JP2006515266A - オリゴヌクレオチド組成物および免疫応答の調節のためのそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、3’−OH、5’−OHホスホロチオエートおよびホスホジエステルポリヌクレオチドを含む組成物ならびに免疫応答を調節するためのそれらの使用に関する。
樹状細胞(DC)は、一次免疫応答の開始に関与する抗原提示細胞(APC)である。それらの機能は、成熟に伴って変化する。未熟DCはネイティブタンパク質抗原のプロセシングに非常に有効であるが、しかし十分な細胞表面MHCクラスIIおよび抗原提示のための同時刺激分子を欠く。成熟DCは、提示のための新規のタンパク質をあまり捕捉できないが、休止CD4およびCD8Tリンパ球の刺激にはより効率的である。形態学的には、成熟DCでは、細胞のサイズおよび粒度を増大する。成熟DCは、細胞表面分子MHC II、CD40、CD83ならびに同時刺激分子CD80およびCD86のレベルが
増大している。成熟DCの活性化は、先天性および後天性免疫の両方を強化する高レベルのIL−12の合成を生じる。
40、CD80、CD83およびCD86の上向き調節(アップレギレーション)を誘発することが報告されている(Sparwasser et al. Eur. J. Immunol. 1998, 28: 2045-205;
Hartman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 9305-9310; Askew et al. J. Immunol. 2000, 165: 6889-6895)。塩基数が30であるCpGモチーフを含む合成ホス
ホジエステルオリゴヌクレオチドは、IFNの合成を刺激し、そしてDC前駆体上のCD80およびCD86の発現を上向き調節することが報告されている(Kadowaski et al. J. Immunol. 2001 166: 2291-2295)。
本発明は、6塩基の3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物を提供することにより、この必要性を満たす。一実施形態では、ポリヌクレオチドのリン酸骨格は、ホスホジエステル骨格である。別の実施形態では、ポリヌクレオチドのリン酸骨格は、ホスホロチオエート骨格である。好ましくは3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは合成物であり、さらに好ましくは3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、5’GTGTGT3’(配列番号1)、5’GGTGGG3’(配列番号2)、5’GGGTGG3’(配列番号3)、5’GGGCGG3’(配列番号4)、5’GGGAGG3’(配列番号5)、5’GGGGGG3’(配列番号6)および5’GGCCGG3’(配列番号7)からなる群から選択される。3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、ヒトまたは動物に投与された場合、免疫応答を刺激する。免疫応答は、全身性または局所性であり得る。一実施形態では、3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが投与されるヒトまたは動物におけるAPCを刺激した。3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、APCの刺激のためにインビトロで直接APCに投与され得る。刺激されたAPCは次に、ヒトまたは動物における免疫応答の活性化のためにヒトまたは動物に投与され得る。
の増大、ならびに細胞表面でのOX−2の発現の低減からなる群から選択される応答を誘導することにより、DCを刺激する。
. Immunol. 1998; 160: 1612(IL−12による自己免疫における自己抗体産生の下向き調節); Vogel et al., Eur. J. Immunol., 1996; 26: 219(IL−12による、自己免疫の発生に関与するBリンパ球サブセットであるB1リンパ球の抑制);Dey et al., Blood, 1998; 91: 3315(IL−12による移植片対宿主疾患(GVHD)の抑制);Smits
et al., Int. Arch Allergy Immunol., 2001; 126-102(アレルギーの治療におけるIL−12によるTh1プロフィールに向けての病原性Th2免疫プロフィールの修飾)参照)。その他の実施形態では、本発明は、予防接種による自己免疫疾患の治療および移植拒絶の予防を達成する(例えばZhang et al., J. Mol. Med. 1996; 74: 653(自己反応性疾患に関与する自己反応性BまたはTリンパ球に対する予防接種);Vignes et al., Eur. J. Immunol., 2000; 30: 2460(移植片拒絶に関与する同種異系反応性Tリンパ球に対す
る予防接種);Liu et al., J. Exp. Med., 2002; 196: 1013(in situでの活性
化DC細胞への死細胞の送達による免疫寛容の導入)参照)。
の作用を強化する組成物および方法を提供することである。
