CN101695502A - 镧富勒醇及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种镧富勒醇及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，具体说，涉及通式M@ C_2m(OH)x的镧富勒醇纳米颗粒及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，其中，M为La稀土金属，m＝41或30，10≤X＜50(但是由于相邻羟基的重排，实际上C₈₂碳笼上O的数目与H的数目会有一些不同，因此，也可以写成M@C_2mO_XH_Y的形式。与目前临床普遍使用的环磷酰胺、顺铂、紫杉醇等相比，镧富勒醇M@C_2m(OH)x或M@C_2mO_XH_Y用量小、毒性低，且肿瘤抑制率高。

Description

镧富勒醇及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用

本申请是一件分案申请，原申请的申请号为200610152170.7，申请日为2006年9月15日，发明名称为“金属富勒醇及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用”。

技术领域

本发明涉及一种新型纳米材料及其在生物医学中的应用。具体地说，涉及通式为M@C_2m(OH)x的金属富勒醇纳米颗粒及其在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，其中，M选自Gd，La等稀土金属，10≤X＜50。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，目前已成为人类死亡的主要原因。在中国，肝癌，肺癌，胃癌和乳腺癌是发病率最高的肿瘤。目前全世界每年至少有700万人死于癌症，其中我国约130万。癌症除了致人死亡外，也给家庭和社会造成巨大的经济负担。新抗肿瘤药物的不断发现及深入研究已使肿瘤化学治疗成为学科并使肿瘤内科学得以诞生。但是，抗肿瘤药的研究面临严重的挑战，这就是多数常见实体瘤如肺癌、肝癌、结肠癌及胰腺癌等还缺乏有效药物，不少抗肿瘤药在临床应用过程中产生耐药性，副作用极大。环磷酰胺、阿霉素、顺铂、紫杉醇等在起到治疗作用的同时，产生骨髓抑制、消化道剧烈反应、肾脏毒性等等毒副作用，严重地限制了其临床使用剂量。因此，新型抗肿瘤药物研究势在必行。

在生命科学研究中，纳米颗粒已经显示出其独特的优势和诱人的应用前景，如靶向性纳米药物载体、疾病高效检测的量子点、高效医学成像以及肿瘤治疗技术相关的纳米材料等，已经成为国际前沿科学问题。

雷勒烯C60是一种由碳原子构成，纳米尺度的球体分子，具有独特的物理化学性质，在生物医学、材料科学等领域有着重要的应用前景。Friedman等于1993年在J.Am.Chem.Soc.115：6506-6509理论计算模拟了富勒烯C60衍生物可以抑制HIV病毒的活性：C60是强疏水性球形分子，直径为0.71nm，而HIV是末端开口的圆柱状分子，尺寸与C60直径相似，其活性位置表面也是强疏水性的，两者有可能以共价键结合，从而阻止HIV病毒的生长。含有14核苷酸富勒烯衍生物和DNA的加合物可形成较稳定的三螺旋结构，在光催化下可对DNA进行选择性的位点切割。

由于富勒烯及其许多衍生物是疏水性的，无法与人体内“靶分子”作用，使得它们在生物化学领域中的研究和应用受到很大的限制。近年来，研究合成水溶性富勒烯衍生物方面的突破和成功，大大加速和拓宽了C60衍生物在生物方面的应用。在水环境中，羟基衍生化的富勒烯并不是以单独的分子形式存在的，而是通过与大分子相互作用团聚成纳米颗粒物，这些颗粒物有很好的生物亲和性(Sayes CM et al，Nano Lett，2004，4(10)：1881-1887.Dugan LL et al，Proc Natl Acad Sci USA 1997；94：9434-9439.Mirkova SM et al，NitricOxide 2004；11：201-207.Chiang LY et al，J Org Chem 1994，59；3960-3968)。发表在2004年10月份Nano Lett的一篇论文中(Sayes CM et al，Nano Lett，2004，4(10)：1881-1887)，Rice大学Colvin指出富勒烯的细胞毒性高度依赖于其碳笼表面是否修饰和修饰的基团。在两种细胞系中，不同的结构的毒性可相差7个数量级，以富勒烯毒性最大，富勒醇(C₆₀(OH)₂₄)最小。富勒醇(C₆₀(OH)₂₄)的LD50＞5,000ppm，而富勒烯的LD50为20ppb。人们对富勒烯及其衍生物在实验动物体内的分布进行了初步的研究。Nakamura等于1994年首先合成了¹⁴C标记的一种富勒烯吡咯环衍生物，并研究了它在小鼠体内的生物分布和药物代谢，通过尾静脉注射到SD大鼠，化合物很快分布到小鼠身体的各个器官，90-95％富集于肝脏。166Ho@C₈₂(OH)_x则显出生物分布较广，在肝、骨骼、脾、肾、肺的含量依次递减，其它组织分布极低(Cagle DW et al.，Proc Natl Acad Sci 1999；96：5182-5187)。

