CN101010093A - 一种提高白头翁抗癌效果的方法及该方法制备的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种通过酶反应和提取白头翁而富含具有非常强抗肿瘤活性的3－O－[O－α－L－鼠李糖吡喃基－(1→2)－[O－β－D－葡糖吡喃基－(1→4)]－α－L－***糖吡喃基]常春藤皂苷(编号SB 365)的组合物。

Description

一种提高白头翁抗癌效果的方法及该方法制备的组合物
技术领域
本发明是关于一种提高白头翁抗癌效果的方法及该方法制备的组合物。
背景技术
白头翁(Pulsatillae Radix)是属于毛莨科的朝鲜白头翁(Pulsatillakoreana)的干燥根(K.W.Bae，A Illustrated Pictorial Book of Korean Flora)。白头翁作为中药用于净化血液、收敛、止血、止泻等。据报道，白头翁的提取物对阿米巴痢疾和毛滴虫具有抗菌作用。白头翁的皂角苷据报道也有抗癌作用。
干白头翁具有约9％的皂角苷。迄今为止分离的皂角苷为原白头翁素、白头翁素、毛茛苷、常春藤皂苷、桦木酸和齐墩果酸衍生物及其糖苷。对白头翁皂角苷作用的研究开展得并不多。其中报道说原白头翁素具有线粒体毒性(mitotoxicity)(Vonderbank，F.，Pharmazie，5，210，1950)。据报道，毛莨苷对KB细胞具有细胞毒性，毛茛苷细胞毒性的机理是抑制DNA-聚合酶。
本发明的发明人已经从白头翁中分离出了抑制形成新血管和癌细胞增长的物质(韩国专利第315200号；Y.Kim，Planta med.)。从白头翁的水提取物中分离出了具有抗癌作用的皂角苷，该皂角苷被命名为编号为SB365。这种物质对BDF1鼠的LL/2癌症具有80％的强抑制作用(Y.Kim等人，Comparison of the antitumor activity of SB31-Injection(Trade name)with thoseof some clinically used antitumor agents.Archives of Pharmacal Research.2004.1.；Korean Patent Appln No.2002-0043016)。本发明的发明人从白头翁中分离出了共计16种皂角苷，并评价丁每种皂角苷连同复方的抗癌活性(KoreanPatent Appln No.2002-0043016)。
发明内容
多方面专利说明书描述了含有白头翁提取物或白头翁抗肿瘤成分的抗肿瘤组合物。例如，韩国专利72982(专利公开号1994-234)公开了一种含有白头翁提取物作为抗肿瘤活性的活性成分的药物组合物。此外，本发明的发明人在其发明的韩国专利申请2002-0043016(申请公开号2004-9172)中公开了白头翁中具有抗肿瘤活性的活性成分为3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷(编号SB 365)，是一种白头翁皂角苷D，并公开了含有SB 365作为活性成分的抗肿瘤组合物。与阿霉素(adriamicine)相比，SB 365对NCI-H23细胞系具有更强的活性。
Figure A20058002591300041
然而，白头翁中3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷(SB 365)的含量非常低，并且大部分白头翁皂角苷D以3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷28-O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→4)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→6)]-β-D-葡糖吡喃酯(编号为SB 365-O)的形式存在(Viqar U.A.Spectroscopic data of saponins press：CRC，2000；Vol.3.pp.2520；Kang，S.S.，Saponins from the root of Pulsatilla korean(Arch.Pharm.Res.12(1)，42-47，1989)。SB 365-O这种物质是其中3个单糖在SB 365糖苷配基的17-位与羧基键链的酯。SB 365-O的结构式如下：
Figure A20058002591300051
