CN110129235B - 一种耐热植物乳杆菌及其在农业生产中的应用 - Google Patents

一种耐热植物乳杆菌及其在农业生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株耐热植物乳杆菌，并提供了其在农业生产中的应用。所述植物乳杆菌筛选自沼气池底部污泥，保藏编号为CCTCC NO:M2019401。该菌株耐热性强，且具有较强的产酸和产蛋白酶能力，抑菌效果也很明显，可广泛应用于农业生产。

Description

一种耐热植物乳杆菌及其在农业生产中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物的筛选与应用技术领域，具体涉及一株新型的耐热植物乳杆菌及其在农业生产中的应用。
背景技术
现代堆肥技术是发达国家在20世纪初开发研究成功的，目前在英国、美国、法国、德国、日本等国家已被广泛应用。美国每年约有49％的污泥制成肥料施于农田或林地。法国也应用BIOTERRA机械堆肥工艺，取得良好效果。我国传统堆肥法一般都是采用增加营养和改善环境条件的方法，利用堆制原料中的土著微生物来降解有机污染物，但由于堆肥初期土著微生物量少，需要一定时间才能繁殖起来，并且各种微生物分解速度差别很大，因此传统堆肥往往存在发酵时间长、产生臭味且肥效低等问题。目前现代堆肥技术普遍采用人工接种分解有机物能力强的微生物的方法。由于微生物的表面积比较大，代谢旺盛，数目巨大，繁殖迅速，在堆肥化过程中对有机物质降解起主导作用。
有机堆肥的发酵过程简单可分为以下4个阶段：
1、发热阶段
堆肥制作初期，堆肥中的微生物以中温、好气性的种类为主。它们启动堆肥的发酵过程，在好气性条件下旺盛分解易分解有机物质(如简单糖类、淀粉、蛋白质等)，产生大量的热，不断提高堆肥温度，从20℃左右上升至40℃，称为发热阶段，或中温阶段。
2、高温阶段
随着温度的提高，好热性的微生物逐渐取代中温性的种类而起主导作用，温度持续上升，一般在几天之内即达50℃以上，进入高温阶段。
在高温阶段，好热性的微生物对堆肥中复杂的有机物质(如纤维素、半纤维素、果胶物质等)进行强烈分解，热量积累，堆肥温度上升至60-70℃，甚至可高达80℃。随即大多数好热性微生物也大量死亡或进入休眠状态(20天以上)，这对加快堆肥的腐熟有很重要的作用。不当的堆肥，只有很短的高温期，或者根本达不到高温，因而腐熟很慢，在半年或者更长时期内还达不到半腐熟状态。
堆肥高温期作为有机大分子分解的主要阶段，也是保障堆肥无害化的重要阶段。因为许多堆肥用的基质携带人类、动植物的病原体，以及杂草种子。在堆肥过程中，通过短时间的持续升温，能够使动植物病原体以及杂草种子失活
3、降温阶段
当高温阶段持续一定时间后，纤维素、半纤维素、果胶物质大部分已被分解，剩下很难分解的复杂成分(如木质素)和新形成的腐殖质，微生物的活动减弱，温度逐渐下降。当温度下降到40℃以下时，中温性微生物又成为优势种类。
如果降温阶段来的早，表明堆制条件不够理想，植物性物质分解不充分。这时可以翻堆，将堆积材料拌匀，使之产生第二次发热、升温，以促进堆肥的腐熟。
4、腐熟保肥阶段
堆肥腐熟后，体积缩小，堆温下降至稍高于气温，这时应将堆肥压紧，造成厌气状态，使有机质矿化作用减弱，以利于保肥。
简而言之，有机堆肥的发酵过程实际上就是各种微生物新陈代谢、繁殖的过程。微生物的新陈代谢过程即有机物分解的过程。有机物分解必然会产生能量，这些能量推动了堆肥化进程，使温度升高，同时还可干燥湿基质。
参与堆肥过程的主要微生物种类是细菌、真菌以及放线菌等。这些微生物都有中温菌和高温菌。其中，乳酸菌(厌氧型),是堆肥常用的一种细菌，它以摄取光合细菌酵母菌产生的糖类等物质为基础，产生乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用。但乳酸菌的耐热性较差，不同菌属最适生长温度大致在35～45℃。因此，受高温因素的影响，乳酸菌在堆肥高温期种群数量和活性会普遍降低，由此限制了有机物的快速分解。因而选育耐高温的乳酸菌菌株具有极为重要的理论意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一株耐热植物乳杆菌，并提供了其在农业生产中的应用。所述植物乳杆菌筛选自沼气池底部污泥，耐热性强，且具有较强的产酸和产蛋白酶能力，抑菌效果也很明显，可广泛应用于农业生产。
本发明一方面提供了一种植物乳杆菌LLH-2(Lactobacillus plantarum LLH-2)，已于2019年5月27日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019401。
本发明还提供了植物乳杆菌LLH-2在堆肥中的应用。
本发明还提供了植物乳杆菌LLH-2在植物病害防治中的应用。
所述植物病害包括根腐病、白绢病、白粉病、炭疽病、疮痂病、灰霉病、枯萎病、褐斑病或果腐病中的任意一种。
本发明还一方面提供了一种生物腐熟剂，包含上述植物乳杆菌LLH-2。
所述腐熟接种剂还包含芽孢杆菌、球菌、曲霉菌、酵母、木霉菌、链霉菌、小多孢菌、放线菌、假单胞菌、乳酸菌中的任意一种或两种或多种的组合。
所述腐熟接种剂中植物乳杆菌LLH-2的活菌量至少为109CFU/g。
本发明还提供了上述生物腐熟剂在有机物料堆肥中的应用。
所述有机物料包括蘑菇菌渣、玉米皮、花生壳、畜禽粪便、作物秸秆、城市污泥、餐厨垃圾、食品加工或制药废渣中的任意一种或两种或多种的组合。
