CN101426514A - Hcv疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其中每2周对人类个体进行HCV疫苗给药，至少3次，所述HCV疫苗包含：有效量的至少一种HCV T细胞抗原，以及含有肽键的聚阳离子化合物。

Description

HCV疫苗
本发明涉及用于预防HCV感染和用于治疗HCV感染的患者(特别是慢性肝炎患者)的疫苗和疫苗接种策略。
大约3％的世界人口(约170百万人)存在慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的情况。丙型肝炎病毒(HCV)是一种黄病毒科的一员。目前有至少6种HCV基因型，并且已经对50多种亚型进行了描述。在美国、欧洲和日本，基因型1、2和3是最普通的。HCV基因型的地理分布变化极大，其中基因型1a主要分布于美国和西欧的部分地区，而基因型1b主要分布在欧洲南部和中欧地区。HCV通过肠胃外途径或经皮途径传播，并在肝细胞中复制。大约15％的患者经历过与病毒清除和康复有关的急性自限型肝炎。大约85％的感染者成为慢性携带者。感染过程通常在无症状表现的情况下以缓慢的进程持续若干年，然而最终，HCV主要导致肝硬变、晚期肝病和肝癌。CD4+辅助性T细胞(HTL)和CD8+细胞毒T细胞(CTL)这二者的应答的强度和质量决定了患者是康复(自发的或是经过治疗后的结果)还是发展成慢性感染。在丙型肝炎的自然发展过程中，在20-30年内，大约25％的患者发展成肝硬变，而大约5％的患者发展成肝细胞癌。对这些慢性丙型肝炎的后遗症(包括肝移植)进行治疗导致大量的费用产生。
目前，基于α干扰素和利巴韦林的结合治疗是针对慢性丙型肝炎患者的标准治疗方法。然而，在大约50％的患者中，以及在仅仅43％至46％的感染了在欧洲、美国和加拿大最普遍的、基因型为1型的丙型肝炎病毒的患者中，都对所述治疗产生了持续应答(SR)，其中所述持续应答可定义为在停止治疗后的6个月内，不存在可检测的病毒血症。这种治疗方法的低的可耐受能力以及相当大的副作用无疑使新的治疗干预(包括治疗疫苗)成为必要。因此，对新的治疗方式进行评价是有根据的。
基于α干扰素的治疗具有相当大的副作用，例如类流感综合症、发烧、头痛、关节痛、肌痛、抑郁、体重减轻、脱发、白血球减少以及血小板减少。这些副作用通常非常明显，并且可以对生命的品质或工作能力造成限制。干扰素治疗方法特别受到血液副作用(血小板减少症)的限制，并且在许多已经患有血小板减少症(由于肝硬变造成，并伴有脾肿大)的患者中是不当的。
利巴韦林也具有多种副作用，并且这些副作用在临床上是重大的。利巴韦林会诱导溶血作用和显著的贫血，这可以导致向组织传递氧的过程降低，并且利巴韦林与冠心病患者的心肌梗塞有关。此外，施用利巴韦林会潜在地引起畸形、导致突变和致癌。因此，在对育儿期的男性和女性患者进行利巴韦林的治疗期间，必需进行避孕措施。
诸如HCV特异性蛋白酶、聚合酶或解旋酶抑制剂之类的其他可能的治疗策略还处于临床前阶段或早期临床研发阶段。目前，还不能预见这些方法的临床实用性。
由于所述标准的治疗方法一方面存在这种有限的效力而另一方面又存在着严重的副作用，所以迫切地需要用于丙型肝炎的新的治疗方式。
一直以来所从事的研究策略在于研发出基于肽的疫苗。已经显示出这种途径可能会成功的方法在(例如)专利文献WO 01/24822、WO2004/024182、WO 2005/004910或PCT/EP2005/054773中有所描述。
因此，本发明涉及用于预防或治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其中每两周对人类个体进行HCV疫苗给药至少3次，所述HCV疫苗包含：
-有效量的至少一种HCV T细胞抗原，以及
-含有肽键的聚阳离子化合物。
根据本发明，令人惊奇地发现含有HCV T细胞抗原的HCV疫苗的效力高度取决于给药频率。诸如给药途径、疫苗剂量的总数或每剂量中使用的抗原的量之类的其他给药参数也是重要的，但是对于最佳效力而言，这些参数不如给药频率重要。对于待接种疫苗的人类个体而言，高效的给药频率会反应出疫苗应答与该个体的耐受能力之间的平衡。根据本发明发现，与(例如)每天、每周或每月(四周)的给药频率相比，所述的每两周施用HCV T细胞疫苗的方式所产生的总效力是优异的。这可以通过比较临床试验(在健康志愿者以及患者(特别是慢性HCV患者)中)得到证实。
根据本发明，优选的是尽可能严格地将每两周的给药频率保持为14天的时间间隔。然而，疫苗的给药频率还可以为10天至20天的时间间隔，优选为11天至18天的时间间隔，特别为12天至16天的时间间隔(这种给药频率由于诸如可行性和患者的健康状况之类的实际环境而成为必要)，鉴于此类疫苗接种策略的标准实施方法，所以上述给药频率也被认为是满足所述的“每2周”进行给药的要求的。
虽然进行2次或3次的每两周给药没有消除疫苗的效力，但是优选的是，根据本发明的HCV疫苗每2周给药至少进行4次，优选为至少6次，特别为至少8次。已经证实，这种为期12至16周的疫苗接种策略对于慢性HCV患者而言是特别有效的。还可以采用间断的疫苗接种策略，例如在最初接种疫苗后，在中断一段较长的时间后再进行强化注射。例如，在初期疫苗接种阶段(采用进行3、4、5、6、7或8次的每2周疫苗接种方式)之后，接着进行后期的强化接种，例如在所述的每2周疫苗接种之后进行1至12个月的强化接种，优选为2至6个月的强化接种。
优选的是，将根据本发明的HCV疫苗中的HCV T细胞表位与合适的佐剂、免疫刺激物质等结合，以便能够针对应施用所述疫苗的个体的免疫***，增进或确保HCV T细胞抗原适当地呈递。因此，除了HCV抗原以外，根据本发明的疫苗还包含含有肽键的聚阳离子化合物。优选地，根据本发明的含有肽键的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子化合物、碱性聚氨基酸及其混合物。优选的含有肽键的聚阳离子化合物包含链长为至少4个氨基酸残基的肽链。
因此，优选的是选自以下物质中的聚阳离子化合物，所述物质包括：在多于8个、特别是多于20个的氨基酸残基中含有多于20％、特别是多于50％的碱性氨基酸的多肽；特别是聚精氨酸或聚赖氨酸；聚阳离子型抗微生物肽；含有至少2个KLK基序(其由具有3至7个疏水性氨基酸的连接体隔开)的肽；或其混合物。优选地，根据本发明的含有肽键的聚阳离子化合物含有20至500个氨基酸残基，特别是含有30至200个氨基酸残基。
这些聚阳离子化合物可以以化学方式或重组方式制备，或者可以得自天然来源。
阳离子(多)肽还可是抗微生物肽。这些(多)肽可以来源于原核生物，或者来源于动物或植物，或者可以以化学方式或重组方式制备。所述肽还可以属于防卫素的种类。这些肽的序列可以在(例如)合适的综述文献(例如Curr Pharm Des.2002；8(9)：743-61)中或在以下网址所示的抗微生物序列数据库中找到，所述网址为http://www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/pag2.html。
这种宿主防卫肽或防御物质也是根据本发明的聚阳离子聚合物的优选形式。总体而言，可以作为终产物活化(或下调)合适的免疫***(优选通过APC(包括树突细胞)介导)的化合物用作聚阳离子聚合物。
特别优选的用作本发明的聚阳离子化合物的是由抗菌肽(cathelicidin)衍生的抗微生物肽或其衍生物(参见国际专利申请WO 02/13857，该专利文献以引用方式并入本文)，特别是由哺乳动物的抗菌肽衍生的抗微生物肽，所述抗菌肽优选得自人、牛或小鼠。
