JP4755974B2 - 核酸の選択的断片化によるdna断片の作製方法およびその適用 - Google Patents
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Description
・制限酵素により生じた断片のサザンブロッティングによる分析を含むRFLP (制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism))技術は、1回の反応において1つだけ、または最大でもいくつかの遺伝子座しか分析できないという限りにおいて解決に乏しい。さらに、得られる断片は、生じる断片の数が多すぎてチップが飽和してしまうので、DNAチップハイブリダイゼーションにより分析できない。
a) 分析されるべき核酸の試料を無作為に断片化することができかつ平滑末端または付着末端を有するDNA断片F1を生じることができる少なくとも1種の制限酵素E1を用いて第一の二本鎖DNA断片F1を作製する、
- 該単位の配列が、制限酵素E2の切断部位が認識部位の下流に位置する制限酵素E2の認識部位(N塩基対を含む)の最初の(N-x)塩基対(1≦x≦(N-1))であり、かつ
- 前記DNA断片F1の5'に位置する該単位の3'末端がE1制限酵素の制限部位である
を形成するようにライゲーションする(断片F'1の生成)、
c) b)で得られたDNA断片F'1を、その5'末端の近傍で、短い断片F2のフラクションを選択するように制限酵素E2を用いて切断する、
d) 該短い断片F2のフラクションをいずれの適切な手段により精製する
を含む短い断片の第一の選択、および任意に
e) d)で得られた短い断片F2の遊離末端(アダプタAA'に連結していない)を少なくとも第二の相補アダプタBB'にライゲーションする(断片F'2の生成)、および
f) 前記アダプタ(AA'およびBB')に連結された短い断片F'2を、少なくとも1対の適切なプライマ(少なくとも1つがその5'末端で任意に標識されていてもよい)を用いて、d)で得られた短い断片F2のフラクションから短い断片F'2の少なくとも1の部分集合を得るように増幅する
に従う、工程d)で得られた短い断片F2のフラクションからの断片の1以上の部分集合の第二の選択(図3)。
・DNA断片の用語は、二本鎖DNA断片を意味することを意図する。
・短い断片F2またはF'2の用語は、100塩基対未満のDNA断片を意味することを意図する。
・長い断片F1またはF'1の用語は、数百塩基対のDNA断片を意味することを意図する。
・DNA断片、アダプタまたは制限酵素による認識もしくは切断の部位に関する5'末端および3'末端の用語は、該DNA断片、該アダプタまたは該制限酵素による認識もしくは切断の部位のプラス鎖のそれぞれ5'末端および3'末端を意味することを意図する。
・アダプタの相補末端の用語は、DNA断片の3'または5'末端に結合する該アダプタの末端を意味することを意図する。該アダプタが該DNA断片の5'末端に結合する場合、これは該アダプタの3'末端を含み、逆も同じである。
- 分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な短い断片F2のフラクションの、アダプタAA'を用いる選択による分析されるべき試料の複雑性の減少(図2)。このような選択により、ハイブリダイゼーションに用いられるDNAチップタイプの支持体の飽和の問題を回避することができる。
- 分析されるべき全ゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な、すなわちオリゴヌクレオチドプローブと同じ長さを有する短い断片F'2を得ること(図1および3)。
- 分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な種々の遺伝フットプリントまたはマーカーの最大数を、短い断片F2の組を用いて、種々のアダプタ(B1B1'、B2B2'など)を用いて工程d)で得られる短い断片F2のこの組の部分集合の第二の選択により検出すること(図2および3)。
アダプタのライゲーションおよび制限酵素での切断だけにより選択される短い断片F2のフラクションは、分析されるべき全ゲノムまたはトランスクリプトームを代表する。まず、これらの短い断片は増幅が容易であり、次に、部分的に分解されたDNAに働くことを可能にする。さらに、ハイブリダイゼーションに用いられるDNAチップタイプの支持体の飽和の問題を回避することを可能にする、分析されるべきゲノムまたはトランスクリプトームに代表的な短い断片F2のフラクションの、アダプタAA'を用いる第一の選択による分析されるべき試料の複雑性の低減は、ゲノムまたはトランスクリプトームの分析の信頼性および再現性の増大にも貢献する。