过去几年，笼内包金属富勒烯的研究已取得很大进展，迄今为止，三价金属原子(Sc，Y)、碱土金属原子(Ca，Sr，Ba)、碱金属原子(Li，Na，K，Cs)和四价金属原子(Zr，Hf)等已成功地被包笼到富勒烯内，形成了单原子、双原子、三原子金属包笼物。笼内包金属富勒烯的许多优异的物理和化学性质使它们有可能发展成为超导、有机铁磁体、非线性光学材料、功能分子开关，核磁造影剂、生物示踪剂等新型材料(Bolskar RD et al.，J Am Chem Soc 2003；125：5471-5478)。

发明内容

我们知道，肿瘤组织较正常组织富含血管，且肿瘤组织的毛细血管壁上有许多纳米尺寸的孔径，营养物质可通过这些孔径渗透到肿瘤组织之中。假设这些血液通道恰好被同尺寸的纳米粒子所堵塞，就会抑制血液的流通，使肿瘤不能够获得足够的营养物质，进而中断了肿瘤组织的生长。为了验证这一观点，发明人设计并制备了一种金属富勒醇化合物，其分子直径约为1nm，结果发现，金属富勒醇纳米颗粒有很强的肿瘤抑制作用，当其在溶液中形成直径为1-200nm的颗粒时肿瘤抑制效果更佳，其作用机制不是通过对肿瘤细胞的直接杀死作用而完成的。

本发明的一个目的是提供一种金属富勒醇。

本发明的另一目的是提供一种肿瘤抑制组合物，其中含有治疗有效的金属富勒醇颗粒和药学上可接受的载体。

本发明的再一目的是提供一种金属富勒醇在制备抑制肿瘤生长药物中的应用。

为实现上述目的，本发明包含以下方案：

一种金属富勒醇，它以通式表示，通式中，M选自La，Gd等稀土金属；m＝41或30；10≤X＜50。

上述化合物包括一个磁性中心金属离子M和一个由C原子构成的纳米碳笼，其表面存在许多羟基基团，因此M@C_2m(OH)_x在生物体内有很好的生物亲和性。(参见图1)同时，由于羟基基团的存在，与金属富勒烯比较毒性大大降低。

由于相邻羟基的重排，实际上碳笼上O的数目与H的数目会有一些不同，因此，也可以将上述通式写成M@C_2mO_xH_y形式。

本发明的通式为M@C_2m(OH)_x(m＝41或30；10≤X＜50)的金属富勒醇，其中M为La。

本发明的通式为的M@C_2m(OH)_x(m＝41或30；10≤X＜50)金属富勒醇，其中M为Gd。

一种肿瘤抑制组合物，其中含有以通式M@C_2m(OH)_x表示的金属富勒醇，通式中，M选自Gd、La等稀土金属；m＝41或30；10≤X＜50。

一种肿瘤抑制组合物，其中含有以通式[M@C_2m(OH)_x]_n表示的金属富勒醇纳米颗粒，通式中，M选自Gd、La等稀土金属；m＝41或30；10≤X＜50；n表示团聚成该金属富勒醇纳米颗粒的金属富勒醇分子数，1≤n＜200。

通式为M@C_2m(OH)_x的金属富勒醇通过大分子相互作用可团聚成纳米颗粒物。在溶剂环境中，可以通过选择溶剂、控制浓度及超声波等方法控制颗粒物的尺寸，形成直径分布范围在1-200nm的颗粒。

上述组合物还可包括溶剂和/或药学上可接受的载体。上述溶剂优选水、生理盐水、Tris-HCl溶液或磷酸盐缓冲液。上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂，填充剂，吸收促进剂等。

本发明的肿瘤抑制组合物，其中，所述的组合物中金属富勒醇在溶剂中的浓度优选为1×10^-5～1mmol/L。当浓度高于1mmol/L时金属富勒醇的溶解性能降低，易团聚成较大颗粒。金属富勒醇终浓度在1×10^-5～1mmol/L之间，对细胞无明显毒性作用。

