CN101024825A - 一种生产植酸酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产植酸酶的方法，它包括以下步骤：(1)采集黄蓝状菌；(2)配制发酵培养基，培养基组分的质量百分比为：碳源2％～6％、氮源0.2％～2％，其余为水；(3)将黄蓝状菌置于步骤(2)中的培养基里培养；(4)将步骤(3)培养所得的酶液在37℃～65℃的温度下与pH4～7的植酸钠溶液反应10～40分钟后，然后酶液在4℃或常温下保存。本发明采用黄蓝状菌生产所得的植酸酶酶活性高，37℃时可高达294U/ml，稳定性较高，丰富了植酸酶的菌种资源，为植酸酶的开发提供了新的材料。

Description

一种生产植酸酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生产植酸酶的方法，尤其涉及一种利用黄蓝状菌生产植酸酶的方法。

背景技术

植酸酶(phytase)，是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或盐)的一类酶的总称，***名称为肌醇六磷酸酶，属于磷酸单脂水解酶，是一类特殊的酸性磷酸酶，即可将植酸钙镁水解产生磷酸盐的酶。植酸酶广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中均有发现。最早是在植物中发现的，在植物组织如谷物、豆类、蔬菜，特别是萌发的种子和花粉中都发现了植酸酶活力并对其特性进行了研究，可是研究发现植物产植酸酶酶活较低，而且在加工、贮存等因素极易遭到破坏，提取困难，酶学特性等方面也不适于应用；在动物组织中由于植酸酶抑制剂存在使得观察该酶存在困难。所以真正具有开发价值的仅限于利用微生物发酵生产的植酸酶。

植酸酶是一种新型的食品添加剂，它能够降解食物中的植酸而提高食物中磷、锌、铁等的吸收率。目前国外已开始将植酸酶作为饲料添加剂提高植物饲料中磷的利用率，并用食品级植酸酶处理粮食，提高食品的生理功能和营业价值。近年来，在我国植酸酶的应用日趋广泛。其主要应用在饲料上，在植物来源的动物饲料中，大部分磷酸盐是以植酸的形式存在的。而单胃动物例如猪和家禽缺少分解植酸的酶。在动物饲料中添加植酸酶可以改良磷酸盐的生物利用度，也减少了动物饲料中无机磷的添加，有利于缓解我国磷资源缺乏，磷供应不足的局面；同时还能消除植酸的抗营养作用，增加钙、镁、锌、锰、铜和铁的生物利用率，促进动物对蛋白质、氨基酸及碳水化合物的消化吸收；减少磷在环境中的***，由此有利于降低农业生态的负担，并减缓水生环境的富营养化；因此，植酸酶作为新型的饲料添加剂，应用前景十分诱人。

另外，在工业生产中，利用植酸酶降解米糠中的植酸从而生产肌醇磷酸盐或肌醇距成为新的热点；在食品中应用植酸酶可以改善铁和锌的吸收，这对于发展中国家的人群营养具有显著的意义；此外，植酸酶的研究对于开发植酸酶菌肥，循环利用土壤中有机磷，及其工程菌在工业废水处理等方面前景均很诱人。

目前，主要利用微生物生产植酸酶，因为(1)利用微生物发酵生产植酸酶不受季节条件限制，可人为控制；(2)生产周期短；(3)由微生物生产的植酸酶所耐受的PH值较宽(2.5-6.0)，并且PH为2.5时与动物胃中酸度接近，PH5.5正处于小肠PH变化范围内。已经从十几种微生物中分离到植酸酶，细菌中有：枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、假单孢菌等；超过200株产植酸酶的丝状真菌被分离到，多数属于曲霉、毛霉、青霉和根霉。一般而言，丝状真菌植酸酶是胞外酶，容易分离提纯，而细菌植酸酶往往是胞内酶。相对于细菌和丝状真菌，酵母菌植酸酶的报道很少。但是由于现有工业生产的植酸酶制剂的酶活性低，且不能耐受高温，限制了它在饲料添加剂中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产植酸酶的方法，其所生产的植酸酶酶活性较高，酶的稳定性较好，能够很好地在饲料添加剂中应用。