本発明は、6個の塩基を含む単離された3’−OH、5’−OHポリヌクレオチド配列を含む組成物であって、塩基の少なくとも50%がグアニンであり、5’塩基がグアニンであり、かつ組成物が投与される動物またはヒトにおける免疫応答を刺激する組成物を提供する。本発明は、動物またはヒトにおける1または複数の抗原提示細胞(APC)または好ましくは1または複数のDCを刺激するのに有効な量で、3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物の動物またはヒトへの投与を含む方法も提供する。動物またはヒトにおける1または複数のAPCの刺激は、全身免疫応答または局所免疫応答を生じ得る。本発明は、APCを刺激するのに有効な量での、抗原を含むAPCへの3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドを含む組成物のインビトロ投与を含む方法も提供する。これらのAPCは次に、免疫応答の刺激のために薬学的に許容可能な担体とともに動物またはヒトに投与され得る。免疫調節剤、賦形剤、希釈剤および/または担体は、動物またはヒトに投与されるこれらの組成物のいずれかに付加され得る。本発明は、動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するための、かつ、インビトロでの抗原提示細胞の刺激のために有用な薬剤の製造における3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドの使用も包含する。APC、例えばDCの刺激を誘導する6塩基3’−OH、5’−OH合成ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの予期せぬそして意外な能力は、動物またはヒトに重要な利益を提供する。
、5’GGCCGG3’(配列番号4)(N4A)、5’GGGGGG3’(配列番号5)(N5A)、5’GGGAGG3’(配列番号6)(N6A)および5’GGGCGG3’(配列番号7)(N7A)。これらの実施形態では、ポリヌクレオチド鎖中の各ヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチドである。上記の配列番号に対応するホスホロチオエート骨格を含む3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、本明細書中では以下のように呼ばれる:5’GTGTGT3’(配列番号1)(N1B)、5’GGTGGG3’(配列番号2)(N2B)、5’GGGTGG3’(配列番号3)(N3B)、5’GGCCGG3’(配列番号4)(N4B)、5’GGGGGG3’(配列番号5)(N5B)、5’GGGAGG3’(配列番号6)(N6B)および5’GGGCGG3’(配列番号7)(N7B)。これらの実施形態では、ポリヌクレオチド鎖中の各ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドである。本発明は、1または複数のホスホジエステルヌクレオチドおよび1または複数のホスホロチオエートヌクレオチドを含む3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドも包含する。好ましくは3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、N1A、N2B、N3BまたはN5B、さらに好ましくはN3BまたはN5Bである。
用語の前後関係によって、DCまたは別のAPCの活性化または成熟を、あるいは免疫応答の活性化または増大を指す。DCの刺激は、細胞サイズおよび/または粒度の増大、IL−1β、IL−12および/またはIFNγ産生の増大、エンドサイトーシスの増大、CD80、CD83、CD86、MHC IIまたはそれらの任意の組合せの細胞表面発
現の増大、OX−2細胞表面発現の低減、あるいはそれらの任意の組合せにより立証され得る。したがって「樹状細胞応答」としては、細胞サイズおよび/または粒度の増大、IL−1β、IL−12またはIFNγ産生の増大、エンドサイトーシスの増大、CD80、CD83、CD86またはMHC IIの細胞表面発現の増大、OX−2細胞表面発現
の低減あるいはそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。「樹状細胞」および「DC」という用語は、間質性DC、ランゲルハンス細胞由来DC、形質細胞様(plasmacytoid)DCおよび上記の細胞の任意の前駆体を含むが、これらに限定されない。本明細書中で用いる場合、「産生」という用語は分子の合成および/または分泌を指す。好ましい実施形態では、樹状細胞は間質性DCである。
の免疫細胞のレベルまたは量の増大、特定位置における免疫細胞の動員(運動性および遊走)、個体におけるサイトカインのレベルまたは量の増大、個体におけるケモカインのレベルまたは量の増大、抗原提示増大、エンドサイトーシス増大、同時刺激性分子(補助分子)の増大または獲得、接着分子の増大または獲得、サイトカイン受容体の増大または獲得、ケモカイン受容体の増大または獲得、細胞媒介性細胞傷害性の増大、形態学的変化、
免疫細胞の記憶の確立、活性酸素(reactive oxygen)中間体のレベルまたは量の増大、
一酸化窒素のレベルまたは量の増大、神経内分泌分子(例えばホルモン、神経伝達物質等)のレベルまたは量の増大、免疫寛容または免疫抑制の遮断により立証され得るが、これらに限定されない。免疫細胞としては、リンパ球、例えばB細胞、T細胞、例えばCD4+およびCD8+細胞、およびNK細胞;単核球食細胞;顆粒球、例えば好中球、好酸球、好塩基球;本明細書中に記載されたような樹状細胞;ならびに上記細胞の任意の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体型としては、IgG、IgA、IgM、IgD、IgEおよびIgYが挙げられる。