上述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直肠结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、***、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮肤癌。

一种金属富勒醇在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，该金属富勒醇以通式M@C_2m(OH)_x表示，通式中，M选自Gd，La等稀土金属；m＝41或30；10≤X＜50。所述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、直肠结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、***、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮肤癌。

一种金属富勒醇在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，该药物被制备成各种剂型，这些剂型所对应的给药量以金属富勒醇计优选为5×10^-8～1×10^-2mmol/kg/天。上述针对人的给药量是由药效实验的小鼠给药量1×10^-6～2×10^-1mmol/kg/天换算得来的。

一种金属富勒醇在制备抑制肿瘤生长药物中的应用，该药物被制备成各种剂型，这些剂型所对应的给药量以金属富勒醇计更优选为5×10^-6～1.25×10^-4mmol/kg/天。上述针对人的给药量是由药效实验的小鼠给药量1×10^-4～2.5×10^-3mmol/kg/天换算得来的。

上述肿瘤抑制组合物优选通过静脉注射、腹腔内注射、口服或局部给药等方式施用于需要治疗的患者。在本发明的一个优选实施方案中，将上述肿瘤抑制组合物制成注射用溶液。

本发明的优点是：与目前临床普遍使用的环磷酰胺、顺铂、紫杉醇等相比，金属富勒醇M@C_2m(OH)_x具有用量小，毒性低，且肿瘤抑制率高的优点。

附图说明

图1为M@C_2m(OH)_x分子结构示意图

图2为Gd@C_2m的HPLC分离结果谱图(5PBB柱)。

图3为Gd@C₈₂(OH)₂₂(a)和Gd@C₈₂(OH)₁₂(b)的C1s电子的XPS谱。

图4为生理盐水溶液中[Gd@C₈₂(OH)₂₂]_n纳米颗粒的高分辨AFM图。

图5为Gd@₈₂(OH)₂₂低剂量组注射后小鼠H₂₂肝癌的生长曲线图。

图6为Gd@C₈₂(OH)₂₂高剂量组注射后小鼠H₂₂肝癌的生长曲线图。

图7为CTX组肿瘤抑制率和剂量关系曲线图。

图8为Gd@C₈₂(OH)₂₂组肿瘤抑制率和剂量关系曲线图。

图9为鼠肝癌H₂₂模型不同治疗组肿瘤组织病理切片照片。其中，A、B为对照组；C、D为Gd@C₈₂(OH)₂₂治疗组；E、F为环磷酰胺治疗组。

图10为La@C₈₂(OH)₁₈注射后小鼠Lewis肺癌的生长曲线图。

图11为金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₂₂对人肝癌HepG2细胞存活率的影响。

图12为金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₂₂诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的百分比。

图13为金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₂₆诱导鼠肝癌Rh35细胞凋亡的百分比。

图14为金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₃₂诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的百分比。

图11、图12、图13和图14中横坐标的数值为M@C₈₂(OH)_x摩尔浓度的乘方值。

图15为金属富勒醇La@C₈₂(OH)₂₀对神经胶质瘤细胞存活率的影响。

具体实施方式

发明人采用化学合成法制备了金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)_x，Gd@C₆₀(OH)_x，La@C₈₂(OH)_x，La@C₆₀(OH)_x，其制备方法参考中国发明专利03146028.3。Gd@C₆₀的合成与分离纯化参考文献Robert D.Bolskar等，J.AM.CHEM.SOC.2003，125，5471-5478。

采用本发明方法制备的金属富勒醇M@C_2m(OH)_x，其羟基数目在10～50的范围，在本文中当羟基数用具体数值表示时，该数值指羟基数目的加全平均值。该值由合成金属富勒醇反应中NaOH溶液的浓度决定，可根据需要调节NaOH溶液的浓度，从而获得指定羟基数目加全平均值的金属富勒醇。当羟基数目低于10时，金属富勒醇的生物相容性不好；当羟基数目高于50时，碳笼的结构不稳定。

精确测定富勒醇的羟基数目至关重要，本发明中，我们利用北京同步辐射装置X射线光电子能谱(XPS)并结合元素分析方法来确定金属富勒烯的表面修饰后的羟基数目。

XPS实验在中国科学院北京同步辐射装置上进行。在单晶硅片上通过磁控离子溅射镀上高纯Pt作为XPS样品测试基底。M@C₈₂和M@C₈₂(OH)_x滴加在高纯Pt基底上获得XPS测量的薄膜，将薄膜放入8×10^-10Torr的XPS样品制备室的超高真空***足够长时间，以除去样品上可能吸附的空气杂质。金属富勒醇的C1s光电子发射谱用于确定样品包含的羟基数目。改变入射光子能量，采集样品的价带光电子能谱。采集样品的部分产额谱以获得样品的吸收谱。装置的能量分辨率约为～0.5eV。样品在采集数据前，先进行XPS扫描，以确保样品表面清洁并确定仪器处于良好运行状态。

