CN101234122B

CN101234122B - 多聚赖氨酸的新用途

Info

Publication number: CN101234122B
Application number: CN2008101012689A
Authority: CN
Inventors: 张秀凤; 唐亚林; 向俊峰
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2008-03-03
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2028-03-03
Also published as: CN101234122A

Abstract

本发明公开了多聚赖氨酸的一种新用途。该用途是L-多聚赖氨酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或***药物中的应用，特别是在制备预防和/或治疗人肝癌和人结肠癌药物中的应用；所述的L-多聚赖氨酸，其结构如式(I)所示。抗癌活性实验结果表明L-多聚赖氨酸对癌细胞有较好的抑制作用。L-多聚赖氨酸对人肝癌细胞Bel-7402和人结肠癌细胞HCT-8的IC₅₀分别为0.76μg/ml、1.35μg/ml。实验中采用5-氟尿嘧啶为阳性对照药物，它对人肝癌细胞Bel-7402和人结肠癌细胞HCT-8的IC₅₀分别为0.62μg/ml、1.79μg/ml。L-多聚赖氨酸的抗癌活性与5-氟尿嘧啶相当。

Description

多聚赖氨酸的新用途

技术领域

本发明涉及多聚赖氨酸的新用途。

背景技术

端粒DNA是位于染色体末端并对染色体具有保护作用的富含鸟嘌呤(G)的DNA序列，它由一段双链重复区域和一段单链重复区域构成，人类和哺乳动物的重复序列单元为TTAGGG。富含G的DNA单链在阳离子的诱导下可以通过G碱基间Hoogsteen氢键形成四链体(G4)。研究表明，85～90％恶性肿瘤的发病都与端粒酶的活性有关，而DNA G4结构的形成可以有效抑制端粒酶的活性，进而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。因此，能够诱导DNA G4形成并使之稳定的化合物有望成为抗肿瘤的先导化合物，成为目前研究的热点。

大量研究表明，单链DNA(序列为TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，简称为Hum24)在Na⁺溶液中形成反平行结构G4，在K⁺溶液中形成平行和反平行共存的G4混合结构。

发明内容

本发明的目的是提供L-多聚赖氨酸的一种新用途。

本发明所提供的L-多聚赖氨酸的用途是L-多聚赖氨酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或***药物中的应用，所述L-多聚赖氨酸的结构式如下：

式(I)

所述L-多聚赖氨酸药学上可接受的盐具体可为溴盐。

所述L-多聚赖氨酸或其药学上可接受的盐，特别适合于制备预防和/或治疗人肝癌和人结肠癌药物。

所述的L-多聚赖氨酸，其分子量为15000-30000。

本发明的另一目的是提供一种预防和/或***的药物。

本发明所提供的预防和/或***的药物，它的有效成分为下述式(I)所示的L-多聚赖氨酸或其药学上可接受的盐：

式(I)

所述L-多聚赖氨酸药学上可接受的盐具体可为溴盐。

所述预防和/或***药物特别适合于制备预防和/或治疗人肝癌和人结肠癌的药物。

其中，所述药物中的L-多聚赖氨酸，其分子量为15000-30000。

所述预防和/或***药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

以L-多聚赖氨酸或其药学上可接受的盐为活性成分的抗肿瘤药物，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

用L-多聚赖氨酸或其药学上可接受的盐制备的预防和/或***药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

L-多聚赖氨酸体外抗癌活性实验结果表明多聚赖氨酸对癌细胞有较好的抑制作用。L-多聚赖氨酸对人肝癌细胞Bel-7402的IC₅₀为0.76μg/ml，对人结肠癌细胞HCT-8的IC₅₀为1.35μg/ml。实验中采用的阳性对照药物为5-氟尿嘧啶，它对人肝癌细胞Bel-7402和结肠癌细胞HCT-8的IC₅₀分别为0.62μg/ml、1.79μg/ml。L-多聚赖氨酸的抗癌活性与5-氟尿嘧啶相当。

