CN111875662B - 一种美花铁线莲茎化学提取物的提取方法和应用 - Google Patents

一种美花铁线莲茎化学提取物的提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体来说是一种美花铁线莲茎化学提取物的提取方法和应用，分子式为C47H76O16，采用波谱解析和化学手段，确定该化合物为3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖‑(1→4)‑[α‑L‑吡喃鼠李糖‑(1→2)]‑β‑D‑吡喃木糖‑齐墩果酸苷。体外抗肿瘤实验表明，该化合物对HL‑60白血病细胞和HepG2肝癌细胞具有较强的细胞毒性，对HL‑60白血病细胞和HepG2肝癌细胞的半数抑制浓度分别是5.04μM和3.12μM，本发明旨在提供一种结构新颖且活性好的化合物，为美花铁线莲在抗肿瘤药物中的应用及研究提供理论依据和实验基础。

Description

一种美花铁线莲茎化学提取物的提取方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体来说是一种美花铁线莲茎化学提取物的提取方法和应用。
背景技术
美花铁线莲(Clematis potaninii)为毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis L.)植物，生于海拔1700-3000米的山坡或山谷的林下等阴湿处。分布于我国的西藏，云南，四川，甘肃，陕西等地。生长于山坡、山谷林下或溪边，资源丰富。
毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属(Clematis L.)植物约有350多个品种，各大洲均有分布。我国约有150余种，全国各地都有分布，尤以西南地区种类较多。该属植物具有很高的观赏价值，有“藤本花卉皇后”的美称。本属植物具有较高的药用价值，在韩国常被用来治疗哮喘、脚气及小便不利；在印度作为传统草药用来治疗烧伤；在中国，中医常用其根或茎入药，用于淋证、水肿、风湿、经络麻痹等疾病的治疗；近年来，研究发现铁线莲属植物在抗肿瘤，抗菌，抗病毒、抗氧化等方面有着重大的功效。
迄今为止，国内外学者已对该属20多种植物开展了化学成分研究，从中分离得到了多种类型的化合物，但尚未有对美花铁线莲化学成分的研究报道。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供了一种美花铁线莲茎化学提取物的提取方法和应用，本发明旨在提供一种结构新颖且活性好的化合物，为美花铁线莲在抗肿瘤药物中的应用及研究提供理论依据和实验基础。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种美花铁线莲茎的化学提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述美花铁线莲茎的化学提取物的化学结构如式(Ι)所示：
Figure BDA0002641000130000021
上述式(Ι)结构的化学名称为3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃木糖-齐墩果酸苷，以下简称ARXO。
优选的，所述美花铁线莲茎的化学提取物ARXO用于抑制HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞。
优选的，所述的美花铁线莲茎的化学提取物可以在制备抗肿瘤药物中单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物。
优选的，所述剂型为注射剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。
本发明还保护了一种美花铁线莲茎的化学提取物的提取方法，包括如下步骤：
(1)药材的提取：
将干燥的美花铁线莲的茎粉碎，按重量体积比加入3-5倍原料重的70％乙醇加热回流2-3提取，每次2-3h，合并提取液，减压蒸馏浓缩得提取液；将提取液分散于按重量体积比2-3倍的水中，先用和水等体积的石油醚2-3萃取，分离得到的水相再用与水等体积的饱和正丁醇3-5萃取，合并正丁醇萃取液后减压浓缩得到正丁醇层提取物；
(3)化合物的分离：
将步骤(1)得到的正丁醇层提取物采用100-200目硅胶柱色谱分离，以体积比为50:1:0-6:3:0.5的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，得到含式I化合物ARXO的混合物A，再采用100-200目硅胶柱色谱分离，以体积比为1:2-3的***-水混合溶剂梯度洗脱，得到含式I化合物ARXO的混合物B；
(4)ARXO的提取：