由天然来源衍生的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生所得的阳离子肽、触角肽(antennapedia peptide)、脱乙酰壳多糖、或壳多糖的其他衍生物)，或者采用生物化学制备方法或重组制备方法由所述这些肽或蛋白质衍生的其他的肽。其他优选的聚阳离子化合物为抗微生物肽前体(cathelin)或与抗微生物肽前体相关的或由抗微生物肽前体衍生的物质。例如，小鼠的抗微生物肽前体是氨基酸序列为NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH的肽。相关的或衍生的抗微生物肽前体物质具有全部或部分(具有至少15-20个氨基酸残基)的抗微生物肽前体的序列。所述衍生物可以包括由非20个标准氨基酸中的氨基酸对天然氨基酸进行取代或修饰而得的产物。此外，其他的阳离子残基可以被引入到这种抗微生物肽前体分子中。这些抗微生物肽前体分子优选地与抗原相结合。令人惊奇地发现，在未加入其他佐剂的条件下，这些抗微生物肽前体分子还可以有效地作为用于抗原的佐剂。因此，在含有或不含有其他免疫活化物质的条件下，都可以使用根据本发明的含有肽键的聚阳离子化合物(例如所述的抗微生物肽前体分子)作为疫苗配制物中的有效的佐剂。
根据本发明使用的另一种优选的聚阳离子化合物是这样的合成肽，该合成肽含有至少2个KLK基序，并且该至少2个KLK基序被具有3至7个疏水性氨基酸的连接体所隔开(参见国际专利申请WO02/32451，该专利文献以引用方式并入本文)。因此，优选的HCV疫苗进一步含包含序列为R1-XZXZNXZX-R2的肽，其中N为3至7的整数，优选为5；X为带正电荷的天然和/或非天然的氨基酸残基；Z为选自L、V、I、F和/或W中的氨基酸残基；R1和R2互相独立地选自-H、-NH2、-COCH3、-COH、具有至多20个氨基酸残基的肽、或者含有或不含有肽的肽反应性基团或肽连接体；X-R2可以是所述多肽的C末端氨基酸残基的酰胺、酯或硫代酯。
根据本发明的聚阳离子化合物还可以与其他免疫物质(immuniser)相结合。对于所述的这种其他免疫物质的优选实例在专利文献WO 01/93905和WO 02/095027中有所公开(含I或含U的寡脱氧核苷酸(I-或U-ODN)；其中根据本发明，I-ODN还可以特别用作TLR的配体或拮抗剂(参见下文))。优选地，I-或U-ODN可以与根据专利文献WO 02/32451中所述的分子(特别是KLKLLLLLKLK)或聚精氨酸结合。
根据本发明使用的HCV T细胞抗原应为得自HCV蛋白的保守区域的T细胞抗原。因此，优选地使用衍生自HCV蛋白质的保守多肽的表位，已知该表位是患者中产生免疫应答的靶位。为了减少病毒逃脱的情况，应该优选采用在最普遍的株系中保守的肽的库。这保护了对HCV特异性的T细胞免疫的诱导过程。所述肽与MHC分子结合，从而被T细胞受体识别。由于HLA-A2是白种人中最普通的MHC分子(在MHC为I类的情况下)，因此仅选出了与这种HLA等位基因产物相互作用的多肽。因此，对于在这种人群中应该具有最佳效力的HCV疫苗而言，根据本发明应该将带有对HLA型特异的T细胞表位的这种HCV疫苗接种到对某种HLA型(例如HLA-A2)呈阳性的个体中。本发明使用的HCVT细胞抗原的长度是不重要的。应该考虑的是所需多肽的最佳的合成方法、最佳的溶解性、每个多肽中T细胞表位的最佳的数目等。优选地，HCV T细胞表位以由7至50个氨基酸残基、优选为由8至45个氨基酸残基、特别是由8至20个氨基酸残基构成的多肽形式提供，其中每个多肽都包含至少1个T细胞表位。
根据本发明使用的优选的HCV T细胞抗原可以选自作为有效的表位而在专利文献WO 01/24822、WO 2004/024182、WO 2005/004910和/或PCT/EP2005/054773中公开的那些。优选地，T细胞抗原选自：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，
GYKVLVLNPSVAAT，
AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，
DLMGYIP(A/L)VGAPL，
GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，
VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，
AAWYELTPAETTVRLR，
GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，
FTDNSSPPAVPQTFQV，
LEDRDRSELSPLLLSTTEW，
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，
MSTNPKPQRKTKRNTNR，
LINTNGSWHINRTALNCNDSL，
TTILGIGTVLDQAET，
FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，
ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，
AFCSAMYVGDLCGSV，
GVLFGLAYFSMVGNW，
VVCCSMSYTWTGALITPC，
TRVPYFVRAQGLIRA和
TTLLFNILGGWVAAQ；
或者它们的片段，其中所述片段都包含至少7个、优选为至少8个、特别是至少9个氨基酸残基，并且所述氨基酸残基含有至少1个T细胞表位。优选地，根据本发明的HCV疫苗具有至少3个T细胞表位，并且每个T细胞表位都得自不同的热点表位，其中所述热点表位被定义为含有选自以下肽的表位：AYAAQGYKVLVLNPSVAAT、GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA。此外，优选地，根据本发明的HCV疫苗进一步包含热点表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK和DLMGYIP(A/L)VGAPL中的至少1种的表位。优选地，所述至少3个表位中的每个表位都选自以下三组：GYKVLVLNPSVAAT、AYAAQGYKVL或AYAAQGYKVLVLNPSVAAT；CINGVCWTV、GEVQVVSTATQSFLAT或GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV；和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、MWNFISGIQYLAGLSTLPGN、NFISGIQYLAGLSTLPGNPA、QYLAGLSTL或HMWNFISGI。此外，优选的是进一步包含选自以下的至少1种表位：KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK、KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL、YLLPRRGPRL、LPRRGPRL，GPRLGVRAT或RLGVRATRK；或者DLMGYIPAV，GYIPLVGAPL或DLMGYIPLVGAPL。
根据本发明的优选HCV疫苗包含以下表位中的至少2个表位：KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DLMGYIPAV，LEDRDRSELSPLLLSTTEW，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV，GYKVLVLNPSVAAT，CINGVCWTV，AAWYELT-PAETTVRLR，YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，TAYSQQTRGLLG，HMWNFISGIQY-LAGLSTLPGNPA，IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP.