本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种利用黄蓝状菌生产植酸酶的方法，它包括以下步骤：

(1)采集黄蓝状菌；

(2)配制发酵培养基，培养基组分的质量百分比为：碳源2％～6％、氮源0.2％～2％，其余为水；

(3)将黄蓝状菌置于步骤(2)中的培养基里培养；

(4)将步骤(3)培养所得的酶液在37℃～65℃的温度下与PH4～7的植酸钠溶液反应10～40分钟后，测定植酸酶的酶活性；然后酶液在4℃或常温下保存。

本发明中酶活性的测定参照国标GB/T 18634-2002方法。植酸酶的活性定义为：酶液在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、PH5.5的条件下，每分钟从植酸钠中释放出1nmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

本发明所述的碳源是供黄蓝状菌充分生长及植酸酶产生的必须的条件，而它既可包括仅起碳源作用的糖和醇之外，也可以还包括那些即可做碳源又可做氮源的胨、肉汁提取液等。这些碳源可单独使用，也可以组合使用。而在众多的碳源中糖是最适合的，单糖、二糖、多糖均可使用，如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精、乳糖等，经实验证明葡萄糖的利用能最强，因此葡萄糖为最合适碳源，且它的用量为2％～6％，优选5～6％。

本发明所述的氮源也是培养菌落不可或缺的条件之一，有机氮或无机氮均可使用，它的例子包括氨、脲、胨、铵盐，如胰蛋白胨、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵。还有酵母提取液、肉汁提取物、酵母浸膏等也可作为氮源使用。各种有机氮和无机氮可单独使用，也可混合使用。在实验中发现胰蛋白胨和硫酸铵的利用率非常高，是众多氮源中利用率最高的。因此胰蛋白胨、硫酸铵为最适合的氮源，二者可单独使用也可结合使用，实验反映二者结合使用的效果较优。胰蛋白胨的用量为0.2％～1.0％，优选0.2～0.4％；硫酸铵的用量为0.2％～1.0％，优选0.2～0.4％。

在本发明方法步骤(2)中培养基还可以是以下组分和质量百分比：

碳源2％～6％  氮源0.2％～2％  无机盐0～0.8％  其余为水

本发明所述的无机盐可以是硫酸铵、氯化钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁和一水硫酸锰中的一种或几种的组合。

步骤(3)中的黄蓝状菌的接种量为培养基总量的2％～10％，优选2％；种龄时间为2～5天，以种龄3天为佳。培养温度在28℃～33℃的范围，以32℃时植酸酶的酶活性最高，PH值在为5.5时植酸酶的酶活性最高。

由于黄蓝状菌生长较慢，因此在培养的过程中可以将装有培养液的容器放在摇床上震摇，以加速容器中液体通氧，转速为70～90rmp/min。培养时间7～10天，以8天为佳。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用黄蓝状菌生产所得的植酸酶酶活性高，37℃时可高达294U/ml。

(2)本发明所得到的植酸酶稳定性较高：在不同的PH值的条件下于4℃保存24h后测酶活，在PH1～9之间比较稳定，酶活损失很少，可见所得到的植酸酶对酸碱度的稳定性较好；在4℃和常温条件下保存酶液，24h内酶活损失较快，4℃保存24h酶活损失44.5％，常温保存24h酶活损失34.1％，此后240h内酶活几乎没有新的损失，可见该酶稳定性很好。

(3)以黄蓝状菌产植酸酶，丰富了植酸酶的菌种资源，为植酸酶的开发提供了新的材料。

附图说明

图1是黄蓝状菌在察氏培养基上的形态特征图；

图2是黄蓝状菌在麦芽汁培养基上的形态特征图；

图3是黄蓝状菌分生孢子的形态特征图；

图4是黄蓝状菌分生孢子梗的形态特征图；

图5是黄蓝状菌利用各种碳源所产的植酸酶的酶活性柱形图；

图6是黄蓝状菌利用各种有机氮源所产的植酸酶的酶活性柱形图；

图7是黄蓝状菌利用各种无机氮源所产的植酸酶的酶活性柱形图；

图8是黄蓝状菌利用不同浓度的镁盐和钾盐所产植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图9是黄蓝状菌利用不同浓度的铁盐和锰盐所产植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图10是黄蓝状菌在不同接种量所产的植酸酶的酶活性曲线图；

图11是黄蓝状菌在不同装液量所产的植酸酶的酶活性曲线图；

图12是发酵培养的PH值对黄蓝状菌产植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图13是发酵培养的温度对黄蓝状菌产植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图14是发酵培养时间对黄蓝状菌产植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图15是温度对植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图16是PH值对植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图17是植酸酶与底物反应的时间对植酸酶的酶活性影响的曲线图；