ハイブリダイゼーションの感度および特異性は、以下のことにより増大する。
- ハイブリダイズされる断片のサイズの減少(従来技術の方法における数百塩基または塩基対の代わりに、100塩基もしくは塩基対未満の標的またはプローブ)。この減少は、クロスハイブリダイゼーション反応および偽陽性を、「非標的配列」の排除により減少させ、かつDNAの二次構造の減少によりハイブリダイゼーションシグナルを増大させる。
- DNAの純度(酵素、バッファーおよび残っている長いDNA断片の除去)。
核酸(標的またはプローブ)の断片化は、実行が単純な工程を含む(酵素消化、ライゲーション)。さらに、DNA(標的またはプローブ)の長さ、構造および組成の最適化は、良好な品質のハイブリダイゼーション(偽陽性なし、わずかなバックグラウンドノイズなど)を得ることを可能にし、よって必要とされるコントロールの数を最小限にすること、ひいてはチップの複雑性を減少させることを可能にする。
ハイブリダイゼーション時間はかなり減少され、従来技術の方法の12〜18時間の代わりに、1時間未満(約15〜20分)である。
チップの複雑性の低減は、チップのコストの削減を可能にする。
- DNAチップ上の標的核酸(ゲノムDNAまたはmRNAの逆転写により得られるcDNA)の多数の試料の迅速な分析、および
- 特に、ゲノムまたはトランスクリプトームの遺伝マーカーを代表するプローブが固定化されたDNAチップの製作のためのRNAまたはゲノムDNAからの小さくかつ制御されたサイズのプローブの作製
に適する。
- 少なくとも一方が、他の制限酵素により任意に生じるものとは異なる付着末端を生じ、かつ
- E11A制限部位の3'末端が、工程b)で規定される単位のものである
ような2つの異なるE1制限酵素、E1AおよびE1Cを用いて行なわれる。
DNAを希に切断する酵素の限定しない例としては、5または6の塩基対の制限部位を有するもの、例えばPst IおよびEcoR Iを挙げることができる。
上記のDNA断片の別の有利な実施形態によると、これは、その5'末端の1つで、核酸ハイブリッド(DNA-DNAまたはRNA-DNA)を検出するための適切な標識、例えば蛍光体に連結される。
- 図1は、本発明による方法の工程a)〜d)を図示する。図を単純にするために、アダプタAA'の鎖Aにのみ注釈をつける。
- 図4-1〜4-3は、本発明による方法の工程a)〜f)の第一の例を示す。図4-1:工程aおよびb、図4-2:工程cおよびd、図4-3:工程eおよびf。
- 工程b):アダプタAA' (16/20 bp)は、それぞれ5'から3'に:15塩基対(鎖A上に領域2:GGAAGCCTAGCTGGA (配列番号1))と、EcoR I部位に相補的でない1塩基対(鎖A上のC)と、鎖A'の5'末端にはさらにMme I部位の5'末端(A)を含むEcoR I 部位に相補的な4塩基(領域1)と、リン酸残基(5'リン酸-AATT)とを含む。DNAリガーゼは、ホスホジエステル結合によりEcoR I断片の付着末端にアダプタを連結させることができる。
- 工程e):工程d)で精製された短い断片は、その一方の末端で、鎖B'1の3'末端で該断片の末端に相補的な2つの塩基(TT)を含み、かつ鎖B1の5'末端でリン酸基を含むアダプタB1B1' (14/16 bp)に連結される。2つの特定の塩基(AA)の選択は、出発試料に比べて断片の数を2048 (4×2×4×4×16)分の1に減少させることを可能にし、分析されるべきDNAに特異的な28塩基対を含む59の塩基対の短い断片を得ることを可能にするが、ここで該断片は遺伝フットプリントの16の可能性のある部分集合に対応する。
- 工程a):二本鎖DNA断片は、GGATCC部位を認識するBamH Iを用いる切断により生じる。
- 工程e):工程d)で精製された短い断片は、その一方の末端で、鎖B'1の3'末端で該断片の末端に相補的な2つの塩基(TT)を含み、かつ鎖B1の5'末端でリン酸基を含むアダプタB1B1' (14/16 bp)に連結される。2つの特異的塩基(AA)の選択は、出発試料に比べて断片の数を512 (2×4×4×16)分の1に減少させることを可能にし、分析されるべきDNAに特異的な28塩基対を含む58の塩基対の短い断片を得ることを可能にするが、ここで該断片は遺伝フットプリントの16の可能性のある部分集合に対応する。
