CN106701984A - 一种基于分支dna放大信号的电化学发光核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于分支dna放大信号的电化学发光核酸检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN106701984A CN201710067407.XA CN201710067407A CN106701984A CN 106701984 A CN106701984 A CN 106701984A CN 201710067407 A CN201710067407 A CN 201710067407A CN 106701984 A CN106701984 A CN 106701984A
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Abstract

本发明提出了一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，通过不对称PCR扩增目标基因获取单链目标DNA，采用分支DNA放大信号原理设计针对目标DNA特异性序列的电化学发光核酸检测探针组，单链目标DNA与电化学发光核酸检测探针组杂交，对杂交产物进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，最终实现目标基因的检测。本发明还提供一种采用上述方法进行核酸检测的试剂盒，具有反应灵敏，检测速度快，结果准确的优点。

Description

一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学及核酸检测技术领域，特别是指一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，本发明还涉及基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测试剂盒。
背景技术
近年来，核酸检测(nucleic acid testing，NAT)在感染性疾病的预防和控制、恶性肿瘤的早期诊断及精准治疗、遗传性疾病的早期筛查、动植物病毒的预防与控制、转基因检测等方面发挥着重要作用。
当前，核酸检测的主要方法有基因芯片、原位杂交以及PCR等。基于核酸杂交的基因生物传感器是近年来发展最迅速的核酸检测方法之一。其中电化学发光基因传感器将电化学发光方法的快速灵敏和核酸分子杂交的高度序列特异性结合起来，可实现核酸的快速、灵敏、准确检测。
新近发展起来的分支DNA(branched DNA,bDNA)信号放大技术是一项以微孔形式进行特异性核苷酸检测的扩增技术。它原理是：利用碱性磷酸酶标记的寡脱氧核苷酸探针在组织或细胞水平上与基因或病原体核苷酸依序杂交，使杂交信号级联放大，获得化学发光信号，并通过化学发光仪读取发光值，再根据已知浓度标准品绘制的标准曲线，计算目标DNA的拷贝数，从而实现定性或者定量检测。bDNA技术具有显著的优点：采用释放剂直接释放目标DNA，避免了DNA的提取，节省了时间；无需扩增，避免了PCR反应过程中因为操作不当或实验环境污染可能引起的假阳性；设备要求不高，成本更低廉；操作简便，实验步骤简单，可实现自动化检测。
虽然bDNA技术在原理上已经有一定的探明，但实际的使用上，却并没有获得大面积的推广，原因在于从理论到实际使用中，存在诸多的技术难点，比如，实际使用时的缓冲液体系的构建、放大探针组的设计等，都会直接影响到使用的效果，而现实中，虽然有部分相关的产品，但仅限于仅有的几个厂家，每个厂家对于bDNA技术所需缓冲液成分并未说明，所涉及放大探针组的设计方法，以及具体序列也并未公开，而是采取了技术秘密的保护方式，另外，当前电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)技术的具体实验做法并未开放，里面涉及到的发光标记探针具体合成方法鲜有公开，造成电化学发光的实际研究与使用具有很多难点需要去面对和解决，同时电化学发光也需要使用到专门的电化学发光仪，而它的研发需要物理、化学、生物和电子等知识，这也极大的限制了ECL技术的应用。进而，将核酸检测、bDNA技术和ECL技术联用，要求对所需探针序列十分清楚，以免产生非特异性杂交、识别等问题，就目前而言，这两种技术所涉及序列均公开较少，限制了这两种技术联用，尤其是这两种技术联用在核酸检测领域。
