KR101291609B1 - 김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커 - Google Patents

김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커 Download PDF

Info

Publication number
KR101291609B1
KR101291609B1 KR1020110062110A KR20110062110A KR101291609B1 KR 101291609 B1 KR101291609 B1 KR 101291609B1 KR 1020110062110 A KR1020110062110 A KR 1020110062110A KR 20110062110 A KR20110062110 A KR 20110062110A KR 101291609 B1 KR101291609 B1 KR 101291609B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
laver
seaweed
primer set
species
product
Prior art date
Application number
KR1020110062110A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130001398A (ko
Inventor
이정호
황미숙
박은정
하동수
공용근
Original Assignee
주식회사녹색식물연구소
대한민국(관리부서:국립수산과학원)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사녹색식물연구소, 대한민국(관리부서:국립수산과학원) filed Critical 주식회사녹색식물연구소
Priority to KR1020110062110A priority Critical patent/KR101291609B1/ko
Publication of KR20130001398A publication Critical patent/KR20130001398A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101291609B1 publication Critical patent/KR101291609B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 생육 상태 또는 건조된 김으로 그 구별이 용이하지 않은 주요 식용 4종인, 참김(Porphyra tenera), 방사무늬김(P. yezoensis), 잇바디돌김(P. dentata), 모무늬돌김(P. seriata)을 대상으로 제안된 프라이머 세트로 PCR을 하여, 그 PCR 산물을 제한효소로 자르는 PCR-RFLP 방법으로 쉽게 구분할 수 있는 분자 마커이다.

