CN102048694B - 一种多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及药物递送***，具体涉及一种新型多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***及其制备方法。本发明针对现有肝肿瘤靶向给药***存在的不足，使用新型多肽为靶向头基，阳离子高分子材料为基础高分子载体，包载抗肿瘤药物，制成肝肿瘤靶向纳米给药***。本发明选用通过噬菌体展示技术筛选出的新型多肽修饰高分子材料，以内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对药物的摄取，并且安全。本发明具有转铁蛋白作为靶向头基的优点，并且有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和治疗效率高、制备简捷，并且可以应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及药物递送***，具体涉及一种新型多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***及其制备方法。
背景技术
对抗肿瘤药物递送的研究是近年来引人注目的热点，抗肿瘤药物不同于普通小分子药物，其毒副作用大，由于缺乏靶向性，常对机体正常器官造成非常大的损害。构建肿瘤靶向给药***，有效专一地将抗肿瘤药物运输到肿瘤部位，发挥抗肿瘤药物的疗效，同时减少全身毒副作用，降低由此引起的经济损失，是目前肿瘤治疗的瓶颈。
肝肿瘤是我国位居第二的癌症，发病率比西方国家高2-3倍，其恶性度高、病情发展快以及生存期短的特点，使得肝肿瘤的治疗迫在眉睫。肝肿瘤靶向给药***的构建主要有两种策略：被动靶向和主动靶向，目的都是靶向输送抗肿瘤药物到肿瘤组织。被动靶向主要是基于肿瘤组织部位血管特有的EPR效应，而主动靶向则是利用特定的头基修饰给药***，特异性结合肿瘤细胞表面过度表达的受体以达到靶向输送的作用。
研究显示，肝肿瘤细胞表面过度表达一系列受体，其中转铁蛋白受体被用作靶点已有较长的研究历史。但是，内源性转铁蛋白浓度很高，约为25μM，可与以转铁蛋白作为靶向头基的给药***竞争肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体，从而影响肿瘤靶向效率。近期研究公开了使用噬菌体展示技术筛选出一种新型多肽——T7肽，其序列为HAIYPRH，对转铁蛋白受体的亲和力和转铁蛋白相当；T7肽与转铁蛋白受体的结合位点与转铁蛋白不同，不会与转铁蛋白竞争抑制且不影响转铁蛋白本身的生理功能，相反转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合会促进T7肽的入胞效率；此外，T7为小分子多肽，可化学合成，稳定性好，作为靶向头基空间位阻小，临床应用前景好。
阳离子高分子材料如聚酰胺-胺树状分枝物(polyamidoamine，简称PAMAM)和聚赖氨酸(dendri-graft polylysines，简称DGL)是近年来出现的一类新型纳米级的合成高分子，高度分枝，呈单分散性，其末端氨基丰富，强正电性，并易于经过适当的修饰连接抗体等生物活性物质以增加载体的靶向性，同时内部具有大量的疏水性空腔，具有包载疏水性抗肿瘤药物的潜力，有望成为良好的药物载体。
发明内容
本发明的目的是针对现有肝肿瘤靶向给药***存在的不足，提供一种新型多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***。
本发明使用新型多肽为靶向头基，阳离子高分子材料为基础高分子载体，包载抗肿瘤药物，制成肝肿瘤靶向纳米给药***。
本发明选用通过噬菌体展示技术筛选出的新型多肽修饰高分子材料，以内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对药物的摄取，并且安全。
本发明具有转铁蛋白作为靶向头基的优点，并且有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和治疗效率高、制备简捷，并且可以应用于其它肿瘤组织的靶向治疗。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明的肝肿瘤靶向纳米给药***由新型多肽修饰树枝状高分子材料后再包载抗肿瘤药物制备而成，本发明以高分子材料、聚乙二醇、多肽和抗肿瘤药物为组分，所述组分配比为：高分子材料与聚乙二醇的摩尔比是1∶2～1∶40，高分子材料与多肽的摩尔比是1∶1～1∶5，高分子材料与抗肿瘤药物的摩尔比是1∶3～1∶40。
所述高分子材料选自下列高分子：聚酰胺-胺型树状分枝物和聚赖氨酸。
所述聚乙二醇选自下列高分子：马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺(MAL-PEG3500-NHS)。
所述多肽选自噬菌体展示技术筛选出的新型多肽：T7肽，序列为HAIYPRH。
所述抗肿瘤药物选自临床上一线和二线药物，包括盐酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，柔红霉素。
本发明靶向纳米给药***适用于靶向人体来源和动物来源的肝肿瘤细胞及其它肿瘤细胞。
本发明按下述方法制备肝肿瘤靶向纳米给药***：
将高分子材料溶于适量适当的溶剂中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称取适量的聚乙二醇溶解到pH值7.8～8.2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料摩尔比为1∶2～1∶40，一定温度下搅拌反应数小时即可，再将多肽溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽溶液，加入到高分子-聚乙二醇溶液中，与高分子材料摩尔比为1∶1～1∶5，一定温度下反应24h，制得肝肿瘤靶向纳米载体，转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，再与抗肿瘤药物以摩尔比1∶3～1∶40搅拌反应12h，转移到MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的药物，即得肝肿瘤靶向纳米给药***。
本发明具备下述突出优点及特征：
利用可特异性结合肝肿瘤细胞表面转铁蛋白受体的新型多肽T7肽修饰阳离子高分子材料，包载抗肿瘤药物后制成肝肿瘤靶向纳米给药***，将多肽的特性赋予纳米给药***，使纳米给药***的分布具有了更高的肝肿瘤靶向特征和细胞摄取特征，提高对肝肿瘤细胞的摄取效率和肝肿瘤的治疗效率；
另外，选用聚酰胺-胺树状分枝物和聚赖氨酸等高分子为载体材料，与多肽共价连接，采用物理法制备多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***；
本发明制备方法简单，不需要特殊的处理，可直接用于细胞和动物试验。本发明的肝肿瘤靶向纳米给药***由于***中多肽修饰的作用，改进了纳米粒进入细胞的途径。多肽的修饰使肝肿瘤靶向纳米给药***具有了高效的入胞能力，肝肿瘤靶向纳米给药***可在相对较短的时间内得到较高的肝肿瘤细胞摄取效率，并且较有效避免了其他正常细胞的摄取，提高了纳米给药***对肝肿瘤的治疗效率。
