CN102791291A - 含有非dna碱基的多核苷酸组合物和其用于调节免疫反应的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含3至30个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列以及药学上可接受的媒介物，尤其一种或多种佐剂媒介物，和一种或多种抗原的组合物，所述多核苷酸序列包含一个或多个非DNA碱基，其中所述碱基为水粉蕈素、次黄嘌呤，或尿嘧啶，或水粉蕈素、次黄嘌呤和尿嘧啶碱基的组合。本发明涉及这些组合物在用于在体外或在体内诱导或调节免疫反应，尤其用于活化抗原呈递细胞的方法中的用途。

Description

含有非DNA碱基的多核苷酸组合物和其用于调节免疫反应的用途
发明领域
本发明涉及包含含有非DNA碱基的合成多核苷酸、药学上可接受的媒介物和任选地一或多种抗原的组合物，及其用于调节免疫反应的用途。
发明背景
适当识别微生物危险和细胞应激对于宿主的存活至关重要，因为这种识别可导致局部防御机制的活化和特化免疫细胞的募集和活化。因此，抗原呈递细胞(APC)，以及先天免疫***的其它细胞已进化出使用所谓“模式识别受体”(PRR)来进行这种识别的多种方式。PRR识别未经处理的抗原中的分子模式(病原体相关分子模式或PAMP)，诸如由较大的微生物群所共有，但是与在宿主中存在的细胞壁组分或核酸不同的病原体(细菌、分枝杆菌、病毒)的细胞壁组分或核酸。APC可表达包括CD14、甘露糖受体、DEC 205，和toll样受体(TLR)家族的PRR。APC包括但不一定限于：专职APC，诸如髓性和类浆细胞树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、朗氏细胞(Langerhans’cells)、B淋巴细胞、T淋巴细胞、枯氏细胞(Kupffer cells)、小神经胶质细胞、许旺氏细胞(Schwann cells)和内皮细胞；以及非专职APC，诸如但不限于上皮细胞、成纤维细胞、黑素细胞、神经细胞、平滑肌细胞、肌细胞、肝细胞、星形细胞和角质细胞。在现有技术中，已使用通常源自微生物的物质或其变体，通常以非特异性方式来刺激免疫反应。实例为弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)中的分枝杆菌的包涵物、LPS、单磷酰脂质A(LPS的毒性较小衍生物)和海藻糖二霉菌酸酯(分枝杆菌的分枝菌酸物质)的组合、Poly(I:C)、病毒dsRNA的合成类似物，和含有CpG二核苷酸基元的回文DNA序列。最近，若干出版物公开了含有非甲基化CpG基元(CpG)的合成免疫刺激多核苷酸的用途。两种合成咪唑并喹啉化合物(瑞喹莫德(Resiquimod)和咪喹莫特(Imiquimod))也具有免疫刺激活性。已知Toll样受体(TLR)与可充当免疫佐剂的许多天然和合成分子相互作用。这些分子的实例为Poly(I:C)多核苷酸、脂多糖和含有CpG的多核苷酸。如上所述，已识别由给定化合物使用的特异性TLR(即，TLR9识别CpG)。
合成多核苷酸为多阴离子序列。与核酸、特定细胞蛋白、特定核蛋白或特定细胞表面受体选择性结合的合成多核苷酸已予以报道。含有至少一个非甲基化CpG二核苷酸的具有8至100个碱基的合成硫代磷酸酯多核苷酸已被证明可刺激免疫***(美国专利第6,239,116号)。具体而言，已发现含有CpG基元(5′嘌呤-嘌呤-胞嘧啶-乌嘌呤-嘧啶-嘧啶3′)的合成硫代磷酸酯多核苷酸可刺激细胞因子，诸如IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的合成、自然杀伤细胞的溶胞活性和B淋巴细胞的增殖(Krieg，Annual Rev.Immunol.2002，20：709-760)。碱基数目大于14的包含CpG基元的合成硫代磷酸酯多核苷酸据报道可引发树突状细胞的成熟和活化：细胞大小和颗粒度的增加；IL-12的合成；胞吞作用的增加；和细胞表面分子MHC II、CD40、CD80，CD83和CD86的上调(Sparwasser等Eur.J.Immunol.1998，28：2045-205；Hartman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96：9305-9310；Askew等J.Immunol.2000，165：6889-6895)。碱基数目为30的包含CpG基元的合成磷酸二酯多核苷酸据报道可刺激IFN的合成并且上调DC前体上的CD80和CD86的表达(Kadowaski等J.Immunol.2001166：2291-2295)。
我们以前已描述包含选自由以下组成的组的2至20个碱基3′-OH，5′-OH合成多核苷酸的组合物：(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb，和a(TyGx)nb，其中x和y为1和7之间的整数，n为1和12之间的整数，a和b为一个或多个As、Cs、Gs或Ts，其中多核苷酸在2和20碱基之间。这些组合物诱导选自由以下组成的组的反应：诱导细胞周期停滞、抑制增殖、诱导胱天蛋白酶活化、诱导细胞凋亡和刺激单核细胞和外周血单核细胞的细胞因子合成(参见PCT公布第WO 01/44465号)。
因此，需要诱导APC成熟以便在不存在未适当诱导细胞因子的情况下获得更有效的免疫原反应的化合物和相关方法的需要。此类化合物应能够诱导针对抗原的有效和适当的免疫反应，尤其是在抗原供应不足并且疫苗功效需要具备有效性和保护性的情况下。
具体来说，需要新的含有非DNA碱基的多核苷酸组合物和使用这些组合物以调节免疫细胞(包括APC)功能的方法，以便实现有效的免疫佐剂反应。
发明概述
本发明通过提供包含3至30个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸和药学上可接受的媒介物(例如佐剂)的组合物来满足此需要，所述多核苷酸包含一个或多个非DNA碱基。此类多核苷酸在本文称为含有非DNA碱基的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供3至20个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸，其包含一个或多个非DNA碱基。在另一个实施方案中，本发明提供3至9个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸，其包含一个或多个非DNA碱基。此外，本发明提供包含3至30个、3至20个，或3至9个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含一个或多个水粉蕈素碱基、一个或多个次黄嘌呤碱基，或一个或多个尿嘧啶碱基，或水粉蕈素、次黄嘌呤和尿嘧啶碱基的组合。这些多核苷酸任选地进一步包含一个或多个乌嘌呤碱基，或一个或多个胸腺嘧啶碱基，或一个或多个腺嘌呤碱基，或一个或多个胞嘧啶碱基，或其组合。
本发明提供包含一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物(例如佐剂)，以及任选地一种或多种抗原的新颖组合物。这些组合物适用于在体外或体内调节免疫反应。此调节可为免疫反应的增加或减少。本发明的若干组合物允许在疫苗制剂中使用较低剂量的抗原，因为一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸连同药学上可接受的媒介物(例如一种或多种佐剂)和一种或多种抗原可产生针对较低剂量抗原的有效免疫反应。
本发明还提供通过在体外或体内施用这些组合物来使用所述组合物以便诱导免疫反应的方法。此外，本发明组合物可与一种或多种治疗剂一起施用。本发明组合物的此施用可在施用一种或多种为医学或兽医领域普通技术人员已知的治疗剂之前、期间或之后进行。为医学或兽医领域普通技术人员已知，并且用于治疗疾病的任何治疗剂可与这些组合物组合使用。
在一个实施方案中，本发明提供包含3至30个、3至20个或3至9个碱基长度的含有非DNA碱基的合成5′-OH，3′-OH多核苷酸的组合物。在另一实施方案中，这些含有非DNA碱基的多核苷酸包含为磷酸二酯或其它适合修饰物的磷酸骨架。在本申请通篇中，术语含有非DNA碱基的多核苷酸应理解为是指5′-OH或3′-OH多核苷酸。
在另一实施方案中，可对含有非DNA碱基的多核苷酸的5′-OH或3′-OH末端进行修饰以赋予诸如避免细胞内或细胞外降解的保护作用。在一个实例中，含有非DNA碱基的多核苷酸的5′-OH或3′-OH末端可包含但是不限于三乙二醇(TEG)-胆甾醇基。还可使用含有包括但不限于腺嘌呤(A)、乌嘌呤(G)、胞嘧啶(C)，或胸腺嘧啶(T)的碱基的核苷酸，其可添加至一个或两个末端以使得分子的内在活性，即其免疫佐剂活性不受实质性影响。还可使用含有选自水粉蕈素(Neb)、次黄嘌呤(I)和尿嘧啶(U)的额外非DNA碱基的核苷酸，其可添加至一个或两个末端以使得分子的内在活性，即其免疫佐剂活性不受实质性影响。
在一个实施方案中，多核苷酸的磷酸骨架为磷酸二酯骨架。在另一个实施方案中，多核苷酸的磷酸骨架为经修饰的硫代磷酸酯骨架。在其它实施方案中，多核苷酸的磷酸骨架为氨基骨架或包含核糖或2’-脱氧核糖部分的修饰物。优选地，所述5′-OH，3′-OH多核苷酸为合成多核苷酸并且包含非DNA碱基，诸如但不限于水粉蕈素(Neb)、次黄嘌呤(I)或尿嘧啶(U)。本领域中熟知的是，次黄嘌呤碱基在存在于核苷酸中时被称为肌苷(例如肌苷单磷酸-IMP)并且在本文定义为“I”。在一个实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸选自由以下组成的组：NebGGTGNeb(SEQ ID NO：1)、UUGTUU(SEQ ID NO：2)、IIGTII(SEQ ID NO：3)、GNebG(SEQ ID NO：4)、GGGTGGNebNebNeb(SEQ ID NO：5)、GIG(SEQ ID NO：6)、GGGTGGIII(SEQ ID NO：7)、GUG(SEQ ID NO：8)和GGGTGGUUU(SEQ ID NO：9)。含有非DNA碱基的多核苷酸在体外，或在体内施用于人类或动物时产生免疫反应。免疫反应可为全身或局部反应。在一个实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸在施用多核苷酸的人类或动物中刺激APC。含有非DNA碱基的多核苷酸亦可直接在体外施用于APC以刺激APC。然后，可将经刺激的APC施用于产生APC的人类或动物以活化人类或动物的免疫反应。
当施用于APC时，本发明的含有非DNA碱基的多核苷酸可通过诱导例如选自由以下组成的组的反应来刺激APC：通过APC增加IL-1β、IL-6、IL-12、MCP-1、RANTES，和其它细胞因子和/或趋化因子和/或造血生长因子的产生。
本发明进一步提供将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物以有效诱导对于动物或人类中的免疫反应的刺激，并且更优选地，对于动物或人类中的一种或多种APC的刺激的量施用于动物或人类的方法。在一个实施方案中，优选的APC为专职APC，诸如树突状细胞。在另一个实施方案中，除了包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物以外，将一种或多种抗原施用于动物或人类以便在动物或人类中产生抗原特异性免疫反应。优选的抗原为肿瘤抗原、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原或自体抗原，诸如但不限于肝炎表面抗原、灭活或减毒病毒颗粒形式的H1N1抗原、完整分枝杆菌形式的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)菌株卡介苗(BCG)抗原或由一种或多种抗原决定簇、寄生虫抗原、植物抗原或自体抗原组成的亚单位抗原。在一些实施方案中，对于一种或多种APC的刺激在动物或人类中产生全身免疫反应。在其它实施方案中，免疫反应为局部反应。本发明还包括将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物(其可为免疫调节剂或治疗手段)的组合物以有效诱导对于动物或人类中的免疫反应的刺激的量施用于动物或人类的方法。本发明还包括施用包含任选地与一种或多种佐剂一起处于药学上可接受的媒介物中的一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸和较低量的一种或多种抗原的组合物以便获得有效免疫反应的方法，从而在抗原供应不足并且制备可能较困难和成本高时优化抗原节约策略。
