CN103289933B - 解淀粉芽孢杆菌植物亚种b-01及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及涉及微生物领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。所述的解淀粉芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌植物亚种B-01,它的保藏号为CCTCC:M2012191。该菌株可作为水环境生态净化剂，用于净化。本发明菌株能够在低温条件下保持较高的酶活力特性，能够在我国大多数环境温度较低地区发挥较好的生物学作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，BA）是目前农业部令（2008年1126号）酶制剂类饲料添加剂所允许使用的益生菌种类，但该菌在农业部令动物微生物饲料添加剂栏目中尚未列出。研究表明该菌作为益生菌可调控动物消化道微生态环境，抑制有害菌，改善机体代谢功能，目前国家保种中心提供的此类菌种适宜生长温度通常为28-35℃左右，在低温水体环境条件下，由于相关酶系活力较低，极大的抑制了益生菌类生物学功能的发挥，目前该菌类主要用于酶制剂的生产，在水质净化中尚未涉及。
发明内容
为了解决现有B-01解淀粉芽孢杆菌在低温下酶活性较低的问题，本发明从我国北方地区-35℃的寒冷环境中的稗草中分离、纯化、培育到一株低温高活性菌株并保种，与目前国家保种中心现存的相关菌种具有不同的生物学特性，有效地解决了现在技术存在的不足。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌株与中国工业微生物菌种保藏管理中心等国家保藏机构现存菌种来源及生物学特性不同，具有耐低温特性，18℃条件下生长良好。在中国工业微生物菌种保藏管理中心进行菌种分类鉴定，明确鉴定B-01为解淀粉芽孢杆菌植物亚种（Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum），由中国工业微生物菌种保藏管理中心进行了遗传稳定性试验，证明该菌株性状可稳定遗传。其保藏编号是CCTCC:M2012191
本发明所述B-01解淀粉芽孢杆菌植物亚种在水质净化中能够发挥较高的生物学活性。该菌在18℃偏低温条件下生长良好,该菌所分泌的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶均具有较高的酶活力，在富营养低水温环境中可将大分子有机物降解为小分子物质，一方面可反哺益生菌，另一方面可被水生动、植物直接利用，有助于水体环境的生态修复。该菌株作为水质净化剂，能够有效降解水体中的大分子有机物（蛋白质、糖类、脂肪），降低化学需氧量（COD）、氨氮、亚硝酸盐、，提高氧容量（DO）、改善pH、浊度、悬浮物含量等指标。
B-01解淀粉芽孢杆菌可作为新型水环境益生菌生态净化剂以及新型动物微生物饲料添加剂应用。
与现有的解淀粉芽孢杆菌相比，本发明菌株能够在低温条件下保持较高的酶活力特性，能够在我国大多数环境温度较低地区发挥较好的生物学作用。本发明菌株能够有效的降解环境水体中过度营养化的有机物质，将大分子有机物降解为水生动植物能够利用的小分子物质，变废为宝，作为水环境生态净化剂。这对于缓解当前日趋恶化的水资源环境，净化畜牧业养殖水体及生活河流环境的生态修复，营造绿色安全的生活、生产水环境，具有积极的社会学意义和经济学价值。此外，该菌株也可作为动物微生物饲料添加剂应用于畜牧养殖业，作为抗生素替代品应用，可为缓解抗生素滥用现状发挥重大作用。
附图说明
图1 培养条件的正交试验设计中不同条件细菌数随时间变化图。
图2 益生菌液体发酵活菌数随时间变化图。
图3 益生菌液体发酵pH随时间变化图。
图4 益生菌液体发酵脱氢酶活力随时间变化图。
图5 是本发明解淀粉芽孢杆菌植物亚种B-01菌株场发射扫描电镜照片。2万倍S4800场发射扫描电镜照片，细菌长0.8-3um，宽0.6um。
图6 是本发明解淀粉芽孢杆菌植物亚种B-01菌株油镜下照片
注：NA培养基，37℃，培养1天，菌体形态：杆状，0.5μm×2.0～2.67μm，单个、成对或栅栏状排列，革兰氏阳性。
图7 是本发明解淀粉芽孢杆菌植物亚种B-01菌株琼脂培养菌落照片
注：NA培养基，37℃，培养1天，菌落形态：乳白色，不规则形，表面皱褶、粗糙，半透明，边缘不整齐。
图8 18℃淀粉酶（AMS）活力随时间变化图。
图9 18℃脂肪酶（LPS）活力随时间变化图。
图10 18℃蛋白酶活力随时间变化图。
图11 18℃细菌数随时间变化图。
图12 实验室益生菌水质净化效果图（实验前）
注：未加益生菌的富营养水对照瓶。
图13 实验室益生菌水质净化效果图（实验后）
注：加入2%B-01解淀粉芽孢杆菌的富营养水试验瓶。
图14 大量水池污水（210m3）益生菌水质净化（实验前）。