附图说明
图1是氢核磁共振表征肝肿瘤靶向纳米载体PAMAM-PEG-T7。
图2是两种pH条件下抗肿瘤药物DOX的释放情况。
图3是小角度散射法考察两种pH条件下载体的表面结构特性。
图4是原子力显微镜观测纳米给药***的外观形态及粒径。
图5是动态光散射法测定纳米给药***的粒径分布。
图6是采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒和游离DOX分别孵育人肝肿瘤细胞，并设立血浆转铁蛋白对照组，用OLYMPUS IX 71显微镜观察摄取结果并拍照，
其中，A是空白对照，B是游离DOX，C是PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒无转铁蛋白，D是PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒转铁蛋白浓度25μM。
图7是采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒和游离DOX分别48h孵育人肝肿瘤细胞，并设立血浆转铁蛋白对照组，MTT法测定各组对人肝肿瘤细胞的毒性。
图8是采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒、PAMAM-PEG/DOX纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，活体成像法测定各组的体内的分布。
图9是采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒、PAMAM-PEG/DOX纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，高效液相法测定4h后各组织分布。
具体实施方式
实施例1.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺(MAL-PEG3500-NHS)溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲液中配制成1mg/ml工作液。取242μl MAL-PEG3500-NHS工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG2)复合物溶液，再将T7肽溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取34.6μl加入到PAMAM-PEG2复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，生成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG2-T71)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。
实施例2.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将MAL-PEG3500-NHS溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲液中配制成1mg/ml工作液。取607μl MAL-PEG3500-NHS工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG5)复合物溶液，再将T7肽溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取34.6μl加入到PAMAM-PEG5复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，生成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG5-T71)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。
实施例3.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将MAL-PEG3500-NHS溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲液中配制成1mg/ml工作液。取1.214ml MAL-PEG3500-NHS工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7肽溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取34.6μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，生成聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T71)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。
实施例4.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，2.428ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG20)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取34.6μl加入到PAMAM-PEG20复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG20-T71)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。
实施例5.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，4.856ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG40)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取34.6μl加入到PAMAM-PEG40复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG40-T71)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。
实施例6.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。
实施例7.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体。取1mg产物500μl重水溶解于核磁管中考察聚乙二醇及多肽修饰的比例。
实施例8.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.8ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。
实施例9.