发明内容
本发明将电化学发光检测方法快速灵敏的优点和bDNA技术信号放大的优势相结合，提出的一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，并将该法应用于病原微生物、转基因等检测。
本发明的技术方案是这样实现的：一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，通过不对称PCR扩增目标基因获取单链目标DNA，采用分支DNA放大信号原理设计针对目标DNA特异性序列的电化学发光核酸检测探针组，单链目标DNA与电化学发光核酸检测探针组杂交，对杂交产物进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，最终实现目标基因的检测。
进一步，步骤为，提取目标DNA，引物设计修饰、捕获探针组特征序列的设计与合成、放大探针组的设计与合成、发光探针设计与合成和不对称PCR反应，再通过探针组杂交及磁珠孵育与分离，对磁珠进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，最终实现目标基因的检测。
更为具体的，所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，包括步骤：
(1)从待测样品中提取目标DNA：提取目标DNA方法根据检测物的不同，提取方法也不同；
(2)根据目标基因序列设计引物并对上游引物5’端进行生物素修饰：引物的修饰便于与链霉亲合素修饰的磁珠连接起来，引物的设计主要利用premier5设计以及GenebankBLAST特异性分析；
(3)检测探针组的设计与合成，包括：捕获探针组特征序列的设计与合成，根据分支DNA原理对放大探针组进行设计与合成，所述放大探针组包括捕获探针通用序列、前放大探针、放大探针和发光标记探针，发光探针上进行发光物标记。
捕获探针组特征序列的设计与合成：特征部分序列的设计主要依据premier5以及Genebank BLAST特异性分析；
根据分支DNA原理对放大探针组进行设计与合成：放大探针组的设计主要利用premier5设计以及Genebank BLAST特异性分析，要综合探针长度、退火温度、探针错配、二聚体和特异性等相关因素，经过多重筛查，最终确定具体序列；
发光探针设计与合成：遵循碱基互补配对原则，并考虑与其他探针错配，以及自身特异性分析，同时在探针末端修饰氨基、羧基、巯基等活性基团，便于接上发光标记物。
(4)采用不对称PCR扩增目标基因，获取5’端标记生物素的单链目标DNA：因不同的检测目标DNA，所需不对称比例也不一定相同，一般而言，上、下游引物按照1:1至200：1比例进行不对称PCR，进而筛选出最优的上游引物扩增的单链DNA片段；
(5)5’端标记生物素的单链目标DNA与检测探针组杂交：按照捕获探针-前放大探针杂交、前放大探针-放大探针杂交、目标DNA-捕获探针杂交和放大探针-发光标记探针杂交依次进行，条件可为50-60℃，30-50min；
(6)杂交产物与链霉亲和素修饰磁珠孵育，去上清液，收集磁珠并将其分散于缓冲液中，孵育条件可为37℃，15-30min；
(7)对磁珠进行电化学发光检测：发光检测包括：电化学发光、化学发光、荧光等；
(8)根据电化学发光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有目标DNA成分；
(9)制定标准曲线，根据标准曲线对阳性样品中的目标DNA成分进行定量分析。
进一步，步骤(1)中，所述DNA可为肿瘤标记物的DNA、病原微生物DNA和转基因生物DNA，也适用于病毒核酸等。
进一步，步骤(3)中，捕获探针包括特征序列和通用序列，通用序列为所有检测目标共用，特征序列为针对不同目标DNA而设计的特异性序列；放大探针组包括的捕获探针为捕获探针的通用序列。
进一步，步骤(3)中，发光探针不局限于钌探针，也可用诸如鲁米诺、吖啶类、过氧化草酸酯类、稠环芳烃类以及量子点类其他电化学发光探针，以及CdTe、CdSe、CdS、ZnS、C3N4、铽、氧化石墨烯等量子点荧光探针，化学发光探针等；为便于核酸和上述标记物连接，可在探针末端修饰氨基、羧基、巯基等活性基团。
进一步，步骤(6)中，杂交产物通过单链目标DNA上修饰的生物素和链霉亲和素修饰的磁珠连接。