L-多聚赖氨酸抑瘤机理实验结果表明L-多聚赖氨酸通过诱导人和哺乳动物端粒DNA形成平行G4结构来抑制肿瘤细胞生长。

附图说明

图1为人体端粒DNA Hum24在未加入L-多聚赖氨酸和加入L-多聚赖氨酸的条件下构象变化的园二色谱图：(a)Hum24；(b)加入L-多聚赖氨酸，使Hum24与L-多聚赖氨酸的摩尔比为6∶1；每个谱图的摩尔椭圆度为-6-8(mdeg)。

图2为L-多聚赖氨酸诱导单链Hum24形成平行G4结构的熔点曲线图。

具体实施方式

实施例1、MTT还原法检测L-多聚赖氨酸体外抗肿瘤活性实验

MTT法的基本原理为：四甲基偶氮唑盐[MTT，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide](购自北京化学试剂公司)是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的formazon，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解formazon后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。按照公式可计算肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD_对照-OD_实验)/OD_对照×100％，进而计算得到半数抑制浓度(IC₅₀)。

具体操作步骤如下：

1)选用对数生长期的贴壁人肝癌细胞Bel-7402与人结肠癌细胞HCT-8，用0.25％胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液配制成5000个/ml的细胞悬液，分别接种在96孔培养板中，每孔接种100μl，37℃，5％CO₂培养24h。

2)按4个质量浓度梯度设L-多聚赖氨酸组，第1-3行的第1-4列孔按浓度从低到高依次加入L-多聚赖氨酸(分子量15000-30000，Sigma)各10μl，用RPMI 1640培养液补充至每孔终体积为200μl，使每孔中L-多聚赖氨酸终浓度依次为0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml。阳性对照药5-氟尿嘧啶同样也设4个质量浓度梯度，各浓度同L-多聚赖氨酸组，第1-3行第5-8列孔按浓度从低到高依次加入5-氟尿嘧啶各10μl，用RPMI 1640培养液补充至每孔终体积为200μl，使每孔中5-氟尿嘧啶终浓度依次为0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml。第1-3行第9列孔为对照组，加入200μl RPMI 1640培养液。第1-3行第10列孔为空白组，每孔未接种细胞，只加入200ul RPMI 1640培养液。37℃，5％CO₂培养3d。

3)弃上清液，每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入200μl DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544nm处的光密度值。按照下述公式计算肿瘤细胞生长抑制率，肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD_对照-OD_实验)/OD_对照×100％(其中OD_对照、OD_实验为已经扣除OD_空白的实验数值)，通过计算求得IC₅₀值。实验结果如表1所示。实验结果表明：L-多聚赖氨酸对人肝癌细胞Bel-7402和人结肠癌细胞HCT-8的IC₅₀分别为0.76μg/ml、1.35μg/ml。实验中采用的阳性对照药物5-氟尿嘧啶，对人肝癌细胞Bel-7402和人结肠癌细胞HCT-8的IC₅₀分别为0.62ug/ml、1.79ug/ml。说明L-多聚赖氨酸的抗癌活性与5-氟尿嘧啶相当。