图18是冷藏时的PH值对植酸酶的稳定性的曲线图；

图19是不同的金属离子对植酸酶的酶活性影响的柱形图；

图20是保藏温度对植酸酶的稳定性影响的曲线图；

图21是白云山土壤样品培养所得的黄蓝状菌的分生孢子及分生孢子梗形态特征图；

图22是白云山土壤样品培养所得的黄蓝状菌的在固体筛选培养基上形态特征图；

图23是武汉土壤样品培养所得的黄蓝状菌的在固体筛选培养基上形态特征图；

图24是武汉土壤样品培养所得的黄蓝状菌的分生孢子及分生孢子梗形态特征图。

具体实施方式

现结合实施例对本发明进行具体的阐述，但是本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的目的。

实施例一：

1.采集黄蓝状菌

(1)采集土壤样品，用常规稀释法涂平板，通过透明圈法进行初筛真菌

采集广州市蔬菜研究所玉米地表层以下10cm左右土壤样品，按照常规稀释法涂平板即PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，培养2天后将平板上菌落点接于固体筛选培养基上，该培养基pH值为5.5，它的组成成分(每升)：

葡萄糖30g         硫酸铵5g           氯化钾0.5g  七水硫酸镁0.5g

七水硫酸锰0.03g   七水硫酸亚铁0.03g  琼脂15g     植酸钙10g

培养3天后观察是否产透明圈的单菌落。

(2)对得到的透明圈菌株进行形态学以及分子生物学鉴定(如图1～4所示)

①察氏培养基：产棕红色色素，生长慢，培养8天菌落直径大约22mm，菌落表面有同心环，最外面的环表面为白色，第二个环(从外往内数)表面为橙色，第三个环为灰绿色，中间为灰黄色，菌落背面为棕褐色，菌落表面平滑、致密，边缘全缘，菌落扁平，绒毛状，培养13天后产棕色水珠

②麦芽汁培养基：8天时的菌落直径约50mm，菌落正面鹅黄色，周围为青绿色，背面黄色，菌落表面平滑、致密，有同心环，质地粉粒状，菌落扁平，生长较在察氏培养基上生长快，短绒毛状，14天后表面形成一层黄色颗粒状子囊果。

其分生孢子为球形或椭圆形，分生孢子梗为扫帚状。

根据以上形态特征查《真菌鉴定手册》(1979年)及文献：李国庆等，菌核寄生菌Talaromyces flavus的生物学特性及寄生菌核规律初探，微生物学通报，1995，22(3)可知，该真菌与Talaromyces flavus(黄蓝状菌)的特性最为符合。

③提取该真菌的DNA，通过PCR扩增其18s rDNA序列，扩增产物送上海英骏生物技术有限公司进行测序，将得到的碱基序列在GeneBank中比对，根据比对结果，该真菌与Talaromyces flavus(黄蓝状菌)具有最高的同源性，达100％。根据上述形态学特征以及18s rDNA序列对比结果，确定该真菌为黄蓝状菌。

PCR反应体系：

5μl 10×PCR缓冲液、1μl10mmol四种单核甘酸混合物(dNTP)、0.5μl嗜热性DNA酶(Taq polymerase)、5μl25mmol氯化镁、1μl上游引物、1μl下游引物、1μl模板DNA、35.5μl无菌水。

上游引物：5’-CCAGTAGTCATATGCTTGTCT-3’

下游引物：5’-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’

PCR反应程序：

将PCR反应体系先在94℃下进行预变性5分钟，再进行30次变性—复性—延伸循环反应，每个循环包括：94℃反应1分钟，56℃反应1分钟，72℃反应2分钟；最后，在72℃下再延伸7分钟。

其18s rDNA序列如下：

cGAGTGAGGGCCCCTCGCGGCCCAACCTCCCACCCTTGTCTCCAACACCTGTTGCTTCGG

CGGGCCCACCGGGGCCACCCGGTCGCCGGGGGACATCCGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCG

AGGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTGATATGAAAATTGTCAAAAC

TTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT

AATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGG

CATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTT

GGGTGTGGTCCCCCTGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTCGA

GCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGTCACCACCACATC

TTTTTACAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT

AAGGCGGAGAAA

2.研究该真菌产植酸酶的条件，以及其所产植酸酶的酶学性质。

本发明中酶活性的测定参照国标GB/T 18634-2002方法。植酸酶的活性定义为：酶液在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、PH5.5的条件下，1ml酶液中每分钟释放出1nmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U/ml表示。