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.4ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。
实施例10
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.24ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。
实施例11
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。
实施例12
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.06ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。
实施例13
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***，加入到MWCO 1000透析袋中，于pH 7.4磷酸盐缓冲溶液和pH 5.5乙酸盐缓冲溶液中测量阿霉素的释放。
实施例14
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，SAXS小角度散射法测定pH 7.4条件下随角度不同粒子的散射强度情况。
实施例15
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至5.5，SAXS小角度散射法测定pH 5.5条件下随角度不同粒子的散射强度情况。
实施例16
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***，取适量于云母片上自然晾干，原子力显微镜观测。
实施例17
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***，取适量于PSS 380粒径管中，利用光散射法表征纳米粒的粒径。
实施例18
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒和游离DOX分别孵育人肝肿瘤细胞，并设立血浆转铁蛋白对照组，用OLYMPUS IX 71显微镜观察摄取结果并拍照。
实施例19
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒和游离DOX分别48h孵育人肝肿瘤细胞，并设立血浆转铁蛋白对照组，MTT法测定各组对人肝肿瘤细胞的毒性。
实施例20
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒、PAMAM-PEG/DOX纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，活体成像法测定各组的体内的分布。
实施例21
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***，另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒、PAMAM-PEG/DOX纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，活体成像法测定各组的体内的分布。
实施例22
将聚酰胺-胺(PAMAM)溶于适量甲醇中配制成77.35mg/ml的溶液，取1mg于西林瓶中吹干，将NHS-PEG3500-Mal溶于适量的0.035M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成1mg/ml工作溶液，1.214ml聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h制成聚酰胺-胺-聚乙二醇(PAMAM-PEG10)复合物溶液，再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取173μl加入到PAMAM-PEG10复合物溶液中，于室温搅拌反应24h，将制得的聚酰胺-胺-聚乙二醇-多肽(PAMAM-PEG10-T75)，MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的PEG和T7肽，制得肝肿瘤靶向纳米载体，pH 4.5乙酸盐缓冲液复溶，转移到西林瓶中，1N氢氧化钠调节pH至7.4，加入1mg/ml盐酸阿霉素生理盐水溶液0.12ml，室温搅拌反应12h，MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的阿霉素，制得肝肿瘤靶向纳米给药***。另外，采用单纯PAMAM-PEG-T7/DOX纳米粒、PAMAM-PEG/DOX纳米粒、游离DOX尾静脉注射人肝肿瘤细胞皮下移植裸鼠模型，高效液相法测定4h后各组织分布。
Claims (6)
1.一种多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、多肽和抗肿瘤药物组成，其中，所述多肽修饰高分子材料形成纳米粒，所述高分子材料与聚乙二醇的摩尔比为1∶2～1∶40；所述高分子材料与多肽的摩尔比为1∶1～1∶5；所述高分子材料与抗肿瘤药物的摩尔比为1∶3～1∶40；
所述高分子材料选自聚酰胺-胺型树状分枝物；所述聚乙二醇选自马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺；所述多肽为序列为HAIYPRH的T7肽，其通过噬菌体展示技术筛选获得。
2.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***，其特征在于，所述的高分子材料为具有内部空腔的高分子材料聚酰胺-胺型树状分枝物。
3.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***，其特征在于，所述的抗肿瘤药物选自盐酸阿霉素或紫杉醇或柔红霉素。
4.按权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***，其特征在于，所述的序列为HAIYPRH的T7肽特异性结合转铁蛋白受体。
5.权利要求1所述的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***的制备方法，其特征是，其包括下述步骤：
将高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物溶于适量适当的溶剂甲醇中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称取适量的聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶解到pH值7.8～8.2的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物摩尔比为1:2～1:40，一定温度下搅拌反应数小时后，将多肽HAIYPRH溶于适量磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽HAIYPRH溶液，加入到高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物-聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶液中，与高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物摩尔比1:1～1:5，一定温度下反应24h，制得肝肿瘤靶向纳米载体，转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽HAIYPRH，再与抗肿瘤药物以摩尔比1:3~1:40搅拌反应12h，转移到MWCO 3000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未包封的药物，即得肝肿瘤靶向纳米给药***。
6.权利要求1的多肽修饰的肝肿瘤靶向纳米给药***在制备靶向治疗人体来源或动物来源的肝肿瘤细胞药物中的用途。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6743893B2 (en) * | 2000-11-30 | 2004-06-01 | The Uab Research Foundation | Receptor-mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor |
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Patent Citations (8)
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|---|---|---|---|---|
| US6743893B2 (en) * | 2000-11-30 | 2004-06-01 | The Uab Research Foundation | Receptor-mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor |
| CN1631936A (zh) * | 2003-12-24 | 2005-06-29 | 上海市血液中心 | 聚酰胺－胺型树枝状聚合物纳米材料,其合成方法及应用 |
| CN1743008A (zh) * | 2005-09-23 | 2006-03-08 | 南开大学 | 纳米肝靶向生物降解药物载体材料的制备方法 |
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