本发明还提供包括在体外将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物施用于如上所述含有一种或多种抗原的APC，以及更优选DC的方法，其中此施用引起对于APC的刺激。所述方法可进一步包括将经刺激的APC引入产生APC的动物或人类中，以便刺激动物或人类中的免疫反应。这些包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物，任选地含有一种或多种抗原的组合物刺激免疫反应的意外和令人惊讶的能力为动物和人类提供重要益处。
本文所述方法可用于治疗疾病诸如但不限于癌症、治疗过敏症、针对各种病原体对动物或人类进行疫苗接种、治疗自身免疫疾病和预防移植排斥反应。因此，本发明适用于预防和治疗各种疾病，包括但不限于传染病、癌症、自身免疫疾病；和归因于故意传播生物体(诸如病毒、细菌和毒素)的生物***行为，包括但不限于炭疽热、肉毒杆菌中毒、瘟疫、兔热病、天花和病毒出血热。在一些实施方案中，本发明通过增加IL-12合成来实现自身免疫疾病的治疗和移植排斥反应的预防。IL-12的合成可抑制自身免疫疾病、移植排斥反应和移植物抗宿主疾病(GVHD)和过敏症(参见例如Bagenstose等，J.Immunol.1998；160：1612(Downregulation of autoantibody production inautoimmunity by IL-12)；Vogel等，Eur.J.Immunol.，1996；26：219(Inhibition of B1lymphocyte，a B lymphocyte subset implicated in thedevelopment of autoimmunity，by IL-12)；Dey等，Blood，1998；91：3315(Inhibition of graft-versus-host disease(GVHD)by IL-12)；Smits等，Int.Arch Allergy Immunol.，2001；126-102(Modification of the pathogenicTh2immune profile toward a Th1profile by IL-12in the treatment ofallergies))。在其它实施方案中，本发明通过疫苗接种来实现自身免疫疾病的治疗和移植排斥反应的预防(参见例如Zhang等，J.Mol.Med.1996；74：653(Vaccination against autoreactive B or T lymphocytesresponsible for autoreactive diseases)；Vignes等，Eur.J.Immunol.，2000；30：2460(Vaccination against alloreactive T lymphocytesresponsible for graft rejection)；Liu等，J.Exp.Med.，2002；196：1013(Induction of immune tolerance by delivery of dying cells to activatedDC cells in situ))。
因此，本发明提供与药学上可接受的媒介物组合的3至30个、3至20个，或3至9个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸，所述多核苷酸包含一个或多个水粉蕈素碱基、一个或多个次黄嘌呤碱基，或一个或多个尿嘧啶碱基，或水粉蕈素、次黄嘌呤和尿嘧啶碱基的组合。这些序列任选地进一步包含一个或多个乌嘌呤碱基，或一个或多个胸腺嘧啶碱基，或一个或多个腺嘌呤碱基，或一个或多个胞嘧啶碱基，或其组合。优选地，由水粉蕈素、次黄嘌呤、尿嘧啶、乌嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶碱基以所述组合形式构成的多核苷酸含有磷酸二酯骨架。
在另一个实施方案中，本发明提供包含任选地与一种或多种抗原和一种或多种佐剂组合处于药学上可接受的媒介物中的一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸的组合物，和其在有效治疗或预防动物(包括人类)的疾病的方法中的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供可有效地对动物或人类进行疫苗接种的组合物和方法。这些组合物和方法的益处是可使用较低量的抗原来产生有效免疫反应和提供保护。
在另一个实施方案中，本发明提供使用在与常规佐剂一起使用时被视为不太理想的抗原剂量来对动物或人类进行有效疫苗接种的组合物和方法。
在另一实施方案中，本发明提供有效治疗或预防动物或人类的疾病的组合物和方法。
在另一实施方案中，本发明提供有效刺激动物或人类的免疫反应的组合物和方法。
在另一个实施方案中，本发明提供有效诱导动物或人类的APC，以及优选DC的成熟和/或活化的组合物和方法。
在另一个实施方案中，本发明提供有效诱导含有抗原的APC的体外刺激以便将经刺激的APC自体施用于动物或人类的组合物和方法。
在另一个实施方案中，本发明提供通过APC有效增加IL-1β、IL-6、IL-12、MCP-1、RANTES和其它细胞因子和/或趋化因子和/或造血生长因子的产生的组合物和方法。
在另一个实施方案中，本发明提供加强其它治疗或免疫调节剂的效果的组合物和方法。
在另一个实施方案中，本发明提供加强APC，以及优选DC上的一种或多种细胞因子的效果的组合物和方法。
本发明的这些实施方案在回顾以下所公开的实施方案的详细说明和所附权利要求之后将变得显而易见。
发明详述
在一个实施方案中，本发明提供包含一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸和可为一种或多种佐剂的药学上可接受的媒介物的新的组合物。在一个实施方案中，本发明提供包含处于可为佐剂的药学上可接受的媒介物中的一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸以及任选地一种或多种抗原的新的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供这些包含一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物或赋形剂的组合物在制备药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供这些包含处于可为一种或多种佐剂的药学上可接受的媒介物中的一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸以及任选地一种或多种抗原的组合物在制备药物中的用途。这些药物适用于调节对于一种或多种抗原的免疫反应。此调节可为对于免疫反应的刺激，或免疫反应的减少。在另一个实施方案中，这些药物允许使用较低量的一种或多种抗原来产生对于一种或多种抗原的有效免疫反应，由此允许使用较低量的一种或多种抗原。
本发明适用于通过充当APC刺激佐剂来增强对于疫苗抗原的免疫反应。
本发明适用于通过作用于APC来抑制或减少免疫反应。
在另一个实施方案中，本发明提供在体外或体内刺激免疫反应的方法，其包括施用包含一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物或赋形剂，以及任选地一种或多种抗原的组合物。
如本文所使用的术语“抗原呈递细胞(APC)”被定义为在体内负责使T细胞敏化以便对特异性抗原作出反应的抗原呈递细胞，其中T细胞进一步分化为可具有诸如T辅助细胞或细胞毒性T细胞的功能的“效应”细胞或“记忆”T细胞。APC还分泌多种细胞因子和趋化因子，其刺激和引导T细胞功能以及刺激其它免疫细胞，包括提供对病原体的即刻、非病原体特异性杀伤的先天免疫***细胞，诸如自然杀伤细胞。APC包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、B细胞、小神经胶质细胞、粒细胞、类浆细胞树突状细胞和髓性或单核细胞树突状细胞。术语“树突状细胞”和“DC”包括但不限于间质性DC、朗氏细胞衍生的DC、类浆细胞DC和前述细胞的任何祖代。
本发明提供包含含有非DNA碱基的合成多核苷酸的组合物和其使用方法。这些3至9个、3至20个，或3至30个碱基长度的合成多核苷酸包含一个或多个非DNA碱基，其包括一个或多个水粉蕈素碱基、一个或多个次黄嘌呤碱基，或一个或多个尿嘧啶碱基，或水粉蕈素、次黄嘌呤和尿嘧啶碱基的组合。在一个优选实施方案中，新颖合成多核苷酸具有3至9个碱基的长度。这些序列可任选地进一步包含腺嘌呤碱基、胞嘧啶碱基、乌嘌呤碱基或胸腺嘧啶碱基中的一种或多种或其组合。优选地，由水粉蕈素、次黄嘌呤、尿嘧啶、乌嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶碱基以所述组合形式组成的多核苷酸含有磷酸二酯骨架。这些序列中的一个或多个可与可接受的媒介物，例如药学上可接受的媒介物组合形成组合物。此外，这些组合物可与一种或多种抗原以及任选地一种或多种可为药学上可接受的媒介物的佐剂组合。这些组合物亦可与一种或多种为本领域普通技术人员已知适用于产生所需治疗反应的治疗剂组合。
这些组合物适用于诱导免疫反应。在一个实施方案中，将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物，以及任选地一种或多种抗原的组合物以有效诱导动物或人类的免疫反应的量施用于动物或人类。在一个实施方案中，将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物，以及任选地一种或多种抗原和一种或多种佐剂的组合物以有效诱导动物或人类的免疫反应的量施用于动物或人类。
以下符号用于描述本发明多核苷酸序列中的碱基序列：A＝腺嘌呤；C＝胞嘧啶；G＝乌嘌呤；I＝次黄嘌呤；Neb＝水粉蕈素；T＝胸腺嘧啶；和U＝尿嘧啶。如本文所使用，含有非DNA碱基的多核苷酸序列是指包含碱基I、Neb或U中的至少一个或其组合，进一步任选地含有碱基A、C、G或T中的至少一个或其组合的合成多核苷酸。含有非DNA碱基的多核苷酸序列具有3至30个、3至30个或3至9个碱基的长度。
如本文所使用的术语“一”定义为一个或一个以上。如本文所使用的术语“包括”和/或“具有”定义为包括(即，开放性措辞)。
在另一实施方案中，本发明提供包含具备3至9个、3至20个，或3至30个碱基的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列的组合物，其中至少一个碱基为非DNA碱基。在另一个实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸含有至少两个非DNA碱基。本发明还提供一种方法，其包括将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物以有效刺激动物或人类的一种或多种抗原呈递细胞(APC)，或优选一种或多种DC的量施用于动物或人类。在一个优选实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸为5′-OH，3′-OH多核苷酸。对于动物或人类的一种或多种APC的刺激可产生全身免疫反应或局部免疫反应。本发明还提供一种方法，其包括在体外将包含含有非DNA碱基的多核苷酸的组合物以有效刺激APC的量施用于含有抗原的APC。然后，这些APC可以自体方式与药学上可接受的媒介物一起施用于动物或人类以刺激免疫反应。在一个优选实施方案中，所施用的含有非DNA碱基的多核苷酸为5′-OH，3′-OH多核苷酸。含有非DNA碱基的合成磷酸二酯和硫代磷酸酯多核苷酸诱导对于APC的刺激的意外和令人惊讶的能力对于动物和人类提供重要益处。