(1)配制发酵培养基，培养基的组成成分质量百分比为：

葡萄糖6％            胰蛋白胨0.2％      硫酸铵0.5％

氯化钾0.05％         七水硫酸镁0.05％

七水硫酸亚铁0.004％  一水硫酸锰0.004％  其余为水

(2)配制好培养基后取50ml置于500ml锥形瓶中，将为培养基总量2％的黄蓝状菌置于培养基中培养，控制温度在32℃，PH5.5，摇床转速80rmp/min，培养8天。

(3)8天后将培养所得的酶液在37℃的温度下与PH5.5的植酸钠溶液反应10分钟后，测定所得植酸酶得酶活性为294U/ml；然后将植酸酶液在4℃保存。

取所得的植酸酶进行在三个植酸酶的酶活性较高的温度点分别保温不同的时间，测定植酸酶的酶活性，结果如表1：

表1：在不同温度下保温不同时间的植酸酶的酶活性

从表1可看出在水浴保温10分钟的时候，植酸酶保持温度，并且和底物植酸钠溶液充分反应。随着时间延长植酸酶的酶活性虽然有所降低，但是仍具有较高的酶活度。由于37℃是畜禽消化道温度，37℃处测的酶活对实际应用有参考价值，该酶在37℃时酶活较高，说明该酶比较适合用于饲料添加剂。

再对植酸酶进行稳定性试验，即在4℃和常温条件下保存24～240小时，测定它的酶活性。结果显示，4℃保存24h酶活性损失44.5％，从原来的219U/ml降低到120U/ml，常温保存24h酶活性损失34.1％，降低到143U/ml，此后240h内酶活性几乎没有新的损失，4℃保存96h后酶活性为116U/ml，保存240h残余酶活性仍有115U/ml；常温保存96h后酶活性为121U/ml，保存240h残余酶活性仍有106U/ml。可见该酶稳定性很好。

实施例二：

取实施例一培养经鉴定后的黄蓝状菌进行以下发酵产植酸酶。

(1)配制发酵培养基，培养基的组成成分质量百分比为：

葡萄糖6％    胰蛋白胨0.2％    硫酸铵0.5％

(2)配制好培养基后取100ml置于500ml锥形瓶中，将为培养基总量4％的黄蓝状菌置于培养基中培养，控制温度在26℃，PH4，摇床转速80rmp/min，培养8天。

(3)8天后将培养所得的酶液在37℃的温度下与PH5.5的植酸钠底物溶液反应10分钟后，测定酶活性为197U/ml；然后将酶液在4℃保存。

实施例三：

(1)配制发酵培养基，培养基的组成成分质量百分比为：

麦芽糖4％    蛋白胨0.3％    硝酸钾0.2％

氯化钾0.125％        七水硫酸镁0.125％

七水硫酸亚铁0.005％  一水硫酸锰0.005％

(2)配制好培养基后取200ml置于500ml锥形瓶中，将为培养基总量10％的黄蓝状菌置于培养基中培养，控制温度在34℃，PH7，摇床转速80rmp/min，培养8天。

(3)8天后将培养所得的酶液在37℃的温度下与PH5.5的植酸钠底物溶液反应10分钟后，测定酶活性为171U/ml；然后将酶液在4℃保存。

实施例四：

(1)配制发酵培养基，培养基的组成成分质量百分比为：

淀粉4％              胰蛋白胨0.3％    硫酸铵0.2％

氯化钾0.075％        七水硫酸镁0.075％

七水硫酸亚铁0.002％  一水硫酸锰0.002％

(2)配制好培养基后取150ml置于500ml锥形瓶中，将为培养基总量10％的黄蓝状菌置于培养基中培养，控制温度在30℃，PH5，摇床转速80rmp/min，培养8天。

(3)8天后将培养所得的酶液在37℃的温度下与PH5.5的植酸钠底物溶液反应10分钟后，测定酶活性为103U/ml；然后将酶液在4℃保存。

实施例五：

(1)配制发酵培养基，培养基的组成成分质量百分比为：

葡萄糖4％            酵母提取液0.3％    硝酸钾0.2％

氯化钾0.025％        七水硫酸镁0.025％

七水硫酸亚铁0.003％  一水硫酸锰0.003％

(2)配制好培养基后取150ml置于500ml锥形瓶中，将为培养基总量10％的黄蓝状菌置于培养基中培养，控制温度在28℃，PH6，摇床转速80rmp/min，培养8天。

