CN111560458A - 快速高效鉴别水稻光敏色素基因phyb的分子标记引物及应用 - Google Patents

快速高效鉴别水稻光敏色素基因phyb的分子标记引物及应用 Download PDF

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和亚男
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Abstract

本发明公开了一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物及应用。针对敏色素基因PHYB野生型和突变体的基因序列所存在的特异性差异位点，本发明设计了如Seq No.3‑5所示的分子标记引物PHYB‑Allele1/Allele2/Common，利用该引物进行PCR扩增和荧光信号扫描：红色点图为PHYB突变型，蓝色为野生型，绿色为杂合体型。本发明的分子标记具有快速省时(省去电泳试验检测)，健康环保(避免有毒试剂溴化乙锭使用)，精准(避免电泳检测观察误差)的优势，为后续分子育种筛选提供有力工具。

Description

快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物及应用
技术领域
本发明涉及一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变型的分子标记引物及应用，属于植物生物技术领域。
背景技术
高等植物利用光敏色素(phytochromes)、隐花色素(cryptochromes)和向光素(phototropins)等光受体，感受其生长环境中光质、光强、光周期等条件的变化，调节自身的生长发育，以最大限度适应周围环境。其中，光敏色素主要感受红光(red light,R)和远红光(far-red light,FR)。水稻中光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB和PHYC。其中PHYB基因位于水稻的第3染色体短臂，为单拷贝。Takano等(2005)通过伽马射线诱导突变筛选得到了多个phyB突变体，分别命名为phyB1～phyB5。其中phyB1突变体在PHYB基因内部1644bp处***一个碱基C，从而引起翻译提前终止(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)。通过分析水稻光敏色素突变体的光形态建成特征，发现phyB在水稻生长发育和胁迫反应中具有重要作用。phyB突变体无论是长日照条件还是短日照条件下，开花期均明显提前(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)；其干旱胁迫耐性也明显增强(Liu等，2012，PlantMol Biol.,78(3):289-300)；而且对于稻瘟病具有一定的抗性(Xie等，2011，Mol.Plant 4(4):688-696)。
将PHYB的突变体基因型导入水稻优良受体材料，提高水稻品种的花期、耐旱及抗病性，将具有广阔的应用前景。分子标记是一段能反映种间基因组差异的特异性DNA片段。利用分子标记辅助选择，是一种简易操作、成本低廉的检测技术。Takano(2005)等开发了一种鉴定phyB1突变体的分子标记，但该标记扩增片段较大(1Kb)，GC含量较高，要用高GC的PCRbuffer进行扩增，而且PCR扩增时间较长，且用于酶切的限制性内切酶NlaIV属于罕见的限制性内切酶，购买困难，且价格昂贵(3.49元/U，NEB北京)，提高了鉴定成本，不适用于大规模的鉴定；经常出现没有库存、断货等现象，严重影响鉴定工作顺利进行。申请人于2016年开发了一种鉴定phyB突变体的分子标记(CN106282345B)，但该技术必须通过琼脂糖电泳试验进行鉴定区分，试验时间过长且存在有毒试剂操作，无法完全避免电泳条带读取误差。
发明内容
本发明的目的在于针对敏色素基因PHYB野生型和突变体的基因序列所存在的特异性差异位点，提供一种快速省时(省去电泳试验检测)，健康环保(避免有毒试剂溴化乙锭使用)，精准(避免电泳检测观察误差)的PARMS分子标记引物及应用。
本发明的技术方案是：一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物，具体为：
上游引物PHYB-Allele1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCAGCATCATGGACCC-3’(Seq No.3)；
下游引物PHYB-Allele2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCAGCATCATGGACCT-3’(Seq No.4)；
通用引物PHYB-common：
5’-AGAGGGTAGTACTTCCCATGGTAA-3’(Seq No.5)。
上述分子标记引物可用于水稻PHYB突变基因导入系的世代群体分离筛选检测(如BC3F2群体)，也可用于鉴定水稻材料的PHYB基因型是否为野生型、突变型及杂合型。
本发明还公开了应用上述引物鉴定水稻光敏色素基因PHYB野生型、突变型及杂合型(或者水稻PHYB突变基因导入系的世代群体分离筛选检测)的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)利用上游引物PHYB-Allele1、下游引物PHYB-Allele2及通用引物PHYB-common对水稻基因组DNA进行PCR扩增；
(2)然后将PCR扩增产物转移至荧光扫描酶标仪(HEX、FAM和ROX三通道)检测荧光信号强度，最后将信号值采用SNP decoder软件分析，并用散点图格式输出，对产物进行基因分型；
(3)在散点图中，红色信号为突变型，蓝色信号为野生型，绿色信号为杂合体型。
本发明还提供另一种检测方法，具体为：利用上游引物PHYB-Allele1、下游引物PHYB-Allele2及通用引物PHYB-common，以QuantStudio 5荧光定量PCR仪，Genotyping模采集FAM和HEX荧光信号值并自动基因分型。
步骤(1)中所述的PCR扩增体系利用2×PARMS master Mix进行扩增，优选体系为10μL体系。本试验采用景肽生物公司的2×PARMS Pro PCR Mix(10μL)，反应体系如下：2×PARMSPro PCR Mix(包含2条通用荧光引物)：5μL，10mmol/L Allele1引物：0.15μL，10mmol/LAllele2引物：0.15μL，通用引物common：0.4μL；模板DNA：0.5μL；ddH2O：3.8μL。
步骤(1)所述的PCR扩增并扫描的反应程序优选为：94℃激活15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28～30个循环；25℃延伸1min；25℃荧光扫描，30s。
本发明相对于现有的技术具有如下的优点及效果：
(1)开发了一种用于区分水稻光敏色素基因PHYB的突变基因型和野生型的分子标记引物PHYB-Allele1/Allele2/Common，从而对PHYB等位基因型进行精准、快速、高效地鉴定，为后续培育优良水稻新品系提供有力的工具。
(2)与已有标记相比，本标记更加快速省时，省去了跑琼脂糖电泳试验的时间和精力，在PCR扩增程序结束后只需30秒荧光扫描即可出结果；以往通过电泳条带区分基因型的方式，对电泳结果要求高，难免会出现条带读取误差。本标记通过荧光信号方式呈现结果，一目了然，精准度提高。