在本申请通篇中，含有非DNA碱基的多核苷酸应理解为是指5′-OH，3′-OH多核苷酸。如本文所使用的术语“含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸”是指在其5′和3′末端均具有羟基部分并且包含一个或多个非DNA碱基的多核苷酸。更具体而言，本发明的含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸在多核苷酸的5′末端的糖的5′碳处包含羟基部分，并且在多核苷酸的3′末端的糖的3′碳处包含羟基部分。除非另外指示，否则本文所述的多核苷酸序列从左到右以从5′末端到3′末端的取向来显示。
然而，应理解本领域普通技术人员可通过诸如但不限于TEG-胆甾醇基的添加物来修饰5′-OH或3′-OH末端中的一个或两个，前提是对于末端的修饰不实质性影响多核苷酸的内在免疫佐剂活性。可向5′-OH末端或3′-OH末端添加一个或多个额外A、T、C、或G碱基，前提是对于末端的修饰不实质性影响多核苷酸的内在免疫佐剂活性。可将含有选自水粉蕈素、次黄嘌呤和尿嘧啶的额外非DNA碱基的一个或多个额外核苷酸添加至一个或两个末端以使得分子的内在活性，即其免疫佐剂活性不受实质性影响。
如本文所使用的术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是可互换的。在本发明的一个实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸具有3至9个核苷酸碱基的长度。在本发明的另一个实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸具有3至20个核苷酸碱基的长度。在本发明的另一个实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸具有3至30个核苷酸碱基的长度。优选地，所述含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸包含核苷酸碱基，其中这些核苷酸碱基中的至少一个为非DNA碱基，诸如但不限于尿嘧啶(U)、水粉蕈素(Neb)，或次黄嘌呤(I)。在一些实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸可特定地包含选自由以下组成的组的碱基序列或由选自由以下组成的组的碱基序列组成：NebGGTGNeb(SEQ ID NO：1)、UUGTUU(SEQ ID NO：2)、IIGTII(SEQID NO：3)。
在另一个实施方案中，其中含有非DNA碱基的多核苷酸包含水粉蕈素，多核苷酸序列可包括以下序列中的任何一个：NebTNeb(SEQID NO：10)、GNebG(SEQ ID NO：4)、NebNebGNebNebNeb(SEQ IDNO：11)、NebNebNebNebNebNeb(SEQ ID NO：12)、NebNebNebTNebNeb(SEQ ID NO：13)、GGGNebGG(SEQ ID NO：14)、GGGTNebG(SEQ ID NO：15)、GGNebNebGG(SEQ ID NO：16)、GGNebTGG(SEQ ID NO：17)、NebGGTGG(SEQ ID NO：18)、NebGGTGNeb(SEQ ID NO：1)、GGGTGGNeb(SEQ ID NO：19)和NebGGGTGG(SEQ ID NO：20)。
在另一个实施方案中，其中含有非DNA碱基的多核苷酸包含次黄嘌呤，多核苷酸序列可包括以下序列中的任何一个：GGITGG(SEQID NO：21)、GGGIGG(SEQ ID NO：22)、IIGTII(SEQ ID NO：3)、IGGGTGG(SEQ ID NO：23)、GGGTGGI(SEQ ID NO：24)、IGGGTGGI(SEQ ID NO：25)、GGGTGGIII(SEQ ID NO：7)和GIG(SEQ ID NO：6)。
在另一个实施方案中，其中含有非DNA碱基的多核苷酸包含尿嘧啶，多核苷酸序列可包含以下序列中的任何一个：GGUTGG(SEQID NO：26)、GGGUGG(SEQ ID NO：27)、UUGTUU(SEQ ID NO：2)、UGGGTGG(SEQ ID NO：28)、GGGTGGU(SEQ ID NO：29)、UGGGTGGU(SEQ ID NO：30)、GGGTGGUUU(SEQ ID NO：9)和GUG(SEQ ID NO：8)。
在一个实施方案中，含有非DNA碱基的多核苷酸在基于核酸的载体中施用于APC、DC、人类或动物。
含有非DNA碱基的多核苷酸可含有磷酸二酯骨架或其它适合修饰物。
如本文所使用的术语“刺激”还指APC的活化或成熟，或免疫反应的活化或增加，这取决于使用术语的上下文。
据信本文所述的含有非DNA碱基的多核苷酸不仅能够刺激DC，还能够刺激其它APC，其包括专职APC，诸如但不限于单核细胞、巨噬细胞、朗氏细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、枯氏细胞、小神经胶质细胞、许旺氏细胞和内皮细胞；和非专职APC，诸如但不限于上皮细胞、成纤维细胞、黑素细胞、神经细胞、平滑肌细胞、肌细胞、肝细胞、星形细胞和角质细胞。因此，本发明包括用于活化APC的组合物和方法。
除非另外指示，否则在提及免疫反应时，术语“刺激”是指免疫***的一般活化或以抗原非特异性方式的免疫***组分的活化。对于个体的免疫反应的刺激可由但不限于以下方面来证明：细胞增殖、克隆扩充、合成新蛋白、分化成效应细胞、分化成记忆细胞、抗体类型的水平或量增加、抗体类别转换、产生抗体的B淋巴细胞中的体细胞高变、免疫细胞类型的水平或量增加、特定位置中的免疫细胞的募集(运动和迁移)、个体的细胞因子的水平或量增加、个体的趋化因子的水平或量增加、抗原呈递增加、胞吞作用增加、共刺激分子(附加分子)的增加或获得、粘附分子的增加或获得、细胞因子受体的增加或获得、趋化因子受体的增加或获得、细胞介导细胞毒性增加、形态变化、免疫细胞记忆的确立、反应性氧中间体的水平或量增加、氧化氮水平或量增加、神经内分泌分子(例如激素、神经递质等)的水平或量增加，和免疫耐受或抑制中断。免疫细胞包括但不限于淋巴细胞，诸如B细胞、T细胞(包括CD4+和CD8+细胞)和NK细胞；单核吞噬细胞；粒细胞，诸如嗜中性粒细胞、嗜伊红粒细胞和嗜碱性粒细胞；如本文所述的树突状细胞；和前述细胞的任何祖代。抗体类型包括IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和IgY。IgG抗体可进一步划分成不同的同型。在人类中，这些同型为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，其为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。抗病毒免疫反应已知与特定IgG抗体同型反应相关。在小鼠中，这些同型为本领域普通技术人员已知为IgG2a和IgG2b同型。病毒疫苗对于此类抗体的诱导被本领域普通技术人员认为是病毒疫苗功效和效力的量度。
在一个实施方案中，免疫反应是全身免疫反应。术语“全身免疫反应”在本文是指不限于身体特定区域的免疫反应。全身免疫反应的实例是将抗原和免疫刺激分子施用于个体之后，在个体的循环或淋巴***中循环的抗体水平的增加。另一个实例是将免疫刺激分子施用于个体之后，个体的循环或淋巴***中的细胞因子和/或趋化因子的水平增加。另一个实例是在血液或淋巴循环中或在免疫***器官(诸如脾脏、淋巴节或肝脏)中存在能够对致敏抗原的激发作出反应的敏化免疫效应细胞，诸如T-细胞、B-细胞或浆细胞。在其它实施方案中，免疫反应是局部免疫反应。术语“局部免疫反应”是指主要但是未必完全限于身体特定区域的免疫反应。局部免疫反应可由局部化肿胀或发红和/或免疫细胞募集(运动和迁移)至身体特定区域来证明。例如，在粘膜施用抗原和/或免疫刺激分子诸如本文所述的含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸序列之后，可发生粘膜免疫反应。粘膜反应可包括但不限于抗体类型的水平或量增加、IgA抗体的水平或量增加、γ/δ-阳性T淋巴细胞的活化、局部免疫耐受的诱导和全身免疫耐受的诱导。
在本发明的若干实施方案中，将包含含有非DNA碱基的多核苷酸的组合物施用于个体(即，动物或人类)以治疗或预防疾病。如本文所使用，术语“疾病”是指身体健康受损的病状，并且包括但不限于癌症；包括病毒、细菌或寄生虫的病原体感染；过敏症；自身免疫疾病；和对于移植器官的自身免疫反应。在一些实施方案中，与DC机能障碍相关的疾病包括(但不限于)塞扎莱综合征(Sezary syndrome)(患者患有循环DC的深刻缺陷)(Wysocka等，Blood 2002，100：3287)；唐氏综合征(Down’s syndrome)(患者患有树突状萎缩)(Takashima等，J.Intellect.Disabil.Res.1994，38：265)；涉及DC不适当活化的自身免疫疾病(例如，通过DC进行的自体抗原呈递延长)(Erikson等，J.Exp.Med.2003，197：323和Ludewig等，Curr.Opin.Immunol.2001，13：657)；脊髓损伤(患者患有树突状萎缩)(Iversen等，Blood 2000，96：2081)；和格雷夫斯氏疾病(Graves’disease)(甲状腺树突状细胞在疾病中有牵联)(Quadbeck等，Scand.J.Immunol.2002，55：612)。术语“治疗”是指减轻或减少病症并且不需要治愈疾病。还如本文所使用的术语“有效量”是指有效诱导免疫反应的含有非DNA碱基的多核苷酸的量。含有非DNA碱基的多核苷酸的疗效可通过包括但是不限于以下的方法来增加：化学修饰碱基、糖或磷酸骨架以增加在生物环境中的稳定性，化学补充寡核苷酸以增强与免疫***细胞的相互作用或使用含有合适序列的细菌质粒、以生物技术来扩增序列以增加序列在体内的利用度，将序列与生物或化学载体复合或将序列与细胞类型定向配体或抗体偶合。如本文所使用的术语“有效量”是指由治疗继发性免疫缺陷领域中已知的考虑因素确定的量，其中此量必须有效提供所治疗个体的可测量的减轻，诸如表现出包括但不限于以下的改善：改善存活率、更快速的恢复、改善或消除症状、减少感染后并发症和在适当情况下抗体滴度或增加针对感染物的滴度、降低肿瘤质量，和本领域技术人员已知的其它测量。
如本文所使用的术语“抗原”定义为可由抗体、T-细胞受体，或模式识别受体(PRR)特异性结合，从而诱导免疫反应的任何物质。抗原类型包括但不限于病毒、细菌、肿瘤和自体抗原。因此，根据本发明制备的树突状细胞可用于预防和治疗包括以下的各种疾病：传染病、癌症、自身免疫疾病和归因于故意传播生物体(诸如病毒、细菌和毒素)的疾病，包括但不限于炭疽热、肉毒杆菌中毒、瘟疫、兔热病、天花和病毒出血热。
应理解可施用包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸、药学上可接受的媒介物和任选地一种或多种抗原的组合物以便刺激抗体产生以产生单克隆和多克隆抗体产生以用于诸如但不限于以下的应用：治疗性治疗疾病或对于诊断目的而用于成像或本领域技术人员已知的其它应用。
应理解包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸、药学上可接受的媒介物和任选地一种或多种抗原的组合物可作为减少针对过敏原的抗体反应、降低对于过敏原的敏感度的手段，或作为减少诸如但不限于桥本氏疾病(Hashimoto’s disease)、全身红斑狼疮和反应性关节炎的疾病中的自体抗体反应的手段来施用。
应理解包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸的组合物可在药学上可接受的媒介物中、在体外单独，或与影响含有抗原(包括肿瘤抗原)的APC的其它免疫调节剂、一种或多种抗原或一种或多种佐剂组合，以有效诱导对于APC的刺激的量施用于APC，所述APC经设计以自体方式重新注入动物或人类中，以便刺激免疫反应。免疫调节剂包括但不限于以下：氢氧化铝；磷酸铝；磷酸钙；聚合物；共聚物，诸如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物；聚合物P1005；弗氏完全佐剂(用于动物)；弗氏不完全佐剂；失水山梨糖醇单油酸酯；角鲨烯；CRL-8300佐剂；QS 21；皂角苷；ISCOM；胞壁酰二肽；葡萄糖胺基胞壁酰二肽；海藻糖；细菌提取物，包括分枝杆菌提取物；细菌全细胞，包括分枝杆菌全细胞；分枝杆菌细胞壁-DNA复合物，分枝杆菌细胞壁骨架，解毒内毒素；膜脂质；从原核生物分离的DNA，CpG合成多核苷酸；经修饰的CpG合成多核苷酸或含有非CpG的多核苷酸(例如MIMP)，适体；质粒免疫刺激分子；聚(I:C)分子；细胞因子；趋化因子；壳聚糖和衍生物；透明质酸和衍生物；霍乱毒素；百日咳毒素；和匙孔血蓝蛋白，或其组合。包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸或含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸外加免疫调节剂的组合物可在一次治疗或多次治疗中，任选地以不同浓度，并且持续适合于刺激APC的时间而添加至APC。包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸的组合物可在施用免疫调节剂之前、同时或之后施用。此外，包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸的组合物可在施用抗原之前、同时或之后添加。