(3)8天后将培养所得的酶液在37℃的温度下与PH5.5的植酸钠底物溶液反应10分钟后，测定酶活性为112U/ml；然后将酶液在4℃保存。

实施例六：不同碳源对黄蓝状菌产植酸酶影响的试验

初始发酵培养基成分为：(质量百分比)

葡萄糖4％；    蛋白胨0.3％；    硫酸铵0.2％；

氯化钾0.05％；           七水硫酸镁0.05％；

七水硫酸亚铁0.003％；    一水硫酸锰0.003％；

以不同碳源代替初始发酵培养基中的葡萄糖，添加量均为4％(质量百分比)，培养条件设定为28℃，80rpm，5d后取粗酶液测酶活，结果见图5。由图5可知，该菌可以利用的碳源谱比较广，单糖、二糖、多糖均可以利用。添加葡萄糖时酶活性为67U/ml；添加麦芽糖时酶活性为62U/ml；添加淀粉时酶活性为38U/ml。其中它对葡萄糖的利用能力最强，明显优于其它碳源；对麦芽糖的利用仅次于葡萄糖，发酵产酶活为葡萄糖的93％左右；对乳糖的利用能力最弱，发酵产酶活远远低于其他碳源，仅为葡萄糖的15％左右。由此，确定葡萄糖为该菌最适合的碳源，其最适浓度由正交实验来决定。

实施例七：不同氮源对黄蓝状菌产植酸酶影响的试验

以葡萄糖为碳源，添加量为4％(质量百分比)，将初始液体发酵培养基中的氮源分别用不同的氮源代替，保证氮源浓度为1％(质量百分比)，培养条件同实施例六。

从图6、7可以看出，该菌的氮源谱也比较广，不但可以利用有机氮为唯一氮源，也可以利用无机氮为唯一氮源进行发酵产酶。在有机氮中，对胰蛋白胨的利用最好，蛋白胨次之，对酵母浸膏利用最差，仅为胰蛋白胨的8％；添加胰蛋白胨时酶活性为40U/ml；添加蛋白胨时酶活性为21U/ml；添加酵母提取物时酶活性为16U/ml.在无机氮中，对硫酸铵的利用最好，其次是硝酸钾，对硝酸铵利用最差，仅为硫酸铵的7％。添加硫酸铵时酶活性45U/ml；添加硝酸钾时酶活性为24U/ml；添加硝酸钠时酶活性为17U/ml。由此确定该菌的有机氮源为胰蛋白胨，无机氮源为硫酸铵。其最适浓度仍由后面的正交实验确定。

实施例八：镁盐与钾盐的浓度对黄蓝状菌产植酸酶的影响试验

以葡萄糖为碳源，添加量为4％(质量百分比)；胰蛋白胨为有机氮源，添加量为0.5％(质量百分比)；(NH₄)₂SO₄为无机氮源，添加量为0.5％(质量百分比)。将MgSO₄·7H₂O和KCl设定一系列浓度，培养条件同实施例六。

由图8可以看出，在设定的范围0-0.125％内，MgSO₄·7H₂O和KCl对产酶有正促进作用，添加量为0％，0.025％，0.05％，0.075％，0.1％，0.125％时酶活性分别为47U/ml，67U/ml，74U/ml，71U/ml，56U/ml，52U/ml。其最佳浓度为0.05％。

实施例九：铁盐与锰盐的浓度对黄蓝状菌产植酸酶的影响试验

以葡萄糖为碳源，添加量为4％(质量百分比)；胰蛋白胨为有机氮源，添加量为0.5％(质量百分比)；(NH₄)₂SO₄为无机氮源，添加量为0.5％(质量百分比)；MgSO₄·7H₂O和KCl添加量均为0.05％(质量百分比)。将FeSO₄·7H₂O和MnSO₄·H₂O设定一系列浓度，培养条件同实施例六。

由图9可以看出，FeSO₄·7H₂O和MnSO₄·H₂O在设定浓度范围0-0.005％内也对酶活有促进作用，添加量为0％，0.001％，0.002％，0.003％，0.004％，0.005％时酶活性分别为7U/ml，17U/ml，26U/ml，25U/ml，36U/ml，29U/ml。在0.001％-0.005％范围内比较适宜，而最佳浓度为0.004％。