图15 大量水池污水（210m3）益生菌水质净化（实验后）。
图16 B-01菌株与相关种的16SrDNA序列***发育树。
图17 B-01与相关种的gyrA基因序列***发育树。
图18 B-01菌株（第1批）与相关种的gyrA基因序列***发育树。
图19B-01菌株（第1批连续传代5次后菌株）与相关种的gyrA基因序列***发育树。
本发明解淀粉芽孢杆菌植物亚种B-01(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum B-01),于2012年5月30日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，它的保藏号为CCTCC NO:M2012191。
具体实施方式
实施例一菌株的筛选
1.1菌株的分离，筛选，纯化过程
选取我国北方地区-35℃的寒冷环境中的稗草、麻草、羊草各1克接种于生理盐水中浸泡2h，取2mL浸泡液接种于100mL刺激芽孢生长培养液（蛋白胨10g，酵母膏3g，淀粉3g，MgSO40.1g，KH2PO41.5g，Na2HPO42g蒸馏水1000mL，pH7.8，121℃灭菌20min）18℃培养至有白色菌丝长出。
取菌悬液于80℃水浴15min（杀死不产芽孢菌体），选取菌悬液10倍稀释平板涂布于芽孢分离培养基（蛋白胨5g，葡萄糖5g，酵母膏5g，K2HPO44g，3.08%MnSO41mL，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH自然）18℃培养至有单个菌落长出。
挑选低温条件下生长状态良好的菌落，染色观察，菌落低温纯化培养，命名为B-01。
2.1营养底物正交设计试验
以保证最佳培养条件进行培育。采用活菌数作为培养状态的评定指标。
正交设计见表1：接种B-01菌液量为30%+70%培养液(重量百分比)
表1正交试验设计方案
按照能量、蛋白质和矿物质的不同含量，应用金牧软件设计出配方如表2：
表2正交试验方案（9种优化处理）
按照表设计的营养标准配方，应用金牧软件设计出原料配方如表：
表3.9组原料营养配方
注：上述9组配方中均按表4添加小料
表4添加小料配方
| 各配方组均添加小料： | MgSO4 | MnSO4 | K2HPO4 | 合计 |
| 重量百分比（%） | 0.15 | 0.01 | 0.11 | 0.27 |
正交设计不同影响因素间的比较，各试验组合菌落数见表5。
表5正交试验设计测定结果
表6正交试验设计单因素统计
从表6直观分析，各因素水平的优劣顺序是：A1>A2>A3，B1>B2>B3，C2>C3>C1。
表7正交试验设计方差分析结果
| 方差来源 | 离均差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 |
| 能量（A） | 353.018 | 2 | 176.509 | 45.808 | 0.021 |
| 粗蛋白(B) | 995.704 | 2 | 497.852 | 129.205 | 0.008 |
| 矿物质（C） | 23.341 | 2 | 11.670 | 3.029 | 0.248 |
| 误差 | 7.706 | 2 | 3.853 | ||
| 总变异 | 1379.769 | 8 |
从表7的方差分析结果可见，粗蛋白（B）对菌落数有极显著性影响（P＜0.001）；能量（A）对菌落数有显著性影响（P＜0.005）；矿物质对菌落数影响较小，差异不显著，各营养因素主次顺序为B>A>C,选定细菌培养的最佳营养底物为A1B1C2，即，能量2.0MC/kg，蛋白15%，矿物质3.5%（CaHPO43%、NaCl0.5%）
结合正交试验结果,利用金牧软件（VF123-2006版）设计出营养底物配方如表8：
表8营养底物最佳配方
| 名称 | 麸皮 | 豆粕 | 玉米 | 稻壳 | CaHPO4 | NaCl | 小料 |
| 重量百分比（%） | 29.8 | 15.18 | 35.8 | 15.45 | 3.0 | 0.5 | 0.27 |
2.2培养条件正交试验
表9正交试验设计方案
按表9进行4因素3水平正交设计试验，每3h测定细菌的活菌数，共计48h。培养条件的正交试验设计中不同条件细菌数随时间变化图见图1.不同条件菌落数随时间变化可知24h左右为细菌数增长峰值点，因此以24h活菌数作为衡量标准。
表10正交试验设计方差分析结果
| 方差来源 | 离均差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 |
| pH(A) | 3513.849 | 2 | 1756.924 | 184.608 | .000 |
| 温度(B) | 721.529 | 2 | 360.764 | 37.907 | .000 |
| 接种量(C) | 4386.596 | 2 | 2193.298 | 230.460 | .000 |