SB 365-O没有抗肿瘤活性。在白头翁的常规提取条件下，白头翁以几乎没有抗肿瘤活性的SB 365的酯形式(SB 365-O)被提取。事实上，文献中公开了一种首先以SB 365-O提取然后水解成SB 365的方法，但是该方法不经济。虽然普通的溶剂提取物可用酸或碱水解得到SB 365，但是这种方法也不经济，而且在酸性或碱性条件下，白头翁的另一种成分会发生化学反应。本发明的发明人进行了长期的研究，并最终完成了本发明。
本发明的发明人进行了长期的研究并发现这样的事实：白头翁具有用于断裂酯键的酶，并且在白头翁发生酶反应情况下，SB 365-O酯被水解形成SB 365，最终大幅度提高白头翁提取物的抗肿瘤活性。所述酶水解SB 365-O的反应方程式如下。
Figure A20058002591300061
因此，本发明的目的是提供提高白头翁抗肿瘤活性的方法，该方法包括a)将白头翁中的大部分SB 365-O酶促转化成抗肿瘤成分SB 365，和b)对大部分SB 365-O已经转化成SB 365的白头翁进行提取。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物通过下述步骤制备：a)将白头翁中的大部分SB 365-O酶促转化成抗肿瘤成分SB 365，和b)对大部分SB 365-O已经转化成SB 365的白头翁进行提取，所述白头翁提取物富含SB 365。
本发明的再一个目的是提供一种药物组合物，该组合物含有富含SB 365的白头翁提取物作为活性成分以及选自由人参提取物、甘草提取物和木通果皮提取物组成的组中的辅助成分。
附图说明
图1示出了SB 365含量随溶剂比(甲醇∶水)变化的曲线图；
图2示出了水体积和温度对形成SB 365影响的曲线图；
图3示出了SB 365含量随温度变化的曲线图；
图4示出了SB 365含量随酶反应时间变化的曲线图；和
图5示出了SB 365形成和SB 365-O减少随时间的变化趋势曲线图。
具体实施方式
根据水的体积、酶反应时间和温度建立SB 365-O至SB 365的最佳转化条件。此外，在建立最佳条件之前，通过分析3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷(SB 365；白头翁皂角苷D)及其底物(substrate)3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷28-O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→4)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→6)]-β-D-葡糖吡喃酯(编号SB 365-O)(Viqar U.A.Spectroscopic data of saponins press：CRC，2000；Vol.3.pp.2520；Kang，S.S.，Saponins from the root of Pulsatilla korean(Arch.Pharm.Res.12(1)，42-47，1989)的含量，建立底物(SB 365-O)与SB 365之间的化学关系。通过使用由白头翁本身提供的反应介质和机理获取SB 365是本发明的重要特征。
酶反应的对象是作为活性成分的白头翁(SB 31：Trade name of apharmaceutical composition comprising extract of Pulsatillae radix，韩国专利72982，US 6071521)和作为辅助成分的人参(Ginseng radix)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、木通果皮和榆木皮(ulmi cortex)。
a.从白头翁中获取富含SB 365的提取物的条件
具有糖苷(glycoside)的植物具有酶，也即水解这种糖苷的糖苷酶。为了在提取糖苷过程中保持糖苷的原始结构，使酶失活是很重要的。在通过使用普通有机溶剂的萃取条件下，酶会失活且不影响糖苷。通过对比，在本发明中，我们试图通过转化在白头翁中大量存在且几乎没有抗肿瘤活性的底物SB 365-O，通过酶将SB 365-O转化成SB 365以获得比天然状态更高含量的SB 365。本发明是韩国专利申请10-203-0008090的改进发明。
实验实施例1：白头翁在甲醇/水混合溶剂中的酶反应
一般地，在有机溶剂存在下酶作用很困难。在水存在下可能发生酶反应。为了观察白头翁酶反应的效果，研究有机溶剂提取和水提取之间的区别是很重要的。将白头翁粉末在甲醇浓度不同的水中酶反应一定时间，然后将酶反应后的白头翁提取3次以获得提取物。比较高效液相色谱(HPLC)中对应SB365的面积百分比，结果分别如表1和图1所示。