群(患者は樹状突起萎縮を有する)(Takashima et al., J. Intellect. Disabil. Res. 1994, 38: 265)、DCの不適切活性化を伴う自己免疫疾患(例えばDCによる自己抗原
の長期提示)(Erikson et al., J. Exp. Med. 2003, 197: 323およびLudewig et al., Curr. Opin. Immunol. 2001, 13: 657)、脊髄損傷(患者は樹状突起萎縮を有する)(Iversen et al., Blood 2000, 96: 2081)およびグレーブス病(甲状腺樹状細胞が疾患に関
連する)(Quadbeck et al., Scand. J. Immunol. 2002, 55: 612)が挙げられるが、こ
れらに限定されない。「治療」という用語は、疾患症候の減少を指し、疾患の治癒を要さない。同様にまた本明細書中で用いる場合、「有効量」という用語は、免疫応答を誘導するのに有効な3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドの量を指す。3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドの治療有効性は、塩基、糖またはリン酸骨格の化学的修飾、適切な配列を含む細菌プラスミドを用いた配列の化学的補充またはバイオテクノロジー的増幅、配列と生物学的または化学的担体との接合、あるいは配列と細胞型特異的リガンドまたは抗体とのカップリングを含めた方法(これらに限定されない)により増大され得る。
ヌクレオチドを含む組成物は、DCを刺激するのに有効な量で、インビトロでDCに投与される。DCは次に、動物またはヒトにおける免疫応答の刺激のために、薬学的に許容可能な担体とともに動物またはヒトに投与される。好ましい実施形態では、樹状細胞は、以下の:MHC IIの高細胞内レベル;高飲食作用活性;高レベルの特異的ケモカイン受
容体CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6およびCXRC1;低レベルのCCR7;高レベルのCD36、CD68、CD47およびCD91分子;低レベルの同時刺激性CD40、CD54、CD58、CD80およびCD83分子;DC−LAMP(LAMP;リソソーム関連膜タンパク質)の非存在;DCIR(DC免疫受容体)の存在、CLEC−1(C−レクチン受容体)、DC−ASGPR(DCアシアロ糖タンパク質)、MN(マンノース受容体)、TLR−2および−3(Toll様受容体)、FCγR、FcεR、インテグリンαvβ5およびαvβ3の細胞表面の存在(これらに限定されない)を含めた特徴を有する未熟DCである。未熟DCは、末梢血中に見出され得る。さらなる好ましい実施形態では、未熟DCは、DCへの3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドの投与前に、抗原を含むかまたは抗原に曝露される。抗原を含むDCを得る方法としては、抗原パルス標識、ならびに1またはいくつかの抗原を発現する遺伝子修飾DCの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
動物またはヒトに投与される場合、抗原はタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドとして投与されるか、あるいは抗原をコードするポリヌクレオチドが投与され得る。抗原をコードするポリヌクレオチドは、動物またはヒト中での抗原ポリペプチドの発現を可能にするその他の因子を含むベクター内に含まれ得る。一実施形態では、抗原および3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、異なるベクター内に含まれる。
れない。エマルション、ミニポンプおよびポリマーは、送達が必要とされる場所の付近に埋め込まれ得る(Brem et al., J. Neurosurg. 74: 441, 1991)。3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドと固体担体を複合するために用いられる方法としては、固体担体の表面への直接吸着、直接的にまたは連結部分を介しての固体担体の表面への共有的結合、固体担体を造るために用いられるポリマーとの共有的結合が挙げられるが、これらに限定されない。任意選択に、配列(単数または複数)は、非イオン性またはイオン性ポリマー、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN)またはヒアルロン酸の付加により安定化され得る。
、腫瘍へ直接的に、管腔または器官の実質組織中へ、骨髄中へ、ならびに消化系、生殖系、泌尿器系および泌尿生殖系の任意の粘膜表面への投与。好ましい実施形態では、本発明の3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドは、膀胱内(内部膀胱)、目、口腔、鼻腔、直腸および膣表面からなる群から選択される粘膜表面に投与される。上記の種々の投与形態に有用な技法としては、局所適用、経口摂取、外科的投与、注射、噴霧、経皮送達具、浸透圧ポンプ、所望の部位上での直接的電着、あるいは当業者に既知のその他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。適用部位は、外部、例えば上皮上、または内部、例えば胃潰瘍、外科的領域またはその他の場所であり得る。
て疾患の型、疾患の重症度、疾患の位置、およびその他の臨床的因子、例えばレシピエントのサイズ、体重および物理的条件によっている。さらにインビトロ検定は、配列のための、ならびに配列+治療薬投与のための最適範囲を同定するのを助けるために任意選択に用いられ得る。