| 底物(D) | 264.427 | 2 | 132.213 | 13.892 | .000 |
| 误差 | 171.307 | 18 | 9.517. | ||
| 总变异 | 9057.707 | 26 |
正交试验设计方差分析结果见表10，从表10的方差分析结果可见，ABCD各因素均对活菌数有极其显著性影响（P<0.001），各因素主次顺序为C>A>B>D,选定细菌培养的最佳营养底物为A2B2C3D2。
得出B-01的最佳培养条件：pH7.2、温度35℃、接种量15%、底物浓度10%。
2.3B-01解淀粉芽孢杆菌菌株液体发酵代谢规律的动态性研究
选择B-01菌株的上述最适培育条件，发酵容量为30L，每3h动态测定活菌数，pH值和脱氢酶总活力，共24h，重复4次。如图2.B-01解淀粉芽孢杆菌菌株液体发酵菌落数随时间变化图所示，第1批、第2批、第3批、第4批菌落数分别由8×108cfu/mL扩繁到141×108cfu/mL，由13×108cfu/mL扩繁到149×108cfu/mL，由16×108cfu/mL扩繁到168×108cfu/mL，由17×108cfu/mL扩繁到162×108cfu/mL。与发酵0h相比，6-24h菌落数较高，差异极显著（P<0.01）；与发酵3h、6h和9h相比，12-24h菌落数较高，差异极显著（P<0.01）；与发酵12h、15h相比，18-24h菌落数较高，差异极显著（P<0.01）；与发酵18h相比，24h菌落数较高，差异极显著（P<0.01）。菌落数随着菌液不断培养呈上升趋势，益生菌群活性增强；如图3.B-01解淀粉芽孢杆菌菌株液体发酵pH数随时间变化图所示，第1批、第2批、第3批、第4批pH分别由6.76降到6.2，由6.62降到6.01，由6.78降到5.94，由6.76降到5.99。与发酵0h、3h相比，6-24h pH降低，差异极显著（P<0.01）；与发酵6h相比，18-24hpH降低，差异极显著（P<0.01）；发酵9h-21h相比，24h pH降低，差异极显著（P<0.01）。pH值随时间变化而不断降低，表明细菌在不断发酵增殖；如图4，B-01解淀粉芽孢杆菌菌株液体发酵TDHA随时间变化图所示，第1批、第2批、第3批、第4批TDHA分别由0.005提高到0.694，由0.010提高到0.896，由0.023提高到1.003，由0.029提高到0.997。与发酵0h、3h相比，12-24h TDHA较高，差异极显著（P<0.01）；与发酵6-12h相比，18-24h TDHA较高，差异极显著（P<0.01）；与发酵15-21h相比，24h TDHA较高，差异极显著（P<0.01）。24h发酵周期中，TDHA随着发酵进程呈逐渐增加趋势，表明益生菌群的菌酶活力逐渐增强。
3、低温型高活性B-01解淀粉芽孢杆菌形态学研究
上述筛选所得菌株B-01在2万倍S4800场发射扫描电镜照片如图5，细菌长0.8-3um，宽0.6um。
将菌株B-01在NA培养基，37℃，培养1天，然后油镜下观察，照片如图6，可见菌体形态：杆状，0.5μm×2.0～2.67μm，单个、成对或栅栏状排列，革兰氏阳性。
将菌株B-01在NA培养基，37℃，培养1天，菌落形态：乳白色，不规则形，表面皱褶、粗糙，半透明，边缘不整齐（图7）。
实施例二菌株的鉴定
菌株B-01送中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）进行微生物鉴定分析。
1.BA菌株与相与相关种的16S rDNA序列***发育树
采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示B-01与相关种的16S rDNA***发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，（E.,Escherichia）。
由图16.菌株B-01的16S rDNA***发育树分析表明：菌株B-01与枯草芽孢杆菌群(Bacillus subtilis group)内多个种聚在一个***发育分支，序列同源性为99.2%以上。
B-01菌株DNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.B-01与相关种的gyrA基因序列***发育树
采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示B-01与相关种的gyrA基因***发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值。
由图17.B-01解淀粉芽孢杆菌菌株与相关种的pheS基因序列***发育树***发育分析表明：菌株B-01与解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)聚在一个***发育分支，序列同源性为98.7%。该菌株能利用聚糖产酸，芽孢中生，这一特点与解淀粉芽孢杆菌一致。
