CN1602957A - 杂交酵母艾滋病疫苗 - Google Patents

Abstract

该杂交酵母艾滋病疫苗由基因重组杂交酵母组成。艾滋病疫苗杂交载体产物来源于两个分别表达不同目的基因的酵母质粒，其中一个质粒表达T细胞生长因子，另一个质粒表达HIV－1的抗原基因；由此产生的重组杂交酵母载体本身是一种无致病性的基因治疗艾滋病的载体，该载体本身具有免疫增强活力，即免疫佐剂作用；该基因工程艾滋病疫苗主要用于艾滋病感染的治疗和艾滋病的预防。

Description

杂交酵母艾滋病疫苗

技术领域  本发明是一种治疗和/或预防传染性疾病艾滋病的方法及其组成成份。该发明由至少两个基因表达单位经杂交形成一个基因表达载体；其中一个基因表达单位表达细胞T细胞生长因子和/或淋巴因子，另一个基因表达单位表达单个、融合和/或多个HIV病原体抗原基因；该发明主要应用这个基因表达杂交载体研发治疗和预防艾滋病的杂交酵母疫苗。

背景技术  在疾病防治历史上，疫苗一直是最有效、价廉和实用的方法。没有任何一种措施包括抗生素在内曾经如此有效地降低人口的死亡率，疫苗对人类健康的影响之大是难以用语言做评价的。疫苗曾在世界上许多国家成功地控制了以下九种疾病：天花、白喉、破伤风、猩红热、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹。天花是在世界范围内得到最有效控制的疾病。一个疫苗的有效性是取决于它能诱导机体产生保护性免疫反应的能力。

脊椎动物尤其是鸟类和哺乳动物战胜微生物感染的机制是一个复杂的过程。病原体侵入宿主后会激活机体多***多种保护性反应，如果病原体或其毒素成功地攻破机体的外层防线而进入血循环，淋巴器官如脾、肝和骨髓将会分解和清除进入血循环中的病原体或其毒素。淋巴组织是由一系列相互交织的细胞和纤维组成，这些细胞包括白细胞即淋巴细胞和处于不同分化阶段的其它细胞，如浆细胞、淋巴纤维细胞、单核-巨噬细胞、嗜酸细胞和肥大细胞。淋巴细胞主要分为T和B淋巴细胞，它们在机体的抗原特异性免疫反应中起不同作用但又互补。

免疫***通过识别外源性病原体而成为保持机体内环境稳定的重要防线。机体对外源性病原体的初步反应称为“先天性免疫”，先天性免疫的特征是自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和其它白细胞首先对病原体产生应答，这些细胞通过吞噬、消化、裂解或分泌淋巴因子在短时间内消灭病原体。先天性免疫是抗原非特异性的，它是机体产生“获得性免疫”应答之前的第一道抵御病原体的防线。T和B淋巴细胞是参于获得性免疫反应的主要细胞，获得性免疫反应的特征是B细胞识别抗原后被激活从而分泌抗原特异性抗体、T细胞的激活和抗原提呈。

B细胞识别抗原是指抗原与B细胞表面的免疫球蛋白受体结合，这些抗原包括细菌细胞壁、细菌毒素或病毒表面糖蛋白，该结合促使信号传导到B细胞内，此过程称为“第一信号”，在某些情况下，仅需要一个信号就能激活B细胞，这些无需辅助性T细胞就能激活B细胞的抗原称为“不依赖T细胞抗原”(或：不依赖胸腺抗原)；某些情况下，B细胞的激活需要“第二信号”，第二信号通常由辅助性T细胞提供，这类细胞抗原称为“T细胞依赖性抗原”(或：胸腺依赖性抗原)；结合到B细胞表面的抗原通过内吞进入B细胞并被消化为小片段，这些片段又与B细胞表面的MHC II分子结合形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”，该复合物提供T细胞依赖性抗原激活B细胞所需的第二信号。激活B细胞的另一种方式是B细胞与***和脾脏生发中心的树突状细胞(DentriticCells，DC)结合。