优选地，HCV疫苗包含至少4个、优选为至少5个、至少6个、至少8个上述表位，或者包含所有上述12个表位。
根据本发明的另一种优选的HCV疫苗包含以下表位中的至少2个表位：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，DYPYRLWHYPCTVNFTIFKV
AAWYELTPAETTVRLR，TAYSQQTRGLLG，HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK和SMSYTWTGALITP。优选地，这种HCV疫苗包含至少4个、至少5个、特别是包含所有上述7个表位。
本发明的HCV疫苗优选包含至少1个A2表位和至少1个DR1表位。
本发明的HCV疫苗优选包含至少1个DR7表位。
以下表位的组合被认为是特别有效的(至少1组上文所述的表位是得自(1)至(5)组中的至少3组中的表位)：
(1)KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK或KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL或YLLPRRGPRLGVRATRK或YLLPRRGPRL或LPRRGPRL或，LPRRGPRLGVRATRK或GPRLGVRATRK或RLGVRATRK或KFPGGYLLPRRGPRLGVRATRK，
(2)AYAAQGYKVLVLNPSVAAT或AYAAQGYKVL或AAQGYKVLVLNPSVAAT或KVLVLNPSVAAT或GYKVLVLNPSVAAT或AYAAQGYKVLVLNPSV或AYAAQGYKVLVLNPSVAA或AAQGYKVLVLNPSVA或AYAAQGYKVLPSVAAT或AYAAQGYKVLAAT，
(3)DLMGYIP(A/L)VGAPL或DLMGYIPALVGAPL或DLMGYIP(A/L)VG或DLMGYIP(A/L)VGAP或DLMGYIP(A/L)V或DLMGYIPLVGAPL或DLMGY-IPLVGA或DLMGYIPLV，
(4)GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV或GEVQVVSTATQSFLAT或CINGVCWTV或VSTATQSFLATCINGVCWTV或TQSFLATCINGVCWTV或GEVQVVSTATQSFLAT-CING或GEVQVVSTATQSFLAT，
(5)HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA或MWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA或HMWNFISGI或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN或NFISGIQYLAGLSTLPGN或QY-LAGLSTL或HMWNFISGIQYLAGLSTL或HMWNFISGISTLPGNPA或HMWQY-LAGLSTLPGNPA或MWNFISGIQYLAGLSTLPGN；特别是，已经证明含有表位GYKVLVLNPSVAAT、DLMGYIPAV、CINGVCWTV和HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA的HCV疫苗是特别有效的。
如上所述，根据本发明的每2周给药的疫苗包含由多于单一一种抗原形成的混合物(“库”)。优选地，所述疫苗包含至少3种、优选至少4种、特别是至少5种不同的HCV T细胞抗原。在其他实施方案中或者如果(例如)对较大范围内的人群进行疫苗接种，则所述混合物可以包含5至20个、优选8至15个不同(即，具有不同的氨基酸序列)的表位。
已经证明，被提议用于注射的肽抗原的量在之前公开的剂量范围内仍是有效的。因此，根据本发明的HCV疫苗的优选剂量(即，合并在一起的肽的总量)为每份给药剂量中包含1至20mg、优选3至10mg、特别是4至6mg的HCV T细胞抗原。
如上所述，已经发现给药途径对于达到最佳的效力也是重要的。已报道的T细胞疫苗的有效给药途径也适用于本发明。优选地，每2周对根据本发明的HCV疫苗进行皮下给药或皮内给药，特别是进行皮内给药(在本说明书中，术语真皮内(i.d.)和皮内(i.c.)可互换使用)。
根据本发明的HCV疫苗可以进一步包含免疫刺激化合物，以用于进一步刺激对HCV抗原的免疫应答。优选地，在根据本发明的药物制剂中进一步包含的免疫刺激化合物选自：免疫刺激脱氧核苷酸、alumn、弗罗因德完全佐剂、弗罗因德不完全佐剂、免疫应答调节剂、神经活性物质、特别是人类生长激素、或它们的组合。免疫刺激脱氧核苷酸为(例如)天然或人工合成的含有CpG的DNA，由无脊椎动物衍生的一小段伸长的DNA，或是在某一碱基位置处含有非甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的短的寡核苷酸(ODN)形式及含有肌苷和/或尿苷的ODN(I-ODN、U-ODN)形式，如专利文献WO 01/93905和WO02/095027所述。神经活性物质，例如与聚阳离子化合物结合的神经活性物质在专利文献WO 01/24822中有所描述。
在本发明的研究过程中，发现如果将根据本发明的HCV疫苗与免疫应答调节剂(优选与toll样受体(TLR)7拮抗剂或配体、特别是与toll样受体(TLR)7拮抗剂)结合给药，就可以获得优异的效果。免疫应答调节剂(IRM)是一种选择性地活化toll样受体(TLR)的独特的合成分子，其中所述toll样受体对于刺激先天的和细胞介导的免疫过程是重要的。免疫应答调节剂具有范围广泛的、潜在且重要的应用范围，包括增强对疫苗抗原的免疫应答以及疾病特异性的单一疗法。IRM的独特的TLR活化特征谱(例如TLR3、TLR7、TLR8或TLR7和8、TLR9)使得可以选择性地激活多种细胞因子，例如干扰素α(IFN)、白细胞介素-12、IFN-γ和肿瘤坏死因子α。由IRM诱导的一系列细胞因子增强了细胞介导的免疫过程，并使免疫过程发展成强化了它们作为疫苗佐剂的能力的Th1应答。IRM在(例如)专利文献US 4,689,338、US5,238,944、US 6,083,505、US 2004/0076633、WO 03/080114和WO2005/025583中有所公开。
优选地，HCV疫苗与1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(咪喹莫特)结合给药，优选地，作为局部施用的制剂，特别是作为膏状物。这种含有咪喹莫特的膏状物的实例为购自AldaraTM的商品。
AldaraTM是含有咪喹莫特的膏状物的商品名。每克5％的膏状物在水包油状雪花膏底料中含有50mg的咪喹莫特，其中所述底料由异硬脂酸、十六醇、十八醇、白凡士林、聚山梨醇酯60、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、甘油、黄原胶、纯净水、苯甲醇、羟苯甲酯和羟苯丙酯构成。
根据本发明的优选实施方案，将本发明的HCV疫苗以皮下或皮内(特别是皮内)的方式进行给药，并且将咪喹莫特以膏状物(优选为含量为5(重量)％的膏状物)的形式直接施用在注射位点上。咪喹莫特(AldaraTM)作为第一种市售的IRM分子被批准用于治疗病毒引起的状况、外部生殖器和肛周***。其他适应征包括光化性角化病和基底细胞癌。IRM，特别是咪喹莫特，表现出活化朗格汉斯细胞并增强它们向***迁移的能力。最近，咪喹莫特还被研制作为人类试验中用于黑素瘤多肽疫苗的佐剂。
优选地，为了增强根据本发明的HCV疫苗的免疫原性，可以在每次接种疫苗之后都将所述的膏状物直接施用在注射位点(大约3x3cm＝9cm2)上，并且在至少8小时后，可以对注射位点进行温和的清洗。所述的膏状物还可以在注射之后的某一时间施用，例如在最初注射后的4至24小时之后，优选为6至18小时，特别是10至16小时。可选择地，所述膏状物可以在接种疫苗之前施用，例如在接种疫苗之前的24小时施用。