所述生物腐熟剂的添加量为0.5-5kg/吨物料。
有益效果
本发明筛选到的植物乳杆菌LLH-2具有很强的耐热性，在50-70℃高温下仍能大量存活和繁殖，并高效分泌乳酸等酸类物质。与37℃条件下的乳酸产量相比，该菌株在50℃和70℃高温条件下分别保留了高达85.1％和65.2％的乳酸产量。植物乳杆菌LLH-2还具有较强的产蛋白酶能力，37℃培养48h，发酵上清液中蛋白酶酶活高达97U/mL。堆肥中接种植物乳杆菌LLH-2可以显著提高微生物的活性，迅速升高堆肥温度至68℃，并大大延长高温期的持续时间，有利于杀灭堆肥中病原微生物，缩短堆肥时间，提高堆肥品质。
此外，本发明提供的植物乳杆菌LLH-2对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌等致病细菌，以及根腐病菌、白绢病菌、疮痂病菌和褐斑病菌等致病真菌，均有较强的拮抗作用。在大田实验中，该菌株对根腐病和褐斑病的防治效率分别高达83.0％和80.0％，对白绢病和疮痂病的防治效率均超过55％，显著高于药剂处理组多菌灵的防治效果。因此，本发明提供的植物乳杆菌LLH-2可作为生防菌剂，用于防治常见植物病害，且对环境友好，有利于提升农作物的品质，推动传统农业向生态农业、绿色农业的转变，实现农业健康、可持续的发展。
附图说明
图1为鸡粪堆肥过程中堆体的温度变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。
实施例1耐高温乳酸菌的筛选及与鉴定
1.1耐高温乳酸菌的筛选
样品：山东省青岛市平度蓼兰镇养殖场沼气池底部污泥。
将污泥样品经70℃高温富集培养，用梯度稀释法分离得到55株耐高温纯菌株。将分离得到的菌株分别接种至加0.5％碳酸钙的MRS平板(蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80mL，琼脂15g，蒸馏水1.0L组成，pH6.5±0.2)上，37℃培养48h，分离培养有透明圈的菌株，获得3株乳酸菌，分别命名为LLH-1，LLH-2，LLH-3；
将上述3株乳酸菌分别接种于50mL MRS肉汤培养基中，分别在37℃，50℃和70℃条件下，各培养48h，用HPLC分别测定培养基中乳酸的含量，用pH计测定培养基的pH，具体结果如表1所示。
表1耐高温乳酸菌在不同培养温度下产酸能力比较
Figure BDA0002075221670000041
从表1的结果可以看出，本发明筛选到的3株乳酸菌中，LLH-2菌株在37℃、50℃、70℃条件下的乳酸产量均最高，且发酵后培养基的pH值也最低，从而说明LLH-2菌株的综合产酸能力最强。
而且，与37℃条件下的乳酸产量相比，LLH-2菌株在50℃和70℃高温条件下分别保留了高达85.1％和65.2％的乳酸产量，发酵后培养基的pH值分别为3.55和4.07。从而说明，本发明筛选到的LLH-2菌株具有很强的耐热性，在50-70℃高温条件下仍能大量存活和繁殖，并高效分泌乳酸等酸类物质，效果非常显著。
1.2菌株鉴定
LLH-2菌株的菌落为乳白色，边缘整齐；革兰氏染色呈阳性，细胞形态为短杆状、无芽孢；在15℃-70℃条件下生长状况良好。LLH-2菌株在摇瓶MRS肉汤培养基中培养24小时后，活菌数量超过10亿个/mL。
采用分子生物学的方法对上述筛选得到的LLH-3菌株进行鉴定，测得其16s rDNA序列SEQ ID NO:1。将SEQ ID NO:1在GenBank核酸数据库中进行blast比对，发现其与植物乳杆菌的16s rDNA序列相似性最高达98.56％。
SEQ ID NO:1如下所示：
aaagatggcttcggctatcacttctggatggtcccgcggcgtattaggtagatggtggggtaacggctcaccatggcaaagatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacggggggcagcagtagggaattttccaaaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactcttttgttaaagaagaacatatctgagagtaaattttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacctgccagcaggcggggtaattcgtaggtggcaagggttgtcaggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagcctttggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaaattgaatgcagaagaggacagtggaactctatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttta
结合LLH-2菌株的菌落形态和16srDNA比对结果，申请人确认LLH-2菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌LLH-2(Lactobacillus plantarumLLH-2)。