获得性免疫的一个重要机制是T细胞的激活，激活T细胞需要抗原提呈细胞如巨噬细胞和DC细胞与T细胞结合，巨噬细胞表面有多个识别病原体抗原的受体，如甘露糖和清道夫受体，巨噬细胞吞噬这些病原体后在内体和溶酶体的作用下将其消化裂解为多肽片段，这些多肽片段与巨噬细胞表面的MHC II分子结合形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”，当T细胞与该复合物结合后被激活。DC细胞是既能形成“抗原多肽-MHC II分子复合物”又能形成“抗原多肽-MHC I分子复合物”的抗原提呈细胞。

当B细胞与抗原结合后通过“同型转换”使分泌普通IgM抗体的B细胞转化为分泌特异性的IgG抗体，这些细胞分为两类：一类不断***称为克隆扩增，这类细胞成熟后每秒钟可释放2000个同样的抗体，约2-3天后死亡；另一类细胞此时不分泌抗体而成为记忆细胞，这些记忆细胞可存活数月到数年，当再次遇到同样抗原时这类记忆细胞会迅速产生大量抗体，这种免疫反应称为次级免疫反应。研发疫苗的目标就是要诱导这种较初级免疫反应更快更强的次级免疫反应。

经典的主动疫苗分为亚单位和完整病原体疫苗，亚单位疫苗是完整病原体的一部分，其目的是避免应用有致病性的完整病原体或避免应用完整病原体的有毒组份。B型副流感病毒的脂多糖做为脑膜炎疫苗就是应用抗原组份的一个亚单位疫苗例子；完整病原体疫苗通常是灭活或减毒的病原体，如灭活的百日咳疫苗。由于灭活或减毒过程有时会损害一些诱导免疫反应所必需的抗原决定基，因此这类疫苗常需添加免疫增强剂。

传统的预防性疫苗是通过接种疫苗后使机体在再次遇到相同病原体时能产生保护性免疫反应，这种理论适用于病毒或细菌传染性疾病，因病毒或细菌仅有有限数量的抗原；但抗癌疫苗并非如此，抗癌疫苗是必须能够根除已经存在的癌细胞，这样就使我们必须更好地明白肿瘤抗原和宿主免疫的作用机制，当代的疫苗理论是要诱导细胞免疫反应。

迄今为止没有成功的艾滋病(AIDs)疫苗，在某些有症状和无症状的艾滋病患者体内检测到滴度很高的抗gp160/120抗体提示，这些抗体也许不仅不起保护作用，反而有可能促进病毒颗粒与细胞的连接和穿入宿主细胞，更重要的是，现在还没有疫苗能够诱导足够强的细胞免疫反应来消灭已被HIV感染的并不断释放新病毒颗粒的被感染细胞。

尽管有许多基础和临床研究表明免疫***有清除癌细胞的能力，但大多数情况下，免疫***或者不能识别癌细胞或者所产生的免疫反应太弱而无明显效果[Farzaneh，etal.，Immunol.Today，19：294(1998)]，尤其是对已广泛转移的晚期肿瘤。癌症治疗中的手术、化疗、放疗及其联合疗法仍不能达到治愈的目的事实提醒我们，免疫和生物疗法也许是新的希望[Ockert，et al.，Immunol.Today，20：63(1999)]。目前，刺激机体免疫反应来诱导肿瘤消退成为肿瘤免疫的目标，为此，我们需要更好地明白肿瘤抗原基因和T细胞介导的免疫反应与肿瘤逃避[Boon，et al.，Immunol.Today，18：267(1998)；Chen，et al.，Immunol.Today，19：27(1998)]。