表1.L-多聚赖氨酸细胞毒性测试结果

样品名称	浓度(μg/ml)	人肝癌细胞株(Bel-7402)			人结肠癌细胞株(HCT-8)
		人肝癌细胞株(Bel-7402)			人结肠癌细胞株(HCT-8)			OD值(平均值)	抑制率(％)	IC<sub>50</sub>(μg/ml)	OD值(平均值)	抑制率(％)	IC<sub>50</sub>(μg/ml)
		L-多聚赖氨酸	5	0.4414	79.07	0.76	0.6055	OD值(平均值)	抑制率(％)	IC<sub>50</sub>(μg/ml)	OD值(平均值)	抑制率(％)	IC<sub>50</sub>(μg/ml)	69.75	1.35
0.5	2.2356		5	0.4414	79.07	0.76	0.6055	-5.98		1.9319	3.49			69.75	1.35
0.5	2.2356		0.05	1.9888	5.72		1.8701	-5.98		1.9319	3.49		6.57
0.005	2.0387		0.05	1.9888	5.72		1.8701	3.35		2.0061	-0.22		6.57
0.005	2.0387		5-氟脲嘧啶	5	0.3589	82.71	0.62	3.35		2.0061	-0.22		0.6451	68.39	1.79
0.5	1.2239	41.04		5	0.3589	82.71	0.62		1.8457	9.57			0.6451	68.39	1.79
0.5	1.2239	41.04		0.05	2.2089	-6.41			1.8457	9.57		2.1224	-3.98
0.005	2.0727	0.16		0.05	2.2089	-6.41			2.1373	-4.71		2.1224	-3.98
0.005	2.0727	0.16		对照		2.1094			2.1373	-4.71			2.0017

实施例2、L-多聚赖氨酸抑瘤机理

在无金属离子存在的条件下，溶液中Hum24呈单链构型存在，这种构型在园二色谱(CD)中有明显的特征：在255nm附近出现一个正峰，在238nm附近出现一个负峰。当单链Hum24溶液中加入一定浓度多聚赖氨酸时，Hum24由单链转化为一种平行的G4结构，在CD谱中有明显的特征为：在260nm附近出现一个正峰，在240nm附近出现一个负峰。

具体的实验方法如下：缓冲溶液为由如下终浓度的物质组成的水溶液：10mMTris-HCl，1mM EDTA；pH 7.4。将30OD单链Hum24(上海英俊生物技术有限公司)(其序列如序列表中序列1所示)溶解在所述缓冲溶液中得到浓度为200μM的Hum24母液。将3.8mg L-多聚赖氨酸(分子量15000-30000，Sigma)溶解在所述缓冲溶液中得到浓度为200μM L-多聚赖氨酸母液。将L-多聚赖氨酸母液用所述缓冲溶液稀释成浓度分别为0.2μM、0.25μM、0.33μM、0.4μM、0.5μM、0.7μM、1μM、2μM L-多聚赖氨酸溶液。取200μM的单链Hum24溶液分别加入上述浓度的L-多聚赖氨酸溶液，使混合溶液中单链Hum24与L-多聚赖氨酸的摩尔比分别为10∶1，8∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1。将上述混合溶液，均在25℃孵育12h，采用圆二色谱仪测定其构象的变化情况。实验结果表明单链Hum24与L-多聚赖氨酸的摩尔比对于平行G4结构的形成非常重要，只有在其摩尔比为8∶1-4∶1时才能形成平行G4结构。其中，单链Hum24与L-多聚赖氨酸摩尔比为6∶1时形成的平行G4结构的园二色谱图如图1中b所示。

将以单链Hum24与L-多聚赖氨酸摩尔比为6∶1时形成的平行G4结构通过圆二色谱变温测定实验进行熔点的测定。采用的仪器为Jasco815圆二色谱仪，CD实验中采用的CD吸收池光程为1cm。在进行CD实验前用高纯N₂除氧5分钟，而且实验中也一直用高纯N₂作为保护气以保证没有臭氧出现，CD实验数据采集前，用缓冲溶液进行基线校对。在近紫外区220nm-320nm采集CD光谱，扫描速度为500nm/min，采集次数为4次。在变温实验中采用JascoPTC-423S控温仪，升温速度为2℃/min，通过监控262nm CD信号来进行G4熔点的测定，结果如图2所示。测得平行G4结构的熔点为45℃。

说明L-多聚赖氨酸通过诱导人和哺乳动物端粒DNA形成平行G4结构来抑制肿瘤细胞的生长。

序列表

Claims

1.式(I)所示的L-多聚赖氨酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或***药物中的应用，所述多聚赖氨酸的结构式如下：

式(I)

所述L-多聚赖氨酸的分子量为15000-30000；

所述肿瘤为人肝癌或人结肠癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述L-多聚赖氨酸药学上可接受的盐为溴盐。