金属富勒醇M@C_2m(OH)_x分子的粒径约为1nm。金属富勒醇分子可通过大分子相互作用团聚成纳米颗粒物。在溶剂环境中，可以通过超声波等方法控制颗粒物的尺寸，形成直径分布范围在1-200nm的颗粒。本文以下实施例中所涉及的金属富勒醇溶液均为含有直径分布范围在1-200nm的金属富勒醇颗粒的溶液。

以下结合实施例和对比例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。

实施例1

Gd@C_2m(OH)_x的制备

第一步Gd@C_2m的合成

将高纯(＞99.999％)Gd₂O₃与高纯石墨粉(＞99.999％)按原子比Gd∶C＝0.5～3∶100混合，压制成模，制成石墨-金属混合电极；或者将直径为6～20mm石墨棒钻空，充填氧化钆得到石墨-金属混合电极。1000～2000℃高温烧结后，使用惰性气体弧形放电法，合成金属富勒烯Gd@C_2m。惰性气体为He或Ar，压力为50～600Torr，电流为80～500A。

第二步Gd@C₈₂和Gd@C₆₀的分离纯化

a.采用高温回流加高温高压两步高效提取方法萃取分离碳纳米类物质。首先将弧形放电的烟炱在甲苯中100～200℃下回流12～24小时，再在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中100～200℃下高温高压(50～100MPa)提取12～24小时，以萃取碳纳米类物质。

b.使用广泛应用的循环式HPLC(高效液相色谱)两步法或萃取法纯化目标所需要金属富勒烯Gd@C₈₂和Gd@C₆₀，得到纯度大于99.99％的目标产物Gd@C₈₂和Gd@C₆₀。Gd@C₈₂的产率为碳棒的10％；Gd@C₆₀产率为碳棒的35％。HPLC分离结果谱图参见图2。(5PBB柱)

第三步金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₂₂的合成

使用NaOH法，在甲苯溶液中将Gd@C₈₂与浓度为35％的NaOH溶液进行反应，再经过滤、离子交换层析等分离、纯化过程，除去NaOH后，得到纯度大于99.99％的产物Gd@C₈₂(OH)₂₂，冷冻干燥保存。

金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₁₂的合成

在甲苯溶液中将Gd@C₈₂与浓度为30％的NaOH溶液进行反应，再经过滤、离子交换层析等分离、纯化过程，除去NaOH后，得到纯度大于99.99％的产物Gd@C₈₂(OH)₁₂，冷冻干燥保存。

Gd@C₆₀(OH)_x的合成：

将300mg Gd@C₆₀悬浮液与210mg KH在20mL THF中混合后，连续搅拌15分钟，并将1.255g二乙基溴代丙二酸一滴滴地加入混合液。搅拌40分钟以后生成咖啡色溶液。然后过滤，除去没有反应的KH。将粗产物用四氢呋喃分离，再用己烷漂洗，低压抽干，然后在甲苯中与NaH一起回流，并用甲醇结束反应。用酸性离子交换柱分离纯化，用NaOH调节溶液的pH值到7.0。蒸干得到Gd@C₆₀(OH)_x产品。

第四步金属富勒醇颗粒[Gd@C₈₂(OH)₂₂]_n(1≤n＜200)的合成

将金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₂₂溶解在生理盐水中，超声1分钟，形成直径分布范围在1-200nm的颗粒物[Gd@C₈₂(OH)₂₂]_n，1＜n＜200。

实施例2

测定Gd@C₈₂(OH)₂₂和Gd@C₈₂(OH)₁₂的羟基数

Gd@C₈₂(OH)₂₂(a)和Gd@C₈₂(OH)₁₂(b)的C1s电子的XPS谱如图3所示，C-C和C-O键之间的相对强度用于分析Gd@C₈₂(OH)_x中的羟基数目。图2中实线的高斯拟合分析表明分子中存在两种不同的碳原子：峰位置在284.4eV的是没有连接其它基团的具有sp2杂化的碳原子(C-C)的结合能；位于285.3eV的峰是羟基化的碳原子(C-OH)。