肿瘤动物模型的研究表明，细胞毒性T细胞(Cytotoxicity T cells，CTL)在抗肿瘤免疫反应中起着重要的作用[Denfeld，et al.，Int J.Cancer，62；259；Greten，etal.，J.Clin.Oncol.，17：1047(1998)；Sampson，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：10399(1996)]，但是诱导T细胞介导的免疫反应是研发肿瘤疫苗的最重要挑战[Sampson，et al.]。激活淋巴细胞的双信号模型被认为是最理想的激活方式，它需要TCR提呈的抗原性特异性信号和抗原非特异性刺激信号的共同参与[Van Seventer，et al.，Curr.Opin.Immunol.，3：294(1991)；Linsley，et al.，J.Exp.Med.，173：721(1991)]。由此看来，肿瘤细胞侵润机体不仅涉及肿瘤细胞本身，而且损害宿主细胞的整体免疫功能，这些包括：肿瘤细胞MHC复合物的表达缺陷、抗原提呈缺陷、T细胞识别肿瘤相关抗原的缺陷、协同刺激信号的缺陷、粘附分子表达缺陷、Fas受体和配体的表达缺陷、肿瘤微环境免疫因子分泌缺陷等[Boon，et al.，1997]。因此，在病理状态下常是因为免疫反应太弱而不能抵御疾病，而全面激活抗原特异性T细胞至少需要两个刺激信号[Young，et al.，J.Clin.Invest.，90：229(1992)；Allison，et al.，Science，270：932(1995)]，一是由抗原提呈细胞(APC)提呈的与T细胞受体(TCR)偶联的抗原多肽MHC复合物，二是由T细胞和APC细胞提呈的细胞因子，如CD28和B7-1，这两个信号协同作用激活T细胞，被激活的T细胞通过克隆扩增和分化而成为功能性T细胞[Lisley，et al.，1991；Young，et al.1992；Bluestone，Immunity，2：555(1995)；Guerder，etal.，J.Immunol.，155：5167(1995)；Webb，et al.Blood，86：3479(1995)；Thompson，Cell，81：979(1995)]。功能性T细胞与天然性T细胞不同，功能性T细胞一旦被激活，它就不再需要协同刺激信号来识别和消灭带有抗原的靶细胞，一旦免疫反应被启动，一部分功能性T细胞就成为记忆细胞以备再次遇到相同抗原时产生更强更快的免疫反应[Gray，Ann.Rev.Immunol.，11：49(1993)；Ahmed，et al.，Science，272：54(1996)]，而缺乏第二个刺激信号时常产生无功能性T细胞[Chen，1998；Van Gool，et al.，Res.Immunol.，146：183(1994)]。

许多肿瘤细胞都表达靶抗原，但它们通常都不能刺激免疫反应[Boon，et al.，1997；Boon，et al.，J.Exp.Med.，183：725(1996)]，小鼠动物模型中的研究已证明，CTL反应能够使已形成的肿瘤消退[Mogi，et al.，Clin.Cancer Res.，4：713(1998)；Gong，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：2715(2000)]，诱导强有力的CTL反应是目前抗癌疫苗的策略。

CTL依赖性抗肿瘤免疫不仅需要CTL能识别的抗原而且需要有效的抗原导入方法，CTL能够识别的靶抗原是MHC I分子与抗原多肽的复合物，为有效激活CTL，MHC I-抗原多肽复合物必须通过专业性APC细胞提呈给CTL，而将外源性抗原有效地导入MHC I限制性的APC细胞是设计癌症疫苗的关键，目前正在研究阶段的抗原导入方法有多肽、热休克蛋白、负载抗原的APC细胞的被动移植等。近来一些研究表明，应用病毒或脂质体载体导入DNA疫苗或裸体DNA疫苗都能诱导一定程度的抗肿瘤免疫。

研究表明，CTL的激活通常需要IL-2使CTL-P转化为CTL，IL-2缺乏或不足时会使更被激活的CTL发生细胞凋亡，在这种情况下，已激活的免疫反应又会被迅速终止。

为了克服通过激活CTL的方法来战胜HIV和癌症，目前急需新型有效的疫苗载体***。最理想的莫过于载体本身具有免疫佐剂作用，这种载体能有效地将抗原导入巨噬细胞和DC，如果这个载体能携带多种抗原分子将更有利于全面激活所希望的获得性免疫反应，双信号激活模型能提供有效和持久的T细胞活性，现代大多数疫苗都需要诱导强效的由细胞介导的免疫反应(CMI)，包括CTL免疫反应，但是，仅用蛋白很难诱导强效的CTL反应，因此，如何有效地将蛋白或DNA导入体内靶部位成为疫苗成功的关键。