将步骤(2)得到的混合物B依次采用ODS反相硅胶柱色谱和高效液相色谱纯化，ODS反相硅胶柱色谱以甲醇为洗脱剂，采用30％-68％的甲醇溶液按照浓度逐渐增大的顺序依次梯度洗脱，收集50-68％的甲醇洗脱液，高效液相色谱纯化以乙醇为洗脱剂，采用55-75％的乙醇溶液按照浓度逐渐增大的顺序依次梯度洗脱，收集65-75％的乙醇洗脱液，得到ARXO。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明化合物ARXO是首次从本属植物中分离，化合物ARXO，经SciFinder数据库检索，确定为新化合物，且其中化合物ARXO的3位糖链连接顺序(木糖2,4位均连有糖链)在该属植物皂苷中比较少见，本发明还对新化合物进行了体外抗肿瘤活性研究，结果显示：化合物ARXO对HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞有显著地活性，半数抑制浓度(IC50值)分别是5.04μM和3.12μM，式Ι化合物ARXO对多种HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞的显著抑制作用也表明其可以进一步作为新的抗肿瘤药物进行研究开发。
2、本发明通过体外抗肿瘤活性筛选，初步探讨了齐墩果烷型三萜皂苷抗肿瘤的构效关系。
3、本发明的申请人还于2017年4月在中南药学2017年4月第15卷第4期(CentralSouth Pharmacy.April 2017,Vol.15 No.4)公开发表了名称为“美花铁线莲地上部分的皂苷类成分研究”的论文，发明人为卫柯、孙雨芊、李虎、陆云阳、王玉梅和汤海峰，论文具体公开了首次从美花铁线莲中分离得到5种新的化合物，与本申请相比，首先本申请分离得到的化合物为首次分离得到，与论文中的5种新的化合物均不同；其次，申请人还对本申请分离得到的新的化合物ARXO进行了体外抗肿瘤活性研究，结果显示化合物ARXO对HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞有显著地活性，半数抑制浓度(IC50值)分别是5.04μM和3.12μM；本发明为合理开发美花铁线莲的药用资源提供了科学依据，为进一步研究其活性物质积累了实验材料，为扩大铁线莲属药用植物资源提供了新的资料，同时也为开发抗肿瘤新药提供了有价值的先导化合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的ESI-MS质谱图；
图2为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的HR-ESI-MS高分辨质谱图；
图3为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的氢谱图；
图4为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的碳谱图；
图5为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的DEPT频谱；
图6为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的HSQC光谱图；
图7为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的HMBC光谱图；
图8为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的1H-1HCOSY谱图；
图9为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的诺斯光谱图；
图10为本发明美花铁线莲茎中提取的化合物ARXO的托克斯光谱图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明研究使用的药材于2015年8月采自陕西省太白山，经陕西中医药大学鉴定为美花铁线莲(Clematis potaninii)的茎。样品标本(No.20150831)保存于第四军医大学天然药物学教研室。
实施例1
一种美花铁线莲茎的化学提取物的提取方法，包括如下步骤：
(1)药材的提取：
将干燥的美花铁线莲的茎7.5kg粉碎，按重量体积比加入3-5倍原料重的70％乙醇加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压蒸馏浓缩得提取液约481g。将提取液分散于(10L)水中，先用和水等体积石油醚萃取4次，分离得到的水相再用与水等体积的饱和正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液后减压浓缩得到正丁醇层提取物171.83g。
(2)化合物的分离：