本发明还包括将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物和抗原的组合物作为疫苗直接施用于动物或人类的方法，其中此施用在动物或人类中产生免疫反应，并且更优选地，抗原特异性免疫反应。抗原可在施用包含一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物之前、同时或之后施用于动物或人类。在一个优选实施方案中，抗原与包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物同时施用。
本发明还包括将包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物和不包含于APC中的抗原的组合物施用于动物或人类的方法，其中抗原的量得以显著降低并且此施用在动物或人类中产生有效免疫反应，并且更优选地，抗原特异性免疫反应。抗原可在施用包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物之前、同时或之后施用于动物或人类。在一个优选实施方案中，抗原与包含含有非DNA碱基的多核苷酸的组合物同时施用。在一个实施方案中，抗原可与包含含有非DNA碱基的多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物组合并且施用于动物或人类。
本文所述的抗原不限于任何特异性抗原或抗原类型。实际上应认识到本领域普通技术人员在阅读本发明的详细说明和实施例之后将能够使用本发明的多核苷酸组合物以及除本发明所描述的抗原以外的抗原，而不背离详细说明、实施例和权利要求书中所定义的本发明精神和范围。本领域普通技术人员可选择任何抗原或一种以上抗原以便与本发明的含有非DNA碱基的多核苷酸和一种或多种药学上可接受的媒介物一起组合于组合物中。此类抗原对于所需免疫反应或针对特异性抗原的疫苗具有特异性。在一个实施方案中，抗原是肿瘤抗原，诸如由肿瘤细胞溶解产物或分子生物学领域普通技术人员已知的技术(诸如但不限于测序、克隆、转染、扩增于基于原核生物或真核细胞的合适***中并且随后分离和纯化)产生的肿瘤抗原。在另一个实施方案中，抗原是来源于病原体的抗原，并且更优选地是表达于病原体外表面上的抗原。源自病原体的表面抗原的一个实例是肝炎表面抗原。在另一个实施方案中，抗原由完整病原体组成。完整病原体的一个实例是灭活或减毒H1N1病毒颗粒。另一个实例是完整牛分枝杆菌菌株卡介苗(BCG)，其未经修饰或在适当情况下经基因修饰以表达预防其它分枝杆菌感染的抗原，所述分枝杆菌诸如但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或乌分枝杆菌(Mycobacterium avium)和亚种，诸如副结核(paratuberculosis)。当将不包含于APC中的抗原施用于动物或人类时，所述抗原可以蛋白、肽或多肽形式施用，或可施用编码所述抗原的多核苷酸。编码抗原的多核苷酸可包含于包括其它元件以便在动物或人类中表达抗原多肽的载体中。在一个实施方案中，抗原和含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸包含于不同载体中。抗原包括但不限于H1N1抗原、流感抗原、甲型肝炎抗原、乙型肝炎抗原、甲型肝炎抗原和乙型肝炎抗原的组合、人***状瘤抗原、肺炎球菌抗原、白喉抗原、脑膜炎球菌抗原、破伤风抗原、一种或多种人免疫缺陷病毒抗原、一种或多种猫免疫缺陷病毒抗原，和一种或多种猿免疫缺陷病毒抗原
应理解，施用经含有非DNA碱基的多核苷酸刺激的含有抗原的APC，或将包含含有非DNA碱基的多核苷酸、药学上可接受的媒介物和抗原的组合物施用于动物或人类在动物或人类中产生对于免疫反应的刺激。在优选实施方案中，此类施用在动物或人类中产生对于免疫***的刺激以及抗原特异性免疫反应。术语“抗原特异性免疫反应”是指主要针对所述抗原的免疫反应。抗原特异性免疫反应包括但不限于以下或由以下但不限于以下组成：抗体量(抗体滴度)的增加、抗体类别的转换、产生抗体的B淋巴细胞中的体细胞高变、免疫细胞记忆的确立、施用抗原的人类或动物中的具有针对抗原的特定B细胞受体或T细胞受体的细胞量的增加。当抗体以足够的亲和力和亲合力与抗原结合，从而导致产生抗体-抗原复合物时，抗体对于特异性抗原“具有特异性”。
包含处于药学上可接受的媒介物中的一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸，以及任选地一种或多种抗原的本发明组合物包括但不限于诸如以下的施用手段或方法：注射剂、溶液、乳膏、凝胶剂、植入物、泵、软膏、乳液、悬浮液、微球、颗粒、微粒、纳米粒子、脂质体、糊剂、贴片剂、锭剂、透皮输送装置、喷雾剂、气溶胶或本领域普通技术人员熟悉的其它手段。本发明的药物制剂可通过本领域中已知的程序，使用熟知和可轻易获得的成分来制备。例如，本发明组合物可与常见赋形剂、稀释剂或载体一起配制，并且形成锭剂、胶囊剂、悬浮液、粉末等。药学上可接受的媒介物为本领域普通技术人员已知，并且包括常见赋形剂、稀释剂，或载体。例如，组合物可与常见赋形剂、稀释剂或载体一起配制，并且形成锭剂、胶囊剂、悬浮液、粉末等。适合于此类制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括以下：填充剂和增量剂(例如淀粉、糖、甘露糖醇和硅酸衍生物)；粘合剂(例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、褐藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)；保湿剂(例如甘油)；崩解剂(例如碳酸钙和碳酸氢钠)；延缓溶解剂(例如石蜡)；再吸收加速剂(例如季铵化合物)；表面活性剂(例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯)；吸附载体(例如高岭土和膨润土)；乳化剂；防腐剂；甜味剂；稳定剂；着色剂；芳香剂；调味剂；润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁)；固体聚乙二醇；及其混合物。药学上可接受的媒介物包括药学上可接受的载体。一些载体可为本领域普通技术人员已知的免疫佐剂载体。
制剂可经构成以使得其仅仅或优选在特定位置中，可能持续一段时间来释放活性成分(即，缓释制剂)。此类组合提供控制释放动力学的进一步机制。包衣、壳层和保护基质可由例如聚合物或蜡制成。
包含一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物通过使一种或多种含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸与药学上可接受的媒介物均匀和紧密地缔合来制备。药学上可接受的媒介物可为液体媒介物、固体媒介物或两种媒介物。液体媒介物为水性媒介物、非水性媒介物或两种媒介物。药学上可接受的媒介物包括免疫佐剂载体。药学上可接受的媒介物包括但不限于水性悬浮液、油乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位点特异性乳液、长时驻留乳液、粘性乳液、微乳液和纳米乳液。固体媒介物是生物媒介物、化学媒介物或两种媒介物，并且包括但不限于使得含有非DNA碱基的多核苷酸组合物得以持续释放的病毒载体***、颗粒、微粒、纳米颗粒、微球、纳米球、微泵、细菌细胞壁提取物和可生物降解或不可生物降解的天然或合成聚合物。乳液、微泵和聚合物可植入于需要输送的位置附近(Brem等，1991J.Neurosurg.74：441)。用于使含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸与固体媒介物复合的方法包括但不限于直接吸附于固体媒介物表面、直接或经由连接部分来共价偶合于固体媒介物表面，和共价偶合于用于制造固体媒介物的聚合物。任选地，序列可通过添加非离子或离子聚合物诸如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(通常被称为吐温)或透明质酸或透明质酸衍生物来稳定化。
优选的水性媒介物包括但不限于水、盐水和药学上可接受的缓冲剂。优选非水性媒介物包括但不限于矿物油或中性油，其包括但不限于甘油二酯、甘油三酯、磷脂、脂质、油和其混合物，其中油含有多不饱和与饱和脂肪酸的适当混合物。实例包括但不限于大豆油、菜籽油、棕榈油、橄榄油和丙二醇二辛酯/二癸酯，其中脂肪酸可为饱和或不饱和的。任选地，赋形剂可包含在内，而与用于将含有非DNA碱基的多核苷酸组合物呈递给细胞的药学上可接受的媒介物无关。这些赋形剂包括但不限于抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂，并且可包括悬浮剂和增稠剂。
一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸可单独或与包括但不限于以下的其它免疫佐剂媒介物或载体组合施用于人类或动物：明矾，氢氧化铝；磷酸铝；磷酸钙；聚合物；共聚物，诸如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物；聚合物P1005；弗氏完全佐剂(用于动物)；弗氏不完全佐剂；失水山梨糖醇单油酸酯；角鲨烯；角鲨烷；CRL-8300佐剂；QS 21；皂角苷；ISCOM；胞壁酰二肽；葡萄糖胺基胞壁酰二肽；海藻糖；亲水性或亲脂性细菌提取物，包括分枝杆菌提取物；细菌全细胞，包括分枝杆菌全细胞；细菌细胞壁制剂，包括分枝杆菌细胞壁制剂；解毒内毒素；脂质A和其合成类似物；膜脂质；从原核生物分离的DNA，CpG合成多核苷酸；非CpG合成多核苷酸；适体；编码免疫刺激分子的质粒；聚(I:C)分子；细胞因子；趋化因子；壳聚糖和衍生物；透明质酸和衍生物；霍乱毒素；百日咳毒素和匙孔血蓝蛋白或其组合。免疫佐剂媒介物或载体为本领域普通技术人员已知，并且包括但不限于明矾、油基佐剂、免疫复合物(ISCOMS)、病毒体、单磷酰脂质A(MPL)和/或其类似物。在本发明的一个优选实施方案中，颗粒载体是明矾，其为由氢氧化铝或磷酸铝制备并且用作疫苗佐剂的胶状抗原载体。
包含处于药学上可接受的媒介物中的一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸的组合物可单独，或与本领域普通技术人员已知的其它治疗手段组合施用，所述治疗手段包括但不限于化学治疗剂、抗微生物剂，或抗病毒剂。化学治疗剂包括但不限于抗代谢物、DNA损伤剂、微管减稳剂、微管稳定剂、肌动蛋白解聚剂、生长抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、嘌呤抑制剂、嘧啶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、CDK抑制剂、血管生成抑制剂和分化增强剂。这些其它治疗手段的施用剂量和方法为本领域普通技术人员已知。