从表1和图1可以确定，与经过酶反应并仅用水提取的提取物相比，经过酶反应并用甲醇与水的混合溶剂提取后的提取物具有非常低含量的SB365。结果表明，经过酶反应且用纯甲醇和20％甲醇水溶液提取的提取物在SB 365含量方面没有区别，这意味着在纯水中酶将白头翁中的SB 365-O水解成SB 365，并且将SB 365-O水解成SB 365的酶对甲醇非常敏感，即使在少量甲醇存在下，酶也失活。事实上，在酶反应和用水提取白头翁情况下获得的提取物与酶反应并用纯甲醇或甲醇水性溶液提取白头翁获得的提取物相比，SB 365的含量高18-44倍。因此，为了获得最大SB 365含量，白头翁应当酶反应并用纯水提取。
表1不同溶剂比下SB 365的HPLC峰面积
  甲醇∶水   100∶0   80∶20   60∶40   50∶50   40∶60   20∶80   0∶100
  第一第二第三   905412664-   8728-8012   1432912495-   10837113658224   -1104515071   603066243793   263147276242191076
  平均   10859   8370   13412   10142   13058   5482   243488
  ％比   4.1％   3.4％   5.3％   4.1％   5.3％   2.2％   100％
*％比：水用作溶剂的峰面积为100时的HPLC峰面积百分比
实验实施例2：SB 365的形成与水体积之间的关系
如上述所证实的，白头翁酶反应中水的存在是很重要的因素。我们试图定量研究该因素。首先，通过固定酶反应温度为40℃且酶反应时间为1小时，我们观察白头翁中SB 365的形成和水体积的关系。结果如表2和图2所示。从表2和图2可以确认，当加入相对白头翁重量2倍重量的水时，SB 365的形成非常好。结果发现，白头翁与水的重量比1∶2为最佳条件，因为酶和SB 365前驱体-SB 365-O的浓度、盐水、pH和反应条件等与白头翁细胞的自然状态非常接近。2毫升水对1克白头翁的比例是混合和处理的水的最小体积。2-20倍体积的水对1克白头翁、优选将2-10倍体积的水加入到白头翁中，并在搅拌条件下使所得混合物进行酶反应。为了防止水蒸发，酶反应优选在相对湿度为70-90％的仓(chamber)内进行。
如表2和图2所证实的，SB 365的形成随水含量的增加而趋于下降。在每克白头翁2-5毫升水的情况下，形成的SB 365的含量为24.9-23.4毫克/克，并且从6毫升水开始，形成的SB 365的含量下降。这个趋势看起来像是酶活性降低，可能是由于反应混合物中反应介质的稀释。在白头翁的发酵过程中，水体积至10倍范围时，SB 365的形成似乎也基本没有变化。在水体积为20倍情况下，SB 365的形成急剧下降，该数据在表2和图2中没有显示出来。每1克白头翁中SB 365的含量比用公知方法(韩国专利72982和美国专利US 6071521)高得多。
表2 SB 365含量随水含量的变化
  水的体积     保留时间(分钟)     峰面积(AT)     SB 365的含量/1克白头翁
  2毫升3毫升4毫升5毫升6毫升7毫升8毫升9毫升10毫升     30.58729.45330.26029.22729.14730.68030.65330.57329.480     400822239243523821539376868233830353299998324744131317463270866     24.97毫克24.45毫克23.81毫克23.48毫克21.08毫克20.56毫克20.23毫克19.51毫克20.38毫克
*As(SB 365标准溶液的峰面积)：481425
实验实施例3酶反应温度和SB 365的形成之间的关系
在该实验中，使用白头翁的各种原料的混合物。在实验实施例2中，固定水的最佳体积，并从初步温度标(preliminary temperature scale)固定反应温度的范围。通过以1℃为酶反应温度区分(dividing)单位，进行酶反应并测量酶反应介质中SB 365的含量。结果如表3和图3所示。从表3和图3可以看出，由于从40℃开始SB 365的形成快速增长，因此实验从37℃开始。SB 365的含量随温度升高而逐渐升高并在40℃时达到最大含量15.44毫克/克。在温度超过40℃情况下，SB 365的形成逐渐降低。然而，14.6毫克/克的SB 365大含量甚至是在42℃形成的。因此，本发明中实际的可实施温度范围为38-42℃。