3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドの調製
3’−OH、5’−OHポリヌクレオチド配列は、アバカスセグメント化合成技法(Abacus Segmented Synthesis Technology)を用いて、シグマ−ジェノシス(Sigma-Genosys, Woodlands, TX)により調製された。別記しない限り、配列は、使用直前に、オートク
レーブ処理脱イオン水中に、または薬物学的に許容可能な緩衝液、例えば生理食塩水(これらに限定されない)中に分散した。以下の配列を用いた:N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AおよびN7B。
樹状細胞
ヒト樹状細胞は、クロンティクス(Clonetics)(San Diego, CA, USA)から入手し、
クロンティクスが推奨した培地中で培養した。DCは、3つの異なる個体から入手した(表1参照)。これらの個体の各々に関して主要組織適合分類を実施し、HLA(ヒト白血球抗原)型のいくつかを示す。
3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドを用いて培養したDCの細胞サイズおよび粒度の増大
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml
中に、DCを播種した。FACSCaliburを用いてフローサイトメトリーにより細胞サイズ(FCS:前方側散乱)および粒度(SSC:側面光散乱)を測定し、CELLQuest Proソフトウェア(ともにBecton-Dickinson, San Diego, CA, USAから)を用いて分析した。3つの異なる個体から単離されたDCに関して3’−OH、5’−OHポリヌクレオチドを用いた処置後に、FCS>500単位およびSSC>400単位を示すDCのパーセンテージを測定した。
IL−1β産生の誘導
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml
中にDCを播種した。インキュベーションの48時間後、市販ELISA(BioSource, Camarillo, CA, USA)を用いて、100μlの培養上清中で、IL−1βの産生を測定し
た。対照細胞と比較した場合の処置DCによるIL−1β産生の「倍」(×)増大として結果を表す。
IL−12産生の誘導
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml
中にDCを播種した。インキュベーションの48時間後、市販ELISA(BioSource)
を用いて、100μlの培養上清中で、IL−12の産生を測定した。対照細胞と比較した場合の処置DCによるIL−12産生の「倍」(×)増大として結果を表す。
IFN−γ産生の誘導
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml
中にDCを播種した。インキュベーションの48時間後、市販ELISA(BioSource)
を用いて、100μlの培養上清中で、IFN−γの産生を測定した。対照細胞と比較した場合の処置DCによるIFN−γ産生の「倍」(×)増大として結果を表す。
配列+GM−CSFによるIL−12の誘導
500単位のヒト組換えGM−CSF(Clonetics)および100μgの6塩基ポリヌ
クレオチドN1AまたはポリヌクレオチドN7Aを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml中に個体BからのDCを播種
した。インキュベーションの48時間後、市販ELISA(BioSource)を用いて、10
0μlの培養上清中で、IL−12の産生を測定した。組換えGM−CSFの非存在下または存在下で、対照細胞と比較した場合の処置DCによるIL−12産生の「倍」(×)増大として結果を表す。
DC細胞表面でのCD40レベルの増大
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml
中に個体BおよびCからのDCを播種した。インキュベーションの48時間後、CD40に向けられたFITC接合モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリー(FACSCaliburシステム)により、細胞表面でのCD40レベルを測定し、CELLQuest Pro(全てBecton Dickinsonから)により分析した。処置後のCD40hiDCのパーセンテージとして、結果を表す。「CD40hi」という用語は、CD40のベースライン発現より高いとフローサイトメトリーにより同定された細胞の集団を指す。
DC細胞表面でのCD80レベルの増大
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml
中に個体BおよびCからのDCを播種した。インキュベーションの48時間後、CD80(Serotec, Oxford, U.K.)に向けられたFITC接合モノクローナル抗体を用いてフロ
ーサイトメトリーにより、細胞表面でのCD80レベルを測定し、CELLQuestにより分析した。処置後のCD80hiDCのパーセンテージとして、結果を表す。
DC細胞表面でのCD86レベルの増大
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml
中に個体BおよびCからのDCを播種した。インキュベーションの48時間後、CD86(Serotec)に向けられたPE接合モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーに
より、細胞表面でのCD86レベルを測定し、CELLQuest Proにより分析した。処置後のCD86hiDCのパーセンテージとして、結果を表す。
DC細胞表面でのMHC−IIレベルの増大
100μgの6塩基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml中に個体Bからの
DCを播種した。インキュベーションの48時間後、MHC II(Serotec)に向けられたFITC接合モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより、細胞表面でのMHC IIレベルを測定し、CELLQuest Proにより分析した。処置後のM
HC−IIhiDCのパーセンテージとして、結果を表す。
IIの発現を有意に上向き調節した。**p<0.001コルモゴロフ−スミルノフ(D>0.20)。
DC細胞表面でのOX−2レベルの低減
1、10または100μgの6塩基N3AまたはN6Aポリヌクレオチドを用いて、48時間、6ウエル平底組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml中
に個体AからのDCを播種した。インキュベーションの48時間後、OX−2に向けられたFITC接合モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより、細胞表面でのOX−2のレベルを測定し(BioSPARK, Greenwich, CT, USA)、CELLQuest Proにより分析した。DC表面抗原であるOX−2は、Th1サイトカイン産生の刺激を抑制すること、そして免疫細胞に寛容化シグナルを提供することが見出された(Gorczynski et al., J. Immunol. 1999 162: 774-781)。処置後のOX−2hiDCのパーセンテージとして、結果を表す。
DCによるエンドサイトーシスの増大
100μgの6塩基N2A、N2B、N3A、N3B、N5A、N5BおよびN6Bポリヌクレオチドの非存在下または存在下で、4℃(FITC−デキストランの細胞表面結合を制御)および37℃(エンドサイトーシスを査定するため)で、1mg/mlのFITC−デキストラン(20kDa;Sigma-Aldrich)を用いて、24時間、6ウエル平底
組織培養プレート中で1.0×105細胞/mlで、1.0ml中に個体BからのDCを
播種した。細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、CELLQuest Proを用いてフローサイトメトリーにより分析した。相対エンドサイトーシス率として、結果を表す(正常化△平均蛍光値(△MFV))。△MFV=37℃でFITC−デキストランに曝露されたDCのMFV−4℃でFITC−デキストランに曝露されたDCのMFV。△MFV=(△MFV配列/△MFV対照)×100。
抗原パルス標識DCを用いた癌予防接種
C57BL/6マウスから単離したDCに、メラノーマB−16細胞からの腫瘍細胞溶解物をインビトロで負荷する。抗原パルス標識中に、N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを含ませる。75匹のC57BL/6マウスに、約2×106個のB
−16メラノーマ細胞を皮下注射する。
個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DCを予防接種する;群2マウスに、2×104個の
B−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN1Aポリヌクレオチドを予防接種する;群3マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN
1Bポリヌクレオチドを予防接種する;群4マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解
物パルス標識DC+100μgのN2Aポリヌクレオチドを予防接種する;群5マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN2Bポリヌクレオ
チドを予防接種する;群6マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC
+100μgのN3Aポリヌクレオチドを予防接種する;群7マウスに、2×104個の
B−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN3Bポリヌクレオチドを予防接種する;群8マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN
4Aポリヌクレオチドを予防接種する;群9マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解
物パルス標識DC+100μgのN4Bポリヌクレオチドを予防接種する;群10マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN5Aポリヌクレ
オチドを予防接種する;群11マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識
DC+100μgのN5Bポリヌクレオチドを予防接種する;群12マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN6Aポリヌクレオチドを予防