尤其适合于各种形式的施用包含本发明的含有非DNA碱基的多核苷酸组合物和药学上可接受的媒介物的组合物，包含含有非DNA碱基的多核苷酸的APC或DC，或本发明的包含含有非DNA碱基的多核苷酸和其它材料诸如载体的组合物的方法包括但不限于以下施用类型：经口(例如，口腔或舌下)、***、直肠、以栓剂形式、表面、肠胃外、鼻腔、气溶胶、吸入、鞘内、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、真皮内、真皮下、皮下、肌肉内、组织内(例如，组织或腺体)、子宫内、***、施用于体腔内、手术施用于肿瘤或内部损伤位置处、直接施用于肿瘤内、施用于器官内腔或软组织内、施用于骨髓内和胃肠、生殖、泌尿和生殖泌尿***的任何粘膜表面内。包含本发明的含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸和药学上可接受的媒介物的组合物还可施用于选自由以下组成的组的粘膜表面：膀胱内(膀胱)、眼睛、口腔、鼻腔、直肠和***表面。适用于以上提到的各种施用形式的技术包括但不限于表面涂覆、摄入、手术施用、注射剂、喷雾剂、透皮输送装置、渗透泵、直接电沉积于所需位点，或本领域普通技术人员熟悉的其它方法。涂覆位点可在外部，诸如在表皮，或内部，例如胃溃疡、手术区域，或在别处。
本发明组合物可以乳膏、凝胶剂、溶液、悬浮液、脂质体、颗粒形式或配制和输送组合物领域技术人员已知的其它方式施用。超细颗粒尺寸可用于治疗剂的吸入输送。皮下施用的合适制剂的一些实例包括但不限于植入物、储库(depot)、针、胶囊和渗透泵。***施用的合适制剂的一些实例包括但不限于乳膏和环。口服的合适制剂的一些实例包括但不限于：丸剂、液体、糖浆和悬浮液。透皮施用的合适制剂的一些实例包括但不限于凝胶剂、乳膏、糊剂、贴片剂、喷雾剂和凝胶剂。皮下施用的合适输送机制的一些实例包括但不限于植入物、储库、针、胶囊剂和渗透泵。适合于肠胃外施用的制剂包括但不限于可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预定接受者的血液等渗的溶质的水性和非水无菌注射溶液，以及可包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水无菌悬浮液。可由本领域普通技术人员通常使用的无菌粉末、颗粒剂和锭剂来制备临时注射溶液和悬浮液。
本发明组合物与例如一种或多种药学上可接受的媒介物或赋形剂组合的实施方案可方便地以单位剂型呈现并且可通过常规制药技术来制备。此类技术包括使含有活性成分和医药媒介物或赋形剂的组合物缔合的步骤。在一般情况下，制剂通过使活性成分与液体媒介物均匀和紧密地缔合来制备。优选单位剂量制剂是含有所施用成分的剂量或单位，或其合适部分的制剂。应理解除了以上特别提到的成分以外，包含本发明组合物的制剂可包括本领域普通技术人员通常使用的其它药剂。
施用体积取决于施用途径而有所不同。此类体积为将组合物施用于动物或人类领域的普通技术人员所已知。取决于施用途径，每剂量的体积优选为每剂量约0.001至100mL，更优选地每剂量约0.01至50mL，并且最优选地每剂量约0.1至30mL。例如，肌肉内注射剂可在约0.1ml至1.0ml体积范围内。单独或与其它治疗剂一起施用的含有非DNA碱基的多核苷酸组合物可在一次给药治疗中、多次给药治疗中施用，或按照排程并且持续对于所治疗疾病、接受者的病状和施用途径适合的一段时间来连续地输注。此外，其它治疗剂可在施用包含一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸的组合物之前、同时或之后施用。
优选地，每剂量施用的含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸的量为约0.0001至100mg/kg体重，更优选地约0.001至10mg/kg体重并且最优选地约0.01至5mg/kg体重。所施用的特定含有非DNA碱基的多核苷酸和特定治疗剂、每剂量的量、给药排程和施用途径应由医生使用本领域技术人员已知的方法来确定并且取决于疾病类型、疾病严重程度、疾病位置和其它临床因素，诸如接受者的体型、体重和身体健康状况。另外，可任选地使用体外分析以帮助识别序列和序列外加治疗剂施用的最佳范围。
为了在本发明中使用，含有非DNA碱基的多核苷酸可使用许多在本领域中熟知的程序中的任何一个来重新合成。例如，可利用β-氰乙基亚磷酰胺方法(Beaucage和Caruthers 1981Tet.Let.22：1859)和核苷H-膦酸酯方法(Garegg等，1986Tet.Let.27：4051-4054；Froehler等，1986Nucl.Acid.Res.14：5399-5407；Garegg等，1986Tet.Let.27：4055-4058，Gaffney等，1988Tet.Let.29；2619-26220)，或使用液相合成程序(Bonora等，1993Nucl.Acids Res.21：1213-1217)。这些化学过程可通过多种可购得的自动寡核苷酸合成器来执行。或者，多核苷酸可使用已知技术从现有核酸序列(例如基因组或cDNA)来制备，所述技术诸如使用限制酶、核酸外切酶和/或核酸内切酶的技术。
为了在体内使用，多核苷酸优选对于降解具有相对抗性(例如经由核酸内切和外切酶)。多核苷酸稳定化的一个实例是经由使用磷酸骨架修饰。在一个实施方案中，稳定化多核苷酸具有硫代磷酸酯修饰的骨架。多核苷酸的硫代磷酸酯骨架修饰在啮齿动物中产生四十八小时的全身半衰期，并且此类药代动力学表明其可适用于体内应用(Agrawal等，1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7595)。硫代磷酸酯可使用自动技术采用氨基磷酸酯或H膦酸酯化学来合成。可产生芳基膦酸酯和烷基膦酸酯(例如如美国专利第4,469,863号中所描述)；并且烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分如美国专利第5,023,243号和欧洲专利第092,574号中所描述经烷基化)可通过自动固相合成使用市售试剂来制备。进行其它DNA骨架修饰和取代的方法已得以描述(Uhlmann，E.和Peyman，A.(1990)Chem.Rev.90：544；Goodchild，J.(1990)Bioconjugate Chem.1：165)。
为了在体内施用，包含一种或多种含有非DNA碱基的多核苷酸的组合物可与引起与靶细胞(例如，B细胞和自然杀伤细胞(NK))表面的较高亲和力结合和/或通过靶细胞进行的细胞吸收得以增加的分子相缔合。多核苷酸可使用本领域中熟知的技术与合适分子离子或共价缔合。可使用多种偶合或交联剂(例如，蛋白A，碳二亚胺，和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP))。核苷酸可替代地使用熟知技术囊封于脂质体或病毒体中。
以下实施例用来进一步说明本发明，然而同时对其不构成任何限制。相反，可清楚地理解，本领域的技术人员在阅读本文的描述后，可以具有根据本文的建议得出各种其它实施方案、改进及其等同物的手段而不背离本发明精神和范围。
实施例1
制备含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸
以下含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸序列通过Sigma-Genosys(Oakville，ON，Canada)或Midland(Midland，TX，USA)来制备。除非另外说明，序列在使用之前直接分散于经高压处理的去离子水或药学上可接受的缓冲剂诸如但不限于盐水中。
本领域普通技术人员显而易知含有非DNA碱基的多核苷酸可使用常规或标准亚磷酰胺寡核苷酸技术来制备。
以下含有非DNA碱基的5′-OH，3′-OH多核苷酸序列只代表可用作免疫佐剂的组合物。预期诸如但不限于以下描述的对于这些分子的修饰可由疫苗佐剂制剂领域的普通技术人员来使用。然而，从以下实施例中可明确了解使用含有Neb、U或I的多核苷酸序列来充当免疫佐剂的一般原则将予以保留。同样地，本领域技术人员已知的合适佐剂制剂的选择也保留使用含有Neb、U或I的多核苷酸序列来充当免疫佐剂的一般原则。
另外，可使用合适合成方法来产生具有合适骨架修饰，或本领域技术人员已知可赋予对于细胞外和细胞内降解的增强抗性的其它化学修饰的多核苷酸序列。也可使用ODN的5’-或3′-末端的赋予保护的修饰(诸如但不限于TEG-胆甾醇基添加物或骨架保护，诸如但不限于使用硫代磷酸酯键)。也可使用含有碱基诸如但是限于A、G、C、T、Neb、U或I的额外天然或非天然核苷酸，其添加至多核苷酸的一个或两个末端以使得内在免疫佐剂活性不受实质性影响的。可使用核糖和/或脱氧核糖或修饰而不脱离本发明范围和精神。
以下序列使用标准亚磷酰胺多核苷酸技术以磷酸二酯骨架来合成：
(SEQ ID NO：1)NebGGTGNeb
(SEQ ID NO：2)UUGTUU
(SEQ ID NO：3)IIGTII
(SEQ ID NO：4)GNebG
(SEQ ID NO：5)GGGTGGNebNebNeb
(SEQ ID NO：6)GIG
(SEQ ID NO：7)GGGTGGIII
(SEQ ID NO：8)GUG
(SEQ ID NO：9)GGGTGGUUU
这些分子用来说明可用作免疫佐剂的含有非DNA碱基的多核苷酸的一般组成，所述多核苷酸呈具有需要对其进行免疫反应的一种或多种抗原的简单混合物形式或具有载体和一种或多种旨在优化免疫反应的额外佐剂的复杂混合物或制剂形式。此类方法通常使用诸如明矾(磷酸铝或氢氧化物)的载体分子或材料，但是本领域技术人员可利用的载体或媒介物的选择是广泛的，并且本领域普通技术人员将认识到它们可适用于本发明的多核苷酸序列而不背离如以下实施例和权利要求中定义的本发明精神和范围。
以下参考多核苷酸也通过硫代磷酸酯骨架来合成并且从Midland(Midland，Texas，USA)购买：
(SEQ ID NO：31)非CpG 40105′-TGCTGCTTTTTGCTGGCTTTTT-3′
(SEQ ID NO：32)CpG 20065′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′，(A-类)
(SEQ ID NO：33)CpG 23365′-GGGGACGACGTCGTCGGGGGG-3′(A-类)
(SEQ ID NO：34)CpG 79095′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′(B-类)
(SEQ ID NO：35)CpG 24295′-TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG-3′(C-类)
实施例2
缺少通过含有非DNA碱基的多核苷酸进行的TLR活化
Toll样受体(TLR)已知与可充当免疫佐剂的许多天然和合成分子相互作用。这些分子的实例为Poly(I:C)多核苷酸、脂多糖和含有CpG的多核苷酸。含有非DNA碱基的多核苷酸(SEQ ID NO：1-3)与TLR相互作用并且诱导下游信号转导的相互作用通过评估表达人类TLR2、3、4、5、7、8和9的HEK293细胞中的NF-κB活化来测试。TLR接合通过测量处于可由NF-κB诱导的报道基因控制下的碱性磷酸酶的分泌来确定。对于每一种TLR均使用适当阳性对照。含有非DNA碱基的多核苷酸以100μg/mL的浓度溶解于无菌水中，并且以10μg/mL的最终浓度使用。将含有合适TLR和NF-κB报道***(InvivoGen，San Diego，CA，USA)的HEK293细胞放置于96孔板的孔中(25,000-50,000个细胞，处于最终体积为200μL的培养基中，其经设计用于检测经NF-κB诱导而分泌的碱性磷酸酶的表达)，并且与含有非DNA碱基的多核苷酸或阳性对照一起孵育16-20小时。TLR活化活性通过使用Coulter AD340C吸收检测器来测量650nm波长下的吸收率而确定。所显示的结果以光密度(OD)来表达。代表性分析的结果显示于表1中。
表1.通过含有非DNA碱基的多核苷酸进行的TLR活化
Figure BDA00001869712800281
1650nm下的光密度
2阳性对照：
hTLR2：108细胞/毫升的热灭活单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)
hTLR3：1μg/mL的Poly(I:C)
hTLR4：100ng/mL的大肠杆菌(E.coli)K12LPS
hTLR5：100ng/mL的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)鞭毛蛋白
hTLR7：1μg/mL的Gardiquimod
hTLR8：1μg/mL的CL075
hTLR9：100ng/mL的CpG ODN 2006
NK-κB对照细胞：100ng/mL的PMA