通过16S rDNA序列和gyrA基因序列***发育分析，菌株B-01被鉴定为：解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)。3.B-01解淀粉芽孢杆菌菌种遗传稳定性分析
菌株解淀粉芽孢杆菌B-01送中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）进行微生物菌种遗传稳定性分析。菌株解淀粉芽孢杆菌B-01(1批)经连续传代培养，菌株形态学特征未发现可见变化，gyrA基因序列无变化，生理生化特征无明显变化，菌株性状可稳定遗传。
3.1B-01菌株生理生化特征（见表11）
表11B-01菌株生理生化特征
符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性；“+w”，弱阳性；ND，未测。
3.2序列分析
序列比对：解淀粉芽孢杆菌B-01(1批)
98.4%Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42T(CP000560)
95.1%Bacillus amyloliquefaciens supsp.amyloliquefaciens KCTC1660T(AF272015)
83.6%Bacillus mojavensis NRRL B-14698T(EU138598)
83.4%Bacillus subtilis subsp.inaquosorum NRRL B-23052T(EU138605)
83.0%Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B-23049T(AF272020)
82.6%Bacillus subtilis subsp.subtilis KCTC3135T(AF272021)
82.4%Bacillus tequilensis NRRL B-41771T(EU138625)
82.3%Bacillus atrophaeus KCTC3701T(AF272016)
82.2%Bacillus vallismortis NRRL B-14890T(AF272025)
80.3%Bacillus sonorensis NRRL B-23154T(EU138611)
菌株解淀粉芽孢杆菌B-01(1批)与相关种的gyrA基因序列***发育树（图18B-01解淀粉芽孢杆菌菌株(1批)与相关种的gyrA基因序列***发育树）
鉴定结论：解淀粉芽孢杆菌植物亚种B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum
序列比对：解淀粉芽孢杆菌B-01(1批连续传代5次后菌株)
98.4%Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42T(CP000560)
95.1%Bacillus amyloliquefaciens supsp.amyloliquefaciens KCTC1660T(AF272015)
83.6%Bacillus mojavensis NRRL B-14698T(EU138598)
83.4%Bacillus subtilis subsp.inaquosorum NRRL B-23052T(EU138605)
83.0%Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B-23049T(AF272020)
82.6%Bacillus subtilis subsp.subtilis KCTC3135T(AF272021)
82.4%Bacillus tequilensis NRRL B-41771T(EU138625)
82.3%Bacillus atrophaeus KCTC3701T(AF272016)
82.2%Bacillus vallismortis NRRL B-14890T(AF272025)
80.3%Bacillus sonorensis NRRL B-23154T(EU138611)
菌株解淀粉芽孢杆菌B-01(1批连续传代5次后菌株)与相关种的gyrA基因序列***发育树（见图19B-01解淀粉芽孢杆菌菌株(1批连续传代5次后菌株)与相关种的gyrA基因序列***发育树）
鉴定结论：解淀粉芽孢杆菌植物亚种B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum。
实施例三低温型高活性B-01解淀粉芽孢杆菌菌株酶活性动态研究及细菌动态计数