表3 SB 365含量随温度的变化
  酶反应温度(℃)   保留时间(分钟)   峰面积(AT)   SB 365的含量   SB 365的平均含量(毫克)
37   26.7226.7126.91   3648.0423561.7593695.118   13.3613.0413.53 13.31
38   25.9126.6327.27   3865.1153772.5913846.004   14.1513.8114.08 14.01
39   26.5126.3626.58   3895.7524016.3543962.139   14.2714.7114.51 14.49
40   25.6225.8125.61   4236.3094183.8894232.389   15.5115.3215.51 15.44
41   26.3426.1830.59   4093.2634163.3464106.118   14.9915.2515.04 15.09
42   29.4929.0729.35   3912.6633963.8944144.249   14.3314.5215.18 14.67
43   29.1328.8928.39   3805.3413782.2853815.679   14.0013.8513.97 13.94
*As(标准SB 365溶液的峰面积)：272.98
实验实施例4 SB 365的形成随酶反应时间的变化
使用与实验实施例3相同的原料。固定水的体积和酶反应温度，为获得SB 365的最大含量，我们试图发现最佳酶反应时间。结果如表4和图4所示。从表4和图4可以看出，在20分钟内形成9.1毫克SB 365、90分钟内16.3毫克、180分钟内20.1毫克，240分钟内19.2毫克。因此，酶反应的时间为20分钟至12小时，优选90-240分钟，最优选约180分钟。总之，最佳酶反应时间为180分钟。可实施的最佳酶反应时间的实际范围为90-240分钟。之后SB 365的含量趋于下降，这意味着之后SB 365被破坏或者酶失活了。
表4 SB 365含量随酶反应时间的变化
  酶反应温度(℃)   保留时间(分钟)     峰面积(AT)   SB 365的含量(毫克)
  020406090120180240   25.61326.87727.00028.46327.00328.87228.85228.165     370.7954997.5736365.0207370.5218905.5439977.75770977.24010489.101   0.6979.15311.65813.49916.31118.27520.10919.211
*As(标准SB 365溶液的峰面积)：272.98
实验结果
1.基于上述实验的白头翁酶反应的结论
在一定量白头翁粉末的酶处理中，2倍体积的水是最合适的。但是，在将水体积增加到4-10倍的情况下，可以形成相当大量的SB 365。虽然最佳温度为40℃，在38-42℃温度范围内仍可形成经济上有意义的量的SB 365。当使用2倍体积水并使白头翁在30℃下酶反应3小时时，实验实施例中获得的SB 365的产量为20.1毫克/克-24.5毫克/克。该产量为韩国专利722982和美国专利US 6071521(发明名称：一种新型的具有抗癌活性的药物组合物)中产量的3-5倍。在本发明中，将经过酶反应和提取的白头翁的提取物称为“Pu-ex”。
2.形成的SB 365的化学性质
由于形成的SB 365的体积与酶反应的温度和时间成比例并与水的体积成反比，因此SB 365的形成一定是涉及水解酶的化学反应。为了明确地研究该酶反应，本发明的发明人分离出了看起来象SB 365的前驱体的纯的SB365-O。根据实验实施例1，在乙腈∶水＝36∶64的溶剂条件下，SB 365分离得很好，显示保留时间(RT)为29-30分钟。此外，在实验实施例1的HPLC条件下，当溶剂条件为乙腈∶水＝25∶75时，SB 365-O的峰分离得很好，保留时间为15-16分钟。
将SB 365和SB 365-O的保留时间固定后，将2克水加入到1克白头翁中，并在39℃下观察SB 365的形成和SB 365-O的减少随时间的变化。结果如表5和图5所示。从图5可以看出，SB 365的形成和SB 365-O的减少成反比，并且可以看出，SB 365-O一定是SB 365的底物。可以看出，反应速率的初始速度非常快，随后随着时间的推移，反应速率稳定。反应被认为是典型的酶反应。
3.从上述实验结果可以看出，在1克白头翁对2-20倍体积水、37-43℃和20-360分钟下，酶反应是可能的