本发明是一种杂交酵母艾滋病疫苗载体，它能诱导与MHC I和II分子偶联的强效、持久的保护性CTL免疫反应，也就是说是能达到理想免疫效果的疫苗载体***。

发明内容  本发明第一部分是一个基因载体***。该载体由两个DNA质粒组成，一个编码协同刺激信号，由启动子操作的T细胞生长因子；另一个DNA质粒编码由启动子操作的至少一个或多个HIV-1抗原基因。

本发明第二部分是一种诱导HIV-1特异性的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应(CTL)对抗HIV-1病毒及其它病原微生物的方法。

本发明第三部分是一种基因表达***，该***由独立启动子分别表达T细胞生长因子如IL-2和HIV-1病原体抗原基因。

本发明第四部分是一种诱导脊椎动物免疫反应的方法，所需免疫反应通过该艾滋病疫苗载体及疫苗载体所携带的抗原基因或T细胞生长因子来体现。

附图说明  以下附图说明是对本发明以图表示时的一些部分的具体描述，同时也是对本发明原理的辅助性解释。

图1.本发明操作原理的图解。

图2.本发明应用的艾滋病疫苗实例图解。

图3.应用本发明所表达的hIL-2水平的线图示。

图4.应用本发明所生产的疫苗免疫接种小鼠后所诱导的CTL反应条形图示。

图5.应用本发明所生产的疫苗对HIV-1.gag肿瘤B16-gag生长的抑制作用条形图

图6.应用本发明所生产的疫苗不同剂量对HIV-1.gag肿瘤B16-gag生长的抑制作用条形图

具体实施方式  本发明的艾滋病疫苗载体***是一种诱导强效、持久的CTL免疫反应的方法，它通过激活依赖MHC I和II的途径来产生保护性免疫反应。图1是对本发明操作原理的图解，图中的酵母质粒α和a分别表达抗原基因和一个协同刺激信号，该协同刺激信号通常是促使抗原基因刺激最有效免疫反应的相应细胞生长因子，而且很可能若没有同时将此细胞因子导入，其免疫反应将不能达到其最佳状态。这些抗原分子有如下所列但并不限于这些，如病毒、细菌、寄生虫和肿瘤细胞组份、百喉毒素C片断、霍乱毒素B亚单位、B型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原、志贺氏杆菌脂多糖(LPS)等以及单个、多个或不同排列组合的抗原。另一些抗原可以是真菌、原虫、蛔虫和癌细胞抗原；HIV-1病毒抗原有如下所列但并不限于这些，如gag、pol、env等；细胞因子有如下所列但并不限于这些，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、TNF-β和IFN-γ等。

本发明的疫苗载体***首先是由两个分离的质粒通过真核生物基因交配的方法形成。该真核生物包括如下所列但并不限于这些，Saccharomyces，Schizosaccharomyces，Yarrowia，candida，hansenula。另外，这个载体***也可由原核细胞组成，如大肠杆菌和病毒质粒等但并不限于这些。因此，无论是真核或原核细胞所形成的最后产品是由一个启动子控制表达细胞因子，另一个多克隆位点供***各种各样的抗原基因，另有复制子、转录、翻译元件的DNA序列、筛选标记等通过连接子将其连成完整质粒，真核细胞表达载体的筛选标记有neo、leu2、ura3、trp1、ade1、his3等，该疫苗载体被用于需要治疗的机体。

本发明疫苗载体的结构原理如图1所示，首先，构建二个功能性的多核苷酸序列组成的DNA表达质粒；这两个质粒的具体应用本发明疫苗如图2所示。其中的启动子是真核生物启动子但并不限于此，如酵母Sccharomyces cerevisine和Candida albicans。启动子可以是诱导性的或组成性的，诱导性启动子可以被调介，如营养成份(carbonsouces，nitrogen souces和其它)、药物(抗药性等)、与感染过程有关的特殊试剂(血清等)和温度(热休克和冷休克等)。将所得到的两个质粒分别转化为真核微生物如单倍体酵母，转化DNA的方法可以是多种多样的，包括钙磷沉淀法、显微注射法、脂质体法、电穿孔法和病毒载体法等，这里也包括各种各样的含有载体的宿主细胞。