相关菌系酶活性测定均控制在18℃培养条件下进行，每份样品发酵容量为200Ml，3份平行重复样。目前市场应用产品菌类酶活性测定，因为低温条件下酶活力较差，通常测定采用淀粉酶活力60℃、脂肪酶40℃、蛋白酶40-55℃等高温条件，低温型益生菌产品在实际环境温度较低的水质净化过程中将显现独特的优势，能保持较高的生物学活性，因此具有很好的市场应用前景。
18℃进行酶活力测定（用南京建成生物工程研究所提供的脂肪酶、淀粉酶测定试剂盒，用GB/T1803-1993方法测定蛋白酶活力）
淀粉酶活力单位定义：100ml酶液中的AMS，在18℃与底物作用30分钟，水解10mg淀粉为1个单位
淀粉酶AMSu/dl=（空白管吸光度-测定管吸光度）/空白管吸光度*(0.4*0.5/10)*(30分钟/7.5分钟)*（1/0.05）*样本测试前稀释倍数
=（空白管吸光度-测定管吸光度）/空白管吸光度*0.16
脂肪酶活力单位定义：18℃条件下，每豪升酶液在本反应体系中与底物反应1分钟，每消耗1umol底物为一个酶活力单位。
LPS活力=(A1-A2)/As*标准管浓度（umol/l）*样本在反应体系中的稀释倍数*反应时间（10分钟）
蛋白酶活力定义：1ml液体酶在18℃，PH7.3条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/ml）
蛋白酶活力=A*K*4/10*n
1.B-01菌的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶酶活力动态变化规律研究
由图8.B-01解淀粉芽孢杆菌菌株淀粉酶活力随时间变化图所示，18℃淀粉酶（AMS）活力随时间变化图可知，淀粉酶活力一直在上升，淀粉酶活力分别在44h和62h有大幅的增长，62h-74h维持在较高水平，最高淀粉酶活力为11.532u/dl。
由图9.B-01解淀粉芽孢杆菌菌株脂肪酶活力随时间变化图所示，18℃脂肪酶（LPS）活力随时间变化图可知，在44h时脂肪酶活力大幅上升，直到56h时达到最高值为1.56411u/l，随后脂肪酶活力又有所下降。
由图10.B-01解淀粉芽孢杆菌菌株蛋白酶活力随时间变化图所示，18℃蛋白酶活力随时间变化图可知，蛋白酶活力随时间变化而不断升高，直到62h-74h时维持在较高水平，其中在62h时达到最高值为8.836u/mL。
2.B-01菌在低温培养条件下菌落数随时间动态变化规律研究（图11.B-01解淀粉芽孢杆菌菌株低温条件下菌落数随时间变化图）
20h后测定低温条件下菌落数，如图11所示，20h-44h细菌生长较缓慢，44h-68h菌体生长旺盛，68h时达到最高菌落数81×108cfu/mL，随后含菌量有所降低。
实施例四B-01解淀粉芽孢杆菌水质净化特性的研究
1.实验室益生菌水质净化
在实验室条件下，采用特制的富营养水（配方：猪肉糜50g+麸皮粉50g+豆粕粉50g+玉米粉50g+水1L，经100℃煮沸1h后，取滤液并加水至10L定容），按每100mL营养水加入本发明B-01解淀粉芽孢杆菌菌液2mL（活菌数：100亿/mL）混匀，静置观察20天时的水质表观变化如图12、13。
未加益生菌的富营养水对照瓶水体浑浊并散发臭味，加入2%B-01解淀粉芽孢杆菌的富营养水试验瓶水体清澈透亮，无异味。
2.大量水池污水（210m3）益生菌水质净化20天前后对比
在污水池中泼洒1吨菌液（0.48%菌液）至水面，观察净水效果并测定20天前后相对照的各项水质指标，见表12。水质表观变化如图14、15.
各项水质测定指标均采用国标测定方法：
1.化学需氧量（COD）采用高锰酸钾法GB/T15456-2008,
2.氧容量（DO）采用碘量法GB7489-87
3.氨氮奈氏试剂分光光度法GB7479-87
4.亚硝酸盐分光光度法GBT7493-87
5.pH用pH计测定
表12采用B-01解淀粉芽孢杆菌净化水质前后相关水质指标变化
| 水质净化指标 | 净化前水体 | 净化后水体 |
| 化学需氧量（COD） | 11.4mg/L | 5.8mg/L |
| 氧容量（DO） | 1.72mg/L | 6.8mg/L |
| :氨氮 | 2.7mg/L | 1.83mg/L |
| 亚硝酸盐 | 0.047mg/L | 0.023mg/L |
| pH | 6.4 | 7.2 |
注：净化前水体浑浊并散发臭味净化后水质清澈，无异味。
Claims (3)
1.解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B-01菌株,它的保藏号为CCTCC NO:M2012191。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种B-01菌株作为水环境生态净化剂的应用。
3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种B-01菌株作为动物微生物饲料添加剂的应用。
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