申请人已于2019年5月27日将上述植物乳杆菌LLH-2(Lactobacillus plantarumLLH-2)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019401。
实施例2植物乳杆菌LLH-2产蛋白酶活力测定
将植物乳杆菌LLH-2接入MRS液体培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80lmL，蒸馏水1.0L组成，pH6.5±0.2)中，在37℃培养24h，连续转接活化两代，以1％(/v/v)接种量接入200mL MRS液体培养基中，37℃培养48h；4℃，8000r/min离心10min，收集上清夜，采用下述方法检测上清液中蛋白酶酶活。
结果显示，本发明筛选到的植物乳杆菌LLH-2发酵上清液中蛋白酶酶活高达97U/mL，取得了意料不到的技术效果。
(1)酶活力定义：37℃，每分钟分解牛血清蛋白产生1μmol的色氨酸所需酶量即为一个酶活单位。
(2)酶活测定方法：取50μL浓度为1％(w/v)牛血清蛋白(BSA)，酶液450μL，与浓度为0.1mol/L，pH 7.0的1.5mL乙酸钠缓冲液混合，在37℃下保温5min。以0.5mL浓度为10％的三氯乙酸终止反应，在280nm处测定吸光值。
空白对照管：以蒸馏水代替酶液如上同样条件操作。
酶活公式：酶活(U/mL)＝(k×w)(/v×T)，其中K为酶液稀释倍数；W为生成的色氨酸量(μmol)；V为反应酶液体积(mL)；T为反应时间(min)。
实施例3植物乳杆菌LLH-2在堆肥中的应用
1、堆肥物料为鸡粪和锯末，分别取自青岛市平度的养鸡场和木材加工厂。
2、实验组设置：
(1)空白对照组：接种无菌水；
(2)CGMCC1.572处理组：接种植物乳杆菌CGMCC1.572；
(3)LLH-2处理组：接种植物乳杆菌LLH-2。
根据鸡粪与锯末的性质，将水分调节至60％左右，C/N比调节至25～30之间，充分混合均匀后，装入容积为4L的泡沫盒中。
堆肥接种前，先将植物乳杆菌发酵液((108-109cfu/ml))以物料湿重的5‰与玉米面按体积质量为1∶1的比例充分混匀，待堆体温度上升至40℃以上时接种至堆肥物料中。空白对照组以等量无菌水代替发酵液与玉米面混合加入。
将装有堆肥物料的泡沫盒置于室温18℃左右的实验室内进行腐熟。分别在每天上午10：30和下16：30对堆体内部进行温度测定，每个实验组各取3个点测定，并记录当时的环境温度，取1d中测定值的平均值作为当天温度值。结果见图1。
从图1可以看出，堆体温度经历了快速上升、维持，然后下降的过程。堆体温度在堆肥开始后第2天上升至40℃左右。接种植物乳杆菌后，LLH-2处理组在第3天进入高温期，温度高达70℃；CGMCC1.572处理组也在第3天进入高温期，但温度只有60℃；而空白对照组第3天时，堆体温度仅为54℃，第4天才进入高温期，堆体温度为57℃，显著低于植物乳杆菌处理组。
堆肥第7天，LLH-2处理组堆体温度维持在53℃，CGMCC1.572处理组堆体温度下降至47℃，而空白对照组堆体温度下降至44℃，均显著低于LLH-2处理组。LLH-2处理组堆体最高温度达到70℃，比CGMCC1.572处理组最高温度(60℃)高10℃，比空白对照组最高温度(57℃)高13℃；而且LLH-2处理组高温期持续时间比CGMCC1.572处理组多1天，比空白对照组多2天。
上述结果说明，堆肥中接种本发明提供的耐高温菌株植物乳杆菌LLH-2可以显著提高微生物的活性，迅速升高堆肥温度，且高温期持续时间更长，有利于杀灭堆肥中病原微生物，缩短堆肥时间，提高堆肥品质。因此，本发明提供的植物乳杆菌LLH-2可作为生物腐熟剂广泛应用于玉米皮、花生壳、蘑菇菌渣、畜禽粪便、作物秸秆、城市污泥、餐厨垃圾、食品加工和制药废渣等有机物料堆肥，效果显著。
实施例4植物乳杆菌LLH-2抑菌能力测定
1、对细菌的抑制能力测定
1)乳酸菌液制备：将植物乳杆菌LLH-2接种于100mL MRS液体培养基中，37℃静置培养48h；
2)致病菌菌液制备：分别将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌菌种接种于营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜；
3)抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5mL灭菌营养琼脂培养基(50℃左右)加100μL致病菌菌液(菌量106数量级)，混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的植物乳杆菌LLH-2菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。结果见表2。
表2植物乳杆菌LLH-2对致病菌的抑制作用
致病菌 大肠杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 李斯特菌
抑菌圈直径 28mm 25mm 27mm 28mm
由上表可以看出，本发明筛选出的植物乳杆菌LLH-2对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌均有很强的抑制作用，尤其对大肠杆菌和李斯特菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达到28mm。