本发明用酵母作为宿主微生物，酵母质粒被成功地转化为酵母时，可用氨基酸缺陷培养基筛选转化子，然后通过单倍体酵母基因交配而形成双倍体杂交酵母，此时再用双氨基酸缺陷培养基筛选双倍体杂交转化子[Guthrie Fink，Guide to Yeast Genetics &Molecular Biology，Methods in Enzymology，194：3-231(1999)]，在这个过程中，非转化子被自然淘汰。

本发明中的DNA质粒的启动子可以是原核细胞启动子，在这种情况下，宿主可以是原核细胞表达质粒，其目的也是诱导所需的免疫反应，可用多种方法将此原核细胞表达质粒转化为真核微生物，如转导、偶联、转化、电穿孔法和转染等。

本发明艾滋病疫苗载体用于艾滋病治疗性和/或预防疫苗。

应用该疫苗的另一个方法是从HIV患者分离巨噬细胞或DC细胞，然后将该艾滋病疫苗导入被分离出的巨噬细胞或DC细胞，在体外培养这种细胞并加入一些淋巴因子，然后将该细胞输回入患者。

为构建艾滋病疫苗，将T细胞生长因子IL-2、IL-4、IL-6等克隆到在组成性酵母启动子控制下的酵母质粒α上，将HIV-1病毒抗原gag、pol、env等克隆到酵母质粒a，将所得到的两个单倍体酵母质粒α和a分别转化到宿主酵母W303α和a上，将所得到的转化子交配形成双倍体，通过leu2/ura3氨基酸缺陷培养基筛选终末疫苗产品。

本发明中的疫苗通常通过注射，如皮下、皮内、肌内、腹腔使用，也可通过胃肠道使用等；也可通过鼻腔滴入、喷雾吸入和口服；本发明也包括该艾滋病疫苗的其它配方，如栓剂或应用纳米技术；使用疫苗的途经可根据个体情况选择以达到最佳临床效果；本疫苗可通过计算活性单位来定量，可以是无菌胃肠道型和非胃肠道型的，也可以是普通胃肠道型和非胃肠道型的；可以是油水或水油乳剂；使用该疫苗的疗程可以是2-3周内2次或视具体情况决定。

以下举例说明本发明的具体实施例，当然本发明的应用并不局限于此，另外，用同样方式同样性质组分但又作些修改仍显而易见属于本发明之范畴。

例1.构建酵母表达质粒表达hIL-2和构建表达HIV-1抗原基因的广谱质粒载体

图2中的质粒pcDNA3.IL-2由上海医科大学何博士赠送，将该质粒中的hIL-2用限制性内切酶smalI/NotI消化后克隆到pYES3/CT(Invitrogen)的多克隆位点区(MCS)smalI/NotI，将质粒pYEX-BX(Clontech)的MCS区域修饰即增加多个限制性内切酶位点使其容易克隆，由此构建成表达抗原基因的广谱质粒载体pYEX.UIG。

所得到的质粒pYEX.UIG可用于克隆表达HIV-1抗原基因，在此实施例中为HIV-1融合抗原基因(gag基因，由中国AIDS协会何敏博士赠送)，用EcoRI/XhoI内切酶将其抗原基因克隆到pYEX.UIG载体。

例2.杂交酵母艾滋病疫苗载体的构建

如图2所示，将例1中所得质粒pYES3/CT.IL-2用TE/LiOAc方法转化为酵母W303-1Aα(ATCC)，用Leu营养缺陷琼脂培养基平板筛选转化子；将例1中所得质粒pYEX.UIG.gp41.36用TE/LiOAc方法转化为酵母W303-1Aa(ATCC)，用Ura3营养缺陷琼脂培养基平板筛选转化子；将所得两个转化子IGV.IL-2(α)和IGV.gp41.36(a)通过基因配型杂交生成终末疫苗产品，该疫苗具有表达T细胞生长因子IL-2和HIV-1.gag蛋白的能力。