本发明的另一个目的在于提出一种所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法得到的核酸检测试剂盒，检测简便，快速，成本低，其中包括目标DNA序列引物、放大探针组、DNA聚合酶、MgSO4、dNTP、10×PCR Buffer、Marker、阳性对照和阴性对照。
进一步，所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测试剂盒中，所述放大探针组序列如下：
前放大探针序列为SEQ ID NO：1；捕获探针序列通用部分序列为SEQ ID NO：2；放大探针序列为SEQ ID NO：3；标记探针序列为SEQ ID NO：4。
进一步，所述阳性对照为目标DNA质粒，所述阴性对照品为ddH2O。
本发明的所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法与现有的核酸检测方法相比，具有以下突出的特点：
1.致病菌引物是根据9类食源性致病菌的16S rDNA基因的保守区域设计的。
2.转基因引物是根据CaMV35S启动子和NOS终止子设计的，此方法还适用于癌基因等的引物。
2.捕获探针的设计：DNA测序获得相关序列，并结合GenBank中相关的序列，确定引物扩增区内各目标菌的标签序列，在标签序列区域内设计探针，以实现特异性检测。
3.放大探针组的设计，根据碱基互补配对，以及非同源杂交原则，通过GenBank中BLAST功能筛查设计出通用放大探针组。
4.发光标记探针设计与合成，根据碱基互补配对，通过BLAST筛选出特征序列，作为发光标记探针序列，合成并在3’端标记钌。
5.上、下游引物按照1：1至200：1比例进行不对称PCR扩增，进而得到单链目的DNA产物。
6.引物-磁珠的生物素-链霉亲合素修饰，引物在5’端修饰生物素，磁珠包被上链霉亲合素便于目标DNA富集。磁珠的目的就是吸附、进一步放大信号，便于分离观察。
7.分支DNA技术优点，不存在DNA或RNA纯化和PCR假阳性等问题，且所需设备简单，操作便捷，便于自动化检测DNA靶标。
8.通用试剂盒可用于致病微生物、转基因及癌基因检测等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是是本发明实施例提供的检测流程图；
图2是本发明实施例提供的金黄色葡萄球菌不对称电泳图，其中，M：Maeker，1：阴性对照，2、3、4为正常实验组300bp为单链DNA，400bp为双链DNA，5：阳性对照；
图3是本发明实施例提供的金黄色葡萄球菌检测ECL图(将待测样在电化学发光仪正常实验，在15-30s施加1.25V触发电压)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出了一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，利用分支DNA信号放大技术，同时采取一种电化学发光信号组合对应一种序列的模式，通过不对称PCR扩增目标DNA，针对PCR产物特异性序列进行检测，从而实现目标基因的检测。
所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，包括以下步骤：
(1)从待测样品中提取目标DNA：提取目标DNA方法根据检测物的不同，提取方法也不同；DNA可为肿瘤标记物的DNA、病原微生物DNA和转基因生物DNA，也适用于病毒核酸等。
(2)根据目标基因序列设计引物并对上游引物5’端进行生物素修饰：引物的修饰便于与链霉亲合素修饰的磁珠连起来，引物的设计主要利用premier5设计以及GenebankBLAST特异性分析；利用引物设计软件Primer5设计引物，根据参数，选择三对最优引物进行实验筛选，然后将上游引物5’端修饰生物素，用于后续和链霉亲合素修饰磁珠结合。
(3)捕获探针组特征部分序列的设计与合成：捕获探针的设计主要依据premier5以及Genebank BLAST特异性分析；最后利用引物设计软件Primer5确定引物扩增区内各目标菌的特征序列，进而筛选出最优捕获探针序列。
(4)根据分支DNA原理对放大探针组进行设计与合成：放大探针组(包括捕获探针通用部分、前放大探针、放大探针和发光标记探针)的设计主要依据premier5以及GenebankBLAST特异性分析，根据碱基互补配对，以及非同源杂交原则，综合探针长度、退火温度、探针错配、二聚体等相关因素，多重筛查，最终确定出通用放大探针组。