实施例十：培养基中的碳源、氮源、无机盐的浓度选定试验

对培养基的碳源和两种氮源进行正交试验优化培养基，设计3水平3因素，如表2所示，表3即为此正交试验的设计及结果。

表2  正交试验因素与水平表

因素	葡萄糖	胰蛋白胨	(NH4)2SO4
				水平1	2％	0.2％	0.2％
水平2	4％	0.5％	0.5％
				水平3	6％	1.0％	1.0％

表3  正交试验设计及结果

试验号(U/ml)	葡萄糖	胰蛋白胨	(NH4)2SO4	试验结果AU
					试验1	1	1	1	47
试验2	1	2	2	38
					试验3	1	3	3	13
试验4	2	1	2	65
					试验5	2	2	3	35
试验6	2	3	1	11
					试验7	3	1	3	66
试验8	3	2	1	50
					试验9	3	3	2	14
均值1	32.7	59.3	36.0
					均值2	37.0	41.0	39.0
均值3	43.3	12.7	38.0
					极差	10.6	46.6	3.0

由表可以得出，在所设定的范围内，即葡萄糖2％-6％；胰蛋白胨0.2％-1.0％；(NH₄)₂SO₄0.2％-1.0％，该黄蓝状菌都能产植酸酶。实验得到碳源和氮源的最适配方为：葡萄糖6％；胰蛋白胨0.2％；(NH₄)₂SO₄0.5％。则最佳培养基配方为：葡萄糖6％；胰蛋白胨0.2％；(NH₄)₂SO₄0.5％；KCl0.05％；MgSO4·7H₂O0.05％；FeSO4·7H₂O0.004％；MnSO₄·H₂O0.004％。

实施例十一：接种量对黄蓝状菌产植酸酶的影响试验

分别以2％-10％范围内一系列接种量分别进行液体发酵，培养条件同实施例六。

由上图10可知，酶活性与接种量有直接的关系，在2％-10％接种量范围内都可以产植酸酶。通过实验发现，2％、4％、6％接种量发酵酶活基本相同，分别为60U/ml，60U/ml，58U/ml。接种量高于6％后酶活开始下降，到8％时酶活性为46U/ml，10％时为37U/ml。因此确定2％为黄蓝状菌发酵产酶的最适接种量。

实施例十二：装液量对黄蓝状菌产植酸酶的影响试验

分别取50ml，100ml，150ml，200ml不同量的液体发酵培养基装入500ml锥形瓶中发酵发酵条件同实施例六。

由图11可知，在500ml锥形瓶中装50ml-150ml培养基都能较好的产植酸酶，而最佳装液量为50ml/500ml锥形瓶。装液量为50ml，100ml，150ml，200ml时酶活性分别为115U/ml，60U/ml，36U/ml，19U/ml。由于黄蓝状菌生长比较缓慢，装液量太多，不利于通氧，影响菌体充分生长，从而使得酶活较低。

实施例十三：培养环境PH值对黄蓝状菌产植酸酶的影响试验

调节初始PH在1-9范围内的液体发酵培养基，培养条件同实施例六。结果如图12。从图中可以看出，该黄蓝状菌发酵产植酸酶的适宜的初始PH范围为4-7，在PH为4，4.5，5，5.5，6，65，7时的酶活性分别为69U/ml，67U/ml，69U/ml，72U/ml，67U/ml，66U/ml，71U/ml。其最适PH为5.5。而PH4-2之间和PH7-9之间曲线下降很快，而PH为1时曲线又有所上升，其发酵酶活性为PH5.5时的42％，推测原因可能是由于在发酵过程中产一种红棕色的色素所致。

实施例十四：培养温度、时间对黄蓝状菌产植酸酶的影响试验

设定不同的温度条件下，80rpm，培养5d测酶活。

由图13、14可以看出，该黄蓝状菌在设定的温度范围内26℃-34℃都可以生长，并且能够产植酸酶，26℃时酶活性为41U/ml，28℃时为60U/ml，30℃时为62U/ml，32℃时为89U/ml，34℃时为34U/ml。在发酵温度为32℃是酶活性最高，因此确定最适发酵温度为32℃。

通过以上实验得出本发明中黄蓝状菌产植酸酶的最适发酵条件为：培养温度：32℃；发酵培养基最适PH：5.5；装液量：50ml(500ml锥形瓶)；接种量：2％；种龄：3d；摇床转速：80rmp/min；培养时间：8d。

实施例十五：不同温度对植酸酶的酶活性的影响试验

将酶液在37℃-90℃这一范围内的不同温度点与底物反应30min，然后测酶活性。

由图15可知，在37℃-65℃酶活性都较高，37℃酶活性为132U/ml，40℃酶活性为133U/ml，50℃酶活性为239U/ml，55℃酶活性为268U/ml，60℃酶活性为225U/ml，65℃酶活性为91U/ml。酶活性最高点在55℃左右，在70℃和80℃酶活性很低，而90℃又有所升高，37℃是畜禽消化道温度，37℃处测的酶活性对实际应用有参考价值，该酶在37℃时酶活性较高，说明该酶比较适合用于饲料添加剂。

