CN108743696A - 具有促进伤口愈合的胆木提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有促进伤口愈合的胆木提取物,取胆木茎,切段,捣碎,加入一定量的水浸泡提取,收集提取液,减压浓缩得到胆木浸膏,浸膏经萃取获得二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位,分别以不同配比二氯甲烷‑‑乙酸乙酯、二氯甲烷‑甲醇为洗脱液,经反复硅胶柱分离得到单体成分。本发明深入研究胆木的生物碱成分体外增殖活性研究,通过实验研究表明,本发明得到的胆木生物碱,包括异常春花苷内酰胺、短小蛇根草苷,能明显促进HUVEC细胞的增殖,可广泛应用于制备创伤、烧伤或溃疡性伤口愈合的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药提取物,具体涉及一种具有促进伤口愈合的胆木提取物,该提取物包括异常春花苷内酰和短小蛇根草苷。
背景技术
胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard.)为茜草科乌檀属植物,又名乌檀、熊胆树、黄胆木、山熊胆等,以枝、皮入药,具有清热解毒、消肿止痛的功效,用于治疗咽喉炎、支气管炎、急性扁桃体炎等,有“植物抗生素”之称。异常春花苷内酰胺作为胆木主要生物碱类成分,喜果苷作为其同分异构体,已有文献初步分析其抗肿瘤活性;短小舌根草苷为胆木中存在的喹酮类生物碱,未有文献报道其抗炎作用及机制。
本发明深入研究胆木中的异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷的生物活性,开发其新的功效用途。
发明内容
发明目的:本发明目的是为了克服现有技术的不足,提供一种活性成分明确,杂质少,不良反应低,具有很好的促进细胞修复作用的胆木提取物。该胆木提取物包括异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷。
技术方案:为了实现以上目的,本发明采取的技术方案为:
具有促进伤口愈合的胆木提取物,其特征在于,它通过以下方法制备得到:
取胆木干燥茎枝,切段,粉碎,加入一定量的水浸泡提取,收集提取液,减压浓缩得到胆木浸膏,浸膏经萃取获得二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位,取二氯甲烷部位采用硅胶柱分离,采用二氯甲烷--乙酸乙酯洗脱,得到第一个胆木提取物;取乙酸乙酯部位采用硅胶柱分离,采用二氯甲烷-甲醇洗脱,分离得到第二个胆木提取物。
作为优选方案,以上所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物,它通过以下方法制备得到:
取胆木茎枝,切段,粉碎,加药材5~10倍体积量的水分3次浸泡提取,合并提取液,浓缩得浸膏;分别用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取,浓缩;取二氯甲烷部位,以体积比为90:10~10:90的二氯甲烷-乙酸乙酯经硅胶柱洗脱,洗脱液浓缩,得到第一个胆木提取物;取乙酸乙酯部位,以体积比为95:5~10:90的二氯甲烷-甲醇为洗脱溶剂硅胶柱色谱分离,以TLC分析合并相似部位,再以体积浓度为50%-90%甲醇经ODS柱洗脱,得到第二个胆木提取物。
作为优选方案,以上所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物,它是有下列重量份数的原料制成:
取胆木茎枝,切段,粉碎,加入胆木重量6倍体积量的水分3次浸泡提取,每次5h,合并提取液,浓缩得浸膏;加入浸膏重量3倍体积的萃取液,分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙酯萃取部位;取二氯甲烷部位,按体积比为90:10-80:20-70:30-60:40-10:90的二氯甲烷-乙酸乙酯经硅胶柱洗脱,洗脱液浓缩,得到第一个胆木提取物;取乙酸乙酯部位,以体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇洗脱溶剂硅胶柱色谱分离,以TLC分析合并相似部位,再以体积浓度为60%和70%甲醇经ODS柱洗脱,得到第二个胆木提取物。
作为优选方案,以上所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物,所述的第一个胆木提取物为异常春花苷内酰胺,第二个胆木提取物为短小蛇根草苷。
一种具有促进伤口愈合的胆木提取物的药物,将异常春花苷内酰胺或短小蛇根草苷和药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、合剂、丸剂、涂剂、膏剂或透皮吸收制剂。