- 工程a):二本鎖DNA断片は、CCGCGG部位を認識するKsp Iを用いる切断により生じる。
- 工程e):工程d)で精製された短い断片は、その一方の末端で、鎖B'1の3'末端で該断片の末端に相補的な2つの塩基(TT)を含み、かつ鎖B1の5'末端でリン酸基を含むアダプタB1B1' (14/16 bp)に連結される。2つの特異的塩基(AA)の選択は、出発試料に比べて断片の数を64 (4×16)分の1に減少させることを可能にし、分析されるべきDNAに特異的な28塩基対を含む短い断片を得ることを可能にするが、ここで該断片は遺伝フットプリントの16の可能性のある部分集合に対応する。
核酸の作製、酵素消化、ライゲーション、PCR増幅およびそのようにして得られた断片の精製は、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA)に記載されるもののような標準的なプロトコルに従う通常の技術を用いて行なった。
- アダプタAA'
- 鎖A:5'-GGAAGCCTAGCTGGAC-3' (配列番号2)
- 鎖A':5'-P-AATTCTCCAGCTAGGCTTCC-3' (配列番号3)
B:5'-P-GGTGAGCACTCATC-3' (配列番号4)
B':5'-GATGAGTGCTGACCTT-3' (配列番号5)
プライマ対1:
センス:5'-CCTTCGGATCGACCTG-3' (配列番号6)
アンチセンス:5'-CTACTCACGAGTGGAA-3' (配列番号7)
またはプライマ対2:
センス:5'-GGAAGCCTAGCTGGAC-3' (配列番号2)
アンチセンス:5'-GATGAGTGCTGACCTT-3' (配列番号5)
を区別なく用いることができる。
プライマ対2は、特に、アダプタの配列の一部分を再利用することを可能にする。
1) ゲノムDNAのEco RIを用いる消化およびアダプタAA'への断片のライゲーション(工程aおよびb)
精製ゲノムDNA (5μg)とアダプタ(5μg)とを、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM ATPおよび1 mg BSAと、50 IUのEcoR Iおよび2 IUのT4 DNAリガーゼとを含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5 40μl中に37℃で3時間インキュベートした。このようにして得られたアダプタAA'がその末端に連結されたDNA断片を、3M酢酸アンモニウムおよびエタノールの1:4 (V/V)混合物からの沈殿により精製した。
ペレットを50 mM酢酸カリウム、20 mM Tris-酢酸、10 mM 酢酸マグネシウムおよび1 mM DTTを含むバッファー、pH 7.9 40μlに再懸濁し、5 IUのMme Iの存在下に37℃で1時間インキュベートした。
酵素を、Micropure-EZキット(Millipore)を用いて除去し、続いて塩を濾過(Microcon YM3)により除去し、YM3濾紙上に保持されたDNAを溶出し、短い断片を濾過(Microcon YM 30またはYM 50, Millipore)により精製した。100 bp未満のDNA断片が溶出液に相当し、それより大きい断片は濾紙上に保持される。
工程d)で得られた短い断片とアダプタBB' (3μg)とを、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM ATPおよび1 mg BSAと、2 IUのT4 DNAリガーゼとを含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5、40μl中に、37℃で3時間インキュベートした。
工程e)で得られた、アダプタBB'に連結された短い断片を、続いて、アダプタAA'およびBB'の鎖AおよびB'に相補的な配列に相当するセンスおよびアンチセンスの対を用いてPCRにより、1 ngのDNA断片、150 ngの各プライマおよび2 IUのAmpliTaq GOLD (登録商標) (Perkin Elmer)を、10 mM KCl、5 mM MgCl2および200μM dNTPsを含む15 mM Tris-HClバッファー、pH 8.0中に含む50μlの反応容量で増幅した。増幅は、サーモサイクラーで、94℃で30秒間の変性工程、続いて60℃で30秒間のハイブリダイゼーション工程および72℃で2分間の伸長工程を含む35サイクルで行なった。PCR増幅断片を、製造業者の使用説明に従ってMinElute PCR Purificationキット(参照LSKG, Qiagen)を用いて精製した。