实施例十六：不同PH值缓冲液对植酸酶的酶活性的影响试验

以不同的PH值缓冲液配置植酸钠底物溶液，37℃反应30min，测酶活。结果如下：

由图16可知，在PH4-7范围内酶活性比较高，PH为4时酶活性为56U/ml，PH为5时酶活性为60U/ml，PH为5.5时酶活性为157U/ml，PH为6时酶活性为52U/ml，PH为7时酶活性仅13U/ml。曲线在PH5.5处出现了一个峰，该PH值处于单胃动物小肠的PH变化范围内，也说明了该酶适合做饲料添加剂。

实施例十七：温度和恒温加热的时间对植酸酶的酶活性的影响试验

在实施例十五的基础上挑选三个酶活性较高的温度点，在此温度值分别保温不同时间，测定酶活性。

如图17所示，经过比较可以看出，三条曲线均在水浴10min时的残余酶活最高，这个共同点反映出此酶的特性，即在水浴10min的时候，酶蛋白保持稳定，并且和底物充分反应，因此，确定水浴10min为其最佳反应时间。37℃水浴10min，20min，30min，40min测定出酶活性分别为294U/ml，173U/ml，143U/ml，141U/ml；55℃水浴不同时间测出酶活性分别为456U/ml，336U/ml，290U/ml，264U/ml；而在65℃时水浴不同时间测得酶活性分别为264U/ml，135U/ml，95U/ml，72U/ml。并且该酶在55℃时最稳定，保温40min后残余酶活仍然有57.9％。

实施例十八：酶液的PH值对植酸酶的酶活性的影响试验

将酶液分别调整PH为不同PH处，4℃冰箱保存24h，然后测酶活，与保存前比较。保存前各PH点酶活性同实施例12，保存后PH为4的酶活性为35U/ml，PH为5的酶活性为55U/ml，PH为5.5的酶活性为140U/ml，PH为6的酶活性为42U/ml，PH为7的酶活性仅5U/ml。

比较图18中两条曲线可知，此酶在2-9之间酶活比较稳定，失活损失很少，可见此酶PH稳定性比较好，适用于工业生产。

实施例十九：不同金属离子对植酸酶的酶活性的影响试验

用PH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液配置不同金属离子，浓度分别为1mM和5mM，以此配置底物溶液，测定酶活比较不同金属离子在不同浓度时对酶活的影响。

由图19可知，Ca²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Hg²⁺对酶活都有一定的抑制作用，而只有EDTA对酶活有微弱的促进作用。

实施例二十：保藏温度对植酸酶的酶活性的影响试验

将酶液PH调整为5.5，分别在常温和4℃冰箱保存酶液，取不同保存时间的酶液，测残余酶活性。

由图20可知，在4℃和常温条件下保存酶液，在24h-240h内相对比较稳定。24h内酶活性损失较快，4℃保存24h酶活性损失44.5％，从原来的219U/ml降低到120U/ml，常温保存24h酶活性损失34.1％，降低到143U/ml，此后240h内酶活性几乎没有新的损失，4℃保存96h后酶活性为116U/ml，保存240h残余酶活性仍有115U/ml；常温保存96h后酶活性为121U/ml，保存240h残余酶活性仍有106U/ml。可见该酶稳定性很好。

实施例二十一：

1、采集土壤样品，用常规稀释法涂平板，通过透明圈法进行初筛真菌

采集白云山土壤样品，用常规稀释法涂固体筛选培养基平板，培养基PH5.5，其组分为(质量百分比)：

葡萄糖2％          硝酸铵0.3％          氯化钾0.05％  七水硫酸镁0.05％

七水硫酸锰0.003％  七水硫酸亚铁0.003％  琼脂1.5％     植酸钙1％

在28℃的温度下培养3天后，观察有透明圈的单菌落生成。挑取产透明圈菌落，转接PDA培养基进行培养。

2、对得到的透明圈菌株进行形态学以及分子生物学鉴定(图21、22)