表5 SB 365和SB 365-O峰面积随时间的变化
时间(分钟)             SB 365             SB 365-O
  保留时间(分钟)    峰面积(At1)   保留时间(分钟)    峰面积(At2)
    0204060180   28.18729.61330.38730.25330.627    933062615161375100341946535254626   15.61315.70716.37316.01315.267    268576212975207987336404498499
*HPLC分析中的溶剂条件：SB 365(乙腈∶水＝36∶64)，SB 365-O(乙腈∶水＝25∶75)
b.从酶反应的白头翁中获得的溶剂提取物
将甲醇加入到酶反应的白头翁糊状物中，以制备30-90％甲醇溶液。将所得混合物搅拌并离心分离以得到溶液。残渣用30-90％甲醇溶液提取2次以上。将合并后的30-90％甲醇提取物干燥至对1克最初的白头翁含20-50倍体积的99％或者以上的纯甲醇。将混合物搅拌并静置。将沉淀出的碳水化合物和聚合物过滤出，蒸馏甲醇溶液，得到甲醇残留物。甲醇残留物(甲醇提取物)的产量为1克白头翁平均580毫克。使用甲醇提取物本身或者使用甲醇提取物与辅助成分的组合作为抗肿瘤剂。
在使用相同百分比乙醇、异丙醇或丁醇的情况下，所得提取物分别为478毫克、501毫克和411毫克。使用高极性的甲醇得到的提取物的产量最高。
除了用于抗肿瘤剂的主要成分Pu-ex，引入选自由人参提取物、甘草提取物、木通果皮提取物和榆木皮提取物组成的组中的一种或多种作为辅助成分，以获得更高的抗肿瘤活性。
人参具有抗紧张(anti-stress)活性、抗糖尿病活性和多种药理活性。虽然人参因为抗肿瘤活性用作功能食物，但其抗肿瘤活性非常弱，不能用作药物制剂(pharmaceutical agent)。据报道，人参中所含的丁二炔衍生物具有强的细胞毒性活性，但没有关于丁二炔衍生物抗肿瘤活性研究的报道。
甘草用于保护肾和肝、解毒、镇痛和抗炎。虽然关于甘草对肝的保护进行了各种研究，但没有进行关于抗肿瘤活性的研究。由于甘草具有低毒性和解毒功效，我们决定将甘草提取物加入本发明的组合物中。
木通果皮是木通(Akebia quinata)的果实，对腰痛、肋间痛(intercostalpain)、胃痛、尿道结石(urethrolithiasis)、***和腹泻具有一定的功效。由于木通果皮具有例如常春藤皂苷的皂角苷和齐墩果酸，因此，木通果皮对白头翁的抗肿瘤活性表现协同作用是可能的。
榆木皮是榆木种的皮和根，用于利尿和浮肿。在最近的文献中报道，榆木皮能够预防全身和局部过敏(Him，H.M.，Shin H.Y.，Choi，I.Y.，Lee E.H.andLee E.J.，Action of Ulmi radicis cortex extract on systemic and local anaphylaxison rats.Gen.Pharmacol.，31，483-488(1998))。该文献报道榆木皮没有毒性作用。
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例1
分别准确称取1克白头翁粉，并分别放入9个离心管中。以1毫升为单位，将从2至10毫升的定量的水加入各离心管中，分别制成糊状物。各离心管分别在40℃下酶反应1小时。分别将30毫升甲醇加入各离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟，收集各上层。分别将30毫升甲醇加入各离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟。将各合并的层蒸馏，以获得各自的残留物。分别将30毫升用于HPLC的甲醇加入到各残留物中，溶解、过滤以获得用于HPLC分析的各溶液。用HPLC分析各溶液，以获得各SB 365的产量。
每1克白头翁中SB 365的含量(毫克)＝标准溶液中SB 365的含量(毫克/毫升)×(AT/AS)×30(毫升)
流动相的溶剂条件：乙腈∶水＝36∶64
结果如图2所示。
实施例2
分别准确称取1克白头翁粉，并分别放入到6个离心管中。分别将2毫升水加入到各离心管中，将各混合物制成糊状物。所得离心管在间隔为1℃的37-42℃温度条件的培养箱中酶反应1小时。随后分别将30毫升甲醇加入到各离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟，收集各上层。分别将30毫升甲醇加入各离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟。将各合并的层蒸馏，以获得各自的残留物。分别将10毫升用于HPLC的甲醇加入各残留物中，溶解并用0.45微米的膜过滤器过滤，以获得用于HPLC分析的各溶液。用HPLC分析各溶液，以获得各SB 365的产量。