2、对致病真菌的抑制能力测定
(1)培养致病真菌：
在无菌操作台中，分别接种花生根腐病菌、白绢病菌、疮痂病菌和褐斑病菌至PDA培养基中，28℃倒置培养3天。
(2)接种对峙菌：
待致病真菌长至约占培养皿1/3时，在距离真菌2cm处分别接种植物乳杆菌LLH-2，以未接种植物乳杆菌LLH-2的真菌作为对照，继续在37℃条件下培养3天后，分别测定各致病真菌的菌落半径，计算抑菌率。
抑菌率＝[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径)/对照真菌生长半径]×100％。
结果显示，植物乳杆菌LLH-2对上述四种花生致病真菌均有明显的拮抗作用。其中，LLH-2对花生根腐病菌和褐斑病的抑制作用最强，抑制率分别高达84.5％和80.7％；对花生白绢病菌和疮痂病的抑制作用相对较弱，抑制率分别为58.7％和60.8％。
实施例5植物乳杆菌LLH-2在花生病害防治中的应用
1、实验地点：
青岛平度后沙岭村的花生连作田，花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病发生严重。
2、实验设计：
随机设置实验区，每个实验区为6m×10m的长方形区域，且每个实验区之间保持3米以上的间隔。花生的行距为40cm，株距20cm。每个实验组设置三个平行实验区。
(1)空白对照组：清水；
(2)杀菌剂处理组：50％多菌灵800倍液；
(3)植物乳杆菌CGMCC1.572处理组：分别在播种期、播种后15d、30d、45d利用植物乳杆菌CGMCC1.572发酵液(108-109cfu/ml)灌根，每株每次浇稀释100倍发酵液约50mL；
(4)植物乳杆菌LLH-2处理组：分别在播种期、播种后15d、30d、45d利用植物乳杆菌LLH-2发酵液(108-109cfu/ml)灌根，每株每次浇稀释100倍发酵液约50mL。
其他田间管理同正常生产，75天后调查发病情况，结果如表3-6所示。
根腐病分级标准：
0级:茎基和主须根上均无病斑；
1级:茎基和主根上有少量病斑；
3级:茎基和主根上病斑较多,病斑面积占茎基和根总面积的1/4～1/2；
5级:茎基和主根上病斑多且大,病斑面积占茎基和根总面积的1/2～3/4；
7级:茎基和主根上病斑连片,形成绕茎现象,但根系并未死亡；
9级:根系坏死,植株地上部萎蔫或死亡。
白绢病分级标准：
0级：植株无症状；
1级：仅在茎基部产生病斑；
2级：茎基部产生缢缩症状,整株的三分之一以下表现***症状(枯萎、死亡、萎蔫等)；
3级：整株的三分之二以下表现***症状；
4级：整株的三分之二以上表现***症状。
疮痂病分级标准：
0级：健康植株
1级：在顶部嫩叶和果柄上出现小病斑
2级：在嫩叶、果柄、茎上出现小病斑
3级：嫩叶边缘向上卷曲，在花生茎和果柄上出现疮痂状
4级：果柄、茎严重弯曲，植株现灼烧状
褐斑病分级标准：
0级：无病害症状；
1级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/10以下；
2级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/4以下；
3级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以下；
4级：受害叶片面积占调查叶片面积的1/2以上，落叶。
病株率＝发病株数/总株数×100％
病情指数＝∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)
防治效率＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
表3花生根腐病防治效果比较
Figure BDA0002075221670000091
Figure BDA0002075221670000101
表4花生白绢病防治效果比较
Figure BDA0002075221670000102
表5花生疮痂病防治效果比较
Figure BDA0002075221670000103
表6花生褐斑病防治效果比较
Figure BDA0002075221670000104
从表3-6的大田实验数据可以看出，本发明提供的植物乳杆菌LLH-2对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病均有明显的防治效果，其中对根腐病和褐斑病的防治效率高达和83.0％和80.0％，对白绢病和疮痂病的防治效率超过55％，显著高于药剂处理组多菌灵的防治效果。而市售的植物乳杆菌CGMCC1.572对花生根腐病、白绢病、疮痂病和褐斑病虽然也具有一定的防治效果，但防治效率仅均低于10％，远低于本发明所述植物乳杆菌LLH-2。
上述结果表明，本发明提供的植物乳杆菌LLH-2对花生常见病害的防治效果要显著优于传统的化学杀菌剂，且对环境友好，有利于提升农作物的品质，可广泛应用于绿色农业生产中。
序列表
<110> 青岛力力惠生物科技股份有限公司
<120> 一种耐热植物乳杆菌及其在农业生产中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1253
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