根据另一个方面，本发明涉及至少1种HCV T细胞抗原和含有肽键的聚阳离子化合物在制备HCV疫苗中的用途，其中所述HCV疫苗通过每2周给药、至少进行3次来治疗和预防HCV感染。
本发明的另一个方面涉及用于治疗和预防HCV感染的试剂盒，该试剂盒含有如本文所定义的至少4个剂量的HCV疫苗以及用于每2周给药的给药工具。
优选地，根据本发明的试剂盒进一步包含如本文所定义的免疫应答调节剂。
对根据本发明的试剂盒进行特别设计，以用于每2周给药。因此，优选地本发明的试剂盒还包含用于帮助患者或负责进行每2周给药的医务人员的装置(工具)，例如用于进行每2周给药处理的给药手册、用于进行每2周给药处理的日历、具有每2周的闹钟功能的电子提醒日历、或它们的组合。
在以下的实施例和附图中对本发明进行进一步的描述，但是这些描述不限定本发明。
图1显示，与皮下注射相比，在HLA-A*0201转基因小鼠中真皮内施用HCV疫苗诱导出更强的HCV肽特异性的T细胞应答，该应答可以通过共同施用AldaraTM而进一步增强(免疫刺激剂：咪喹莫特)。
图2和3显示，在HLA-A*0201转基因小鼠中增加的注射次数增强了HCV肽的特异性免疫应答，并且施用额外的免疫刺激剂产生更快且更显著的针对某种HCV特异性的MHC I类限制性表位的应答(CD8+T细胞应答)。
图4示出对HLA-A*0201转基因小鼠进行间隔注射方法会对短期应答产生影响，并且共同施用其他的免疫刺激剂会诱导持续的针对某种HCV特异性的MHC I类限制性表位的应答。
图5示出了根据实施例5至7的临床研究方案。
图6示出了对采用最佳时间表的IC41疫苗产生的干扰素γ酶联免疫斑点应答的时间过程图。图中示出了在5个处理组中应答者的总酶联免疫斑点应答(CD4和CD8T细胞)(A)和CD8 T细胞应答(B)的中位数(用于计算疫苗的总量以及I类斑点的总数，参见实施例5至7)。(C)采用最佳的和老式的时间表的重要的CD8+I类T细胞应答。图中示出了在所有的酶联免疫斑点I类应答者中I类斑点的总数的中位数。
实施例
实施例1：
施用位点对HLA-A*0201转基因小鼠中的HCV肽特异性T细胞应答的影响
小鼠：HLA-A*0201转基因小鼠(HHD.2)
疫苗：临床批号PD03127(批号K)
对每只小鼠使用的100μl体积的注射物包含：
抗原：Ipep 83(KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL)200μg，Ipep 84(GYKVLVLNPSVAAT)200μg，Ipep 87(DLMGYIPAV)200μg，Ipep 89(CINGVCWTV)200μg，Ipep 1426(HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA)200μg；
佐剂：平均聚合度(使用多角度激光散射仪进行测定(MALLS))为40至50个精氨酸残基的聚-L-精氨酸，批号113K7277，Sigma Aldrich公司，400μg；
其他佐剂：含有5％咪喹莫特的AldaraTM，一种通过TLR7起作用的免疫刺激剂，3M Health Care有限公司，剂量为：大约20mg/只小鼠；
配制缓冲剂：5mM磷酸盐/270mM山梨醇。
实验设定每组10只小鼠：
1.皮下注射入侧腹，
2.真皮内注射入背部，
3.真皮内注射入背部，然后在注射区域立即施用AldaraTM膏状物。
在第0、14和28天时，在如上所述的不同位置处，向小鼠注射总量为100μl/只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物质。在第35天时，取得各实验组中的小鼠的脾，并采用磁选分离技术(MACS)富集CD4+T细胞。除去了CD4+T细胞的脾细胞用于测定CD8+T细胞的应答。采用IFN-γ酶联免疫斑点检测法测定MHC II类限制性T细胞(CD4+T细胞)和MHC I类限制性T细胞(CD8+T细胞)对各种单一的HCV衍生肽的应答情况。总体而言，用非相关肽进行的再刺激不能产生IFN-γ。
结果
如图1所示，在进行皮下注射之后，可以检测到MHC I类限制性CD8+T细胞对Ipeps 84、87和89做出的应答，以及MHC II类限制性CD4+T细胞对Ipeps 84和1426做出的应答。这些应答可以通过真皮内施用疫苗而进一步增强。此外，在进行真皮内注射之后直接共同施用AldaraTM会进一步增强所检测到的应答，特别是MHC I类限制性CD8+T细胞对Ipep 87做出的应答。
总之，与皮下注射相比，真皮内施用HCV疫苗会诱导出更强的HCV肽特异性T细胞的应答，这种应答可通过共同施用AldaraTM而进一步增强。
实施例2：
在经过1次、2次或3次注射之后，在HLA-A*0201转基因小鼠中产生的HCV肽特异性MHC I类限制性CD8+T细胞的应答情况
小鼠：HLA-A*0201转基因小鼠(HHD.2)
疫苗：对每只小鼠使用的100μl体积的注射物包含：
抗原：Ipep 83 200μg，Ipep 84 200μg，Ipep 87 200μg，Ipep 89200μg，Ipep 1426 200μg；
佐剂：平均聚合度(使用MALLS进行测定)为40至50个精氨酸残基的聚-L-精氨酸，批号113K7277，Sigma Aldrich公司，400μg；
其他佐剂：含有5％咪喹莫特的AldaraTM，一种通过TLR7起作用的免疫刺激剂，3M Health Care有限公司，剂量为：大约20mg/只小鼠；
配制缓冲剂：5mM磷酸盐/270mM山梨醇。
实验设定每组30只小鼠(10只/分析的时间点)：
1.真皮内注射入背部，
2.真皮内注射入背部，然后在注射区域立即施用AldaraTM膏状物。
在第0、14和28天时，以真皮内注射的方式向小鼠注射总量为100μl/只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物质。在第7、21和35天时，取得各实验组中的小鼠的脾，并采用磁选分离技术(MACS)除去CD4+T细胞。采用酶联免疫斑点检测法测定在使用单一的HCV衍生肽进行再刺激后由MHC I类限制性CD8+T细胞产生的IFN-γ。总体而言，用非相关肽进行的再刺激不能产生IFN-γ。
此外，进行体内CTL检测，以测定在进行单一一次注射之后或在进行强化注射之后MHC I类限制性CD8+T细胞的效应物功能。简言之，由首次用于实验的小鼠制备的抗原呈递细胞(APC)或者载有Ipep 87并用CFSE高标记，或者(为了进行对照)载有Ipep1247(非相关肽)并用CFSE中标记，或者未载有肽，其用CFSE低标记。将这些APC混合在一起(1:1:1)，并在第6、20或34天时通过静脉注射将其适当地转移到接种了疫苗的小鼠体内。一天后(即，第7、21或35天)，进行FACS分析，以测定经转移的载有相关肽的APC是否存在(如果所述APC不存在，则表示发生了由疫苗诱导的杀死行为)。在任何实验中都不能观察到未负载的APC的杀死行为。
结果
如图2中上部的图所示，在经过单一一次真皮内注射或强化的真皮内注射之后，可以检测到由MHC I类限制性CD8+T细胞产生的HCV肽特异性IFN-γ，其差别在于对于某些肽的应答强度不同。
详细而言，在经过单一一次真皮内注射之后，只检测到对Ipep89的应答，而在经过2次注射后，以相当的强度诱导出对Ipep84、87和89的应答。这种应答可通过第3次注射而进一步增强，其中清楚地示出对Ipep87的应答要优于对Ipep89和84的应答。
与此形成对比的是，通过共同施用AldaraTM在单一一次注射后已经诱导出对所有3种肽的应答。在第2次施用之后，已经可以看出占有优势的对Ipep87的应答。第3次施用进一步增强了Ipep87特异性应答的强度。