接種する;群13マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100
μgのN6Bポリヌクレオチドを予防接種する;群14マウスに、2×104個のB−1
6腫瘍溶解物パルス標識DC+100μgのN7Aポリヌクレオチドを予防接種する;ならびに群15マウスに、2×104個のB−16腫瘍溶解物パルス標識DC+100μg
のN7Bポリヌクレオチドを予防接種する。
群2〜15マウスは、群1マウスより少ない腫瘍塊を有する。腫瘍溶解物パルス標識DCの注射の前および後のマウス由来の末梢血単核球を用いて、IFN−γELISPOTにより、B−16抗原に向けられた特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を分析する。B−16に向けられたCTLの頻度は、群1マウスより群2〜15マウスにおいて高い。
百日咳菌(Bordatella perutussis)パルス標識DCを用いた予防接種
C57BL/6マウスから単離したDCに、107個の加熱殺菌百日咳菌をインビトロ
で負荷する。抗原パルス標識中に、N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7AまたはN7Bポリヌクレオチドを含ませる。70匹のC57BL/6マウスを5匹の15群分ける。群1マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DCを予防接種する;群2マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN1Aポリヌクレオチドを予防接種する;群3マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN1Bポリヌク
レオチドを予防接種する;群4マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+
100μgのN2Aポリヌクレオチドを予防接種する;群5マウスに、107個の加熱殺
菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN2Bポリヌクレオチドを予防接種する;群6マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN3Aポリヌクレ
オチドを予防接種する;群7マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+1
00μgのN3Bポリヌクレオチドを予防接種する;群8マウスに、107個の加熱殺菌
百日咳菌パルス標識DC+100μgのN4Aポリヌクレオチドを予防接種する;群9マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN4Bポリヌクレオ
チドを予防接種する;群10マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+1
00μgのN5Aポリヌクレオチドを予防接種する;群11マウスに、107個の加熱殺
菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN5Bポリヌクレオチドを予防接種する;群12マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN6Aポリヌク
レオチドを予防接種する;群13マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC
+100μgのN6Bポリヌクレオチドを予防接種する;群14マウスに、107個の加
熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN7Aポリヌクレオチドを予防接種する;ならびに群15マウスに、107個の加熱殺菌百日咳菌パルス標識DC+100μgのN
7Bポリヌクレオチドを予防接種する。
を殺害し、血清中の百日咳菌特異的IgGレベル、肺中の細菌荷重、および百日咳菌特異的抗体分泌細胞に関して検定する。群2〜15マウスは、群1マウスより高いレベルの百日咳菌特異的IgGを示す。群2〜15マウスは、群1マウスより少ない肺中の百日咳菌を示す。群2〜15マウスは、肺中の高レベルの百日咳菌特異的抗体分泌細胞を示す。
肝炎表面抗原を用いた予防接種
水酸化アルミニウム(アルミニウムアジュバント;SuperFos Biosector, Vedback, Denmark)および/またはN3A、N6AまたはN6Bポリヌクレオチドと組合せた組換えB型肝炎表面抗原(HbsAg;Cortex Biochemical, San Leandro, CA, USA)を用いた免疫感作を、6〜8週齢雌BALB/Cマウス(Charles River, St-Constant, Qc, Canada)で実行した。0日目および21日目に、総容積50μl中に以下のものを含む溶液を、各マウス(5匹/群)に1回筋内注射で脛骨筋に投与した:
生理食塩水(群1)、HbsAg 1μg(群2)、HbsAg 1μg+アルミニウム
アジュバント10μg(群3)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μ
g+N3A 10μg(群4)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μg
