CN112410459A - 一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记及其应用，属于农业生物技术领域。本发明根据Pi25基因编码区的775bp和2687bp处目的基因关键特异性位点设计两对引物Pi25‑K775和Pi25‑K2680/2687，以水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后对扩增产物进行信号扫描分析，目的基因进行基因分型。本发明利用基于KASP反应原理及抗感材料Pi25基因编码区内的单碱基差异设计的KASP标记能高通量的对水稻材料进行Pi25基因检测，两对KASP分子标记能相互验证，避免实验过程中的误差，达到更高的准确率。具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点，适用于Pi25基因的鉴定分型和抗水稻稻瘟病品种的辅助选择育种。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记及其应用。
背景技术
稻瘟病是目前水稻生产上最具毁灭性的真菌性病害之一，在世界种植水稻的各稻区均有分布并持续发生，严重影响水稻产量，给粮食的安全带来了极大的隐患。实践表明，培育和推广抗稻瘟病品种是防治稻瘟病最为经济、有效、安全和环保的措施。
传统的水稻抗病育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助选择育种简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率。目前文献报道中主要利用的标记类型为CAPS标记(王慧梅等，作物学报，38(11):1960-1968)，连锁标记(RM3330，SA7和Si1370C)(朱玉君等，福建稻麦科技，2010，28(01)：1-3)，特异性显性标记(专利号：200910152617.4)，和特异性共显性标记(申请号：201610014679.9)。在实践应用中，CAPS标记需要酶切，过程繁琐；连锁标记存在多态率较低，差异较小的缺点，特异性标记限制条件较多，扩增不稳定，以上标记在检测过程中使用的EB或聚炳烯酰胺易对环境造成污染、对人体产生危害。
竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele specific PCR KASP)分子标记是一种基于SNP的新型基因分型技术。KASP技术具有稳定性好和准确性高、高通量，检测成本较低等优点，近年来得到快速的发展(He et al，Methods Mol Biol，2014，1145，75-86)。Pi25基因源自籼稻品种谷梅2号，是克隆的24个稻瘟病抗性基因之一，对稻瘟病具有广谱抗性，对于培育具有抗稻瘟病水稻品种具有很大的利用价值(Chen et al，J GenetGenomics,38:209-216)。开发与抗稻瘟病基因Pi25共分离的特异性分子标记及建立高效、环境友好的相关检测体系，则对促进Pi25基因在抗稻瘟病育种中的应用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点，而且本发明的两对KASP分子标记能相互验证，避免实验过程中的误差，达到更高的准确率，可应用于筛选、鉴定或培育抗水稻稻瘟病品种中。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两段核苷酸序列。
本发明还提供了一种扩增上述分子标记的引物组，包括Pi25-K775引物组和Pi25-K2680/2687引物组；
所述Pi25-K775引物组为：
Pi25-K775-F1：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAG-3’、
Pi25-K775-F2：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAA-3’、
Pi25-K775-Common primer：5’-TTCGACCAAGCCTCTGTAATTTGTGA-3’，
所述Pi25-K2680/2687引物组为：
Pi25-K2680/2687-F1：5’-GTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCC-3’、
Pi25-K2680/2687-F2：5’-CGTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCT-3’、
Pi25-K2680/2687-Common primer：
5’-TCATACAGCAGAAGAGCTTGTGGAT-3’。
优选的，所述引物Pi25-K775-F1和Pi25-K2680/2687-F1的5’端添加有FAM荧光标签序列，所述Pi25-K775-F2和Pi25-K2680/2687-F2的5’端添加有HEX荧光标签序列。
本发明还提供了一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记方法，包括以下步骤：(1)提取待测水稻基因组DNA；(2)利用上述两组引物以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行荧光扫描；(4)分析等位基因分型结果。
优选的，所述步骤(2)中PCR扩增的反应体系按体积份数计包括2×KASP Mastermix 5份、KASP Primer mix 0.14份、模板DNA 1份、ddH2O 3.86份组成，其中模板DNA的浓度为20ng/μL；