附图说明
图1水稻PHYB野生基因型和突变基因型部分序列差异位点比对结果；
图2利用本标记引物PHYB-Allele1/Allele2/Common，利用2×PARMS Pro PCR Mix(10μL)进行PCR扩增的结果；其中红色图像为PHYB突变基因型单株；蓝色图像为日本晴野生型单株；绿色图像为杂合体基因型；
图3散点图对应的PCR加样板上的样品位置。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记的建立
(1)引物设计
phyB1突变体在PHYB基因内部1644bp处***一个碱基C，从而引起翻译提前终止(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)。在突变位点前后选取175bp序列进行比对(图1)，该位点具有phyB1突变体的基因型的特异性和代表性，可作为分子标记开发位点。
与PHYB野生型位点检测相关的核苷酸序列如下所示(Seq No.1)：
CACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGT ACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGT；
与PHYB突变型位点检测相关的核苷酸序列如下所示(Seq No.2)：
CACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAG TACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGT。
根据序列差异，利用SNPway(http://www.snpway.com)在线设计引物，引物序列如下：
上游引物PHYB-Allele1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCAGCATCATGGACCC-3’(Seq No.3)；
下游引物PHYB-Allele2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCAGCATCATGGACCT-3’(Seq No.4)；
通用引物PHYB-common：
5’-AGAGGGTAGTACTTCCCATGGTAA-3’(Seq No.5)。
(2)扩增片段理论分析
水稻PHYB突变型和野生型基因组分别能扩增出带有FAM和HEX荧光标记的片段，长度为69bp；荧光扫描处理图像后，突变型和野生型样品分别显示红色和蓝色图像，杂合体基因型显示绿色。
实施例2：利用SKC1-Allele分子标记分析淮稻5、phyB1突变体及以淮稻5为轮回亲本携带phyB1的BC3F2分离群体的基因型
(1)水稻叶片基因组DNA的提取
试验材料包括淮稻5(编号A1)、phyB1突变体(编号A2)及以46株BC3F2分离群体(编号A3-12，B1-12，C1-C12，D1-D12)
选取水稻单株的幼嫩叶片，采用SDS法提取水稻的基因组DNA，具体步骤如下：
①取适量叶片置于2mL离心管中，加入DNA提取液300μL，加入钢珠一枚，用组织破碎研磨仪震荡30s左右；
②将离心管置于65℃水浴30min，期间上下颠倒混匀2-3次；
③静置至室温，加入等体积的氯仿，上下剧烈摇动，充分混匀；
④12000rpm离心10min，吸上清约200μL到新的灭菌的1.5mL离心管中；
⑤加入等体积的预冷的异丙醇上下颠倒混匀，-20℃放置30min左右，使DNA充分沉淀；
⑥12000rpm离心10min，倒掉上清，加入500μL 75％乙醇漂洗一次；
⑦12000rpm瞬间离心，倒掉上清后将离心管倒置在纸巾上，静置2min；
⑧通风厨内干燥DNA后加入适量1×TE buffer溶解DNA；
⑨置于-20℃保存，备用。
(2)利用分子标记SKC1-Allele分析淮稻5、phyB1突变体及BC3F2分离群体的基因型
利用鉴定引物PHYB-Allele1(Seq No.3)/PHYB-Allele2(Seq No.4)及PHYB-common(Seq No.5)进行PCR扩增和荧光扫描。利用普通PCR仪进行常规扩增，然后将产物转移至荧光扫描酶标仪(HEX、FAM和ROX三通道)检测荧光信号强度，最后将信号值用SNPdecoder软件上分析，并用散点图格式输出，对产物进行基因分型。
本试验采用景肽生物公司的2×PARMS Pro PCR Mix(10μL)，反应体系如下：2×PARMSPro PCR Mix(包含2条通用荧光引物)：5μL，10mmol/L Allele1引物：0.15μL，10mmol/LAllele2引物：0.15μL，通用引物common：0.4μL；模板DNA：0.5μL；ddH2O：3.8μL。
10μL 2×PARMS master Mix体系为：94℃激活15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28～30个循环；25℃延伸1min；25℃荧光扫描，30s。
(3)基因型判定
荧光扫描处理图像后，红色点图为PHYB突变型，蓝色为野生型，绿色为杂合体型(图2)。上述的基因型散点图像结果与对应的材料基因型一致(图3)，与预期结果一致。证明开发的标记能够快速有效的区分PHYB的基因型。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省水稻研究所
<120> 快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物及应用
<130> 0
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 99
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 与PHYB野生型位点检测相关的核苷酸序列
<400> 1
cacacaaagc cccagcatca tggaccttgt gaagtgtgat ggtgctgctc tgtattacca 60
tgggaagtac taccctcttg gtgtcactcc cacagaagt 99
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 与PHYB突变型位点检测相关的核苷酸序列
<400> 2
cacacaaagc cccagcatca tggacccttg tgaagtgtga tggtgctgct ctgtattacc 60
atgggaagta ctaccctctt ggtgtcactc ccacagaagt 100
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 上游引物PHYB-Allele1
<400> 3
gaaggtgacc aagttcatgc tccccagcat catggaccc 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 下游引物PHYB-Allele2
<400> 4
gaaggtcgga gtcaacggat tccccagcat catggacct 39
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 通用引物PHYB-common
<400> 5
agagggtagt acttcccatg gtaa 24