前放大探针序列为SEQ ID NO：1；捕获探针序列通用部分序列为SEQ ID NO：2；放大探针序列为SEQ ID NO：3；标记探针序列为SEQ ID NO：4。
(5)发光探针设计与合成：发光探针修饰，根据发光标记物不同，在探针末端修饰也不尽相同，发光探针不局限于钌探针，也可用诸如鲁米诺、吖啶类、过氧化草酸酯类、稠环芳烃类以及量子点类其他电化学发光探针，以及CdTe、CdSe、CdS、ZnS、C3N4、铽、氧化石墨烯等量子点荧光探针，化学发光探针等。发光探针的序列遵循碱基互补配对原则，并考虑与其他探针错配，及自身特异性分析，并在探针末端修饰氨基、羧基、巯基等活性基团，便于接上发光标记物。
(6)采用不对称PCR扩增目标DNA，获取5’端标记生物素的单链目标DNA：因不同的检测目标DNA，所需不对称比例也不一定相同，一般而言，上、下游引物按照1:1至200：1比例进行不对称PCR，进而筛选出最优的上游引物扩增的单链DNA片段。
(7)5’端标记生物素的单链目标DNA与探针组杂交：按照捕获探针-前放大探针杂交、前放大探针-放大探针杂交、目标DNA-捕获探针杂交和放大探针-发光标记探针杂交依次进行，条件可为50-60℃，30-50min；
取一定量Tris–HCl(pH 7.1,20mM Tris–HCl,140mM NaCl,5mM KCl,1mM CaCl2,1mM MgCl2)杂交液，加入一定比例捕获探针、前放大探针和放大探针，50-60℃振荡孵育30min，然后再加入一定比例目标DNA，50-60℃振荡孵育30min，最后加入一定比例发光标记探针，50-60℃振荡孵育30min，即得到已获取放大探针组的目标DNA分支状分子。
(8)杂交产物与链霉亲和素修饰磁珠孵育和分离：孵育条件可为37℃，15-30min；
取一定量上述杂交单链目标DNA，并加入链霉亲合素修饰磁珠(7.2mg/mL)于37℃轻微振荡孵育30min，然后置于磁分离器，磁分离去上清，并用Tris–HCl清洗3次，最后分散到Tris–HCl溶液，最后得到连有单链目标DNA的功能化磁珠。
(9)对磁珠进行电化学发光检测，包括：电化学发光、化学发光、荧光等；
取一定量磁珠和三丙胺(TPA)一起加入样品池，置于工作电极底部的磁片将磁珠吸附于工作电极表面，并给定工作电极和参比电极间电压，进行电化学发光检测。根据光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有目标DNA成分；制定标准曲线，根据标准曲线对阳性样品中的目标DNA成分进行定量分析。
一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法得到的核酸检测试剂盒，其中包括目标DNA序列引物、放大探针组、DNA聚合酶、MgSO4、dNTP、10×PCR Buffer、Marker、阳性对照和阴性对照，阳性对照为目标DNA质粒，阴性对照品为ddH2O。
进一步，所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测试剂盒中，所述放大探针组序列如下：
前放大探针序列为SEQ ID NO：1；捕获探针序列通用部分序列为SEQ ID NO：2；放大探针序列为SEQ ID NO：3；标记探针序列为SEQ ID NO：4。
为了便于理解本发明的技术方案，采用实施例进行具体说明。
实施例1
食源性金黄色葡萄球菌检测
当前，有害致病微生物不仅影响人们的健康，危及人们的生命，而且还会引起全社会的恐慌，影响正常的社会运行。传统的致病微生物鉴定主要依靠细菌培养、血清学、生物化学及菌落形态学等方法进行分类鉴定。这类方法虽然可靠，但往往需要几天甚至几周时间才能获得结果；而且菌落形态也会受到环境影响。对微生物进行核酸检测可快速准确地鉴定致病微生物，从而将病原体对人体的伤害降到最低。
1)菌株培养
金黄色葡萄球菌采用7.5％NaCl肉汤培养，霍乱弧菌和副溶血弧菌采用碱性蛋白胨水培养，化脓性链球菌采用葡萄糖肉浸液肉汤培养，其它细菌一般通过营养肉汤或营养琼脂培养。
2)目标DNA提取
采用水煮裂解法提取菌株标本DNA。具体如下：取过夜培养的1ml菌液离心获得菌体，或从营养琼脂平板上获得菌苔；用100ul无菌水悬浮菌体，100℃加热10min，冷却至室温，14000rpm离心8min，取上清作为PCR扩增的模板。
3)不对称PCR扩增