所述步骤(2)中PCR扩增的反应程序为：阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃变性20s，65℃～57℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.8℃；阶段3：94℃变性20s，57℃退火延伸60s，26个循环。
优选的，所述KASP Primer mix由上述Pi25-K775引物组或Pi25-K2680/2687引物组组成，其中Pi25-K775-F1、Pi25-K775-F2和Pi25-K775-Common primer的用量比例为1:1:2.5，Pi25-K2680/2687-F1、Pi25-K2680/2687-F2和Pi25-K2680/2687-Common primer的用量比例为1:1:2.5。
优选的，所述步骤(4)具体为：
若同时检测到Pi25-K775-FAM对应的碱基G和Pi25-K2680/2687-FAM对应的碱基G，则判断待测水稻含有纯和的Pi25基因；
若只检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A，或只检测到Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，或同时检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A和Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，则判断待测水稻不含有Pi25基因；
若同时检测到碱基G和A，则判断待测水稻含有杂合的Pi25基因。
本发明还提供了一种上述分子标记或上述扩增引物组在抗水稻稻瘟病品种筛选、鉴定或培育中的应用。
本发明还提供了一种检测抗稻瘟病基因Pi25的试剂盒，包括扩增上述KASP分子标记的引物或者包括上述扩增引物组。
本发明还提供了一种上述试剂盒在筛选、鉴定或培育抗水稻稻瘟病品种中的应用。
本发明有益效果：
本发明基于KASP反应原理及抗感材料Pi25基因编码区内的单碱基差异设计的KASP分子标记能高通量的对水稻材料进行Pi25基因检测，两对KASP分子标记能相互验证，避免实验过程中的误差，达到更高的准确率。
本发明基于KASP的基因分型方法，通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。克服了现有检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点，本发明检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醛对人体的危害，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点。本发明提供的两个KASP分子标记可应用于Pi25基因的鉴定及抗水稻稻瘟病品种的筛选、鉴定或培育中，可以大大节约时间和人工成本，提高筛选、鉴定或育种效率。
附图说明
图1为KASP分子标记Pi25-K775或Pi25-K2680/2687在遗传分离群体中的分型结果。
具体实施方式
本发明提供了一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两段核苷酸序列。
本发明所述两个检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记的开发过程如下：来自籼稻品种谷梅2号的Pi25基因已经被克隆，位于水稻第6染色体，全长2775bp，编码924个氨基酸，基因登录号为HM448480。对谷梅2号与5个常用测序品种公布的基因组(日本晴，9311，蜀恢498，珍汕97，明恢63)Pi25序列进行比对，发现谷梅2号与上述5个品种具有共同变异的核苷酸位点有11个(g130c,t144g,g775a,t1197c,t1713g,g1729a,a1874t,t2444a,c2566g,g2680a,g2687a)，其中2个(t144g,t1197c)是无义突变，9个变异造成了氨基酸的替换。虽然Pi25基因已经克隆，但是其致病机制仍然不清楚，无法判断哪一个SNP变异造成功能的改变；不同品种Pi25基因核苷酸变异很多，需要找到不同品种间的共同的变异位点比较困难，利用SNP位点设计的特异性标记在不同品种间要有通用性，且在分离群体中可通过表型验证。因此，针对上述9个变异位点设计KASP分子标记，对含有Pi25基因供体材料谷梅2号和恢12-33、其他抗稻瘟病供体材料、感病对照材料以及不含Pi25基因的多个节水抗旱稻亲本进行KASP反应验证，挑选出能特异区分Pi25基因供体材料及扩增效果好的2个KASP标记。本发明所述检测水稻抗稻瘟病基因Pi25的两个KASP分子标记的检测碱基位于水稻第6染色体第13057243和第13055341位(MSU7.0基因组版本)，分别位于Pi25基因编码区的775bp和2687bp处，根据该两个检测碱基位点分别确定了两段核苷酸序列作为KASP分子标记，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。通过旱恢3号/谷梅2号的96株BC2F2分离群体进行了表型验证，证明了本发明的可行性和准确性。
在本发明中，提供了两组能够特异性的扩增上述两个KASP分子标记的引物组，分别为Pi25-K775引物组和Pi25-K2680/2687引物组，其中Pi25-K775引物组可扩增获得SEQID NO.1所示核苷酸序列，包括三条引物，分别为：