每1克白头翁中SB 365的含量(毫克)＝标准溶液中SB 365的含量(毫克/毫升)×(AT/AS)×10(毫升)
流动相的溶剂条件：乙腈∶水＝35∶65
结果如图3所示。
实施例3
分别准确称取1克白头翁粉，并分别放入到8个离心管中。分别将2毫升水加入到各离心管中，将各混合物制成糊状物。所得离心管在39℃的培育室中酶反应各自固定的时间。随后分别将30毫升甲醇加入到各离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟，收集各上层。分别将30毫升甲醇加入各离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟。将各合并的层蒸馏，以获得各自的残留物。分别将5毫升用于HPLC的甲醇加入各残留物中，溶解并用0.45微米的膜过滤器过滤，以获得用于HPLC分析的各溶液。用HPLC分析各溶液，以获得各SB 365的产量。
每1克白头翁中SB 365的含量(毫克)＝标准溶液中SB 365的含量(毫克/毫升)×(AT/AS)×5(毫升)
流动相的溶剂条件：乙腈∶水＝35∶65
结果如图4所示。
实施例4
准确称取1克白头翁粉，并放入到离心管中。将2毫升水加入到离心管中，并将混合物制成糊状物。所得离心管在最佳条件39℃的培育室中酶反应3小时。随后将30毫升甲醇加入到该离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟，收集上层。将30毫升甲醇加入该离心管中，然后将离心管超声搅拌10分钟，以3000转/分钟速度离心20分钟。将合并的层蒸馏，以获得残留物。将30毫升用于HPLC的甲醇加入残留物中，溶解并用0.45微米的膜过滤器过滤，以获得用于HPLC分析的溶液。用HPLC分析各溶液，以获得各SB 365的产量。
每1克白头翁中SB 365的含量(毫克)＝标准溶液中SB 365的含量(毫克/毫升)×(AT/AS)×30(毫升)
流动相的溶剂条件：乙腈∶水＝36∶64
结果如图4所示。最好的结果由提取180分钟的提取物获得，并计为“Pu-ex”。
实施例5
含白头翁的天然植物的酶反应制剂(GGG-ex制剂)(配方6)：
将3克粉末状白头翁、1.5克粉末状人参和0.45克粉末状甘草精细(finely)混合，并加入10毫升蒸馏水，制成糊状物。将该糊状物加入到250毫升烧杯中。依次用纱布和盖子将烧杯盖住，并在相对湿度为90％的39℃培养箱中酶反应3小时。将50毫升甲醇加入到烧杯中，搅拌10分钟后过滤。分别将50毫升80％的甲醇加入残留物中并提取两次。将合并后的甲醇溶液减压蒸馏以得到残留物。将60毫升纯甲醇加入到残留物中，搅拌并用0.45微米的膜过滤器过滤，以移除杂质。将滤液减压蒸馏，获得2.13克提取物。将该提取物溶于30毫升生理盐水中，用0.22微米的millidisk筒式过滤器(millidisk cartridge filter)过滤，以获得注射用溶液。为长期储存，提取物可以冻干。
实施例6
人参提取物制剂(“G-ex“制剂)
将2毫升水加入到1克粉末状人参中，制成糊状物并在与实施例4相同的条件下进行酶反应。加入10毫升甲醇、搅拌并提取。残留物分别用5毫升80％的甲醇提取2次。将合并的甲醇提取物蒸馏，以获得431毫克G-ex。
实施例7
甘草提取物制剂(“Gg-ex”制剂)
将1克粉末状甘草用与实施例6相同的条件进行处理，以获得470毫克Gg-ex。
实施例8
木通果皮提取物制剂(“Q-ex”制剂)
将1克粉末状木通果皮用与实施例6相同的条件进行处理，以获得553毫克Q-ex。
实施例9
榆木皮提取物制剂(“U-ex”制剂)
将1克粉末状榆木皮用与实施例6相同的条件进行处理，以获得367毫克U-ex。
本发明抗肿瘤活性提高的白头翁提取物可以单独制备，也可以与选自由人参、甘草、木通果皮和榆木皮组成的组中的辅助成分以及与药理可接受赋形剂一起制备成注射剂、片剂、粉剂、溶液、糖浆或软胶囊。
制备实施例(配方)
制备实施例1(配方1)
将250毫克得自实施例4的Pu-ex溶解在50毫升生理盐水中，用0.22微米millidisk筒式过滤器过滤并填充到5毫升的安瓿瓶中。将0.2毫升的该溶液注射到鼠身上。
制备实施例2(配方2)