実施例1で得られた短い二本鎖DNA断片(標的DNAs)を、0.02 Mクエン酸アンモニウムバッファー、pH 5中に3×10-3 IUの5'-エキソヌクレアーゼを含む40μlの反応容積中に、37℃で30分間の消化により一本鎖DNAに変換した。酵素、塩および遊離のdNTPsを、Micropure-EZ (Millipore)上、次いでMicrocon YM3 (Millipore)上での濾過により除去し、濾紙上に保持された一本鎖DNAを溶出した。
ゲノムDNAを、実施例1に記載のようにして作製する。
次のアダプタおよびプライマを合成した。
- アダプタAA' (Taqα I部位に相補的)
- 鎖A:5'-GACGATGAGTCCTGAC-3' (配列番号8)
- 鎖A':5'-P-CGGTCAGGACTCATCGTC-3'(配列番号9)
- 鎖C:5'P-AATTGGTACGCAGTCTAC-3' (配列番号10)
- 鎖C':5'-GTAGACTGCGTACC-3' (配列番号11)
- プライマ
- センスプライマ:5'-Cy3-GACGATGAGTCCTGACCG-3' (配列番号12)
- アンチセンスプライマ:5'-ビオチン-GTAGACTGCGTACCAATT-3' (配列番号13)
1) ゲノムDNAのEco RIおよびTaq α Iを用いる消化ならびに断片のアダプタAA'およびCC'へのライゲーション(工程aおよびb)
精製ゲノムDNA (5μg)とそれぞれのアダプタ(5μgのAA'および5μgのCC')を、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、10 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM ATPおよび1 mg BSAと、50 IUのEcoR I、50 IUのTaqα Iおよび2 IUのT4 DNAリガーゼを含む10 mM Tris-HClバッファー、pH 7.5 40μl中に37℃で3時間インキュベートした。
5'位でアダプタAA'にかつ3'位でアダプタCC'に連結されたDNA断片F'1を、センスおよびアンチセンスプライマ(配列番号8および11)を用いて、10 mM KClおよび5 mM MgCl2を含むTris-HClバッファー、pH 8中に1μlのライゲーションされた断片、2 IUのポリメラーゼ(AmpliTaq Gold, Perkin-Elmer)、150 ngの各プライマおよび200μMの各dNTPを含む50μlの最終容積の反応混合物中で増幅させた。増幅は、次の条件下で行った:94℃で30秒間の変性工程、続いて60℃で30秒間のハイブリダイゼーション工程および72℃で2分間の伸長工程を含む35サイクル。
ビーズで形成されたペレットをBseR I酵素反応バッファー40μl中に再懸濁し、5 IUのBseR Iの存在下に37℃で3時間インキュベートした。反応媒体中に放出された短い断片F2を回収する。
その上にオリゴヌクレオチドプローブ(このいくつかは得られた標的DNA断片に相補的DNAある)が固定化されたDNAチップタイプのガラス支持体を、それ自体で知られる技術に従って作製した。次いで、該標的DNAを95℃で3分間変性させ、ハイブリダイゼーションバッファー(H7140, Sigma)中に希釈し、10μlを、スライドとカバーガラスとの間でガラス支持体上に沈積させた。次いでハイブリダイゼーションを、湿気のあるチャンバ内で、50℃で2時間行った。ハイブリダイゼーション反応を、ガラススライドを氷上におくことにより停止させた。
Claims (31)
- 少なくとも以下の工程:
a)分析されるべき核酸の試料を無作為に断片化することができかつ平滑末端または付着末端を有するDNA断片F1を生じることができる少なくとも1種の制限酵素E1を用いて第一の二本鎖DNA断片F1を作製し、
b)工程a)で得られたDNA断片F1の末端に少なくとも1種の第一の二本鎖アダプタを、該アダプタの3'末端と該DNA断片F1の5'末端との接続部で、次工程で使用されるタイプIIS制限酵素E2の認識部位の5'末端の最初の1以上の塩基対からなるが該認識部位の全体ではない配列であって、制限酵素E1の認識部位の3'末端の最初の1以上の塩基対をその3'末端に含有する配列が形成されるようにライゲーションして、DNA断片F'1を得、
c)制限酵素E2の認識部位の3'末端の最初の1以上の塩基対の配列であって、前記5'末端の最初の1以上の塩基対と共に制限酵素E2の認識部位全体を形成できる配列をその5'末端に含有するDNA断片F1と第一の二本鎖アダプタとから形成されるDNA断片F'1を、制限酵素E2を用いて選択的に切断して、短いDNA断片F2のフラクションを得、