Pi25-K775-F1：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAG-3’、
Pi25-K775-F2：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAA-3’、
Pi25-K775-Commonprimer：5’-TTCGACCAAGCCTCTGTAATTTGTGA-3’；
其中Pi25-K2680/2687引物组可扩增获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，包括三条引物，分别为：
Pi25-K2680/2687-F1：5’-GTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCC-3’、
Pi25-K2680/2687-F2：5’-CGTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCT-3’、
Pi25-K2680/2687-Common primer：
5’-TCATACAGCAGAAGAGCTTGTGGAT-3’。更优选的，本发明中还在引物Pi25-K775-F1和Pi25-K2680/2687-F1的5’端添加FAM荧光标签序列，在Pi25-K775-F2和Pi25-K2680/2687-F2的5’端添加有HEX荧光标签序列，其中FAM荧光标签序列优选为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，HEX荧光标签序列优选为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，即，本发明所述扩增获得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的Pi25-K775引物组中三条引物序列分别为Pi25-K775-FAM：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAG-3’，Pi25-K775-HEX：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAA-3’，Pi25-K775-Commonprimer：
5’-TTCGACCAAGCCTCTGTAATTTGTGA-3’；本发明所述扩增获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的Pi25-K2680/2687引物组中三条引物序列分别为Pi25-K2680/2687-FAM：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCC-3’，Pi25-K2680/2687-HEX：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCT-3’，Pi25-K2680/2687-Common primer：
5’-TCATACAGCAGAAGAGCTTGTGGAT-3’。
本发明提供了一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记方法，包括以下步骤：(1)提取待测水稻基因组DNA；(2)利用上述两组引物以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行荧光扫描；(4)分析等位基因分型结果。
在本发明中对于提取待测水稻基因组DNA的方法没有特殊限定，采用本领域常规提取基因组DNA的方法均可。在本发明中，利用上述两组引物以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增时，PCR扩增的反应体系按体积份数计优选的包括2×KASP Master mix 5份、KASPPrimer mix 0.14份、模板DNA 1份、ddH2O 3.86份组成，其中模板DNA的浓度为20ng/μL；PCR扩增的反应程序优选的为：阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃变性20s，65℃～57℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.8℃；阶段3：94℃变性20s，57℃退火延伸60s，26个循环。在本发明中，上述KASP Primer mix由Pi25-K775引物组或Pi25-K2680/2687引物组组成，其中Pi25-K775-F1、Pi25-K775-F2和Pi25-K775-Common primer的用量比例优选为1:1:2.5，其中Pi25-K2680/2687-F1、Pi25-K2680/2687-F2和Pi25-K2680/2687-Common primer的用量比例优选为1:1:2.5。
本发明对PCR扩增产物进行荧光扫描时，对于荧光扫描的仪器软件等没有特殊限定，采用本领域常规KASP标记分型软件、仪器均可，在本发明优选的实施例中，使用的为从LGC公司采购的Douglas***配套的软件和SNPline配套的软件。本发明对于分析等位基因分型结果的方式没有特殊限定，依据本领域技术人员添加的荧光标签以及SNP分型软件的种类而定，优选的为若同时检测到Pi25-K775-FAM对应的碱基G和Pi25-K2680/2687-FAM对应的碱基G，则判断待测水稻含有纯和的Pi25基因；若只检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A，或只检测到Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，或同时检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A和Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，则判断待测水稻不含有Pi25基因；若同时检测到碱基G和A，则判断待测水稻含有杂合的Pi25基因。