称量步骤(1)得到的丁醇层提取物170g，以硅胶柱色谱(100-200目)分离，氯仿-甲醇-水(100:1:0-6:3:0.5)混合溶剂梯度洗脱，通过TLC合并类似组份，得到含式I化合物ARXO的混合物A，选择在TLC中点性较好的几个组分，再采用100-200目硅胶柱色谱分离,以体积比为1:2.5的***-水混合溶剂梯度洗脱，得到含式I化合物ARXO的混合物B；
(3)ARXO的提取：
将步骤(2)得到的混合物B依次采用ODS反相硅胶柱色谱和高效液相色谱纯化，ODS反相硅胶柱色谱以甲醇为洗脱剂，采用30％、50％和68％的甲醇溶液按照浓度逐渐增大的顺序依次梯度洗脱，收集50％和68％的甲醇洗脱液，混合后用高效液相色谱纯化以乙醇为洗脱剂，采用55％、65％、75％的乙醇溶液按照浓度逐渐增大的顺序依次梯度洗脱，收集65％和75％的馏分，混合后得到ARXO。
下面对3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃木糖-齐墩果酸苷(简称化合物ARXO)进行技术表征，具体方法如下：
化合物ARXO：
白色无定型粉末，易溶于吡啶和甲醇。Liebermann-Burchard和Molish反应均呈阳性结果，推测该化合物可能为三萜或者甾体皂苷类化合物。ESI-MS(negative)给出m/z 895[M-H]-，ESI-MS(positive)给出m/z 919[M+Na]+，HR-ESI-MS(正离子模式)中的准分子离子峰[M+Na]+m/z实测值为919.5032(计算值C47H76O16Na,919.5031)，结合波谱数据，可以确定化合物的分子式为C47H76O16。
分析化合物ARXO的1H-NMR谱(500MHz,pyridine-d5)中，高场区给出了7个甲基单峰氢信号：δ1.19，δ1.10，δ0.86，δ1.01，δ1.32，δ0.98，δ1.04(all in s,each 3H)，低场区出现了1个烯氢信号δ5.49(br.s,1H)。结合HSQC谱来分析13C-NMR谱(125MHz,pyridine-d5)，高场区相应地出现了7个甲基碳信号：δ28.5，δ17.5，δ16.0，δ18.0，δ26.7，δ33.9，δ24.3，低场区显现了1个连氧的次甲基碳信号δ89.2，2个特征烯碳信号δ122.7和δ145.7，及1个羧羰基碳信号δ181.5。通过以上分析，可初步推断化合物ARXO为齐墩果烷型三萜皂苷，苷元为齐墩果酸。综合分析HSQC、HMBC、1H-1HCOSY、TOCSY和NOESY等二维谱图，对苷元部分的碳信号和氢信号进行全归属(如表1所示)，再根据的C-3信号δ89.2及C-28信号δ181.5，可判断化合物ARXO为齐墩果烷型三萜皂苷，苷元为齐墩果酸，且是3位连糖的单糖链皂苷。在NOESY谱中，可以看出H-3与H-5，H-23有NOE相关，从而确定3位C-O键的相对构型为β。
采用三氟乙酸对化合物ARXO进行酸水解，再制备成糖腈乙酸酯衍生物，经过GC分析，与标准糖同法制备的衍生物对照，检测出含有D-木糖(Xyl)，L-鼠李糖(Rha)，D-葡萄糖(Glc)，比例为1:1:1。从生源角度来说，从铁线莲属植物中分离出来的皂苷所含的鼠李糖均为L型，木糖和葡萄糖均为D型，化合物ARXO的糖基的类型亦可认为是上述构型。观察化合物ARXO的13C-NMR谱(125MHz,pyridine-d5)，低场区出现了3个糖的端基碳信号：：δ105.4(XylC-1)，δ102.3(Rha C-1)，δ106.8(Glc C-1)。结合HSQC谱，在1H-NMR谱(500MHz,pyridine-d5)中显现出3个糖的端基氢信号：δ4.79(1H,d,J＝6.4Hz,H-1 of Xyl)，δ6.19(1H,s,H-1 of Rha)，δ5.15(1H,d,J＝8.0Hz,H-1 of Glc)。通过糖端基氢的偶合常数和相关碳的化学位移值可以判断Xyl和Glc的相对构型为β，Rha的相对构型为α。综合分析HSQC、HMBC、1H-1HCOSY、TOCSY和NOESY等二维谱图，对各个糖的碳信号和氢信号进行全归属，如表1所示。
通过HMBC谱确定糖链的连接顺序，δH 4.79(H-1 of Xyl)与δC 89.2(C-3)存在远程相关关系，δH 6.19(H-1 of Rha)与δC 76.8(C-2 of Xyl)存在远程相关关系，δH 5.15(H-1of Glc)与δC 80.1(C-4 of Ara)存在远程相关关系，以上表明Xyl连接苷元的3位，Rha连接Xyl的2位，Glc连接Xyl的4位。通过NOESY谱分析，进一步验证了上述连接方式。
表1化合物ARXO的1H-NMR谱(500MHz,pyridine-d5)和13C-NMR谱(125MHz,pyridine-d5)数据
C δ<sub>C</sub> δ<sub>H</sub> δ<sub>C</sub> C δ<sub>H</sub>