如图2中下部的图所示，需要进行2次注射来诱导MHC I类限制性CD8+T细胞的Ipep87特异性效应物的功能。此外，在共同施用AldaraTM之后，效应物的功能显著且强烈地增强。
总之，结果显示，注射次数的增加会增强HCV特异性的免疫应答。此外，其他免疫刺激剂(AldaraTM)的施用会产生更快且更明显的针对某些MHC I类限制性CD8+T细胞表位的应答。
实施例3：
在经过3次或6次注射之后，在HLA-A*0201转基因小鼠中产生的HCV肽特异性MHC I类限制性CD8+T细胞的应答情况
小鼠：HLA-A*0201转基因小鼠(HHD.2)
疫苗：临床批号PD03127(批号K)
对每只小鼠使用的100μl体积的注射物包含：
抗原：Ipep 83 200μg，Ipep 84 200μg，Ipep 87 200μg，Ipep 89200μg，Ipep 1426 200μg；
佐剂：平均聚合度(使用MALLS进行测定)为40至50个精氨酸残基的聚-L-精氨酸，批号113K7277，Sigma Aldrich公司，400μg；
其他佐剂：含有5％咪喹莫特的AldaraTM，一种通过TLR7起作用的免疫刺激剂，3M Health Care有限公司，剂量为：大约20mg/只小鼠；
配制缓冲剂：5mM磷酸盐/270mM山梨醇。
实验设定每组20只小鼠(10只/分析的时间点)：
1.皮下注射入侧腹，
2.真皮内注射入背部，
3.真皮内注射入背部，然后在注射区域立即施用AldaraTM膏状物。
在第0、14、28、43、58和71天时，在如上所述的不同位置处，向小鼠注射总量为100μl/只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物质。在第35或78天时，取得各实验组中的小鼠的脾，并采用磁选分离技术(MACS)除去CD4+T细胞。采用酶联免疫斑点检测法测定在使用单一的HCV衍生肽进行再刺激后由MHC I类限制性CD8+T细胞产生的IFN-γ。总体而言，用非相关肽进行的再刺激不能产生IFN-γ。
结果
图3示出了在经过6次及3次注射之后由所得的MHC I类限制性CD8+T细胞产生的IFN-γ。特别针对Ipep87产生的应答可通过进行额外的疫苗接种而得到增强，并且与施用位点无关。最强烈的应答总是在共同施用疫苗和AldaraTM之后观察到。
总之，数据表明，注射次数的增加会增强HCV特异性的免疫应答。此外，其他免疫刺激剂(AldaraTM)的施用会产生更明显的针对某些MHC I类限制性CD8+T细胞表位的应答。
实施例4：
基于不同的注射时间间隔，在经过3次注射之后，在HLA-A*0201转基因小鼠中产生的短期及长期的HCV肽特异性MHC I类限制性CD8+T细胞的应答情况
小鼠：HLA-A*0201转基因小鼠(HHD.2)
疫苗：对每只小鼠使用的100μl体积的注射物包含：
抗原：Ipep 83 200μg，Ipep 84 200μg，Ipep 87 200μg，Ipep 89200μg，Ipep 1426 200μg；
佐剂：平均聚合度(使用MALLS进行测定)为40至50个精氨酸残基的聚-L-精氨酸，批号114K7276，Sigma Aldrich公司，400μg；
其他佐剂：含有5％咪喹莫特的AldaraTM，一种通过TLR7起作用的免疫刺激剂，3M Health Care有限公司，剂量为：大约20mg/只小鼠；
配制缓冲剂：5mM磷酸盐/270mM山梨醇。
实验设定每组20只小鼠(10只/分析的时间点)：
1.皮下注射入侧腹，
2.真皮内注射入背部，
3.真皮内注射入背部，然后在注射区域立即施用AldaraTM膏状物。
基于1周、2周或4周的时间间隔，在如上所述的不同位置处，向小鼠注射总量为100μl/只小鼠的疫苗3次，其中所述疫苗含有上文列出的物质。在第3次注射后的第7天和第110天时，取得各实验组中的小鼠的脾，并采用磁选分离技术(MACS)除去CD4+T细胞。采用酶联免疫斑点检测法测定在使用单一的HCV衍生肽进行再刺激后由MHC I类限制性CD8+T细胞产生的IFN-γ。总体而言，用非相关肽进行的再刺激不能产生IFN-γ。
结果
如图4中上部的图所示，可以观察到，在各个施用位置处，与注射时间间隔为1周或4周的情况相比，在注射时间间隔为2周的情况下，在经过皮下注射或真皮内注射之后所产生的MHC I类限制性CD8+T细胞的应答要稍微强一些。在共同施用疫苗和AldaraTM之后，没有观察到由于注射时间间隔的影响所导致的显著差别。
图4中下部的图示出了不同的注射时间间隔没有对HCV肽特异性MHC I类限制性CD8+T细胞的应答的持续性产生影响。但是，图中数据清楚地表明，与真皮内或皮下单独注射疫苗的情况相比，在共同施用AldaraTM之后，能够更优异地诱导出对Ipep 87和Ipep 89特异性的MHC I类限制性CD8+T细胞的应答。
总之，数据表明，注射的时间间隔会对短期应答产生影响，并且共同施用其他的免疫刺激剂(AldaraTM)会诱导出极为稳定的针对某些HCV特异性MHC I类限制性表位的应答。
实施例5至7：
临床试验
临床试验是用HCV T细胞抗原库进行的(其中所述疫苗被命名为“IC41”，并且是由代表了HCV的保守T细胞表位的合成肽与作为合成的T细胞佐剂的聚-L-精氨酸形成的混合物构成的；IC41包含得自HCV多肽的不同区域的5个肽，i.a.以下3个表位：HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA、CINGVCWTV和DLMGYIPAV)。因此，IC41含有5个主要衍生自非结构区域NS3和NS4的合成肽，已知，NS3和NS4是患者中产生免疫应答的靶物。它们含有至少4个HLA-A*0201限制性CTL表位和3个高度混杂的CD4+辅助性T细胞表位，并且已经显示，在对标准治疗产生应答或由HCV发生自发康复的患者中，所述的所有这些表位都是被靶向的。在基因型1中，有1个例外的多肽的序列是高度保守的。IC41含有聚-L-精氨酸作为合成佐剂，在动物研究中，聚-L-精氨酸已经显示能够增强Th1/Tc1(IFN-γ)的应答。IC41的临床数据表明，施用所述疫苗是安全的并且耐受性良好，并且在健康志愿者以及慢性HCV患者中，IC41能够诱导HCV特异性的Th1/Tc1应答。
采用如上所述的有效的T细胞检测法来读取疫苗的免疫原性(γ干扰素酶联免疫斑点检测法、T细胞增殖检测法、HLA四聚体/FACS检测法)。这些检测法允许对由治疗性HCV疫苗IC41所诱导的表位特异性T细胞应答进行可靠的测定。所述疫苗诱导的T细胞免疫应答起到了效力的替代参数的作用。酶联免疫斑点检测法可以对诸如人类血液之类的生物样品中的肽特异性功能性(即，分泌细胞因子的)T细胞进行定量。所述检测的基础在于：T细胞在受到由T细胞受体特异性识别的肽的刺激之后，会分泌诸如IFN-γ之类的细胞因子。该反应可以在96孔板上进行。在此类板的过滤器孔中涂敷对IFN-γ特异性的Mab。结果，每个分泌IFN-γ的细胞都会留下IFN-γ斑点，该斑点可以通过随后进行的显色反应而显现出来。这些斑点可以使用自动化的多孔板读取器计数。所得的数目为样品中肽特异性的、分泌IFN-γ的T细胞的个数的量度。分别对IC41中的5个肽的每一个肽进行酶联免疫斑点检测，此外，分别对较长的肽中所包含的3个HLA-A2表位进行测定。
在临床实验IC41-102(健康志愿者)、IC41-201(慢性非应答患者，PCT/EP2005/054773)和IC41-103(疫苗应用达到最佳的健康志愿者)中，对每个酶联免疫斑点检测板都采用外标物，这样可以对由这些临床实验所得的数据进行直接的比较(对IC41-102、IC41-201和IC41-103进行的临床研究的设计如图6所示)。
实施例5：
得到改善的应答者的应答速率