本发明还提供了一种上述分子标记或上述扩增引物组在抗水稻稻瘟病品种筛选、鉴定或培育中的应用。
本发明还提供了一种检测抗稻瘟病基因Pi25的试剂盒，包括扩增上述KASP分子标记的引物或者包括上述扩增引物组。
本发明对于检测抗稻瘟病基因Pi25的试剂盒中的其他组成成分没有特殊限定，即包含本领域技术人员公知的检测抗稻瘟病基因Pi25时会用到的其他组分，比如DNA提取液，PCR反应液，标准阳性模板，阴性质控标准品等。
本发明还提供了一种上述试剂盒在筛选、鉴定或培育抗水稻稻瘟病品种中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
CTAB法提取谷梅2号和恢12-33、其他抗稻瘟病供体材料以及不含Pi25基因的38个节水抗旱稻亲本(共45个亲本)全基因组DNA；
对上述亲本全基因组DNA均进行KASP反应(以下1)与2)不存在先后关系，没有顺序限定)：
1)利用Pi25-K775引物组以上述45个亲本的全基因组DNA为模板，在ABI 7500real-time PCR system上进行PCR扩增。
PCR反应体系总体积为10μL，其中2×KASP Master mix 5μL，KASP Primer mix0.14μL(其中Pi25-K775-FAM、Pi25-K775-HEX和Pi25-K775-Common primer的用量比例为1:1:2.5)，模板DNA 1μL(20ng/μL)，ddH2O 3.86μL。
PCR反应程序为94℃预变性15min；94℃变性20s；65℃～57℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.8℃)；94℃变性20s；57℃退火延伸60s，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。
2)利用Pi25-K2680/2687引物组以上述45个亲本的全基因组DNA为模板，在ABI7500 real-time PCR system上进行PCR扩增。PCR扩增体系和反应程序与1)相同，KASPPrimer mix中Pi25-K2680/2687-FAM、Pi25-K2680/2687-HEX和Pi25-K2680/2687-Commonprimer的用量比例也为1:1:2.5。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。
分析等位基因分型结果：
如果1)的荧光扫描结果显示红色，则表示1)中检测到Pi25-K775-FAM对应的碱基G，2)的荧光扫描结果也显示红色，则表示2)中检测到Pi25-K2680/2687-FAM对应的碱基G，则判断待测水稻含有纯和的Pi25基因；
如果1)的荧光扫描结果显示蓝色，2)没有出现荧光，则表示只检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A，如果1)没有出现荧光，2)的荧光扫描结果显示蓝色，则表示只检测到Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，如果1)和2)的荧光扫描结果均显示蓝色，则表示1)中检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A和2)中检测到Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，无论属于上述三种情况的哪种，则判断待测水稻不含有Pi25基因；
如果如果1)的荧光扫描结果显示紫色，则表示同时检测到碱基G和碱基A，2)中显示了与1)中同样的结果即也为紫色，则判断待测水稻含有杂合的Pi25基因。
上述38个节水抗旱稻亲本检测结果如表1所示：
表1：两个KASP分子标记的分型结果
由表1可以看出，含Pi25基因的水稻品种在Pi25-K775和Pi25-K2680/2687测试位点同时检测到碱基G，其他抗稻瘟病基因供体材料、感病对照材料和38份不含Pi25基因的节水抗旱稻亲本在两个测试位点均检测出碱基A，表明本发明所述两个KASP分子标记准确性高、特异性强。
实施例2
水稻抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记的应用
1、自然群体基因型鉴定
针对本发明所述的分子标记设计利用KASP反应可高通量的对水稻种质资源进行抗稻瘟病Pi25基因型鉴定的优势，利用本发明所述的两对KASP分子标记对本单位保存的270水稻微核心种质资源群体(Wu et al.BMC plant biology,2015,15(1):218)的DNA进行了基因型分析，结果发现有4份地方品种存在Pi25抗性纯和等位基因(HONGWAN 1，SHUIYUAN300LI，SANBAILI，NANXIONGZAOYOU)，这4份材料可以作为Pi25基因供体亲本应用到标记辅助育种中。
2、遗传分离群体基因型鉴定
利用本发明所述的两对KASP分子标记对由旱恢3号/谷梅2号构建的BC2F2分离群体中的92个单株进行了基因型检测。KASP分子标记检测方法的具体步骤同实施例1.
