNA片段长度为169bp(即酶切产物中含有169bp的目的DNA片段)。
三)将所有酶切产物和DNA Markers同时进行琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段长度(169bp)附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收169bp的DNA片段。
四)用基因分析软件如Primer 5.0根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列(该特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组中其它任何序列互补)：一段为生物素标记探针序列：5’-TGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTT-3’，将其3’端标记生物素后即制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列：5’-GCCTTTCCTTTATCGCAATGGCAATC-3’，其3’端修饰有可与纳米金粒子连接的巯基基团(带下划线碱基为用于连接巯基的部分)，用于制备高效ECL探针。其中，高效ECL探针制备包括以下步骤：
(1)参考文献“Biophysical Journal 68：342-350(1995)”合成TBR-NHSester；
(2)设计一段与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，其序列为：5’-CCAACGGTAA-3’，在其3’端修饰上可与纳米金粒子连接的巯基基团，5’端修饰上可与TBR-NHS ester反应的氨基基团；将该寡核苷酸链与TBR-NHSester以1∶10的摩尔比置于NaHCO3溶液(0.1M，pH 9)中，37℃，避光孵育4小时，以让氨基基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR-寡核苷酸链；随后，用80％乙醇洗涤、95％乙醇沉淀该寡核苷酸链；最后，用纯水溶解TBR-寡核苷酸链；
(3)TBR-寡核苷酸链和捕获探针以100∶1的摩尔比混匀；随后，利用TBR-寡核苷酸链和捕获探针上的巯基基团与纳米金粒子反应(具体步骤参考文献“Nature Protocols 1(1)：246-252(2006)”)，将TBR-寡核苷酸链和捕获探针修饰到纳米金粒子表面，制备出高效ECL探针(由于连接在纳米金粒子表面的TBR-寡核苷酸链的数目远大于捕获探针，因此一个被捕获探针捕获的目的DNA片段可以转化成多个光信号)。
五)将生物素标记探针和高效ECL探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度90℃、10分钟，然后降温至45℃、120分钟；得到杂交产物。
六)将根据步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在TE(pH7～8)缓冲液中进行孵育连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中。
七)向检测样品池中加入含有TPA的ECL分析液(112mM KH2PO4，88mM K2HPO4·3H2O，50μM NaCl，6.5mM NaN3，0.8μM Tirton X-100，0.4mMTween 20，100mM TPA)，给定电压1.25V，使TBR与TPA发生ECL反应，产生光信号。检测光信号，并根据光信号值是否高于阈值(3个以上的阴性对照样品(即非转基因烟草标准样品)的平均光信号值加上3倍的标准偏差)判断烟草样品中是否含有转基因成分：如果光信号值高于阈值则表明该样品为转基因样品，即该样品中含有转基因成分。
图4是用本发明方法检测非转基因烟草和转基因烟草中的CaMV35S启动子结果图。如图所示：转基因烟草的光信号值高于阈值，非转基因烟草的光信号值低于阈值，结果可以明显区分转基因烟草和非转基因烟草。
实施例三：将本发明方法用于检测转基因番木瓜。
一)分别提取非转基因番木瓜样品和转基因番木瓜样品的基因组DNA。
二)用基因分析软件Primer 5.0对转基因番木瓜样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列——CaMV35S启动子部分序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶——Fok I和BsrD I，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切(酶切反应条件和酶的用量参考试剂说明书)，得到酶切产物，酶切产物中包含部分CaMV35S启动子序列的目的DNA片段，该目的DNA片段长度为169bp(即酶切产物中包含169bp的目的DNA片段)。
三)将包含所有酶切后的所有酶切产物和DNA Markers同时进行琼脂糖凝胶电泳。将目的DNA片段长度(169bp)附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收169bp的DNA片段。
四)用基因分析软件如Primer 5.0根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列(该特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组中其它任何序列互补)：一段为生物素标记探针序列：5’-TGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTT-3’，将其3’端标记生物素后即制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列：5’-GCCTTTCCTTTATCGCAATGGCAATC-3’，其3’端修饰有可与纳米金粒子连接的巯基基团(带下划线碱基为用于连接巯基的部分)，用于制备高效ECL探针。其中，高效ECL探针制备包括以下步骤：
(1)设计一段与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，其序列为：5’-CCAACGGTAA-3’，在其3’端修饰上可与纳米金粒子连接的巯基基团，5’端修饰上可与TBR-NHS ester反应的氨基基团；将该寡核苷酸链与TBR-NHSester以1∶30的摩尔比置于NaHCO3溶液(0.1M，pH 9)中，37℃，避光孵育8小时，以让氨基基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR-寡核苷酸链；随后，用70％乙醇洗涤、100％乙醇沉淀该寡核苷酸链；最后，用纯水溶解TBR-寡核苷酸链；
(2)TBR-寡核苷酸链和捕获探针以120∶1的摩尔比混匀；随后，利用TBR-寡核苷酸链和捕获探针上的巯基基团与纳米金粒子反应，将TBR-寡核苷酸链和捕获探针修饰到纳米金粒子表面，从而制备出高效ECL探针(由于连接在纳米金粒子表面的TBR-寡核苷酸链的数目远大于捕获探针，因此一个被捕获探针捕获的目的DNA片段可以转化成多个光信号)。
五)将生物素标记探针和高效ECL探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度95℃、2分钟，然后降温至60℃、20分钟；得到杂交产物。
六)将根据步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在PBS缓冲液(pH 7～8)中进行孵育连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中。