d)該短いDNA断片F2のフラクションをいずれの適切な手段により精製すること
からなることを特徴とする分析されるべき核酸の試料からDNA断片を作製する方法。 - 以下の工程:
e)工程d)で得られた短いDNA断片F2の第一の二本鎖アダプタに連結していない末端を少なくとも一種の第二の二本鎖アダプタにライゲーションすることにより断片F'2を生成し、
f)第一および第二のアダプタに連結された短いDNA断片F'2を、少なくとも1対の適切なプライマを用いて、工程d)で得られた短いDNA断片F2のフラクションから短いDNA断片F'2の少なくとも1の部分集合を得るように増幅すること
により短いDNA断片F2のフラクションから断片の1以上の部分集合を選択することを更に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 工程a)が:
− 少なくとも一方の制限酵素が付着末端をつくり、ただし、両方の制限酵素が付着末端をつくる場合は互いに異なる付着末端をつくり、かつ
− 一方の制限酵素が、その認識部位の3'末端の最初の1以上の塩基対が工程b)で規定される配列の3'末端に相当する認識部位を有する
2つの異なる制限酵素E1を用いて行なわれることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。 - 2つの異なる制限酵素の一方が頻繁に切断する制限酵素であり、他方が希に切断する制限酵素であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- − 頻繁に切断する制限酵素が、その認識部位の3'末端が工程b)で規定される配列の3'末端に相当し、工程b)において第一の二本鎖アダプタに結合する断片F1の少なくとも一方の末端をつくる制限酵素であり、かつ
− 希に切断する制限酵素が、工程b)において第一の二本鎖アダプタとは異なる第三の二本鎖アダプタに結合する断片F1の少なくとも一方の末端をつくる制限酵素である
ことを特徴とする請求項4に記載の方法。 - ライゲーション工程b)に先立って、1000 bp未満の断片を精製することからなる付加的な工程を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)で規定される第一の二本鎖アダプタが、センス鎖の3'末端またはアンチセンス鎖の5'末端に、1〜8塩基の領域1を含み、該領域1が制限酵素E1で生成されるDNA断片F1の粘着末端に相補的であり、該領域1が、工程a)で得られた前記DNA断片F1の末端への前記第一の二本鎖アダプタのライゲーションにより工程b)で規定される配列が形成されるように選択されることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)で規定される第一の二本鎖アダプタが、センス鎖に関して領域1の5'側に、少なくとも6塩基対の領域2を含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 工程b)で規定される第一の二本鎖アダプタが領域1と領域2との間に位置する少なくとも1の塩基を含み、該塩基が、制限酵素E1の認識部位中で領域1に相当する相補配列に隣接する塩基とは異なることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 工程a)およびb)が同時に行われることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 工程b)で規定される第一の二本鎖アダプタが、アンチセンス鎖の5'末端に共有結合しているリン酸残基を含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法が工程a)〜d)による短い断片の第一の選択からなる場合に、標識されていてもいなくてもよい適切なプライマ対を用いて、工程b)と工程c)との間に断片F'1を増幅し、および/または工程c)と工程d)との間に断片F2を増幅することからなる少なくとも1の付加的な工程を含むことを特徴とする請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 工程b)で規定される第一の二本鎖アダプタが、そのセンス鎖の5'末端で、適切な標識、特に核酸ハイブリッドを検出するための標識または機能化された固体支持体に接着し得る標識に連結されていることを特徴とする請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