结果表明，如缺少碱性磷酸盐报道基因活性所证明，含有非DNA碱基的多核苷酸不能活化TLR介导的信号转导途径(表1)。相比之下，每一种TLR受体由其特异性配体活化(参见表1脚注中的所使用的相应阳性对照配体)。虽然不希望受以下陈述约束，但是这些结果支持以下假设：含有非DNA碱基的多核苷酸免疫佐剂活性并非经由TLR的活性来介导，而是通过一种或多种不同的途径来介导。
另外，这些结果表明含有非DNA碱基的多核苷酸不通过已知核酸TLR受体3、7、8或9来进行信号传导。重要的是，结果表明含有非DNA碱基的多核苷酸在组成和机制上不同于含有CpG的多核苷酸，如含有非DNA碱基的多核苷酸不能刺激TLR9信号转导所证明。相比之下，本领域普通技术人员已知含有CpG的多核苷酸刺激TLR9信号转导，并且此信号转导与免疫佐剂活性相关。
实施例3
在用含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性-抗-HBsAg IgG抗体滴度。
在标准模型(小鼠中的针对乙型肝炎表面抗原的抗体反应)中确定含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性。针对此抗原的免疫反应不视为只对于此抗原具有特异性。相反，使用疫苗配制和开发技术人员已知的其它抗原和其它疫苗佐剂是不言而喻的，并且预期此方法和其它在疫苗接种中已知的常用方法可用于开发含有蛋白、肽、碳水化合物和脂质抗原的疫苗，其以含有非DNA碱基的多核苷酸来辅佐。以下实施例说明使用含有非DNA碱基的多核苷酸作为疫苗佐剂可如何在预防或治疗方案中引起通常被视为具有保护性的免疫反应。
在第0、21和31天，对5只雌性BALB/c小鼠的群组使用肌肉内(I.M.)施用途径以重组乙型肝炎表面抗原(重组HBsAg；CortexBiochemical，San Leandro，CA，USA)和氢氧化铝凝胶的不同组合(明矾；SuperFos Biosector，Vedback，Denmark)和/或SEQ ID NO：1-3(分别为NebGGTGNeb、UUGTUU和IIGTII)来进行免疫接种。与明矾的复合通过在免疫接种之前将抗原和含有非DNA碱基的多核苷酸与明矾混合来获得。在第41天收集血清并且通过ELISA使用HBsAg(1μg/孔，96孔微量滴定板)和与HR偶联的山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体(Southern Biotechnologies，Birmingham，Alabama)来分析抗-HBsAg IgG总、IgG1、IgG2a和IgG2b抗体的存在。抗体滴度以终点滴度来确定。典型免疫接种研究的结果显示于表2-5中。
表2.以HBsAg联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，BALB/c小鼠中的抗-HBsAg IgG(总)滴度。
IgG总
Figure BDA00001869712800301
*每组5只小鼠
表3.以HBsAg联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，BALB/c小鼠中的抗-HBsAg IgG1滴度。
IgG1
Figure BDA00001869712800311
*每组5只小鼠
表4.以HBsAg联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，BALB/c小鼠中的抗-HBsAg IgG2a滴度。
IgG2a
Figure BDA00001869712800312
*每组5只小鼠
表5.以HBsAg联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，BALB/c小鼠中的抗-HBsAg IgG2b滴度。
IgG2b
Figure BDA00001869712800321
*每组5只小鼠
结果证明含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性。在此实施例中，如与明矾复合的抗-抗原IgG抗体滴度所确定，SEQ ID NO：1-3展现三种含有非DNA碱基的多核苷酸的显著免疫佐剂活性，并且所获得的抗体滴度高于对于单独抗原或与标准佐剂明矾复合的抗原所观察到的抗体滴度。以下验证事实具有较大显著性：虽然使用明矾可增强含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性，但是含有非DNA碱基的多核苷酸可在不存在与可溶性抗原组合的作为诱导较高水平的抗原特异性抗体的手段的颗粒载体的情况下加以使用。以下观察结果具有较大显著性：使用单独或与明矾载体组合的含有非DNA碱基的多核苷酸作为佐剂引起IgG2a和IgG2b同型的IgG抗体水平增加。这些抗体由本领域技术人员确认为在诱导针对病毒抗原的免疫反应时是特别有利的。
实施例4
在用含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性-抗-H1N1病毒颗粒IgG抗体滴度。
在标准模型(小鼠中的针对H1N1病毒颗粒的抗体反应)中确定含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性。针对此抗原的免疫反应不视为只对于此病毒颗粒具有特异性。相反，使用疫苗配制和开发技术人员已知的其它病毒颗粒和其它疫苗佐剂是不言而喻的，并且预期此方法和其它在疫苗接种中已知的常用方法可用于开发含有蛋白、肽、碳水化合物和脂质抗原的疫苗，其以含有非DNA碱基的多核苷酸来辅佐。以下实施例说明使用含有非DNA碱基的多核苷酸作为疫苗佐剂可如何在预防或治疗方案中引起通常被视为具有保护性的免疫反应。
在第0、21和31天，将5只雌性C57BL/6小鼠的群组使用肌肉内(I.M.)施用途径以H1N1病毒颗粒(Genway Biotech，San Diego，CA，USA，甲型流感Beijing H1N1)和氢氧化铝凝胶的不同组合(明矾；SuperFos Biosector，Vedback，Denmark)和/或SEQ ID NO：1至9来进行免疫接种。与明矾的复合通过在免疫接种之前将H1N1病毒颗粒和含有非DNA碱基的多核苷酸与明矾混合来获得。在第41天收集血清并且通过标准ELISA使用H1N1病毒颗粒(1μg/孔，96孔微量滴定板)和与HR  偶联的山羊抗小鼠IgG1和IgG2抗体(SouthernBiotechnologies，Birmingham，Alabama)来分析抗-H1N1病毒颗粒IgG1和IgG2b抗体的存在。抗体滴度以终点滴度来确定。典型免疫接种研究的结果显示于表6-7中。
表6.用H1N1病毒颗粒联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸进行免疫接种之后，C57/BL-6雌性小鼠中的抗-H1N1病毒颗粒IgG1抗体滴度。
IgG1
Figure BDA00001869712800331
Figure BDA00001869712800341
*每组5只小鼠
表7.用H1N1病毒颗粒联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸进行免疫接种之后，C57/BL-6雌性小鼠中的抗-H2N1病毒颗粒IgG2b抗体滴度。
IgG2b
Figure BDA00001869712800351
*每组5只小鼠
表6中显示的结果表明含有非DNA碱基的多核苷酸SEQ IDNO：1、2、3、5和9在与单独H1N1病毒颗粒一起施用时具有降低IgG1抗体滴度的能力。含有非DNA碱基的多核苷酸SEQ ID NO：6和7在与单独H1N1病毒颗粒一起施用时可刺激抗-IgG1抗体水平。SEQ ID NO：8在与单独H1N1病毒颗粒一起施用时对于抗-IgG1抗体滴度不具有任何作用。当H1N1病毒颗粒与明矾和含有非DNA碱基的多核苷酸复合时，相较于与单独明矾复合的H1N1，仅SEQ IDNO：2和4引起IgG1抗体滴度升高。这些数据表明可通过使用适当的含有非DNA碱基的多核苷酸和制剂(在盐水中或与载体明矾复合的可溶性制剂)来减弱或增强针对H1N1的IgG1反应。
表7中显示的结果表明含有非DNA碱基的多核苷酸SEQ IDNO：1、8和9在与单独H1N1病毒颗粒一起施用时具有降低IgG2b抗体滴度的能力。含有非DNA碱基的多核苷酸SEQ ID NO：2、3、5、6和7在与单独H5N6病毒颗粒一起施用时可刺激抗-IgG1抗体水平。SEQ ID NO：4在与单独H1N1病毒颗粒一起施用时对于抗-IgG2b抗体滴度不具有任何作用。当H1N1病毒颗粒与明矾和含有非DNA碱基的多核苷酸复合时，相较于与单独明矾复合的H1N1，SEQ IDNO：1、2、3、4、5和7引起抗体滴度升高。SEQ ID NO：6、8和9在与明矾复合时对于IgG2b抗-H1N1抗体水平不具有任何作用。这些数据表明可通过使用适当的含有非DNA碱基的多核苷酸和制剂(在盐水中或与载体明矾复合的可溶性制剂)来减弱或增强针对H1N1病毒颗粒的IgG2b反应。
实施例5
在用含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性-抗-H1N1病毒颗粒IgG抗体滴度-抗原节约。
使用小鼠中的H1N1病毒颗粒模型***来评估含有非DNA碱基的多核苷酸充当抗原节约佐剂的能力。审慎地选择经缩减的免疫接种排程和降低的病毒颗粒激发剂量以代表将在大流行性流感爆发期间遇到的疫苗接种限制因素。在第0和14天，将5只雌性C57BL/6小鼠的群组使用肌肉内(I.M.)施用途径以0.1和0.01μg/注射的免疫接种剂量的H1N1病毒颗粒(Genway Biotech，San Diego，CA，USA，甲型流感Beijing H1N1)和氢氧化铝凝胶的不同组合(明矾；SuperFosBiosector，Vedback，Denmark)和/或SEQ ID NO：1、3、4、5、6和7来进行免疫接种。与明矾的复合通过在免疫接种之前将H1N1病毒颗粒和含有非DNA碱基的多核苷酸与明矾混合来获得。在第22天收集血清并且通过标准ELISA使用H1N1病毒颗粒(1μg/孔，96孔微量滴定板)和与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG1和IgG2b抗体(SouthernBiotechnologies，Birmingham，Alabama)来分析抗-H1N1病毒颗粒IgG2b抗体的存在。抗体滴度以终点滴度来确定。典型免疫接种研究的结果显示于表8-11中。
表8.用0.1μg H1N1病毒颗粒联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸进行免疫接种之后，C57/BL-6雌性小鼠中的抗-H1N1病毒颗粒IgG1抗体滴度。
IgG1
*每组5只小鼠
表9.用0.1μg H1N1病毒颗粒联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸进行免疫接种之后，C57/BL-6雌性小鼠中的抗-H1N1病毒颗粒IgG2b抗体滴度。
IgG2b
Figure BDA00001869712800381
*每组5只小鼠
表10.用0.01μg H1N1病毒颗粒联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸进行免疫接种之后，C57/BL-6雌性小鼠中的抗-H1N1病毒颗粒IgG1抗体滴度。
IgG1
Figure BDA00001869712800391
*每组5只小鼠
表11.用0.01μg H1N1病毒颗粒联合明矾和/或含有非DNA碱基的多核苷酸进行免疫接种之后，C57/BL-6雌性小鼠中的抗-H1N1病毒颗粒IgG2b抗体滴度。
IgG2b
Figure BDA00001869712800392
Figure BDA00001869712800401
*每组5只小鼠
表8-11中显示的结果表明通过用含有非DNA碱基的多核苷酸来辅助0.1或0.01μg/注射的较低病毒颗粒激发剂量的H1N1病毒颗粒，并且使用缩减的免疫接种方案，仍然可在单独或与明矾复合的H1N1显示边际到无免疫原性的条件下引出IgG1和IgG2b类的抗-H1N1抗体。使用明矾作为病毒颗粒和含有非DNA碱基的多核苷酸的载体来获得最佳的抗体反应。因此，含有非DNA碱基的多核苷酸可用作抗原节约佐剂，即使在与不是很理想的免疫接种排程一起使用时也是这样。
实施例6.