Description

김 종 구분용 엽록체 ＣＡＰＳ 마커{Chloroplast CAPS marker for discriminating Porphyra species}
본 발명은 CAPS 마커를 이용한 김 종 판별 방법에 관한 것이다.
'김'은 한국과 일본이 주요 생산 및 소비국이며, 한국에서는 UPOV (International Union for the Protection of New Varieties of Plants) 협약에 의해 2012년에 해조류를 비롯한 모든 식물로 품종보호제도가 확대된다. 일본은 방사무늬김(Porphyra yezoensis)을 주생산품으로 하며, 신흥 김 생산국인 중국은 방사무늬김(P. yezoensis)의 생산을 증대시키고 있으며, 한국은 참김(P. tenera), 방사무늬김, 잇바디돌김(P. dentata) 및 모무늬돌김(P. seriata)을 생산하고 있다. 이들 종 간의 구별은 생산 원산지 추적기술로 적용되는 기술이다. 특히, 전 세계적으로 가장 많이 소비되고 있는 방사무늬김과 참김은 육상식물과 달리 재배 시 생체로도 그 구별이 불가능하며, 건조된 김에서는 더욱 불가능하다.
기존에 핵 유전자인 액틴(actin) 관련 유전자(ARP4 )를 이용한 참김과 방사무늬김의 CAPS 마커가 보고된 바 있다 (Park et al. 2008 Fisheries Science 74: 613-620). 본 발명은 참김 및 방사무늬김 뿐 아니라 돌김류 2종을 추가하여 한국에서 재배되는 참김(P. tenera), 방사무늬김, 잇바디돌김(P. dentata) 및 모무늬돌김(P. seriata) 전 4종을 구별하는 것으로서, 액틴과는 다른 유전자를 이용하는 방법이다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 유전자군의 비교분석을 통해 김의 엽록체 DNA 중의 psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간의 유전자 염기서열을 기반으로 특이적인 프라이머를 제작하였으며, 상기 구간의 염기서열 분석을 통하여 한국에서 재배되는 김 4 종의 구별이 가능한 제한효소를 찾아, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 김 종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 김 종을 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 김 종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 김 종 판별용 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 여러 종이 혼합 제조된 김으로부터 김 종의 구성비를 추적하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트 및 제한효소를 이용한 방법을 사용하면, 참김(P. tenera), 방사무늬김(P. yezoensis), 잇바디돌김(P. dentata) 및 모무늬돌김(P. seriata) 4 종을 정확하고 신속하게 판별할 수 있다.
도 1은 김 PCR-RFLP 마커의 개념도를 보여준다. 김의 엽록체 DNA 중의 psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간의 증폭을 위한 프라이머의 위치는 화살표로 표시하였다. 상기 구간의 PCR 크기는 약 5.8kb이고, 제한효소는 HindIII를 사용하였으며, 전기영동은 아가로즈겔(Agarose gel)에서 실시하였다.
도 2는 한국 주요 식용 김 4종에 대한 PCR-RFLP의 결과를 보여준다.
도 3은 식용 김 4종의 한국과 일본의 23 계통주(품종)에 대한 PCR-RFLP 결과를 보여준다. 1, 2: 한국산 모무늬돌김(P. seriata) 2 계통주; 3: 한국산 잇바디돌김(P. dentata); 4~7: 한국산 참김(P. tenera) 4 계통주; 8~23: 한국산 및 일본산 방사무늬김(P. yezoensis) 15 계통주, 23: 일본산 큰방사무늬김(P. yezoensis narawaensis).
도 4는 방사무늬김(P. yezoensis) 일본산(PY_JPN) 및 한국산 (PY_Kor), 참김(P. tenera ; PT), 잇바디돌김(P. dentata : PD) 및 모무늬돌김(P. seriata: PS)의 HindIII site의 위치를 보여준다.
도 5는 방사무늬김(P. yezoensis), 참김(P. tenera), 잇바디돌김(P. dentata) 및 모무늬돌김(P. seriata)의 한국과 일본의 35 계통주(품종)의 엽록체 DNA psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간 내 HindIII site(AAGCTT) 부위 전후의 염기서열을 보여준다.
도 6은 이미 알려진 방사무늬김(Genbank no: NC_007932) psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간의 염기서열과 공개되지 않은 참김의 프라이머 구간과 HindIII site(AAGCTT) 부위 전후의 염기서열을 보여준다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 김 종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 김 종 판별용 프라이머 세트이다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
상기 김은 참김(Porphyra tenera), 방사무늬김(P. yezoensis), 잇바디돌김(P. dentata), 모무늬돌김(P. seriata) 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
김에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 김 종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 김 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있으며, 바람직하게는 TOYOBO 키트를 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 김 종은 참김(Porphyra tenera), 방사무늬김(P. yezoensis), 잇바디돌김(P. dentata), 모무늬돌김(P. seriata) 등일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 증폭 산물의 검출로 증폭 산물을 제한효소로 절단 후 검출하는 과정을 거친다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 제한효소는 HindIII일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는, 김 종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 제한효소는 바람직하게는 HindIII일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 김 종 판별용 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 제공한다. 상기 마커는 엽록체 DNA psaA~tufA 구간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
김에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
상기 분리된 절단 산물의 패턴(pattern)을 각 김 별로 비교 및 분석하는 단계를 포함하는 여러 종이 혼합 제조된 김으로부터 김 종의 구성비를 추적하는 방법을 제공한다. 상기 표적 서열은 엽록체 DNA psaA~tufA 구간일 수 있으며, 상기 제한효소는 HindIII일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 김 종의 구성비 추적 방법은 여러 종이 혼합 제조된 김의 종별 구성비를 추적하는데 이용될 수 있는데, 구체적으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 후, HindIII 제한효소로 증폭산물을 절단하고, 절단 산물을 겔 전기영동하여 분리한 후, 분리된 패턴을 도 2에 나타난 패턴과 비교함으로써, 혼합 김의 종별 구성비를 추적할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료