本发明所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物在制备促进伤口愈合的药物中的应用。
本发明所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物在制备促进创伤、烧伤或溃疡性伤口愈合的药物中的应用。
一种具有促进伤口愈合的组合物,它包括异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷。特别优选,它由重量比为1:2~1:5的异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷组成。本发明通过大量实验筛选,发现异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷质量比为2时,促进HUVEC细胞的增殖作用最明显(P<0.05)
异常春花苷内酰胺,结构式如下:
短小舌根草苷,结构式如下:
本发明在制成片剂时把胆木提取物浸膏粉添加载体乳糖或玉米淀粉,需要时加入润滑剂硬脂酸镁,混合均匀,然后压片制成片剂。
本发明在制成胶囊剂时,把胆木提取物浸膏糊精或淀粉混合均匀,制粒,然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明在制成颗粒剂时,把胆木提取物浸膏加糊精等混合均匀,制粒,干燥,制成颗粒剂。
本发明在制成合剂时,胆木提取物加纯化水溶解,制成合剂。
本发明在制成口服液时,把胆木提取物加纯化水溶解,加入甜菊素或阿斯巴坦,调pH,制成口服液。
有益效果:本发明提供的具有促进细胞修复作用的胆木取物和现有技术相比具有以下优点:
(1)本发明通过大量实验筛选,提供具有促进细胞修复作用的胆木提取物,细胞修复是多方面共同作用的一个过程,本发明基于细胞修复相关机制,在理论指导下,深入研究胆木的生物碱成分体外增殖活性研究,通过实验研究表明,本发明通过优选方法制备得到的胆木生物碱(包括异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷),能明显促进HUVEC细胞的增殖,短小舌根草苷机制可能与VEGFA-ERK/p-ERK该信号通路相关,可广泛应用于制备创伤、烧伤或溃疡性伤口愈合的药物。
(2)本发明提供的具有促进细胞修复作用的胆木提取物,可以方便和药学载体制备成多种剂型,临床上服用方便,且经急性毒性试验表明,本发明制备得到的胆木提取物(异常春花苷内酰胺和短小舌根草苷),毒性低,应用安全。
附图说明
图1为异常春花苷内酰胺对内皮细胞活力的影响的柱状图。
图2为短小蛇根草苷对内皮细胞活力的影响的柱状图。
图3为异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷组合物对内皮细胞活力的影响的柱状图。
图4为胆木生物碱成分的WB结果图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
1、一种具有促进细胞修复作用的胆木提取物,它通过以下方法制备得到:
取胆木茎枝,切段,粉碎,加入胆木重量6倍体积量的水分3次浸泡提取,每次5h,合并提取液,浓缩得浸膏。加入浸膏重量3倍体积的萃取液,分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙酯萃取部位。取二氯甲烷部位,按体积比为90:10-80:20-70:30-60:40-10:90的二氯甲烷-乙酸乙酯经硅胶柱洗脱,洗脱液浓缩,得到一个胆木提取物:短小蛇根草苷。具体数据如下:
淡黄色粉末(常温),1H NMR(500MHz,DMSO)δ12.14(s,1H),8.13(d,J=8.2Hz,1H),7.70–7.65(m,1H),7.62(d,J=8.1Hz,1H),7.35(s,1H),7.05(d,J=2.7Hz,1H),5.86–5.77(m,1H),5.49(d,J=16.9Hz,1H),5.40(d,J=1.4Hz,1H),5.35(dd,J=10.3,2.0Hz,1H),5.03(dd,J=5.0,2.4Hz,1H),4.96(d,J=5.4Hz,1H),4.78(d,J=11.2Hz,1H),4.61–4.56(m,1H),4.55(d,J=7.9Hz,1H),4.48(dd,J=14.2,2.5Hz,1H),4.33(d,J=14.1Hz,1H),3.70(dd,J=10.0,6.4Hz,1H),3.47–3.40(m,2H),3.33(s,25H),3.18(td,J=8.9,5.1Hz,2H),3.06–2.96(m,2H),2.69–2.62(m,1H),2.50(dt,J=3.6,1.8Hz,23H),2.38–2.35(m,1H),2.03(dd,J=23.2,12.8Hz,2H),1.23(s,1H),0.01–-0.01(m,1H),-0.07(s,1H).13CNMR(126MHz,DMSO)δ164.54(C-22),150.33(C-2),145.65(C-17),140.83(C-13),132.86(C-19),132.18(C-11),125.21(C-9),121.06(C-18),118.85(C-12),113.45(C-6),109.34(C-16),98.25(C-1’),95.28(C-21),77.72(C-3’),76.90(C-5’),73.61(C-2’),70.53(C-4’),61.52(C-6’),59.92(C-3),47.96(C-5),44.03(C-20),28.61(C-14),24.12(C-15)。