- 第三の二本鎖アダプタのアンチセンス鎖の5'末端が、機能化された固体支持体に接着し得る標識に連結されていることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 工程b)で得られる断片F'1または請求項12で規定される付加的な工程で得られる断片F'1の増幅産物を、切断工程c)に先立って機能化された支持体と接触させ、そして工程d)の短い断片F2のフラクションが、工程b)で規定される第一の二本鎖アダプタが前記支持体に接着する標識に連結されている場合には該支持体に保持されている断片のフラクションに相当し、第三の二本鎖アダプタが前記支持体に接着する標識に連結されている場合には遊離している断片のフラクションに相当することを特徴とする請求項13又は14に記載の方法。
- 工程e)がいくつかの異なる第二の二本鎖アダプタのライゲーションを含み、各アダプタが、センス鎖の5'末端またはアンチセンス鎖の3'末端に、1〜10塩基の特異的配列を含むことを特徴とする請求項2〜11および13〜15のいずれか1つに記載の方法。
- 工程e)で規定される第二の二本鎖アダプタが、センス鎖の5'末端に共有結合しているリン酸残基を含むことを特徴とする請求項2〜11および13〜16のいずれか1つに記載の方法。
- 工程f)で規定されるプライマの1つが、その5'末端において適切な標識に結合している請求項2〜11および13〜17のいずれか1つに記載の方法。
- いずれの適切な手段により、工程d)で得られた短い断片F2、請求項12で規定される付加的な工程で得られた短い断片F2の増幅産物または工程f)で得られた短い断片F'2からの一本鎖断片を得ることからなる付加的な工程を含むことを特徴とする請求項1〜18のいずれか1つに記載の方法。
- いずれの適切な手段により、工程f)もしくは請求項12で規定される付加的な工程で得られた増幅産物または請求項19で規定される付加的な工程で得られた一本鎖断片を精製することからなる付加的な工程を含むことを特徴とする請求項2〜19のいずれか1つに記載の方法。
- 請求項1〜20のいずれか1つに記載の方法により得ることができる、遺伝マーカーを表す短いDNA断片であって、該短いDNA断片はゲノム配列またはcDNA配列の断片からなる特異配列を含む100より少ない塩基または塩基対の配列を有し、該特異配列の5'末端は、タイプIIS制限酵素E2の認識部位の3'末端の最初の1以上の塩基対からなるが該認識部位の全体ではない配列と同一であり、3'末端は、制限酵素E2の切断部位の5'末端側の配列と同一であり、該特異配列の各末端に少なくとも6塩基または6塩基対の非特異的配列を含むことを特徴とする短いDNA断片。
- 一本鎖断片であることを特徴とする請求項21に記載のDNA断片。
- その5'末端の1つで適切な標識に連結されていることを特徴とする請求項21または22に記載のDNA断片。
- 請求項21〜23のいずれか1つに記載のDNA断片を含むことを特徴とするDNAチップ。
- 請求項21〜23のいずれか1つに記載のDNA断片の遺伝マーカーとしての使用。
- 請求項1〜20のいずれか1つに記載の方法の工程d)もしくはf)または請求項12もしくは19に記載の方法の付加的な工程で規定されるDNA断片の混合物の遺伝マーカーとしての使用。
- 請求項21〜23のいずれか1つに記載のDNA断片または請求項24に記載のDNAチップを用いることを特徴とする核酸のハイブリダイズ方法。
- 請求項21〜23のいずれか1つに記載の少なくとも1のDNA断片または請求項24に記載のDNAチップを含むことを特徴とするハイブリダイゼーション方法を行うためのキット。
- 前記DNA断片に相補的なオリゴヌクレオチドプローブも含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 請求項7〜9および11のいずれか1つで規定される少なくとも1つの第一の二本鎖アダプタと、請求項1で規定される制限酵素E2とを含むことを特徴とする請求項1〜20のいずれか1つに記載の方法を行うためのキット。
- 請求項2、16または17で規定される少なくとも1つの第二の二本鎖アダプタおよび請求項2または18で規定されるプライマ対も含むことを特徴とする請求項30に記載のキット。
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