본 발명에서는 국립수산과학원 해조류바이오연구센터에서 제공한 김 사상체(포자체)와 엽상체(배우체)를 이용하였다.
2. 김으로부터 게놈 DNA 의 추출
김 시료는 실리카겔(Silica gel)에 넣어, -50℃에서 냉동건조 하였으며, 마른 김은 액체질소에서 유발을 이용해 갈아, 자성 비드(magnetic bead)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
3. psa A ~ tuf A 구간의 LPCR
하기에 명시된 PCR 프라이머를 사용하여, Takara LA tag의 지침에 따라, PCR을 수행하였다.
PCR에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
Porph_tufA.F CAGATGGATGGHGCKATTTTAG 1
Porph_psaA.F AGCTCAMAAGAGCAAGAGACAAAG 2
4. 제한효소 반응
본 발명에서는 HindIII 제한 효소(Enzynomics사)를 사용하였으며, 제조사의 지침에 따라 반응시켰다.
실시예
실시예 1: 한국과 일본의 4 종 35 계통주에 대한 Hind III site 의 위치 검정
한국과 일본의 김 4 종 35 계통주(품종)를 대상으로 엽록체 DNA psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간의 PCR 산물의 완전 염기서열을 분석하여, Sequencher 프로그램(Genecode co., USA)을 이용하여 HindIII 자리의 위치를 확인하였다. 김 4 종의 35 계통주에서 HindIII 자리는 총 4곳으로 각각 2.30, 2.58, 3.67 및 4.85kb의 위치에서 종에 따라 달랐다 (도 4). HindIII site(AAGCTT) 부위 전후의 염기서열은 도 5에 명시하였다. HindIII 자리는 방사무늬김(PY, 7 개의 한국 계통주와 14 개의 일본 계통주)은 2.30 및 2.58kb 위치의 2 곳에, 참김(PT, 4 개의 한국 계통주)은 2.30, 2.58 및 3.67kb 위치의 3곳에, 모무늬돌김(PS, 5 개의 한국 계통주)은 4.85kb 위치의 한 곳에, 잇바디돌김(PD, 5개의 한국 계통주)은 2.30, 3.67 및 4.85kb 위치의 3 곳에 나타남을 완전 염기서열 분석을 통해 검정하였다.
실시예 2: 김의 PCR - RFLP 결과
한국 주요 식용 김 4종을 대상으로 엽록체 DNA psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간의 PCR 산물을 HindIII로 잘라, 아가로즈겔에서 전기영동으로 분리하였다. 도 2에 제시된 바와 같이 한국에서 재배되는 주요 식용 김 4종은 PCR-RFLP로 서로 구별된다. 방사무늬김(P. yezoensis)의 PCR 산물은 3.2kb, 2.3kb 및 280bp의 3단편으로, 참김(P. tenera)의 PCR 산물은 2.3kb, 2.2kb, 1.1kb 및 280bp의 4단편으로, 모무늬돌김(P. seriata)의 PCR 산물은 3.6kb 및 2.2kb의 2단편으로, 잇바디돌김(P. dentata)은 2.3kb, 1.4kb, 1.2kb 및 1.0kb의 4단편으로 분리되므로, 엽록체 psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간의 PCR-RFLP 방법으로 4종 간의 구별이 가능하다.
실시예 3: 한국과 일본의 23 계통주(품종)에 대한 PCR - RFLP 결과
식용 김 4종의 한국과 일본의 23 계통주(품종)를 대상으로 엽록체 DNA psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간의 PCR 산물을 HindIII로 잘라, 아가로즈겔에서 전기영동으로 분리하였다. 실시예 1에서와 같이 방사무늬김(P. yezoensis, 도 3의 레인 8~23)의 PCR 산물은 3.2kb, 2.3kb 및 280bp의 3단편으로 나누어지며, 부분적으로 절단(partial digestion)된 5.8kb(잘리지 않은 엽록체 DNA psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간), 3.48kb(3.2kb + 280bp) 및 2.58kb(2.3kb + 280bp) 단편이 희미하게 보인다.
참김(P. tenera, 도 3의 레인 4~7)의 PCR 산물은 2.3kb, 2.2kb, 1.1kb 및 280bp의 4단편으로 나누어지며, 부분적으로 절단된 4.5kb(2.3 + 2.2kb) 및 1.38kb(1.1kb + 280bp) 단편이 희미하게 보인다.
모무늬돌김(P. seriata, 도 3의 레인 3)의 PCR 산물은 3.6kb 및 2.2kb의 단편으로 나누어지며, 부분적으로 절단된 5.8kb(잘리지 않은 엽록체 DNA psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간) 단편이 희미하게 보인다.
잇바디돌김(P. dentate, 도 3의 레인 1~2)은 2.3kb, 1.4kb, 1.2kb 및 1.0kb의 4단편으로 분리되며, 레인 1은 완전히 절단된 상태(full digestion)이고, 레인 2에서는 부분적으로 절단된 5.8kb(잘리지 않은 엽록체 DNA psaA-psaB-(rps10-tufA) 구간), 4.8kb(5.8 + 1.0 kb), 3.7kb(2.3 + 1.4kb), 2.4kb(1.4 + 1.0kb) 및 2.2kb(1.2 + 1.0kb) 단편이 희미하게 보인다. 도 3의 결과는 HindIII의 반응 위치가 정확함을 보여준다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 김 종 판별용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 김은 참김(Porphyra tenera), 방사무늬김(P. yezoensis), 잇바디돌김(P. dentata), 모무늬돌김(P. seriata)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상인 것을 특징으로 하는 김 종 판별용 프라이머 세트.
  4. 김에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
    상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 김 종을 판별하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  6. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는, 김 종을 판별하기 위한 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 삭제
  9. 김에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
    상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 절단 산물의 패턴(pattern)을 각 김 별로 비교 및 분석하는 단계를 포함하는 여러 종이 혼합 제조된 김으로부터 김 종의 구성비를 추적하는 방법.
KR1020110062110A 2011-06-27 2011-06-27 김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커 KR101291609B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110062110A KR101291609B1 (ko) 2011-06-27 2011-06-27 김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110062110A KR101291609B1 (ko) 2011-06-27 2011-06-27 김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130001398A KR20130001398A (ko) 2013-01-04
KR101291609B1 true KR101291609B1 (ko) 2013-08-13