选取其中一株形态类似黄蓝状菌，挑取少量该菌的孢子，分别点接于察氏培养基和麦芽汁培养基，培养7-14天，观察形态。方法与实施例一相同。

察氏培养基：产棕红色色素，生长慢，菌落表面有同心环，最外面的环表面为白色，第二个环(从外往内数)表面为橙色，第三个环为灰绿色，中间为灰黄色，菌落背面为棕褐色，菌落表面平滑、致密，边缘全缘，菌落扁平，绒毛状。

麦芽汁培养基：菌落正面鹅黄色，周围为青绿色，背面黄色，菌落表面平滑、致密，有同心环，质地粉粒状，菌落扁平，生长较在察氏培养基上生长快，短绒毛状，14天后表面形成一层黄色颗粒状子囊果。

生物学鉴定的方法与实施例一相同，扩增得到的18s rDNA序列与实施例一得到的18s rDNA相同。说明该真菌为黄蓝状菌。

运用所得到的黄蓝状菌生产植酸酶，方法与实施例一相同。用国标GB/T 18634-2002规定的方法测得酶活性为183U/ml。

实施例二十二：

1、采集土壤样品，用常规稀释法涂平板，通过透明圈法进行初筛真菌

采集武汉土壤样品，用常规稀释法涂固体筛选培养基平板，其培养基PH 5.5，其组分为(质量百分比)：

葡萄糖2％          硝酸铵0.3％          氯化钾0.05％  七水硫酸镁0.05％

七水硫酸锰0.003％  七水硫酸亚铁0.003％  琼脂1.5％     植酸钙1％

在28℃的温度下培养3天后，观察有透明圈的单菌落生成。挑取产透明圈菌落，转接PDA培养基进行培养。

2、对得到的透明圈菌株进行形态学以及分子生物学鉴定(图23、24)

选取其中一株形态类似黄蓝状菌，挑取少量该菌的孢子，分别点接于察氏培养基和麦芽汁培养基，培养7-14天，观察形态。方法与实施例一相同。

察氏培养基：产棕红色色素，生长慢，菌落表面有同心环，最外面的环表面为白色，第二个环(从外往内数)表面为橙色，第三个环为灰绿色，中间为灰黄色，菌落背面为棕褐色，菌落表面平滑、致密，边缘全缘，菌落扁平，绒毛状。

麦芽汁培养基：菌落正面鹅黄色，周围为青绿色，背面黄色，菌落表面平滑、致密，有同心环，质地粉粒状，菌落扁平，生长较在察氏培养基上生长快，短绒毛状，13天后表面形成一层黄色颗粒状子囊果。

生物学鉴定的方法与实施例一相同，扩增得到的18s rDNA序列与实施例一得到的18s rDNA相同。说明该真菌为黄蓝状菌。

运用所得到的黄蓝状菌生产植酸酶，方法与实施例一相同。用国标GB/T 18634-2002规定的方法测得酶活性为201U/ml。

Claims (10)

1、一种利用黄蓝状菌生产植酸酶的方法，它包括以下步骤：

(1)采集黄蓝状菌；

(2)配制发酵培养基，培养基组分的质量百分比为：碳源2％～6％、氮源0.2％～2％，其余为水；

(3)将黄蓝状菌置于步骤(2)中的培养基里培养；

(4)将步骤(3)培养所得的酶液在37℃～65℃的温度下与PH4～7的植酸钠溶液反应10～40分钟后，然后酶液在4℃或常温下保存。

2、根据权利要求1所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的碳源为单糖、二糖和多糖中的一种或几种的混合。

3、根据权利要求2所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的碳源为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉和糊精中的一种或几种的混合。

4、根据权利要求1所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的氮源为有机氮、无机氮或有机氮与无机氮的混合物。

5、根据权利要求1或2或3或4所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的有机氮为肉汁提取物、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨或脲；所述的无机氮为氨或铵盐。

6、根据权利要求5所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：所述的铵盐为氯化铵、硫酸铵、硝酸铵或磷酸铵。

7、根据权利要求1或2或3或4所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中培养基还可以是以下组分和质量百分比：

碳源2％～6％  氮源0.2％～2％  无机盐0～0.8％  其余为水。

8、根据权利要求7所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：所述的无机盐为硫酸铵、氯化钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁和一水硫酸锰中的一种或几种的组合。

9、根据权利要求1所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的黄蓝状菌的接种量为培养基总量的2％～10％；种龄时间为2～5天；培养温度在28℃～33℃的范围内，PH值为5～6；培养时间为7～10天。

10、根据权利要求1所述的生产植酸酶的方法，其特征在于：步骤(3)还包括震摇装有培养液的容器，转速为70～90rmp/min。

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