根据设计好的S.aureus(金黄色葡萄球菌)的上游引物序列位于16S RNA的679～696处，序列为5’-CGCACATCAGCGTCAGTT-3’，下游引物位于16S rDNA的1032～1053处，序列为5’-ATACGTAGGTGGCAAGCGTTAT-3’；F’：R’100：1进行非对称PCR扩增，同时将F’引物用生物素标记，进而获得生物素标记单链靶标DNA。
PCR采用25ul反应体系，内含10×buffer(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 8.6)，1.5mM MgCl2，0.4uM各通用引物，0.2mM dNTP，0.5ul Taq酶，0.5ul DNA模板。PCR产物经过2.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，割胶回收，最后通过电泳估算DNA含量(与已知浓度的DNAmarker比对亮度)。
4)5’端标记生物素的单链目标DNA与探针组杂交
取一定量70ul Tris–HCl(pH 7.1,20mM Tris–HCl,140mM NaCl,5mM KCl,1mMCaCl2,1mM MgCl2)杂交液，加入2ul捕获探针、2ul前放大探针和6ul放大探针，50-60℃振荡孵育30min，然后再加入2ul目标DNA，50-60℃振荡孵育30min，最后加入18ul发光标记探针，50-60℃振荡孵育30min，即得到已获取放大探针组的目标DNA分支状分子。
5)杂交产物与链霉亲和素修饰磁珠孵育和分离
取50ul上述杂交单链目标DNA，并加入链霉亲合素修饰磁珠(7.2mg/mL)于37℃轻微振荡孵育30min，然后置于磁分离器，磁分离去上清，并用Tris–HCl清洗3次，最后分散到Tris–HCl溶液，最后得到连有单链目标DNA的功能化磁珠。
6)对功能化磁珠进行电化学发光检测
取50ul孵育磁珠和2ul三丙胺(TPA)一起加入样品池，并给定工作电极和参比电极间1.25V电压，进行电化学发光检测。根根据光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有目标DNA成分；制定标准曲线，根据标准曲线对阳性样品中的目标DNA成分进行定量分析。
实施例2
CaMV35S启动子筛选试剂盒
转基因产品的安全问题备受争议。大部分转基因生物都含有CaMV35S启动子和NOS终止子，且这两种基因是外源基因在植物中表达的常用调控元件，可作为转基因生物的标记。本实施例选择CaMV35S启动子为转基因产品的待测目标基因。
所述试剂盒包括以下组分：Taq DNA聚合酶、MgSO4、dNTP、10×PCR Buffer、Marker、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有CaMV35S启动子基因序列的重组质粒，所述阴性对照品为ddH2O。
所述试剂盒用途：本试剂盒选择CaMV35S启动子检测对象，结合分支DNA电化学发光的检测方法，用于对转基因产品的检测。
所述试剂盒保存：试剂盒中的实际应存放在-20℃、避光保存，有效期为1年。第一次使用后放置于-4℃保存，3个月内有效。
所述试剂盒CaMV35S启动子特异性检测引物序列如下：
上游引物序列：AACAGAACTCGCCGTAAAGACT；
下游引物序列：CAGATAGCTGGGCAATGGAA；
所述特异性检测放大探针组序列如下：
前放大探针：
TATAGTGAGACGTCCATTTTATAGTGAGACGTCCATTTTATAGTGAGACGTCCATTTTGATAGATAGGTTCTCA
捕获探针：
CATACGCGCGACGATACGGCTTTTGAGAACCTATCTATCA
放大探针：
TGGACGTCTCACTATATTTAGCTGAGTCAAAGCATTTTAGCTGAGTCAAAGCATTTTAGCTGAGTCAAAGCAT
标记探针：ATGCTTTGACTCAGCT
所述试剂盒使用方法：提取转基因产品DNA；上下游引物不对称PCR；放大探针组与目标DNA杂交；发光标记探针与上述杂交产物杂交；发光检测。
本发明所涉及的基于电化学发光分支DNA方法，也适用于荧光分支DNA方法，同时还适用于化学发光分支DNA方法等；这类方法均可适用于转基因食品检测、食源性致病菌检测和癌基因检测等。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQ ID NO：1
前放大探针 74