Claims (7)

1.一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物，具体为：
上游引物PHYB-Allele1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCAGCATCATGGACCC-3’；
下游引物PHYB-Allele2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCAGCATCATGGACCT-3’；
通用引物PHYB-common：
5’-AGAGGGTAGTACTTCCCATGGTAA-3’。
2.权利要求1所述的分子标记引物在鉴定水稻材料的PHYB基因型为野生型、突变型及杂合型中的应用。
3.权利要求1所述的分子标记引物在用于水稻PHYB突变基因导入系的世代群体分离筛选检测中的应用。
4.一种鉴定水稻PHYB基因型野生型、突变型及杂合型的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)利用权利要求1所述的上游引物PHYB-Allele1、下游引物PHYB-Allele2及通用引物PHYB-common对水稻基因组DNA进行PCR扩增；
(2)然后将PCR扩增产物转移至荧光扫描酶标仪，HEX、FAM和ROX三通道，检测荧光信号强度，最后将信号值采用SNP decoder软件分析，并用散点图格式输出，对产物进行基因分型；
(3)在散点图中，红色信号为突变型，蓝色信号为野生型，绿色信号为杂合体型。
5.如权利要求4所述的鉴定水稻PHYB基因型野生型、突变型及杂合型的方法，其特征是，所述PCR扩增采用的反应体系为：包含2条通用荧光引物的2×PARMS Pro PCR Mix：5μL，10mmol/L Allele1引物：0.15μL，10mmol/L Allele2引物：0.15μL，通用引物common：0.4μL；模板DNA：0.5μL；ddH2O：3.8μL。
6.如权利要求4或5所述的鉴定水稻PHYB基因型野生型、突变型及杂合型的方法，其特征是，所述PCR扩增并扫描的反应程序为：94℃激活15min；94℃变性20s，65℃退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28～30个循环；25℃延伸1min；25℃荧光扫描，30s。
7.一种鉴定水稻PHYB基因型野生型、突变型及杂合型的方法，其特征是，利用如权利要求1所述的上游引物PHYB-Allele1、下游引物PHYB-Allele2及通用引物PHYB-common，以QuantStudio 5荧光定量PCR仪进行PCR扩增，Genotyping模采集FAM和HEX荧光信号值并自动基因分型。
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