在用含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性-抗-人类血清白蛋白IgG抗体滴度。
在小鼠中使用人类血清白蛋白来研究使用蛋白抗原(以代表亚单位抗原性蛋白疫苗的模型形式)时的含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性。研究用于在不存在疫苗载体佐剂诸如明矾的情况下确定用可溶性抗原和可溶性肽进行免疫接种的作用。在第0和21天，将5只雌性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories Inc.，St.Constant，
Figure BDA00001869712800411
Canada)的群组使用肌肉内(I.M.)施用途径以1μg/注射的免疫接种剂量的人类血清白蛋白(HSA，Sigma-Aldrich Canada，Oakville，Ontario，Canada#A9731，28.5mg/mL)在没有以下序列或与以下序列组合的情况下进行免疫接种：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8和9。在免疫接种之前，将多核苷酸简单地在盐水中与HSA混合，不使用颗粒载体***。在第29至39天收集血清并且通过标准ELISA使用HSA(1μg/孔，96孔微量滴定板)和与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG抗体(Southern Biotechnologies，Birmingham，Alabama)来分析抗-HASIgG抗体的存在。IgG抗-HSA抗体滴度以终点滴度来确定。典型免疫接种研究的结果显示于表12中。
表12.以1μg HSA和/或含有非DNA碱基的多核苷酸免疫接种之后，C57/BL-6雌性小鼠中的抗-HSA IgG抗体滴度。
IgG总
Figure BDA00001869712800412
*每组5只小鼠
此研究的结果表明将HSA在盐水中与多核苷酸混合产生2种类型的佐剂效应。首先，与HSA单独相比，SEQ ID NO：1、2、3、7、8和9导致IgG抗体滴度降低。其次，与单独HSA相比，SEQ ID NO：4、5和6导致IgG抗体滴度增加。根据这些数据可以明确了解含有非DNA碱基的多核苷酸在以其5′OH，3′OH未经保护、磷酸二酯含有非DNA碱基的多核苷酸可溶性形式与抗原组合施用时具有充当关于免疫佐剂活性的免疫调节剂(也就是说，抑制或刺激抗体反应)的能力。
实施例7
通过含有非DNA碱基的多核苷酸来诱导来自人类PBMC细胞的细胞因子
已知许多免疫佐剂能够诱导来自人类PBMC细胞的细胞因子。此类佐剂的实例为明矾、脂多糖、单磷酰脂质A、含有CpG的多核苷酸和含有非CpG的0DN，以及分枝杆菌细胞壁-DNA复合物(MCC)。含有非DNA碱基的多核苷酸，具体来说，SEQ ID NO：1-3(1-100μg/mL)的诱导来自由3个健康成年个体获得的人类PBMC的细胞因子的能力已得以确定。将PBMC使用标准Ficoll-Paque(GEHealthcare Life Sciences，Baie d’
Figure BDA00001869712800422
QC，Canada)梯度离心从全血中分离，并且以106细胞/毫升的浓度(总体积：在含有10％热灭活FBS的RPMI 1640培养基中1mL，均来自Wisent，St-Bruno，QC，Canada)和50μg/mL庆大霉素硫酸盐(Sigma-Aldrich Canada，Oakville，ON，Canada)一起放置于组织培养板中。添加SEQ ID NO：1、2或3以给出100μg/mL的最终浓度，并且将细胞培养48h。在孵育结束时，上清液中的细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和IL-12p40)通过ELISA使用细胞因子捕获分析过程(Biosource，Camarillo，CA)来确定。SEQID NO：32CpG 2006ODN(1-100μg/mL，5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′，A-类CpG)、MCC(1-100μg/mL)和LPS(10μg/mL)用作阳性对照。细胞因子捕获分析的结果显示于表13中。
表13.通过含有非DNA碱基的多核苷酸来诱导人类PBMC中的细胞因子合成
Figure BDA00001869712800431
1结果表示为以细胞因子水平比背景对照治疗增加两倍来作出反应的个体数目。
结果表明含有非DNA碱基的多核苷酸具有不同于CpG2006、MCC或LPS的细胞因子合成刺激概况。由本发明的含有非DNA碱基的多核苷酸诱导的细胞因子水平也显著低于MCC或LPS诱导的水平(少10倍)，并且虽然不希望受以下约束，但是此数据有力地表明诱导细胞因子的能力并非与含有非DNA碱基的多核苷酸的免疫佐剂活性直接相关。
实施例8
与含有CpG的硫代磷酸酯多核苷酸比较，对于来自人类PBMC的细胞因子的诱导
在单独研究中，将含有非DNA碱基的多核苷酸(磷酸二酯)在人类PBMC群体中诱导细胞因子合成的能力加以确定并且与许多含有CpG的硫代磷酸酯多核苷酸的能力相比较。如实施例7中所描述，将LPS和MCC作为阳性对照包括在内。将PBMC使用标准Ficoll-PaquePlus(GE Healthcare Life Sciences，Baie d’
Figure BDA00001869712800441
QC，Canada)梯度离心从全血中分离，并且以1×106细胞/毫升的浓度(总体积：在含有10％热灭活FBS的RPMI 1640培养基中1mL，均来自Wisent，St-Bruno，QC，Canada)和50μg/mL庆大霉素硫酸盐(Sigma-Aldrich Canada，Oakville，ON，Canada)一起放置于组织培养板中。将含有非DNA碱基的多核苷酸SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8和9添加至分开的孔中以给出10μg/mL的最终浓度，添加LPS以给出10μg/mL的最终浓度，并且分别添加非CpG 4010、CpG 2336、CpG 2429和CpG7909多核苷酸，SEQ ID NO：31、33、35和34，以给出10μg/mL的最终浓度。
然后培养细胞48h。使用MilliplexTM MAP试剂盒(MilliporeCorporation，Billerica，MA，USA)，在Bio-Plex 200***(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)上测量培养上清液中的细胞因子(白介素IL-6和IL-10、趋化因子MCP-1和RANTES)。又称为单核细胞趋化蛋白的MCP-1是有效单核细胞和髓性树突状细胞活化和跨过内皮和上皮障碍进行运输所需的基本趋化因子(参见例如Henkel等，2004Ann.Neurol.55：221-235)，并且RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌因子，现在更通常地称为CCL5)由记忆表型T细胞产生并且对于T-细胞具有趋化性并且可激活T-细胞(参见例如Swanson等，2002Immunity 17：605-615)。研究结果显示于表14中。
表14.与含有CpG的多核苷酸比较，对于人类PBMC中的细胞因子合成的诱导
Figure BDA00001869712800442
Figure BDA00001869712800451
此研究结果表明在与免疫刺激剂LPS和MCC的比较中，只有SEQ ID NO：4和5显示对于人类PBMC的强有力的白介素(IL-6)和趋化因子诱导活性(MCP-1，RANTES)。SEQ ID NO：9只显示强有力的MCP-1诱导活性。SEQ ID NO：1、2、3、6、7和8显示边际或无白介素和边际或无趋化因子诱导活性。CpG多核苷酸(SEQ ID NO：33、34、35)不诱导细胞因子，但是都有强有力的MCP-1诱导活性。还应注意非CpG 4010多核苷酸SEQ ID NO：31也具有趋化因子诱导活性。根据这些数据可以明确了解SEQ ID NO：1至9具有不同于硫代磷酸酯骨架CpG多核苷酸的概况的白介素和趋化因子诱导概况，并且如上述实施例中所展现，诱导白介素和趋化因子的能力与充当免疫佐剂的能力不相关。
实施例9
含有非DNA碱基的多核苷酸对于含有明矾的疫苗进行协同辅助
以下实施例说明本发明的多核苷酸序列在增强对于含有用作抗原载体和佐剂的铝盐(明矾)的常规疫苗的免疫反应中的用途。明矾被视为基于人群的免疫接种程序的安全佐剂。较大比例数目的市售疫苗以铝盐(诸如但不限于氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝)进行辅助。这些疫苗进一步使用本发明的含有非DNA碱基的多核苷酸进行辅助以便获得对于抗体产生和保护活性的刺激。所使用的含有非DNA碱基的多核苷酸的剂量(在1-100μg/疫苗剂量范围内但不限于此)在制造过程期间在铝复合阶段期间或在免疫接种前直接添加至疫苗，并且个体的免疫接种根据既定的疫苗接种程序、使用既定的疫苗剂量和施用途径(通常在肌肉内施用于三角肌中)来执行。与以铝辅助的疫苗进行的疫苗接种相比，以包含含有非DNA碱基的多核苷酸的铝辅助疫苗进行免疫接种产生极好的免疫反应，如保护性抗体滴度得以增强和对于传染性暴露的抗性或既定疾病得以消除所确定。本领域技术人员将认识到a)当例如在大流行性免疫接种期间，免疫接种数目并非最佳(例如2次而不是3次免疫接种)或所施用抗原的剂量不是很理想时，也可获得免疫反应得以增强的益处，和b)以明矾辅助的疫苗中的抗原节约是通过以含有非DNA碱基的多核苷酸进行协同辅助来产生的。受益于添加含有非DNA碱基的多核苷酸的疫苗的实例为(但不限于)DTaP(白喉-破伤风-百日咳)疫苗、甲型肝炎疫苗、甲型+乙型肝炎、Hib(嗜血杆菌乙型流感)疫苗、DTaP-IPV(灭活脊髓灰质炎病毒)-乙型肝炎、肺炎球菌偶联物、DT(白喉-破伤风)疫苗、Hib-乙型肝炎疫苗、HPV(人类***瘤病毒)疫苗、H1N1疫苗和狂犬病疫苗。
实施例10
含有非DNA碱基的多核苷酸对于含有油基佐剂的疫苗进行协同辅助