实施例3

La@C_2m(OH)_x的制备

采用与上述制备Gd@C₈₂类似的方法制备La@C₈₂和La@C₆₀。

(1)金属富勒醇La@C₈₂(OH)₁₈的合成

使用NaOH法，在甲苯溶液介质中将La@C₈₂与28％的NaOH溶液进行反应，再经一系列分离、纯化过程，除去NaOH后，得到纯度大于99.99％的La@C₈₂(OH)₁₈产物，冷冻干燥保存。

(2)金属富勒醇La@C₆₀(OH)₂₂的合成

使用NaOH法，在甲苯溶液介质中将La@C₆₀与35％的NaOH溶液进行反应，再经一系列分离、纯化过程，除去NaOH后，得到纯度大于99.99％的La@C₆₀(OH)₂₂产物，冷冻干燥保存。

实施例4

纳米颗粒的测定

金属富勒醇M@C_2m(OH)_x分子的粒径约为1nm。在溶剂环境中，金属富勒醇分子通过大分子相互作用团聚成纳米颗粒物，可以通过超声波等方法控制颗粒物的尺寸，形成直径分布范围在1-200nm的颗粒。

采用同步辐射小角X-射线衍射(SR-SAXS)测得生理盐水溶液中[Gd@C₈₂(OH)₂₂]_n纳米颗粒的粒径范围为1-200nm，平均粒径22nm。

高分辨原子力显微镜(AFM，Nano IIIa SPM，Digital Instruments Inc，3A)证实生理盐水溶液中[Gd@C₈₂(OH)₂₂]_n纳米颗粒的粒径范围为1-200nm，平均粒径22.4nm存在，参见图4。由两种独立的方法得到的结果一致。

实施例5

含[Gd@C₈₂OH₂₂]_n(1≤n＜200)的注射用溶液

将500mg Gd@C₈₂OH₂₂，溶解于400ml生理盐水中，室温超声1分钟，封装于100个玻璃管中，制成注射用溶液。

实施例6

Gd@C₈₂(OH)_m组合物对小鼠肝癌肿瘤的抑制作用

动物品系：昆明种雌鼠，体重为18到22g。

肿瘤模型：小鼠肝癌H₂₂瘤株。

实验分组：A.阴性对照组：生理盐水(saline)；B.阳性对照组：环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，临床上普遍使用的一种抗癌药物；C.药物组：Gd@C₈₂(OH)_m，每组5-7只小鼠。

给药方式：腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)。

CTX和Gd@C₈₂(OH)_m(m＝22或26)溶液以0.9％的生理盐水为溶剂。

剂量设计(1×10^-6～2×10^-3mmol/kg小鼠)

本实验分两个剂量组：

A.高剂量组：

CTX：30mg/kg(0.1mmol/kg)，仅需在实验的前7天注射；

Gd@C₈₂(OH)₂₂，2×10^-4mmolGd/kg；

Gd@C₈₂(OH)₂₆，2×10^-3mmol/kg；

注射体积均为0.2ml。

低剂量组：

CTX：15mg/kg(0.05mmol/kg)；

Gd@C₈₂(OH)₂₂，1×10^-4mmol/kg；

Gd@C₈₂(OH)₂₆，1×10^-6mmol/kg；

注射体积均为0.2ml。

实验方法：每只小鼠右后肢皮下接种小鼠肝癌H₂₂瘤株1×10⁶癌细胞(分散于100μl的0.9％生理盐水中)，接种24小时后开始给药0.2ml/只；实验期间每24小时给药一次，每隔一天测量接种肿瘤的后肢直径，记录其生长情况；同时观察小鼠的反应情况；当生理盐水组小鼠右后肢直径长到20mm左右时，停止实验(正常小鼠后肢直径为6mm)。

实验结束：摘除眼球取血，使用109mmol/L枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂的比例为1∶9；摘取肿瘤，称重；取脏器/器官并称重，计算脏器系数；同时用10％的***固定脏器/器官。

实验结果：Gd@C₈₂(OH)_m组合物抗肝癌H₂₂活性如表1所示，注射Gd@C₈₂(OH)_m纳米颗粒后同注射CTX一样可以抑制小鼠的肿瘤生长，且纳米材料的肿瘤抑制特性优于临床普遍使用的抗肿瘤药物CTX。