1 39.4 0.93m,1.49m 3-O-sugar / /
2 27.1 1.83m,2.05m Xyl-1 105.4 4.79(d,J＝6.4Hz)
3 89.2 3.22(dd,J＝12.0,4.8) 2 76.8 4.54m
4 40.0 / 3 74.4 4.33m
5 56.5 0.77(d,J＝12.0Hz) 4 80.1 4.32m
6 19.0 1.31m,1.48m 5 65.0 3.84(d,J＝11.4Hz),4.44m
7 31.5 1.21m,1.46m Rha-1 102.3 6.19s
8 40.2 / 2 72.8 4.76m
9 49.1 / 3 73.0 4.64m
10 37.5 / 4 74.5 4.30m,
11 24.4 1.92m,2.03m 5 70.3 4.64m
12 122.7 5.49br.s 6 19.1 1.66(d,J＝6.4Hz)
13 145.7 /
14 42.7 / Glc-1 106.8 5.15(d,J＝8.0Hz)
15 28.9 2.22m 2 76.0 4.06(t,J＝8.0Hz)
16 24.4 2.92m,2.03m 3 79.3 3.92m
17 47.3 / 4 71.7 4.27m
18 42.6 4.34(dd,J＝13.6,4.0) 5 79.0 4.23(t,J＝8.8Hz)
19 47.2 1.30m,1.83m 6 63.0 4.38m,4.52m
20 30.5 / / / /
21 34.9 1.21m,1.50m / / /
22 33.7 1.31m,1.46m / / /
23 28.5 1.19(3H,s) / / /
24 17.5 1.11(3H,s) / / /
25 16.0 0.86(3H,s) / / /
26 18.0 1.01(3H,s) / / /
27 26.7 1.32(3H,s) / / /
28 181.5 / / /
29 33.9 0.98(3H,s) / / /
30 24.3 1.04(3H,s) / / /
注：“/”表示没有该项数据。
综上所述，化合物ARXO为3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-xylopyranosyl oleanolic acid。经SciFinder数据库检索，确定其为新化合物。
下面对首次获得的化合物ARXO进行抗肿瘤活性研究，并进行体外抗肿瘤活性测试，具体方法如下所示：
(1)受试样品：化合物ARXO；
(2)实验方法：
2.1溶液的配制
MTT工作液：称取50mg MTT粉剂，PBS溶解并定容至10mL，配制成5mg/mL的贮备液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：取氯化钠(8.0g)、氯化钾(0.2g)、磷酸二氢钾(0.2g)和磷酸氢二钠(3.48g)溶于800mL去离子水中，搅拌溶解，调节pH值至7.2-7.4，加去离子水定容为1000mL高压灭菌后，4℃保存备用。
2.2细胞株的培养
在37℃,5％CO2饱和湿度的培养箱中，用含10％胎牛血清、青霉素100u/mL和链霉素100u/mL的DMEM培养基培养人肝癌HepG2细胞，该细胞是贴壁细胞。HL-60细胞的培养方法与人肝癌HepG2细胞培养方法一样，但是HL-60细胞选用RPMI1640培养基，该细胞为悬浮细胞。
2.3 MTT法检测化合物对HL-60细胞的增殖的影响
收集对数生长期的HL-60细胞，计数并制成1×105/mL悬液，每孔200μl加入96孔培养板。24h后给药，分为positive control组、受试药物组(分别为80,40,20,10,5和2.5μmol/L)，每组设3个复孔，于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育72h后，加入20μl MTT试液孵育4h，弃掉细胞培养液后加入150μl的DMSO溶液并振荡10min，用酶联免疫检测仪在波长为490nm处测定吸光值，并计算细胞抑制率。阳性对照品为阿霉素。
2.4 MTT法检测化合物对HepG2细胞的增殖的影响
取处于指数生长期状态良好的HepG2细胞用0.25％胰蛋白酶消化，贴壁细胞脱落并制成5×104个/mL的细胞悬液。以200μl/孔接种于96孔板上，于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。隔天换液，分为正向控制组、受试药物组(分别为80,40,20,10,5和2.5μmol/L)，每组设3个复孔，培养72小时。将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4小时。吸去上清液，每孔加入150μl的DMSO溶液振摇10min。酶联免疫检测仪在波长为490nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制率。阳性对照品为阿霉素。