取乙酸乙酯部位,以体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇洗脱溶剂硅胶柱色谱分离,以TLC分析合并相似部位,再以体积浓度为60%和70%甲醇经ODS柱洗脱,得到一个胆木提取物:异常春花苷内酰胺。
白色粉末(常温),1H NMR(500MHz,CDCl3)δ11.41(d,J=2.2Hz,1H),11.36(d,J=7.8Hz,1H),11.26(d,J=8.1Hz,1H),11.03(t,J=7.5Hz,1H),10.94(t,J=7.4Hz,1H),9.51–9.42(m,2H),9.24(d,J=17.1Hz,1H),9.17–9.09(m,1H),9.04–8.99(m,1H),8.67(d,J=7.9Hz,1H),7.87(d,J=11.9Hz,1H),7.66(d,J=5.4Hz,1H),7.35(d,J=8.9Hz,1H),7.29(dd,J=11.3,5.2Hz,3H),7.23–7.15(m,2H),6.69(dd,J=15.5,9.6Hz,3H),6.41(dd,J=9.3,3.6Hz,1H),5.40(d,J=12.2Hz,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ168.58(C-22),151.57(C-17),140.81(C-13),137.09(C-2),136.44(C-19),130.48(C-8),125.08(C-11),123.05(C-18),122.57(C-10),121.40(C-9),114.55(C-12),111.84(C-7),111.59(C-16),102.17(C-1’),99.96(C-21),80.87(C-3’),80.53(C-5’),77.37(C-2’),74.12(C-4’),65.22(C-6’),57.31(C-3),47.03(C-5),43.76(C-20),35.16(C-14),29.87(C-15),24.58(C-6)。
取胆木提取物加入适量淀粉,制粒,干燥,装胶囊,即得。
实施例2
1、取胆木茎枝,切段,粉碎,加入胆木重量6倍体积量的水分3次浸泡提取,每次5h,合并提取液,浓缩得浸膏。加入浸膏重量3倍体积的萃取液,分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙酯萃取部位。取二氯甲烷部位,按体积比为90:10-80:20-70:30-60:40-10:90的二氯甲烷-乙酸乙酯经硅胶柱洗脱,洗脱液浓缩,得到一个胆木提取物:短小蛇根草苷。
取乙酸乙酯部位,以体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇洗脱溶剂硅胶柱色谱分离,以TLC分析合并相似部位,再以体积浓度为60%和70%甲醇经ODS柱洗脱,得到一个胆木提取物:异常春花苷内酰胺。加入甜菊苷适量,调节pH至5.5,分装,灭菌即得。
实施例3促细胞增殖的药效学实验
1.CCK-8细胞活力测试实验:实验分为对照组、处理组及本底组。HUVEC细胞用F-12k完全培养基培养,待细胞汇聚度达80%-90%,胰酶消化,调整细胞数为10×104个/mL,按2×104个/孔/200μL接种于96孔板中,置37℃,5%CO2培养箱中孵育24h后,以只加培养基且未经任何处理孔作为空白对照,只含培养基(无细胞)的孔作为本底组。于细胞培养箱中孵育刺激24h。弃掉培养基,每孔以100μL PBS清洗3次(最后一次保留),各加入10μL CCK-8,分别于0.5,1,2,4h检测其450nm处的OD值。
2.结果:CCK-8活力检测结果如图1至图3所示。结果表明,异常春花苷内酰胺,短小蛇根草苷和异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷的组合物(重量比为1:2)以不同浓度处理组细胞活力均大于对照组,经统计学分析有显著性差异(*P<0.05,**P<0.01.),表明胆木主要生物碱成分异常春花苷内酰胺及短小蛇根草苷对HUVEC细胞生长具有促进作用,特别是异常春花苷内酰胺及短小蛇根草苷组合后显示出了更好的协同作用,取得了很好的技术效果。
实施例4细胞增殖的机制研究实验