KASP标记检测结果如图1所示。Pi25基因纯和材料显示红色荧光信号，Pi25基因杂合材料显示紫色荧光信号，而不含Pi25基因的材料显示蓝色荧光信号，空白对照为灰色荧光信号。而且本发明所述两个分子标记基因分型结果一致，其中一份样品DNA无扩增，具体遗传分离群体Pi25基因型和稻瘟病表型的鉴定结果如表2所示，统计发现3种基因型的分离比为23：49：19，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ2＝0.62<χ2 0.05，2＝5.99)。
表2遗传分离群体Pi25基因型和稻瘟病表型的鉴定
稻瘟病表型鉴定委托浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所进行。结果表明携带Pi25基因的72个单株(包括纯和和杂合基因型)全部表现达到中抗水平以上，而不含有Pi25基因的19个单株表现出感病水平。说明本发明所述的两对KASP分子标记能准确的对Pi25不同基因型进行鉴定，可用于Pi25基因的鉴定分型及抗稻瘟病品种的筛选、鉴定和辅助选择育种，提高育种效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市农业生物基因中心
<120> 一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgaactgc tcaagagttt cgcaagaatg atcggaagaa agacttccca gttgacgttg 60
atatcacaaa ttacagaggc ttggtcgaaa ccacccgctc t 101
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagctcact ctggatcata cagcagaaga gcttgtggat agaatccgac ggaaaaaaga 60
gcgaatgatt tgtgacgtcc agagagttta tgttgggttc a 101
Claims (10)
1.一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记，其特征在于：包括SEQ ID NO.1和SEQID NO.2两段核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述分子标记的扩增引物组，其特征在于，包括Pi25-K775引物组和Pi25-K2680/2687引物组；
所述Pi25-K775引物组为：
Pi25-K775-F1：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAG-3’、
Pi25-K775-F2：5’-AATGATCGGAAGAAAGACTTCCCAA-3’、
Pi25-K775-Commonprimer：5’-TTCGACCAAGCCTCTGTAATTTGTGA-3’，
所述Pi25-K2680/2687引物组为：
Pi25-K2680/2687-F1：5’-GTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCC-3’、
Pi25-K2680/2687-F2：5’-CGTCACAAATCATTCGCTCTTTTTTCT-3’、
Pi25-K2680/2687-Commonprimer：
5’-TCATACAGCAGAAGAGCTTGTGGAT-3’。
3.根据权利要求2所述的扩增引物组，其特征在于，所述引物Pi25-K775-F1和Pi25-K2680/2687-F1的5’端添加有FAM荧光标签序列，所述Pi25-K775-F2和Pi25-K2680/2687-F2的5’端添加有HEX荧光标签序列。
4.一种检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测水稻基因组DNA；(2)利用权利要求2-3任一项所述的两组引物以水稻基因组DNA为模板，进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行荧光扫描；(4)分析等位基因分型结果。
5.根据权利要求4所述的检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增的反应体系按体积份数计包括2×KASP Master mix 5份、KASPPrimer mix 0.14份、模板DNA 1份、ddH2O 3.86份组成，其中模板DNA的浓度为20ng/μL；
所述步骤(2)中PCR扩增的反应程序为：阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃变性20s，65℃～57℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.8℃；阶段3：94℃变性20s，57℃退火延伸60s，26个循环。
6.根据权利要求5所述的检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记方法，其特征在于：所述KASP Primer mix由权利要求1所述Pi25-K775引物组或Pi25-K2680/2687引物组组成，其中Pi25-K775-F1、Pi25-K775-F2和Pi25-K775-Common primer的用量比例为1:1:2.5，Pi25-K2680/2687-F1、Pi25-K2680/2687-F2和Pi25-K2680/2687-Common primer的用量比例为1:1:2.5。
7.根据权利要求4所述的检测抗稻瘟病基因Pi25的KASP分子标记方法，其特征在于，所述步骤(4)具体为：
若同时检测到Pi25-K775-FAM对应的碱基G和Pi25-K2680/2687-FAM对应的碱基G，则判断待测水稻含有纯和的Pi25基因；
若只检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A，或只检测到Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，或同时检测到Pi25-K775-HEX对应的碱基A和Pi25-K2680/2687-HEX对应的碱基A，则判断待测水稻不含有Pi25基因；
若同时检测到碱基G和A，则判断待测水稻含有杂合的Pi25基因。
8.权利要求1所述分子标记或权利要求2-3任一项所述扩增引物组在筛选、鉴定或培育抗水稻稻瘟病品种中的应用。
9.一种检测抗稻瘟病基因Pi25的试剂盒，其特征在于，包括扩增权利要求1所述KASP分子标记的引物或者包括权利要求2-3任一项所述扩增引物组。
10.权利要求9所述的试剂盒在筛选、鉴定或培育抗水稻稻瘟病品种中的应用。
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