以下实施例说明本发明的多核苷酸序列在增强对于含有用作佐剂的油或油基乳液的常规疫苗的免疫反应中的用途。许多市售疫苗，尤其在兽医业务中使用的疫苗以油或油基乳液来辅助。这些油包含但是不限于矿物油、蒙达奈(montanides)或角鲨烯。这些疫苗进一步使用本发明的含有非DNA碱基的多核苷酸进行辅助以便获得对于抗体产生和保护活性的刺激。所使用的含有非DNA碱基的多核苷酸的剂量(在1-100μg/疫苗剂量范围内但不限于此)在制造过程期间在配制阶段期间或在免疫接种前直接添加至疫苗，并且个体的免疫接种根据既定的疫苗接种程序、使用既定的疫苗剂量和施用途径(通常但不限于肌肉内注射)来执行。与单独以油或油基乳液辅助的疫苗进行的疫苗接种相比，以包含含有非DNA碱基的多核苷酸的油或油基乳液辅助疫苗进行免疫接种产生极好的免疫反应，如保护性抗体滴度得以增强和对于传染性暴露的抗性或既定疾病得以消除所确定。本领域技术人员将认识到a)当例如在大流行性免疫接种期间，免疫接种数目并非最佳(例如1次或2次免疫接种而不是3次或更多次免疫接种)或所施用抗原的剂量不是很理想时，也可获得免疫反应得以增强的益处，和b)以油或油基乳液辅助的疫苗中的抗原节约是通过以含有非DNA碱基的多核苷酸进行协同辅助来产生的。受益于添加含有非DNA碱基的多核苷酸的以油或油基乳液辅助的疫苗的实例为(但是不限于)大肠杆菌0157铁载体蛋白疫苗、大肠杆菌0157第3型分泌蛋白疫苗、莱姆病(Lyme disease)(布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)外表面蛋白A[OspA]和蛋白C[OspC]新诺明(bactrin))疫苗、***(FMD疫苗，灭活病毒颗粒或病毒蛋白)、出血性败血病(灭活多杀性巴氏杆菌)疫苗、约尼氏病(Johne’s disease)(灭活乌分枝杆菌亚种副结核新诺明或保护性免疫原蛋白)疫苗，克罗恩氏病(Crohn’s disease)(灭活乌分枝杆菌亚种副结核[MAP]新诺明或免疫原蛋白或含有编码来自[MAP]的保护性免疫原蛋白的序列的病毒载体)疫苗、H1N1疫苗、狂犬病疫苗。
实施例11
含有非DNA碱基的多核苷酸对于含有ISCOM基佐剂的疫苗进行协同辅助
以下实施例说明本发明的多核苷酸序列在增强对于含有用作佐剂的ISCOMS(免疫刺激复合物)的常规疫苗的免疫反应中的用途。许多疫苗已被证明受益于以ISCOMS进行辅助。这些疫苗进一步使用本发明的含有非DNA碱基的多核苷酸进行辅助以便获得对于抗体产生和保护活性的刺激。所使用的含有非DNA碱基的多核苷酸的剂量(在1-100μg/疫苗剂量范围内但不限于此)在制造过程期间在配制阶段期间或在免疫接种前直接添加至疫苗，并且个体的免疫接种根据既定的疫苗接种程序、使用既定的疫苗剂量和施用途径(通常但不限于肌肉内注射)来执行。与单独以ISCOM辅助的疫苗进行的疫苗接种相比，以包含含有非DNA碱基的多核苷酸的ISCOM辅助疫苗进行免疫接种产生极好的免疫反应，如保护性抗体滴度得以增强和对于传染性暴露的抗性或既定疾病得以消除所确定。本领域技术人员将认识到a)当例如在大流行性免疫接种期间，免疫接种数目并非最佳(例如1次或2次免疫接种而不是3次或更多次免疫接种)或所施用抗原的剂量不是很理想时，也可获得免疫反应得以增强的益处，和b)以ISCOMS辅助的疫苗中的抗原节约是通过以含有非DNA碱基的多核苷酸进行协同辅助来产生的。受益于添加含有非DNA碱基的多核苷酸的以ISCOMS辅助的疫苗的实例(但是不限于)马红球菌疫苗、马疱疹病毒2型(EHV-2)疫苗、牛传染性胸膜肺炎(CPBB)疫苗、牛病毒性腹泻(BVDV)疫苗、鼠弓形体疫苗、禽流感病毒疫苗、猫流感病毒疫苗、***释放因子疫苗、鸡新城疫疫苗、呼吸道合胞体病毒、疱疹疫苗、麻疹病毒疫苗、人类乳突淋瘤疫苗。
实施例12
含有非DNA碱基的多核苷酸对于含有病毒体的疫苗进行协同辅助
以下实施例说明本发明的多核苷酸序列在增强对于含有病毒体的疫苗的免疫反应中的用途。病毒体代表缺少源病毒的核壳体和遗传物质的重构空病毒包膜。病毒体是市场认可的用于输送免疫活性物质的载体和佐剂***。此主要合成载体广泛适用于几乎任何抗原。所使用的含有非DNA碱基的多核苷酸的剂量(在1-100μg/疫苗剂量范围内但不限于此)在制造过程期间或在免疫接种前直接添加至疫苗，并且个体的免疫接种根据既定的疫苗接种程序、使用既定的疫苗剂量和施用途径(通常在肌肉内施用于三角肌中)来执行。与以病毒体疫苗进行的疫苗接种相比，以包含含有非DNA碱基的多核苷酸的病毒体进行免疫接种产生极好的免疫反应，如保护性抗体滴度得以增强和对于传染性暴露的抗性或既定疾病得以消除所确定。本领域技术人员将认识到a)当例如在大流行性免疫接种期间，免疫接种数目并非最佳(例如2次而不是3次免疫接种)或所施用抗原的剂量不是很理想时，也可获得免疫反应得以增强的益处，和b)以病毒体辅助的疫苗中的抗原节约是通过以含有非DNA碱基的多核苷酸进行协同辅助来产生的。受益于将含有非DNA碱基的多核苷酸添加至病毒体的疫苗的实例为(但是不限于)甲型肝炎疫苗、甲型+乙型肝炎疫苗、HIV/AIDS疫苗、疟疾疫苗、流感疫苗和呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗。
实施例13
含有非DNA碱基的多核苷酸对于含有单磷酰脂质A的疫苗进行协同辅助
以下实例说明本发明的多核苷酸序列在增强含有用于刺激免疫***的免疫刺激剂，单磷酰脂质A(MPL)的疫苗的免疫反应中的用途。MPL是增强抗原特异性免疫力的Toll样受体-4(TLR4)促效剂。诸如的豚草疫苗用于刺激免疫保护(IgG)抗体的产生并且以MPL来进行辅助。所使用的含有非DNA碱基的多核苷酸的剂量(在1-100μg/疫苗剂量范围内但不限于此)在制造过程期间或在免疫接种前直接添加至疫苗，并且个体的免疫接种根据既定的疫苗接种程序、使用既定的疫苗剂量和施用途径(通常在肌肉内施用于三角肌中)来执行。与以含有MPL的疫苗进行的疫苗接种相比，以包含含有非DNA碱基的多核苷酸的含有MPL的疫苗进行免疫接种产生极好的免疫反应，如保护性抗体滴度得以增强和豚草季节期间过敏发作得以减少所确定。本领域技术人员将认识到a)当免疫接种数目并非最佳(例如2次而不是4次免疫接种)时，也可获得免疫反应得以增强的益处。将含有非DNA碱基的多核苷酸添加至含有MPL的疫苗而受益的疫苗的实例为(但是不限于)豚草疫苗、乙型肝炎疫苗、恶性疟原虫疫苗、疱疹(包括生殖器疱疹)病毒疫苗、流感疫苗、菁草花粉过敏症疫苗。
以上引用的所有专利、出版物和摘要全部以引用方式并入本文。应理解上述内容只涉及本发明的优选实施方案并且可对其进行许多修改或改变而不背离如以下权利要求中定义的本发明精神和范围。

Claims (18)

1.一种组合物，其包含：3至30个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列，其中所述非DNA碱基是水粉蕈素、次黄嘌呤或尿嘧啶中的一种或多种；药学上可接受的媒介物；和一种或多种抗原。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述含有非DNA碱基的多核苷酸序列具有3至20个碱基长度。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述含有非DNA碱基的多核苷酸序列具有3至9个碱基长度。
4.根据权利要求1所述的组合物、其中所述药学上可接受的媒介物包括一种或多种佐剂媒介物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述一种或多种佐剂媒介物为明矾、油基佐剂、免疫刺激复合物、病毒体或单磷酰脂质A或其类似物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包含免疫调节剂。
7.一种组合物，其包含3至30个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列，其中所述非DNA碱基是水粉蕈素、次黄嘌呤或尿嘧啶中的一种或多种，其中所述多核苷酸序列为SEQ ID NO: 5。
8.一种包含3至30个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列、药学上可接受的媒介物和一种或多种抗原的组合物在制备药物中的用途，其中所述非DNA碱基是水粉蕈素、次黄嘌呤或尿嘧啶中的一种或多种。
9.一种包含3至30个碱基长度的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列、药学上可接受的媒介物和一种或多种抗原的组合物在制备用于在体内或在体外调节免疫反应的药物中的用途，其中所述非DNA碱基是水粉蕈素、次黄嘌呤或尿嘧啶中的一种或多种。
10.一种调节对于一种或多种抗原的免疫反应的方法，其包括在体外或在体内施用根据权利要求1至6中任一项所述的组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述体内施用包括施用于动物或人类。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述经调节的免疫反应是在以抗原激发之后的抗体反应的变化。
13.一种刺激抗原呈递细胞的方法，其包括在体外或在体内施用根据权利要求1至6中任一项所述的组合物。
14.一种增强对于抗原的免疫反应的方法，其包括向动物或人类施用根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的抗原的量小于在不存在用于增强所述免疫反应的所述含有非DNA碱基的多核苷酸的情况下所需抗原的量。
15.一种减少对于抗原的免疫反应的方法，其包括向动物或人类施用根据权利要求1至6中任一项所述的组合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物中的抗原的量小于在不存在用于增强所述免疫反应的所述含有非DNA碱基的多核苷酸的情况下所需抗原的量。
17.根据前述权利要求中任一项所述的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列，其中所述含有非DNA碱基的合成多核苷酸为SEQ ID NO：1至30中的任一个。
18.根据前述权利要求中任一项所述的含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列，其中所述含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列在所述含有非DNA碱基的合成多核苷酸序列的5’末端或3’末端进一步包含TEG-胆甾醇基部分、一个或多个额外腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤碱基，或一个或多个额外水粉蕈素、次黄嘌呤或尿嘧啶碱基。
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