例3.hIL-2的测定

向8月龄雌性DBA/J小鼠腹腔注射1ml矿物油，24小时后用无血清的PBS液清洗出腹腔渗出液，收集渗出液中的巨噬细胞，将1-6×10⁶个巨噬细胞分为二组并分别与IGV.IL-2和IGV.gp41.36共同孵育，在不同时间时，取出200μl培养上清液储存于-70C°待作IL-2定量测定，用hIL-2测定试剂盒(DuoSet Kit)(Genzyme Diagnostics，Cambridge，MA)定量测定IL-2。如图3所示，接种表达IL-2和gag的疫苗IGV.Factor的IL-2水平为6-67ng/ml，而接种有gag但无IL-2的疫苗的IL-2水平为仅为1-3ng/ml，该结果表明用本发明所生产的疫苗能有效地激活机体APC细胞分泌足够量的淋巴因子，它有利于进一步激活CTL免疫反应。

例4.CTL活性的测定

将4-6周龄雌性C57BL/6小鼠(H-2^b)(Jackson Lab，Bar Harbor，Maine)分为4组，每组10只，向小鼠皮下注射1×10⁶稳定转染HIV-1 gag基因的黑色素瘤细胞(B16)，接种肿瘤后第1和7天时向小鼠接种疫苗产品(IGV.Factor)和对照疫苗IGV.gag，接种剂量为2mg/200μl/次，对照组注射200μl PBS，在第28天时用数字测量仪测量肿瘤体积。在第120天时用CO₂安乐死法杀死小鼠，取出脾脏，以⁵¹Cr标记的B16.gag细胞为靶细胞，以取出的脾脏细胞为功能性T细胞，按照40∶1的E∶T比例测定CTL活性，百***解率(lysis％)实验CPM减去自发CPM的百分比。图4结果表明，疫苗产品(IGV.Factor)的CTL活性为85％，而对照疫苗IGV.gag和IGV.IL-2的活性分别为34％和16％，而PBS组仅为4％。

例5.疫苗在C57BL/6小鼠AIDS模拟模型体内诱导的的保护性免疫反应

用HIV-1.gag表达肿瘤B16-gag模拟疾病，观察HYV-AIDS和HYV-GAG对表达肿瘤B16-gag特异性生长的抑制作用及不同剂量的HYV-AIDS对表达肿瘤B16-gag特异性生长抑制作用的剂量-效应关系。结果：HYV-AIDS疫苗和HYV-GAG疫苗均诱导了HIV-1.gag表达肿瘤的特异性生长抑制作用，含有IL-2基因的HYV-AIDS疫苗治疗效果更为显著且在一定的剂量范围内有明显的剂量-效应关系，如下图1、2所示

例6.疫苗诱导的保护性免疫反应

如前所述向小鼠接种肿瘤和疫苗，当肿瘤长到约50-70mm3时开始测量，追踪测量至120天，肿瘤完全消退后长达21天以上定义为治愈，否则为无效，用疫苗产品(IGV.Factor)接种的小鼠达到92％的治愈率，如表1所示，这是迄今为止艾滋病疫苗临床前期试验很少能达到的治愈率。

     表1.IGV.Factor疫苗诱导的保护性免疫反应

疫苗                          治愈率(治愈数/感染数)

                        试验1     试验2      试验3     总平均

IGV.Factor              9/10      10/10      9/10      92％

IGV.gp41.36             6/10      4/10       5/10      50％

IGV.IL-2                2/10      4/10       3/10      30％

PBS(对照)               0/10      0/10       0/10      0％

例7.疫苗动物模型体内的抗原性

试验通过间接ELISA方法测定杂交酵母艾滋病疫苗免疫C57BL/6小鼠后HIV-1.p55特异性抗体的出现时间和HIV-1.p55特异性抗体的滴度，评价杂交酵母艾滋病疫苗的抗原性。结果：艾滋明克斯疫苗在免疫小鼠第35天可见有明显的HIV-1.p55特异性抗体出现，至免疫小鼠65天HIV-1.p55特异性抗体滴度较高可达1∶56000。显示疫苗的抗原性较强，能够在短时间内诱导模型动物产生高滴度的HIV-1.p55特异性抗体，如表2所示，