2.5细胞抑制率的计算公式
细胞抑制率＝(阴性对照组OD值-治疗组OD值)/阴性对照组OD值×100％)。再采用SPSS软件计算半数抑制浓度(IC50)。
3实验结果与讨论
根据化合物的苷元和糖链类型，选取了化合物ARXO进行了抗肿瘤活性初步筛选，具体见表2。
表2化合物ARXO对人肝细胞性肝癌HepG2细胞和人白血病HL-60细胞的体外杀伤活性(IC50，μM)
Figure BDA0002641000130000101
Figure BDA0002641000130000111
研究发现，混合物B对HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞具有抑制作用，基于上述结果，对混合物B进行了再次分离，得到了化合物ARXO，化合物ARXO对HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞具有较强的细胞毒性，化合物ARXO对HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞有显著地活性，IC50分别是5.04μM和3.12μM。
与现有技术的阿霉素相比，阿霉素的细胞毒性虽然优于本申请分离得到的ARXO，但是阿霉素对正常细胞和机体具有一定的副作用，具体表现为：影响骨髓造血功能，血小板及白细胞减少；具有心脏毒性，严重时可出现心力衰竭；对机体产生恶心、呕吐、口腔炎、脱发、高热、静脉炎及皮肤色素沉着等作用；伴有少数的发热、出血性红斑及肝功能损害；而本申请分离得到的ARXO为天然物质，实验室动物实验结果表明：ARXO对大鼠机体基本无副作用，是一种更加安全的抗肿瘤化合物。
根据化合物的结构，化合物ARXO的C-28位是成酯苷键的双糖链皂苷，化合物ARXO的活性强，原因可能与糖基数目有关，糖链数目增多活性会变弱。化合物ARXO的活性强我们推测可能是化合物ARXO的C-3位有支链糖基的存在。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (3)

1.一种美花铁线莲茎的化学提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述美花铁线莲茎的化学提取物的化学结构如式(Ι)所示：
Figure FDA0003729121650000011
上述式(Ι)结构的化学名称为3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃木糖-齐墩果酸苷，以下简称ARXO；
所述美花铁线莲茎的化学提取物按照如下步骤提取：
(1)药材的提取：
将干燥的美花铁线莲的茎粉碎，按重量体积比加入3-5倍原料重的70％乙醇加热回流2-3提取，每次2-3h，合并提取液，减压蒸馏浓缩得提取液；将提取液分散于按重量体积比2-3倍的水中，先用和水等体积的石油醚2-3萃取，分离得到的水相再用与水等体积的饱和正丁醇3-5萃取，合并正丁醇萃取液后减压浓缩得到正丁醇层提取物；
(2)化合物的分离：
将步骤(1)得到的正丁醇层提取物采用100-200目硅胶柱色谱分离，以体积比为50:1:0-6:3:0.5的氯仿-甲醇-水混合溶剂梯度洗脱，得到含式I化合物ARXO的混合物A，再采用100-200目硅胶柱色谱分离，以体积比为1:2-3的***-水混合溶剂梯度洗脱，得到含式I化合物ARXO的混合物B；
(3)ARXO的提取：
将步骤(2)得到的混合物B依次采用ODS反相硅胶柱色谱和高效液相色谱纯化，ODS反相硅胶柱色谱以甲醇为洗脱剂，采用30％-68％的甲醇溶液按照浓度逐渐增大的顺序依次梯度洗脱，收集50-68％的甲醇洗脱液，高效液相色谱纯化以乙醇为洗脱剂，采用55-75％的乙醇溶液按照浓度逐渐增大的顺序依次梯度洗脱，收集65-75％的乙醇洗脱液，得到ARXO。
2.根据权利要求1所述的一种美花铁线莲茎的化学提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述美花铁线莲茎的化学提取物ARXO用于抑制HL-60白血病细胞和HepG2肝癌细胞。
3.根据权利要求1所述的一种美花铁线莲茎的化学提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述剂型为注射剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、微囊剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。
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