1.WB蛋白印迹实验:实验分为对照组及处理组。HUVEC细胞用F-12k完全培养基培养,待细胞汇聚度达80%-90%,胰酶消化,调整细胞数为10×105个/4mL于细胞瓶中培养24h,弃掉培养基,换以药物终浓度为5μg/mL的含药培养基,对照组只加同等体积的新鲜培养基,于细胞培养箱中共孵育24h。弃掉培养基,胰酶消化收集细胞,于4℃,2500rpm离心10min,弃掉上清液,PBS吹散细胞,相同离心条件清洗细胞,重复操作3次。尽量吸尽液体,离心沉淀物即为细胞总蛋白。裂解蛋白后按BCA说明书操作测试蛋白浓度,加入LoadingBuffer于沸水中煮5min。用以开展WB实验。
2.结果:
经灰度分析,处理组各目的蛋白与对照组比值分别是:异常春花苷内酰胺处理组:VEGF:1.20±0.39倍,ERK:1.15±0.06倍,p-ERK:2.08±0.73倍;短小舌根草苷处理组:VEGFA:3.60±2.70倍;ERK:3.80±1.40倍;p-ERK:2.40±0.19倍。WB实验灰度处理结果如图4所示。
以上结果表明,本发明提供的异常春花苷内酰胺及短小舌根草苷及其组合物具有一定的促增殖药理活性,且安全性高,它们可以作为有效成份用来制备内皮损伤疾病,促进伤口愈合的药物。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.具有促进伤口愈合的胆木提取物,其特征在于,它通过以下方法制备得到:
取胆木干燥茎枝,切段,粉碎,加入一定量的水浸泡提取,收集提取液,减压浓缩得到胆木浸膏,浸膏经萃取获得二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位,取二氯甲烷部位采用硅胶柱分离,采用二氯甲烷--乙酸乙酯洗脱,得到第一个胆木提取物;取乙酸乙酯部位采用硅胶柱分离,采用二氯甲烷-甲醇洗脱,分离得到第二个胆木提取物。
2.根据权利要求1所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物,它通过以下方法制备得到:
取胆木茎枝,切段,粉碎,加药材5~10倍体积量的水分3次浸泡提取,合并提取液,浓缩得浸膏;分别用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取,浓缩;取二氯甲烷部位,以体积比为90:10~10:90的二氯甲烷-乙酸乙酯经硅胶柱洗脱,洗脱液浓缩,得到第一个胆木提取物;取乙酸乙酯部位,以体积比为95:5~10:90的二氯甲烷-甲醇为洗脱溶剂硅胶柱色谱分离,以TLC分析合并相似部位,再以体积浓度为50%-90%甲醇经ODS柱洗脱,得到第二个胆木提取物。
3.根据权利要求2所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物,其特征在于,它是有下列重量份数的原料制成:
取胆木茎枝,切段,粉碎,加入胆木重量6倍体积量的水分3次浸泡提取,每次5h,合并提取液,浓缩得浸膏;加入浸膏重量3倍体积的萃取液,分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙酯萃取部位;取二氯甲烷部位,按体积比为90:10-80:20-70:30-60:40-10:90的二氯甲烷-乙酸乙酯经硅胶柱洗脱,洗脱液浓缩,得到第一个胆木提取物;取乙酸乙酯部位,以体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇洗脱溶剂硅胶柱色谱分离,以TLC分析合并相似部位,再以体积浓度为60%和70%甲醇经ODS柱洗脱,得到第二个胆木提取物。
4.根据权利要求1~3任一项所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物,其特征在于,所述的第一个胆木提取物为异常春花苷内酰胺,第二个胆木提取物为短小蛇根草苷。
5.一种具有促进伤口愈合的胆木提取物的药物,其特征在于,将异常春花苷内酰胺或短小蛇根草苷和药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、合剂、丸剂、涂剂、膏剂或透皮吸收制剂。
6.权利要求4所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物在制备促进伤口愈合的药物中的应用。
7.权利要求4所述的具有促进伤口愈合的胆木提取物在制备促进创伤、烧伤或溃疡性伤口愈合的药物中的应用。
8.一种具有促进伤口愈合的组合物,其特征在于,它包括异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷。
9.根据权利要求8所述的一种具有促进伤口愈合的组合物,其特征在于,它由重量比为1:2~1:5的异常春花苷内酰胺和短小蛇根草苷组成。
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