七)向检测样品池中加入含有TPA的ECL分析液(112mM KH2PO4，88mM K2HPO4·3H2O，50μM NaCl，6.5mM NaN3，0.8μM Tirton X-100，0.4mMTween 20，100mM TPA)，给定电压1.25V，使TBR与TPA发生ECL反应，产生光信号。检测光信号，并根据光信号值是否高于阈值(3个以上的阴性对照样品(即非转基因番木瓜标准样品)的平均光信号值加上3倍的标准偏差)判断番木瓜样品中是否含有转基因成分：如果光信号值高于阈值则表明该样品为转基因样品，即该样品中含有转基因成分。
图5是用本发明方法检测非转基因番木瓜和转基因番木瓜中的CaMV35S启动子结果图。如图所示：转基因番木瓜的光信号值高于阈值，非转基因番木瓜的光信号值低于阈值，结果可以明显区分转基因番木瓜和非转基因番木瓜。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
Claims (10)
1、一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于包括如下步骤：
一)提取待测样品的基因组DNA；
二)用基因分析软件对转基因样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，酶切产物中含有包含转基因特征序列的目的DNA片段；
三)将步骤二)中得到的酶切产物与DNA Markers同时进行琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段长度附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收该长度的DNA片段；
四)用基因分析软件根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列，所述特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组中其它任何序列互补：其中，一段为生物素标记探针序列，制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列，其一端修饰上与纳米/微米粒子连接的活性基团，制备成高效电化学发光探针；
五)将步骤四)制备的生物素标记探针和高效电化学发光探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度90～95℃、2～10分钟，然后降温至45～70℃、20～120分钟；得到杂交产物；
六)将步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在pH 7～8的PBS缓冲液或pH 7～8的TE缓冲液中进行孵育连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中；
七)向检测样品池中加入含有能够与三联吡啶钌即TBR产生电化学发光反应的物质的电化学发光分析液，给定电压1～1.5V，TBR与该物质发生电化学发光反应，产生光信号；检测光信号，并根据光信号值是否高于阈值，判断待测样品中是否含有转基因成分：如果光信号值高于阈值则表明该样品为转基因样品，即该样品中含有转基因成分。
2、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：在判断含有转基因成分的待测样品中进行如下定量分析：通过对不同转基因成分质量含量的标准样品进行电化学发光检测，制定出标准曲线；随后，即可根据标准曲线对步骤七)中确定的转基因样品中的转基因成分进行定量分析。
3、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤二)中包含转基因特征序列的目的DNA片段是包含CaMV35S启动子、NOS终止子、FMV35S启动子、NOS终止子、CaMV终止子或NptII终止子特征序列的目的DNA片段。
4、根据权利要求1或2或3所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤四)中高效电化学发光探针是按下述方法制备：
(1)设计一段与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，在其一端修饰上可与纳米/微米粒子连接的活性基团，另一端修饰上氨基基团；将该寡核苷酸链与过量的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯即TBR-NHS ester在碱性条件下10～60℃避光孵育2小时以上，使氨基基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR-寡核苷酸链；随后，用70％～100％乙醇洗涤并沉淀该寡核苷酸链；最后，用纯水或pH 7～8的TE缓冲液溶解TBR-寡核苷酸链；
(2)TBR-寡核苷酸链和捕获探针以大于40∶1的摩尔比混匀；随后，利用TBR-寡核苷酸链和捕获探针上的可与纳米/微米粒子连接的活性基团与纳米/微米粒子反应，将TBR-寡核苷酸链和捕获探针修饰到纳米/微米粒子表面，制备得到高效电化学发光探针。
5、根据权利要求3所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：当包含转基因特征序列的目的DNA片段是包含CaMV35S启动子序列的目的DNA片段时，所述的两种限制性内切酶为Fok I+BsrD I；
所述生物素标记探针序列：5’-TGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTT-3’，将其3’端标记生物素后即制备成生物素标记探针；
所述捕获探针序列：5’GCCTTTCCTTTATCGCAATGGCAATC-3’，其3’端修饰有与纳米金粒子连接的巯基基团，其中，带下划线碱基GCAATC为用于连接巯基的部分，将其制备成高效电化学发光探针。
6、根据权利要求4所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：当包含转基因特征序列的目的DNA片段是包含CaMV35S启动子序列的目的DNA片段时，步骤(1)中与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，其序列为：5’-CCAACGGTAA-3’，在其3’端修饰上与纳米金粒子连接的巯基基团，5’端修饰上与TBR-NHS ester反应的氨基基团。
7、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤四)中纳米/微米粒子为纳米金、硅珠或聚苯乙烯珠。
8、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤四)中纳米/微米粒子连接的活性基团为巯基基团、氨基基团、羧基基团、生物素或链霉亲和素。
9、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤七)中能够与三联吡啶钌产生电化学发光反应的物质为三丙胺或二丁基乙醇胺。
10、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤七)中含有能够与三联吡啶钌产生电化学发光反应的物质为三丙胺时，三丙胺的电化学发光分析液配方如下：112mM KH2PO4，88mM K2HPO4·3H2O，50μM NaCl，6.5mMNaN3，0.8μM Tirton X-100，0.4mM Tween 20，100mM三丙胺。
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