TATAGTGAGACGTCCATTTTATAGTGAGACGTCCATTTTATAGTGAGACGTCCATTTTGATAGATAGGTTCTCA
SEQ ID NO：2
捕获探针 23
CATACGCGCGACGATACGGCTTT
SEQ ID NO：3
放大探针 73
TGGACGTCTCACTATATTTAGCTGAGTCAAAGCATTTTAGCTGAGTCAAAGCATTTTAGCTGAGTCAAAGCAT
SEQ ID NO：4
标记探针 16
ATGCTTTGACTCAGCT

Claims (9)

1.一种基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：通过不对称PCR扩增目标基因获取单链目标DNA，采用分支DNA放大信号原理设计针对目标DNA特异性序列的电化学发光核酸检测探针组，单链目标DNA与电化学发光核酸检测探针组杂交，对杂交产物进行电化学发光检测，根据电化学发光信号的有无和强度对目标DNA进行定性与定量分析，实现目标基因的检测。
2.如权利要求1中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)从待测样品中提取目标基因DNA；
(2)根据目标基因序列设计引物并对上游引物5’端进行生物素修饰；
(3)检测探针组的设计与合成，包括：捕获探针组特征序列的设计与合成，根据分支DNA原理对放大探针组进行设计与合成，所述放大探针组包括捕获探针通用序列、前放大探针、放大探针和发光标记探针，发光探针上进行发光物标记。
(4)采用不对称PCR扩增目标基因，获取5’端标记生物素的单链目标DNA；
(5)5’端标记生物素的单链目标DNA与检测探针组杂交；
(6)杂交产物与链霉亲和素修饰磁珠孵育，去上清液，收集磁珠并将其分散于缓冲液中；
(7)对磁珠进行电化学发光检测；
(8)根据电化学发光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有目标DNA成分；
(9)制定标准曲线，根据标准曲线对阳性样品中的目标DNA成分进行定量分析。
3.如权利要求1中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述目标DNA包括：肿瘤标志物DNA、病原微生物DNA、转基因生物DNA、病毒核酸。
4.如权利要求1中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：步骤(3)中，捕获探针包括特征序列和通用序列，通用序列为所有检测目标共用，特征序列为针对不同目标DNA而设计的特异性序列；放大探针组包括的捕获探针为捕获探针的通用序列。
5.如权利要求1中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：步骤(3)中，发光探针包括钌探针、C3N4探针、铽探针、电化学发光探针、量子点荧光探针，化学发光探针。
6.如权利要求5中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：步骤(3)中，探针末端具有活性基团修饰，包括氨基、羧基、巯基活性基团。
7.如权利要求1中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法，其特征在于：步骤(6)中，杂交产物通过单链目标DNA上修饰的生物素和链霉亲和素修饰的磁珠连接。
8.根据权利要求1-7中任一所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测方法制备的核酸检测试剂盒，其特征在于：包括目标DNA序列引物、捕获探针组、通用放大探针组、DNA聚合酶、MgSO4、dNTP、10×PCR Buffer、Marker、阳性对照和阴性对照。所述阳性对照为目标DNA质粒，所述阴性对照品为ddH2O。所述目标DNA质粒根据检测目标的不同而相应变化，同样，捕获探针特征序列为针对不同目标DNA而设计的特异性序列。
9.如权利要求7中所述基于分支DNA放大信号的电化学发光核酸检测试剂盒，其特征在于：前放大探针序列为SEQ ID NO：1；捕获探针通用序列为SEQ ID NO：2；放大探针序列为SEQ ID NO：3；发光标记探针序列为SEQ ID NO：4。
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