高剂量组Gd@C₈₂(OH)₂₂对荷瘤小鼠血清总胆红素，ALT，AST和肌苷水平的影响数据参见下页的表2。从反映肝细胞损害最敏感的指标是谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST的活性上分析，注射Gd@C₈₂(OH)₂₂纳米材料可显著抑制荷瘤鼠两种酶的增高，并且接近正常机体的水平。而环磷酰胺组ALT水平反而增加，说明其增加动物肝的损伤。

根据公式V＝4πr³/3计算肿瘤体积，并得到抑瘤率；结果发现低剂量组中0.1μmol/kg的Gd@C₈₂(OH)₂₂抑制肿瘤生长的效率为32.9％(图5和图6)，虽然比0.05mmol/kg的CTX的抑瘤率52.0％低，但是其用药量只是CTX药量的1/500。

另外，我们还比较了抑瘤率与药物使用量之间的关系，当把CTX的剂量提高0.05mmol/kg时，其肿瘤抑制率提高了15％，而把Gd@C₈₂OH₂₂纳米材料的使用剂量仅提高0.1μmol/kg时，其肿瘤抑制率就提高26％(图7和图8)。

鼠肝癌H₂₂模型组肿瘤组织病理切片结果：

以下参见图9，Gd@C₈₂(OH)₂₂治疗组小鼠肿瘤浸润范围更小，瘤体易剥离，肿瘤重量明显减轻。HE染色切片可见肿瘤周围形成明显的肿瘤包绕带(炎细胞、纤维母细胞及毛细血管)。可激活机体免疫功能。

对照组：肿瘤细胞向骨骼肌浸润明显。

环磷酰胺组：肿瘤细胞大量坏死，但不能防止肿瘤细胞向骨骼肌浸润。

表1  Gd@C₈₂(OH)_m抗肝癌H₂₂活性数据表

(N为小鼠数量，表中数据以(平均值±标准差)表示)

表2  高剂量组Gd@C₈₂(OH)₂₂荷瘤小鼠血清总胆红素，ALT，AST和肌苷水平

注：a与生理盐水组比较P＜0.01.

实施例7

Gd@C₈₂(OH)_m对人源MCF-7乳腺癌裸鼠乳腺癌模型的抑制肿瘤效果

实验方法：BALB/c雌性裸鼠(16.0±1.0g)皮下接种MCF-7细胞悬液(1×10⁷细胞)后，饲养20天，把皮下产生的肿瘤取出，切割成3mm×3mm×3mm的肿瘤小块重新植入BALB/c雌性裸鼠备用。接种3天后开始给药，分别给予Gd@C₈₂(OH)_m(m＝32或12)、环磷酰胺、紫杉醇、生理盐水。

给药方法：

Gd@C₈₂(OH)₃₂  2.5μmol/kg/天×13天(以Gd浓度计算)；注射液浓度为0.25μmol/ml。

Gd@C₈₂(OH)₁₂  1.0μmol/kg/天×13天，以Gd浓度计算；注射液浓度为0.1μmol/ml。

环磷酰胺      第一周71.6μmol/kg/天×7天，第8-12天生理盐水

紫杉醇        第0、3、6、9、12天15.2μmol/kg/天，不给药天注射

              生理盐水

生理盐水      0.2ml q.d.×13

动物品系：BALB/c雌性裸鼠，

          Gd@C₈₂(OH)₃₂组  10只；

          Gd@C₈₂(OH)₁₂组  10只；

          环磷酰胺组      10只

          紫杉醇组        9只；

          生理盐水组      8只

肿瘤模型：MCF-7人乳腺癌

给药方式：腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。

CTX和Gd@C₈₂(OH)_m溶液，以0.9％的生理盐水为溶剂。紫杉醇是商用液体制剂。

抑制肿瘤实验结果如表3所示，Gd@C₈₂(OH)₃₂组在2.5μmol/kg体重给药13天时抑瘤率可达到47％，与环磷酰胺组71.6μmol/kg体重给药7天结果一致。Gd@C₈₂(OH)₁₂组在1μmol/kg体重给药13天时抑瘤率可达到35.6％。但是环磷酰胺组小鼠出现明显的毒副作用，如明显体重减轻、消瘦、动物精神状态差。紫杉醇在15.2μmol/kg体重剂量下，每隔2天给药，抑瘤率可达到82％，但是45％的小鼠死亡，说明紫杉醇毒性非常大。而金属富勒醇组小鼠在实验结束时未出现明显的毒性反应。