表2  杂交酵母艾滋病疫苗诱导57BL/6小鼠产生HIV-1.p55抗体的滴度

                              时间(天)

组别                 D0             D35                D65

艾滋明克斯           ＜1∶50        1∶4600            1∶56000

酵母载体             ＜1∶50        1∶2200            2600

无菌注射用水         ＜1∶50        ＜1∶50            ＜1∶50

例8.恒河猴的T细胞增殖免疫反应试验

选取8只恒河猴前臂皮下注射常用剂量的杂交酵母艾滋病疫苗，另一只注射等体积的无菌注射用水为对照，同前方法恒河猴共免疫三次，每次疫苗注射时采血，最后一次疫苗注射后69天CO2吸入法安乐死并采血7ml，同时收集脾脏、***用于T细胞增殖免疫反应分析，其中以刀豆蛋白A(ConA)作为阳性对照有丝***原，以杂交酵母艾滋病疫苗作为特异性的刺激原，测定艾滋明克斯疫苗对恒河猴的抗原特异性T细胞的增殖反应。结果见以疫苗作为特异性刺激原T细胞的增殖反应较高，与生理盐水对照组比较P＜0.01，差异有显著性的意义。见表3表明苗诱导了恒河猴显著的抗原特异性T细胞增殖免疫反应

表3艾滋明克斯疫苗诱导恒河猴的T细胞增殖免疫反应(n＝9)

分组          无菌注射用水     酵母载体     艾滋明克斯疫苗

第一次免疫      3.1±0.6       1.9±0.9     2.0±0.6

第二次免疫      2.0±0.5       3.5±0.6     2.3±1.3

第三次免疫      1.5±1.0       12.5±3.0    6.8±1.0

D83天           1.8±1.1       9.5±2.5     9.7±1.5

新一代的艾滋病重组蛋白疫苗和DNA疫苗比传统的疫苗免疫原性弱，且艾滋病患者自身的免疫***遭到破坏，有一定的免疫耐受性，因此我们急需具有免疫佐剂作用的艾滋病疫苗和艾滋病疫苗载体，当今以诱导细胞免疫为主的疫苗通常缺乏有效的导入刺激T细胞活性的协同刺激淋巴因子的方法，本发明为最有效地刺激机体的免疫反应提供了一个理想的方法，该理论可延伸到基因治疗的所有领域，因为最有效地刺激机体的免疫反应常需要合适的协同因子的配合。

本发明是一个创新性的疫苗平台技术，不仅仅可用于艾滋病的治疗和预防，可用于研发多种以诱导细胞免疫为主的治疗性和预防性疫苗。

Claims (10)

1.刺激艾滋病感染者产生HIV-1特异性杀伤性CTL免疫反应和特异性抗HIV-1病毒的疫苗，该疫苗由一个DNA质粒通过启动子控制表达协同刺激信号的T细胞生长因子和第二个DNA质粒通过启动子控制表达多个HIV-1的抗原基因组成，这两个质粒都由一个宿主微生物作为载体来携带。

2.1中所说的CTL免疫反应是CD8+杀伤性T细胞免疫反应。

3.1中所说的T细胞生长因子包括如下：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和细胞内细胞因子IFN-γ和TNF-β等。

4.1中所说的HIV-1抗原来源于HIV-1病毒。

5.1中所说的艾滋病感染者是人免疫缺陷病毒感染/AIDs。

6.1中所说的宿主微生物载体是真核细胞。

7.6中所说的真核细胞是酵母细胞。

8.将1中所说的疫苗配以赋形剂或与其它药物联合应用。

9.4中所说的病原体抗原是HIV-1的gag、pol和env等HIV-1相关抗原。

10.应用该疫苗载体转染APC细胞使其成为细胞疫苗而诱导机体产生HIV-1中和性抗体和强效持久的CTL免疫反应。

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