如果在接种疫苗过程中或在接种疫苗之后的任何时间点，所测定的任何肽都比基线值高至少3倍，或者如果基线值为0，而所测定的任何肽至少明显呈阳性，则对该应答评分。
与采用每4周进行接种、进行4次的时间表的IC41-102中的情况相比，IC41-103中所有组都显示改善的应答速率。在采用最频繁(每周1次)的时间表的第3组中，得到了CD8+T细胞应答的最高的应答速率。一种可能的解释为至少部分CD4+T辅助性细胞不依赖于通过强烈且频繁的疫苗刺激而活化的CD8+T细胞。
表1：与IC41-102的第K组相比，在IC41-103研究的第1-5组中的酶联免疫斑点的应答者速率
(NRE：在酶联免疫斑点检测中的非应答者；REIV：CD8+T细胞酶联免疫斑点应答者；REV：CD4+T细胞应答者)
组别    所分析的N值     NRE   CD8+    CD4+    ％CD8    ％CD4
                             (REIV)   (REV)
1            8           0      7       8       88％    100％
2            7           2      5       5       71％    71％
3            8           0      8       5       100％   63％
4            9           1      7       7       78％    78％
5            9           1      6       8       67％    89％
102-K        12          6      5       6       42％    50％
实施例6：
疫苗的总量与增多的I类酶联免疫斑点的总数
为了定量地评估由IC41疫苗接种引起的IFN-γ T细胞应答情况，对每个肽测定酶联免疫斑点的应答的时程：通过增加酶联免疫斑点来计算疫苗的总量，其中所述酶联免疫斑点是在背景被减掉(即，减去非相关的HIV肽)之后针对IC41的5个肽中的每个肽分别测定的酶联免疫斑点。通过增加斑点来计算I类酶联免疫斑点的总数，其中所述酶联免疫斑点是在背景被减掉(即，减去非相关的HIV肽)之后针对IC41的5个HLA-A2表位中的每个表位分别测定的酶联免疫斑点。测定出疫苗的最大总量以及I类斑点的最大总数(通常，在最后接种疫苗后记录这2个值)，并测定出每组中所有应答者的中位数(参见表2)。
表2：通过IC41得到的酶联免疫斑点的总数。为了测定疫苗的总量和I类斑点的总数，参见下表，n表示为酶联免疫斑点应答者的数量。
 
IC41治疗 在所有酶联免疫斑点应答者中，疫苗总量的中位数(每1百万个PBMC中的斑点数) 在所有I类酶联免疫斑点应答者中，I类(CD8+T细胞)斑点的总数的中位数(每1百万个PBMC中的斑点数)
所有的IC41-102和201的verum组 35-40(n＝37) 20(n＝23)
第1组(n＝8) 100(n＝8) 45(n＝7)
第2组(n＝7) 60(n＝5) 50(n＝5)
第3组(n＝8) 45(n＝8) 35(n＝8)
第4组(n＝9) 90(n＝8) 60(n＝7)
第5组(n＝9) 95(n＝8) 105(n＝6)
在IC41-201中，在多个患者中观察到I型(分泌IFN-γ)CD8+T细胞应答与HCV的RNA减少相关：可利用的数据表明，为了使HCV的RNA快速减少1个log10以上，需要每1百万个PBMC至少50个的CD8+T细胞酶联免疫斑点的阈值水平。因此，最佳研究结果的一个目标是在至少一部分疫苗中取得所述水平的免疫原性。
如表2所示，在IC41-103的第1、2和4组中，在酶联免疫斑点的I类应答者中，I类斑点的总数的中位数达到了所述的阈值，而第3组和采用老式的每4周进行接种，进行4次(IC41-102)或6次(IC41-201)时间表的所有应答者没有达到所述的阈值。清楚地是，IC41-103的第5组是最佳的，其取得了为所需阈值的2倍以上的免疫斑点数。
第1至5组中所述疫苗总量的中位数和I类斑点总量的中位数的时程如图6A和B所示。重要的CD8+I类T细胞应答急剧增加的情况与老式的每4周进行接种，进行4次(IC41-102)或6次(IC41-201)的时间表中所产生的情况的比较如图6C所示。
实施例7：
经改善的重要的I类(CD8+)T细胞的应答范围
为了防止诸如表位发生突变而逃脱的逃脱机制，另一个目标是取得广泛的应答，即，在相同的时间且在同一个体中，T细胞同时对1种以上的I类表位产生应答。在之前结束的、采用了老式的每4周进行接种进行4次(IC41-102)或6次(IC41-201)的时间表的2个研究中，最多由1种主要的CD8+T细胞表位诱导应答。
为了对比I类应答的范围，在每组中的所有酶联免疫斑点I类应答者中，测定增强了某一受试对象中的应答的CD8+T细胞表位的数目的中位数(参见表3)。
如表3所示，在IC41-103的第1、3和4组中，增强了某一受试对象中的应答的CD8+T细胞表位的数目的中位数可以为2倍。此外，IC41-103的第5组是最佳的，其取得了在某一受试对象中同时靶向3(中位数)个(得自5个可行的CD8+T细胞表位)CD8+T细胞表位。
表3：重要的I类(CD8+)T细胞的应答范围。总数N表示接受治疗的受试对象/患者的数量，n表示为酶联免疫斑点I类应答者的数量。
 
IC41治疗 总数N 在某一受试对象中的CD8+细胞毒T细胞表位的数量的中位数
所有的IC41-102和201的verum组 120 1(n＝23)
第1组 8 2(n＝7)
第2组 7 1(n＝5)
第3组 8 2(n＝8)
第4组 9 2(n＝7)
第5组 9 3(n＝6)
这些临床和临床前的结果表明，在干扰素γ酶联免疫斑点应答的强度和范围方面(参见表2和3)，确定IC41的最佳应用为第5组，其注射时间间隔为最优选的2个星期。注射时间间隔为1个星期的情况要比注射时间间隔为2个星期的情况差一些，注射时间间隔为4个星期的情况明显更差。皮内(真皮内)治疗比皮下治疗(在第1组(s.c.)和第4组(i.d.)之间没有差别)稍微优异一些，但是最好的效果为第5组。局部施用AldaraTM/咪喹莫特(一种toll样受体7拮抗剂)使得临床效果得以改善。
第3组(时间间隔为1个星期，s.c.)显示出，产生100％的CD8+T细胞应答，但是仅为63％的CD4+T细胞应答(参见表1所示的应答者速率)。这可解释为CD4+T细胞不依赖于通过频繁(每星期1次)施用而产生的CD8+T细胞活化。通过第1组(s.c.)和第4组(i.d.)的对比表明，关于施用途径没有明显的差别。此外，还显示出，绝对的注射次数似乎不能增强强度(表2：第2组和第3组进行了16次疫苗接种而其他各组进行了8次疫苗接种；图5的上部：在第8周(相当于在进行4次疫苗接种后或第2组和第3组中的8次疫苗接种后)时情况已经稳定)。最后，CD8+应答的范围＝在第5组中达到最佳的、在单个受试对象/患者中对多种I类表位(需要对在较长序列内含有最少的I类表位的“热点”肽(WO 2004/024182)进行处理)同时产生应答的情况。
序列表
<110>IntercellAG
<120>HCV疫苗
<130>r47674
<140>PCT/AT2006/000166
<141>2006-04-25
<160>40
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>35
<212>PRT
<213>小鼠属(mus)
<400>1
Figure A200680054377D00281
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>聚阳离子
<400>2
Figure A200680054377D00291