实验结果表明，与目前临床普遍使用的环磷酰胺、紫杉醇相比，带有不同羟基数的金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₃₂和Gd@C₈₂(OH)₁₂具有用量小，毒性低，且肿瘤抑制率高的优点。

表3  Gd@C₈₂(OH)_m抑制裸鼠移植的人源乳腺癌生长数据表

(N为小鼠数量)

实施例8

La@C₈₂(OH)₁₈组合物对小鼠Lewis肺癌模型的抑制肿瘤效果

实验方法：C57纯系雌性小鼠(18.0±1.0g)皮下接种Lewis肺癌细胞悬液(1×10⁷细胞)，接种次日开始给药，分别给予La@C₈₂(OH)₁₈、环磷酰胺、生理盐水，每组10只。

给药方式：腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。

给药方法：

La@C₈₂(OH)₁₈  1μmol/kg q.d.×14

环磷酰胺      第一周71.6μmol/kg q.d.×7，第8-14天给予生理盐水

生理盐水      0.2ml q.d.×14

CTX和La@C₈₂(OH)₁₈溶液，均以0.9％的生理盐水为溶剂。

抑瘤实验结果参见图10，La@C₈₂(OH)₁₈在1μmol/kg体重给药14天时可以明显抑制肿瘤的生长，肿瘤的重量不明显增加，与环磷酰胺71.6μmol/kg体重给药7天结果基本一致。但是环磷酰胺组小鼠出现明显的毒副作用，如明显体重减轻、消瘦、动物精神状态差。而金属富勒醇组小鼠在实验结束时未出现明显的毒性反应。

上述实验结果表明，与目前临床普遍使用的环磷酰胺相比，金属富勒醇La@C₈₂(OH)₁₈纳米颗粒具有用量小，毒性低，且肿瘤抑制率高的优点。

实施例9

Gd@C₆₀(OH)₂₀对小鼠Lewis肺癌模型的抑制肿瘤效果

实验方法：C57纯系雌性小鼠(20.0±1.0g)皮下接种Lewis肺癌细胞悬液(1×10⁷细胞)，接种次日开始给药，分别给与Gd@C₆₀(OH)₂₀、生理盐水，每组10只。Gd@C₆₀(OH)₂₀溶液，以0.9％的生理盐水为溶剂。

给药方式：腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。

给药方法：

Gd@C₆₀(OH)₂₀  0.5μmol/kg q.d.×18

生理盐水      0.2ml q.d.×18

抑瘤实验结果表明，Gd@C₆₀(OH)₂₀在0.5μmol/kg体重给药18天时可以明显抑制肿瘤的生长，与生理盐水对照组相比，接种肿瘤的体积不明显增加，抑瘤率可达到42％。

实施例10

细胞毒性试验：

实验方法：

(1)MTT的方法分析金属富勒醇对不同种类癌细胞存活率的影响

MTT法：作为四氮唑类染料之一的MTT进入细胞后，被线粒体呼吸链酶(如琥珀酸脱氢酶)还原为不溶性有色产物，利用光吸收的方法测定有色产物的量，从而间接反映细胞的活性。

取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为2×10⁴/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔接种100μl，分为6个剂量组，每组8个复孔。接种24h后，换成无血清培养基，每孔100μl，按剂量组浓度分别加入药物，继续培养48h后，弃上清，每孔加100μl MTT缓冲液及10μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养3h，弃上清，加DMSO 150μl/孔，震荡，自动酶标仪测定595nm处各孔吸光值。

(2)流式细胞仪分析法：碘化丙啶(PI)染色检测凋亡细胞数

将5ml浓度为10⁵个/ml的细胞接种与25cm²培养瓶中，24h后换成5ml无血清培养基，分别加入不同浓度的金属富勒醇，24h后收取细胞，包括培养基中的少量细胞，收集好的细胞用生理盐水洗两次，然后70％乙醇4℃固定，做流式分析前，用生理盐水洗2次，最后用生理盐水悬起细胞，加入RNase A及碘化丙啶(PI)，终浓度分别是25ppm和50ppm，37℃水浴中放置30分钟，用尼龙纱布过滤后上机测定。PI不能通过完整的细胞膜，但对于凋亡中晚期细胞或死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核红染，DNA结合PI染色后用流式细胞仪进行分析，可在G1峰前出现一亚二倍体峰，根据此峰的百分率可检测凋亡细胞数。