+N3A 100μg(群5)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μg+N3B 10μg(群6)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μg+N3B 100μg(群7)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μg+N6A 10μg(群8)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μg+N6A 100μg(群9)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μg+N6B 10μg(群10)、HbsAg 1μg+アルミニウムアジュバント10μg+N6B 100μg(群11)。31日目に、血漿を回収した。
意に刺激する能力を有する。
肝炎表面抗原を用いた経口予防接種
N6AまたはN6Bポリヌクレオチドと組合せた組換えB型肝炎表面抗原を用いた免疫感作を、6〜8週齢雌BALB/Cマウス(Charles River, St-Constant, Qc, Canada)で実行した。0、7および14日目に、総容積50μl中に以下のものを含む溶液を、各マウス(5匹/群)に経口投与した:
生理食塩水(群1)、HbsAg 10μg(群2)、HbsAg 10μg+N6A 1
μg(群3)、HbsAg 10μg+N6A 10μg(群4)、HbsAg 10μg
+N6A 100μg(群5)、HbsAg 10μg+N6B 1μg(群6)、Hbs
Ag 10μg+N6B 10μg(群7)およびHbsAg 10μg+N6B 100μg(群8)。21日目に、血漿および腸洗浄液を回収した。プロテアーゼ阻害剤(ペプスタチン10μg、ロイペプシン10μg、アンチパイン10μgおよびベンズアミジン50μg)を含むPBS 0.2mlを静かにピペット分取することにより、腸洗浄液(I
gA測定のため)を得た。
ュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスIgA(腸洗浄液用)およびヤギ抗マウス総IgG(血漿用)を用いて検出した。データは、5匹/群の平均±SDとして、OD(450nm)で表14中に表す。IgAに関するODは1:2腸洗浄液希釈後に得て、一方、総IgGは、1:16血清希釈後に得る。
0μg)およびN6B(群8:HbsAg 10μg+N6B 100μg)は、経口投与後のHbsAgに対する免疫応答を有意に刺激した。
Claims (17)
- 6個の塩基を含む単離された3’−OH、5’−OHポリヌクレオチド配列を含む組成物であって、
a)塩基の少なくとも50%がグアニンであり、
b)5’塩基がグアニンであり、かつ
c)前記組成物が投与される動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するか、あるいは該組成物がインビトロで投与される抗原提示細胞を刺激する、組成物。 - 前記ポリヌクレオチド配列が5’GGNNGG3’(NはG、C、AまたはTである)を含む請求項1記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が5’GGGNGG3’(NはG、C、AまたはTである)を含む請求項1記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が5’GTGTGT3’、5’GGTGGG3’、5’GGGTGG3’、5’GGGCGG3’、5’GGGAGG3’または5’GGGGGG3’である請求項1記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列が5’GGGTGG3’または5’GGGAGG3’である請求項1記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列がホスホジエステル骨格を含む請求項1記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチド配列がホスホロチオエート骨格を含む請求項1記載の組成物。
- 前記動物またはヒトにおける1または複数の抗原提示細胞を刺激する請求項1記載の組成物。
- 前記抗原提示細胞が樹状細胞である請求項1または8記載の組成物。
- 前記免疫応答の刺激が、細胞サイズおよび/または粒度の増大、IL−1β、IL−12またはIFNγ産生の増大、CD40、CD80、CD86またはMHC IIの細胞
表面発現の増大、OX−2細胞表面発現の低減およびエンドサイトーシスの増大からなる群から選択される1または複数の樹状細胞応答を含む請求項1記載の組成物。 - 前記免疫応答が全身性免疫応答または粘膜免疫応答である請求項1記載の組成物。
- 抗原ポリペプチドをさらに含む請求項1記載の組成物。
- 抗原をコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項1記載の組成物。
- 免疫調節剤をさらに含む請求項1記載の組成物。
- 前記組成物が投与される抗原提示細胞を刺激し、かつ、この刺激された抗原提示細胞が動物またはヒトに投与される、請求項1に記載の組成物。
- 動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するために有用な薬剤の製造における請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 抗原提示細胞のインビトロでの刺激のための請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物の使用。
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