<210>3
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>3
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<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>4
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<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>5
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<220>
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<220>
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<400>6
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<220>
<223>抗原
<400>7
Figure A200680054377D00303
Figure A200680054377D00311
<210>8
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>8
Figure A200680054377D00312
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<212>PRT
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<220>
<223>抗原
<220>
<221>Xaa
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<220>
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<223>F或Y
<220>
<221>Xaa
<222>(21)..(21)
<223>V或I
<400>9
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<211>16
<212>PRT
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<220>
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<400>10
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<211>25
<212>PRT
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<220>
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<400>11
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<212>PRT
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<220>
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<400>12
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<211>16
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<213>人工序列
<220>
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<400>13
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<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>14
Figure A200680054377D00333
Figure A200680054377D00341
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<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>15
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<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>16
Figure A200680054377D00343
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<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>17
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<211>15
<212>PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<211>20
<212>PRT
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<220>
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<220>
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<400>21
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<213>人工序列
<220>
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
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<220>
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>26
Figure A200680054377D00383
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<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>27
Figure A200680054377D00384
Figure A200680054377D00391
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>29
Figure A200680054377D00393
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<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>30
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<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>31
Figure A200680054377D00402
<210>32
<211>9
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<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>32
Figure A200680054377D00403
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>33
Figure A200680054377D00404
Figure A200680054377D00411
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>34
<210>35
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>35
Figure A200680054377D00413
<210>36
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>36
Figure A200680054377D00414
Figure A200680054377D00421
<210>37
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>37
Figure A200680054377D00422
<210>38
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>38
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>39
Figure A200680054377D00431
<210>40
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>抗原
<400>40
Figure A200680054377D00432

Claims (19)

1.用于预防或治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，其中每2周对人类个体进行HCV疫苗给药，至少3次，所述HCV疫苗包含：
-有效量的至少一种HCV T细胞抗原，以及
-含有肽键的聚阳离子化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中每2周进行HCV疫苗给药，至少4次，优选至少6次。
3.根据权利要求1所述的方法，其中每2周进行HCV疫苗给药，至少8次。
4.根据权利要求1至3的任意一项中所述的方法，其中所述的含有肽键的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子化合物、碱性聚氨基酸和它们的混合物。
5.根据权利要求1至4的任意一项中所述的方法，其中所述的含有肽键的聚阳离子化合物包含链长为至少4个氨基酸残基的肽链。
6.根据权利要求1至4的任意一项中所述的方法，其中所述的含有肽键的聚阳离子化合物选自：在多于8个、特别是多于20个的氨基酸残基中含有多于20％、特别是多于50％的碱性氨基酸的多肽，特别是聚精氨酸或聚赖氨酸，聚阳离子型抗微生物肽，含有至少2个由具有3至7个疏水性氨基酸的连接体隔开的KLK基序的肽，或它们的混合物。
7.根据权利要求1至6的任意一项中所述的方法，其中所述的含有肽键的聚阳离子化合物含有20至500个氨基酸残基，特别是含有30至200个氨基酸残基。
8.根据权利要求1至7的任意一项中所述的方法，其中所述的HCV T细胞抗原为由7至50个氨基酸残基、优选为8至45个氨基酸残基、特别是8至20个氨基酸残基构成的多肽，其中每个所述肽都包含至少1个T细胞表位。
9.根据权利要求1至8的任意一项中所述的方法，其中所述的HCV T细胞抗原选自以下的一个或多个：
KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRK，
GYKVLVLNPSVAAT，
AYAAQGYKVLVLNPSVAAT，
DLMGYIP(A/L)VGAPL，
GEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTV，
HMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPA，
VDYPYRLWHYPCT(V/I)N(F/Y)TIFK(V/I)RMYVGGVEHRL，
AAWYELTPAETTVRLR，
GQGWRLLAPITAYSQQTRGLLGCIV，
IGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFK，
FTDNSSPPAVPQTFQV，
LEDRDRSELSPLLLSTTEW，
YLVAYQATVCARAQAPPPSWD，
MSTNPKPQRKTKRNTNR，
LINTNGSWHINRTALNCNDSL，
TTILGIGTVLDQAET，
FDS(S/V)VLCECYDAG(A/C)AWYE，
ARLIVFPDLGVRVCEKMALY，
AFCSAMYVGDLCGSV，
GVLFGLAYFSMVGNW，
VVCCSMSYTWTGALITPC，
TRVPYFVRAQGLIRA和
TTLLFNILGGWVAAQ；
或者它们的片段，其中所述片段包含至少7个、优选为至少8个、特别是至少9个氨基酸残基，并且所述氨基酸残基含有至少1个T细胞表位。
10.根据权利要求1至9的任意一项中所述的方法，其中所述的HCV疫苗包含由至少3种、优选为至少4种、特别是至少5种不同的HCV T细胞抗原构成的混合物。
11.根据权利要求1至10的任意一项中所述的方法，其中所述的HCV疫苗在每份给药剂量中包含1至20mg、优选为3至10mg、特别是4至6mg的HCV T细胞抗原。
12.根据权利要求1至11的任意一项中所述的方法，其中所述的HCV疫苗通过皮下或皮内进行给药，特别是通过皮内进行给药。
13.根据权利要求1至12的任意一项中所述的方法，其中所述的HCV疫苗与免疫应答调节剂、优选与toll样受体(TLR)拮抗剂、特别是与toll样受体(TLR)7拮抗剂、特别与TLR7和8拮抗剂或与TLR9拮抗剂相结合进行给药。
14.根据权利要求1至13的任意一项中所述的方法，其中所述的HCV疫苗与1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(咪喹莫特)相结合进行给药，优选地，作为局部施用的制剂，特别为膏状物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述的HCV疫苗通过皮下或皮内进行给药，优选地通过皮内进行给药，并且将咪喹莫特以膏状物的形式、优选为以含量为5重量％的膏状物的形式直接施用在注射位点上，优选地在进行了HCV疫苗给药之后的4至24小时之后、特别是10至16小时之后。
16.至少1种HCV T细胞抗原和含有肽键的聚阳离子化合物在制备HCV疫苗中的用途，其中所述HCV疫苗通过至少4次的每2周给药来治疗和预防HCV感染。
17.用于治疗和预防HCV感染的试剂盒，所述试剂盒含有如权利要求1至15的任意一项中所定义的至少4个剂量的HCV疫苗以及用于每2周给药的给药工具。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其进一步包含如权利要求13至15的任意一项中所定义的免疫应答调节剂。
19.根据权利要求17或18所述的试剂盒，其中所述的用于每2周给药的给药工具选自：用于每2周给药的给药手册、用于每2周给药的日历、具有每2周的闹钟功能的电子提醒日历、或它们的组合。
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