实验结果举例：

[1]MTT的方法分析金属富勒醇对人肝癌HepG2细胞存活率的影响

Gd@C₈₂(OH)₂₂终浓度在10～10⁶nmol/L范围内，实验结果如图11所示，细胞活性较未加任何药物的细胞活性有所增加，但药物各剂量组之间差别不大，也没有明显的线性关系。

[2]流式细胞仪的方法分析金属富勒醇Gd@C₈₂(OH)₂₂对人肝癌HepG2细胞的毒性

结果如图12所示，细胞凋亡比例均在3.5％～7％之间，Gd@C₈₂(OH)₂₂的终浓度在10～10⁶nmol/L范围内，细胞凋亡比例与对照组基本一致，药物各剂量组之间没有显著性差别。Gd@C₈₂(OH)₂₂不诱导HepG2细胞凋亡，对细胞的增值和生长没有影响。

[3]流式细胞仪的方法分析Gd@C₈₂(OH)₂₆对鼠肝癌Rh35细胞的毒性

结果如图13所示，Gd@C₈₂(OH)₂₆的终浓度在10～10⁶nmol/L范围内，与未加任何诱导剂的对照组细胞凋亡百分比相当，凋亡细胞的比例均在2.0％～3.5％之间，说明Gd@C₈₂(OH)₂₆不诱导鼠肝癌Rh35细胞凋亡。

[4]流式细胞仪的方法分析Gd@C₈₂(OH)₃₂对乳腺癌MCF-7细胞的毒性

结果如图14所示，Gd@C₈₂(OH)₃₂的终浓度在10～10⁶nmol/L范围内，与对照组细胞凋亡百分比相当，凋亡细胞的比例在3.0％～9％之间，表明Gd@C₈₂(OH)₃₂不诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡，对细胞毒性较小。

[5]MTT的方法分析金属富勒醇对神经胶质瘤细胞存活率的影响

La@C₈₂(OH)₂₀终浓度在100～10⁶nmol/L范围内，实验结果如图15所示，细胞存活率与未加任何药物的对照组基本一致，对神经胶质瘤细胞的生长没有明显的影响。

上述不同浓度的金属富勒醇对多种肿瘤细胞的细胞毒性实验结果显示，在10-1000000nmol/ml的浓度范围内，金属富勒醇对不同类型的肿瘤细胞株的生长没有影响，不诱导细胞凋亡，同时细胞存活率与不加药物的对照组一致，说明金属富勒醇不具备直接的细胞毒性，不直接杀死细胞。

Claims (12)

1.一种镧富勒醇，其特征在于：它以式La@C₈₂(OH)x或La@C₆₀(OH)x表示，式中，10≤X＜50。

2.一种肿瘤抑制组合物，其特征在于，它包括以式La@C₈₂(OH)x或La@C₆₀(OH)x表示的镧富勒醇，式中，10≤X＜50。

3.一种肿瘤抑制组合物，其特征在于，它包括以通式[M@C_2m(OH)_x]n表示的镧富勒醇纳米颗粒，通式中，M为La，m＝41或30；10≤x＜50；n表示团聚成所述镧富勒醇纳米颗粒的镧富勒醇分子数，1≤n＜200。

4.根据权利要求2或3所述的肿瘤抑制组合物，其特征在于，所述的组合物还包括溶剂和/或药学上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的肿瘤抑制组合物，其特征在于，所述的溶剂为水、生理盐水、Tris-HCl溶液或磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求4所述的肿瘤抑制组合物，其特征在于，所述的镧富勒醇在溶剂中的浓度为1×10^-5～1mmol/L.

7.根据权利要求5所述的肿瘤抑制组合物，其特征在于，所述的镧富勒醇在溶剂中的浓度为1×10^-5～1mmol/L.

8.根据权利要求2或3或5或6或7所述的肿瘤抑制组合物，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、直肠结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、官颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮肤癌。

9.根据权利要求4所述的肿瘤抑制组合物，其特征在于，所述的肿瘤为肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、直肠结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、官颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴肉瘤、白血病、黑色素瘤或皮肤癌。

10.一种镧富勒醇在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于，金属富勒醇以通式M@C_2m(OH)_x表示，通式中，M为La，m＝41或30；10≤x＜50。

11.根据权利要求10所述的镧富勒醇在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的药物被制备成各种剂型，这些剂型所对应的给药量以镧富勒醇计为5×10^-8～1×10^-2mmol/kg/天。

12.根据权利要求11所述的镧富勒醇在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的药物被制备成各种剂型，这些剂型所对应的给药以镧富勒醇计为5×10^-6～1.25×10^-4mmol/kg/天。

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