根据现有文献韩国专利第72982号和美国专利US 6071521制备的组合物(SB 31：商品名称)
制备实施例3(配方3)
将250毫克Pu-ex、90毫克G-ex和30毫克Gg-ex溶解在50毫升生理盐水中，用0.22微米millidisk筒式过滤器过滤后使用。
制备实施例4(配方4)
将250毫克Pu-ex、120毫克Q-ex和30毫克Gg-ex溶解在50毫升生理盐水中，用0.22微米millidisk筒式过滤器过滤后使用。
制备实施例5(配方5)
将230毫克Pu-ex、80毫克U-ex和30毫克Gg-ex溶解在50毫升生理盐水中，用0.22微米millidisk筒式过滤器过滤后使用。
制备实施例6(配方6)
由实施例5获得的组合物。
实验实施例5
基于Pu-ex，将其它植物的提取物加入到上述获得的天然植物(raw plant)提取物中，以获得下表6的抗肿瘤配方。表6的抗肿瘤配方中提取物比例和给药量遵照韩国专利第72982号和美国专利US 6071521(SB 31(商品名称)：重量比白头翁∶人参∶甘草＝3∶1.5∶0.45)。
各提取物的产量和在5毫升注射液中各提取物的含量示于表6中。
表6每1克植物中提取物的产量和各小瓶(5毫升)中提取物的含量
    植物种类     提取物     产量     每小瓶含量
    白头翁人参甘草木通果皮榆木皮     Pu-exG-exGg-exQ-exU-ex     580毫克/克431毫克/克470毫克/克553毫克/克367毫克/克     25毫克/小瓶9毫克/小瓶3毫克/小瓶12毫克/小瓶8毫克/小瓶
*计算基准：20毫克SB 365/1克酶反应白头翁，0.87毫克SB 365/43毫克Pu-ex配方1-6中5毫升小瓶内各提取物的含量示于表7中。
表7各配方和抗肿瘤活性
  配方   提取物含量     抗肿瘤活性[IR(％)]
  配方1配方2配方3配方4配方5配方6   Pu-ex25毫克/5毫升SB 31/5毫升(Pu-ex25毫克+G-ex9毫克+Gg-ex3毫克)/5毫升(Pu-ex25毫克+Q-ex12毫克+Gg-ex3毫克)/5毫升(Pu-ex25毫克+U-ex8毫克+Gg-ex3毫克)/5毫升GGG-ex/300毫升     67％60％70％62％60％71％
*抗肿瘤活性[IR(％)]3次测量值的平均值
*在配方1、2、3、4和5中，将各配方的0.2毫升腹膜内注射(I.P.)给药给每只老鼠
*将GGG-ex溶解在300毫升生理盐水中，用0.2毫升millidisk筒式过滤器过滤后并腹膜内注射(I.P.)给约给每只老鼠
实验结果
由酶反应后的白头翁提取物组成的配方1显示比配方2即已知配方SB31更好的抗肿瘤效果。配方6为其中与SB 31具相同重量比的天然植物在最佳条件下酶反应并用甲醇提取的配方。因此，配方6与用水提取且未经酶处理的配方SB 31有很大的不同。
因此，配方6显示比SB 31更优异的抗肿瘤活性。配方4和5为其中使用Q-ex或U-ex代替配方3中的G-ex的混合配方。配方4和5的抗肿瘤活性不比原始配方2或应用配方6好。
最后，由配方SB 31经酶反应获得的GGG-ex显示比原配方SB 31更优越的抗肿瘤活性。因此，步骤1和2的实验是必须的。
毒性
此外，通过白头翁酶反应和甲醇提取得到的组合物，具有比通过已知水提取白头翁且不经过通过酶反应获得的白头翁提取物更低的毒性，并且通过酶反应和水提取白头翁获得的提取物具有优异的抗肿瘤活性。
配方中SB 365的含量
Pu-ex配方中SB 365的含量在0.80-1.35毫克范围内。
给药范围
基于SB 31第一次实验的结果，上述配方溶解于5毫升生理盐水中并注入静脉中。最佳注入浓度为12.15-29.1毫克/千克，最最佳浓度为21.87毫克/千克。
实验实施例7
SB 365的一般定量分析
测试样品：将准确称取的1克粉末状白头翁加入到离心管中，并用一定量的水制成糊状物。将离心管培养箱中在预定温度下酶反应预定时间。保温后加入30毫升甲醇，所得混合物超声搅拌、以3000转/分钟离心20分钟并收集甲醇溶液。将30毫升80％甲醇水溶液加入到残留物中。所得混合物超声搅拌10分钟、以3000转/分钟离心20分钟并收集甲醇水溶液。将合并后的甲醇溶液干燥、蒸馏，获得提取物。将用于HPLC的甲醇加入绝对干的提取物中并溶解。用0.45微米膜过滤器过滤甲醇溶液。将滤液装入小瓶中，以获得测试样品。
标准溶液：准确称取5毫克定量标准SB 365并溶解在甲醇中，以获得50毫升标准溶液。
操作：用HPLC程序测试测试样品和标准溶液，以获得AT和AS的SB365峰面积。