aaagatggct tcggctatca cttctggatg gtcccgcggc gtattaggta gatggtgggg 60
taacggctca ccatggcaaa gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg 120
actgagacac ggcccaaact cctacggggg gcagcagtag ggaattttcc aaaatggacg 180
aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctttt 240
gttaaagaag aacatatctg agagtaaatt ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag 300
ccacggctaa ctacctgcca gcaggcgggg taattcgtag gtggcaaggg ttgtcaggat 360
ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag cctttggctc 420
aaccgaagaa gtgcatcgga aactgggaaa attgaatgca gaagaggaca gtggaactct 480
atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 540
ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta gataccctgg 600
tagtccatac cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 660
agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa 720
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac 780
cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc taagagatta gacgttccct tcggggacat 840
ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 900
caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg 960
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1020
ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa 1080
tctcttaaag ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa 1140
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1200
gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc caaagtcggt ggggtaacct tta 1253

Claims (4)

1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其特征在于，所述植物乳杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2019401。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在有机物料堆肥中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的有机物料包括蘑菇菌渣、玉米皮、花生壳、畜禽粪便、作物秸秆、城市污泥、餐厨垃圾、食品加工或制药废渣中的任意一种或多种的组合。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌在花生根腐病、花生白绢病、花生疮痂病、花生褐斑病防治中的应用。
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CN101974449B (zh) * 2010-09-13 2012-06-06 郑州大学 一株植物乳杆菌及其应用
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CN104403970B (zh) * 2014-11-27 2016-10-19 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种枯草芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用
CN104877986A (zh) * 2015-05-08 2015-09-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株植物乳杆菌的筛选及其应用

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