Family

ID=47834439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110062110A KR101291609B1 (ko) 2011-06-27 2011-06-27 김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101291609B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102290111B1 (ko) 2020-05-08 2021-08-17 전남대학교 산학협력단 방사무늬김 품종의 그룹 구별을 위한 ssr 마커 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 방사무늬김의 그룹 구별 방법
KR20220153926A (ko) 2021-05-12 2022-11-21 전남대학교산학협력단 세엽형과 광엽형 방사무늬김의 판별을 위한 ssr 마커 및 이의 응용

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102021263B1 (ko) * 2019-02-27 2019-09-19 재단법인 전남생물산업진흥원 잇바디 돌김에서 추출, 분리한 유효성분을 함유하는 피부재생용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI, GenBank Accession No. AP006715 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102290111B1 (ko) 2020-05-08 2021-08-17 전남대학교 산학협력단 방사무늬김 품종의 그룹 구별을 위한 ssr 마커 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 방사무늬김의 그룹 구별 방법
KR20220153926A (ko) 2021-05-12 2022-11-21 전남대학교산학협력단 세엽형과 광엽형 방사무늬김의 판별을 위한 ssr 마커 및 이의 응용

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130001398A (ko) 2013-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102029016B1 (ko) 양송이 균주 구별을 위한 ssr 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101954673B1 (ko) 더덕 품종 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도
KR101804120B1 (ko) 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 dna 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20200049500A (ko) 국화 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도
CN109295179B (zh) 一种筛选不同锌含量和铁含量小麦的方法及其专用试剂盒
KR101291609B1 (ko) 김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커
KR101778877B1 (ko) 황금배와 미니배의 품종 구별을 위한 분자마커
KR101961653B1 (ko) 고구마 품종 판별용 ｓｎｐ 분자 마커 및 이의 용도
KR101807623B1 (ko) 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 dna 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
CN108411030A (zh) 引物对及包含其的试剂盒、用途和检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法
KR102429219B1 (ko) 콩 역병균에 대한 저항성 또는 감수성을 가지는 콩 품종 판별용 마커 조성물 및 이의 용도
KR102335806B1 (ko) 대추 산조 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
CN103589797A (zh) 一种单核苷酸多态性分型的方法及其应用
KR101144990B1 (ko) Ｓｔｓ 프라이머를 이용한 ｐｃｒ 기반 인삼 품종 판별 방법
KR102393484B1 (ko) 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR102380784B1 (ko) 식방풍 유전자원 판별용 분자마커 및 이의 용도
KR102623818B1 (ko) 매실과 살구를 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR102672574B1 (ko) 사초과 식물 '진도사초'를 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
KR102672578B1 (ko) 사초과 식물 '양지사초'를 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
KR102163238B1 (ko) 당귀 속 식물로부터 일당귀를 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR102163235B1 (ko) 당귀 속 식물로부터 바디나물을 판별하기 위한 엽록체 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR102672567B1 (ko) 사초과 식물 '애기흰사초'를 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
KR101499583B1 (ko) 한국잔디 신품종 장성초록을 구분하기 위한 특이 scar 마커 및 이의 용도
KR102672565B1 (ko) 사초과 식물 '애기반들사초'를 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
KR102592643B1 (ko) 농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 농어와 점농어를 판별하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160725

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170614

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180725

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190726

Year of fee payment: 7