每1克白头翁中SB 365的含量(毫克)＝标准溶液中SB 365的含量(AT/AS)×最后使用溶液的体积(毫升)
操作条件：
检测器：紫外吸收光谱仪(波长：210纳米)
柱：Waters ODS-BP
溶剂：乙腈和水的混合物(35∶65或36∶64)
速率：1毫升/分钟
体积：20微升
实验实施例8
抗肿瘤活性检测：
1.测试动物：
用于实验的小鼠为体重20-23克的4周龄BDF-1小鼠，由Korea TestAnimal Center提供。
2.动物的饲养
饲养期间保持22±2℃和相对湿度65±5％，并且12小时循环改变光照和黑暗。自由供给水和食物。使用不含抗生素的鼠粮。
3.测试方法
按照Teruhiro method，分别将LL/2(路易斯肺癌细胞)1×106个/小鼠移植到各BDF-1老鼠的左前肢腋窝。移植24小时后，将每5只动物分成一组。为检测各小鼠体重的变化，将各测试样品进行腹膜内注射2周。当对照组的肿瘤体积达到2立方厘米后，测量各测试组肿瘤的体积，并根据下述等式计算抗肿瘤活性。
肿瘤体积(立方毫米)＝长度(毫米)×面积(平方毫米)/2
肿瘤生长抑制百分比(％)＝(对照组平均肿瘤体积(C)-测试组平均肿瘤体积(T))/对照组平均肿瘤体积×100
4.剂量
分别将250毫克Pu-ex和其它配方2-6溶解在50毫升生理盐水中，用0.22微米millidisk筒式过滤器过滤，各自分别装入到10个安瓿瓶中。分别将0.2毫升各溶液注入到各动物中。测试结果如上表7所示。
工业实用性
白头翁中所含的抗肿瘤成分3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷(编号SB 365)的含量非常低，并且大部分以没有抗肿瘤活性的3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷28-O-α)α-L-鼠李糖吡哺基-(1→4)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→6)]-β-D-葡糖吡喃酯(编号SB 365-O)的形式存在。白头翁具有用于断裂所述酯键的酶，通过酶反应和提取白头翁，富含SB 365的白头翁提取物的抗肿瘤活性大大提高。

Claims (4)

1、一种提高白头翁提取物抗肿瘤活性的方法，其特征在于，通过在37-43℃下对含有1重量份白头翁和2-20重量份水的混合物进行酶反应20-360分钟，将大量存在于白头翁中且没有抗肿瘤细胞活性的3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷28-O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→4-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→6]-β-D-葡糖吡喃酯(编号SB 365-O)转变成具有强抗肿瘤活性的3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷(SB365)，并用常规溶剂进行提取。
2、一种富含具有强抗肿瘤活性的3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷(SB 365)的白头翁提取物，其特征在于，通过在37-43℃下对含有1重量份白头翁和2-20重量份水的混合物进行酶反应20-360分钟，将大量存在于白头翁中且没有抗肿瘤细胞活性的3-O-[O-a-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷28-O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→4)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→6)]-β-D-葡糖吡喃酯(编号SB 365-O)转变成具有强抗肿瘤活性的3-O-[O-α-L-鼠李糖吡喃基-(1→2)-[O-β-D-葡糖吡喃基-(1→4)]-α-L-***糖吡喃基]常春藤皂苷(SB 365)，并用常规溶剂进行提取。
3、一种药物组合物，该组合物含有作为主要活性成分的权利要求2所述的富含SB 365的白头翁提取物和选自由人参提取物、甘草提取物和木通果皮组成的组中的辅助成分。
4、一种药物制剂，该药物制剂含有作为活性成分的权利要求2或3所述的组合物和药理可接受的辅剂成分。
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