CN100354301C - 化学合成多肽的新型大规模分离制备技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学合成多肽的新型大规模分离制备技术。该技术采用常压或低压离子交换色谱与纳滤相结合的分离方法分离化学合成多肽，具体方法为：粗肽溶于水时，采用超声波振荡辅助溶解，再以0.22μm微孔滤膜去除固形不溶物，得澄清粗肽溶液；利用疏水性离子交换树脂作为分离介质，高径比为5∶1～20∶1；将粗肽溶液上柱进行离子交换吸附，再洗杂、洗脱；根据被分离多肽的分子量大小，选择不同截留分子量的纳滤膜，将离子交换洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后将浓缩的多肽溶液经冷冻干燥即可。本发明技术避免使用昂贵的设备和有毒的有机溶液洗脱。本发明分离介质担载量大、设备投资少，易于规模化生产，生产成本低的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物制品加工领域，涉及一种对化学合成多肽的新型大规模分离制备技术。
技术背景
多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。人工方法合成多肽已有百年历史，伴随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，多肽的研究取得了惊人的划时代的进展。人们发现存在于生物体的多肽已有数万种，并且发现所有的细胞都能合成多肽。同时，几乎所有细胞也都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。目前，多肽在医药中的应用主要集中在多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌活性肽、用于心血管疾病的多肽以及诊断用多肽等等，肽类药物的应用已涉及24类临床适应症。随着现代技术日新月异，多肽不仅作为新药开发目标，同时也作为开发其它药品的筛选目标。据不完全统计，多肽类药物的年增长率达到19％。多肽药物与小分子药物相比，它具有机理明确、副作用小等优点。大量的研究发现，几乎所有的病毒性疾病和许多疑难疾病都可以用多肽来预防和治疗，因此，多肽技术将在预防和治疗流行性传染病和重大疾病等方面有所作为。
自20世纪70年代，随着多肽的固相合成及高效液相纯化、分析技术的发展，多肽作为一个潜在的新药，越来越引起人们的兴趣。目前，人工合成多肽主要以固相合成为主。但是由于在固相合成过程中，出现的各种副反应、消旋化等问题，使得合成此多肽是一种低纯度的粗产品，这些杂质包括：①非对映异构的(外消旋)多肽；②缺失(不完全)肽；③断裂肽；④反应副产物；⑤去酰胺多肽；⑥氨基酸侧链的不完全脱保护所形成的副产物；⑦氧化肽；⑧二硫键交换的产物；⑨低聚物和/或聚合物；⑩合成中所用的毒性试剂和溶剂。必须经过纯化才能得到高纯度产品，由此分离纯化问题是化学合成多肽中的最大障碍。
目前，化学合成多肽常规分离方法是采用大分子如蛋白质等化合物的分离方法，其常用分离手段有三种：凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱。凝胶过滤色谱多以交联剂将葡聚糖和琼脂糖交联成网状结构作为介质，根据被分离物的大小差别、形状差异进行分离，主要用于多肽的脱盐，凝胶过滤色谱具有介质不带电荷，分离条件温和，回收率高，生物活性好等特点；离子交换色谱的分离介质是由二乙胺乙基(DEAE)、季铵乙基(QAE)、羧甲基(CM)、磷酸基(P)、磺丙基(SP)等离子交换基团键合到葡聚糖或琼脂糖凝胶载体而构成，根据带电被分离物与离子交换剂之间静电作用力的差异进行分离操作，离子交换色谱具有较高的分离容量，分辨率高，易于放大等特点，广泛应用于生物大分子的分离纯化。反相高效液相色谱的介质是以硅胶作为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键合C4、C8、C18烷基或苯基等非极性分子层，根据被分离物疏水性的差别进行分离纯化，反相高效液相色谱具有分离效果好，分辨率高、回收率高等特点。目前，化学合成肽的分离最主要制备方法是反相高效液相色谱，其用于放大分离合成多肽，不易规模化，且分离成本过高。主要原因，一方面，由于反相载体担载量低，本身造价高，规模放大设备要求精度高、投资大，而成为固相多肽分离纯化放大的难点之一；另一方面，目前固相多肽分离纯化手段单一，有机溶剂用量大，能耗高。目前国内尚无化学合成多肽大规模分离的工业化实例。
国外多肽制造领域蓬勃发展，已经形成一定的产业化规模。著名企业有Bachem公司、Novabiochem公司、Anaspec&ACT公司、Anaspec公司以及American Peptide公司等，其中以Bachem公司规模最大，采用固相合成技术和液相合成技术合成多肽，可以生产从毫克级多肽到几百公斤级多肽以及吨级中间体的各类与多肽相关的产品，最大单批生产分离纯化能力达到公斤级别以上，其分离纯化手段主要是以反相高效液相色谱为主。国内多肽合成企业虽有不少，但多肽合成能力最大只达到公斤级，与之相配套的分离规模还停留在克级水平。从总体而言，国内无论在合成能力方面，还是分离能力方面与国外的差距相当巨大。就局部而言，国内现有分离水平也无法与合成能力相适应，已经成为制约固相多肽合成发展的瓶颈之一。
随着膜技术的飞速发展，采用膜技术替代凝胶过滤色谱已成为可能。如果采用小分子分离纯化手段，有效分离固相合成多肽中目标多肽与杂质，实现分离载体的国产化，减少工艺损耗，大幅度降低多肽成本，促进我国多肽药物的发展，实现高效低成本多肽合成，这将带来显著的经济效益和社会价值。
发明内容
本发明的目的在于克服目前化学合成多肽中分离纯化技术的成本高、不易规模化的缺陷，提供一种将离子交换与纳滤膜(Nanofiltration Membrane)分离相结合的化学合成多肽分离纯化新工艺。
本发明是建立在小分子定向分离思想之上的，其特点在于利用溶液中目标产物与共存杂质之间在物理、化学以及生物学性质的差异，使其在分离操作中具有不同的传质速率和(或)平衡状态，从而实现目标化合物分离的目的。
按照本发明的技术方案，本领域内的普通技术人员无需创造性劳动就能实施本发明。尤其是本领域中普通技术人员了解各个应进行的过程，可以获得目标多肽。
本发明的目的可以通过以下措施来实现：
一种对化学合成多肽大规模分离的技术，该技术采用常压或低压离子交换色谱与纳滤相结合的分离方法分离化学合成多肽，具体方法为：粗肽溶于水时，采用超声波振荡辅助溶解，再以0.22μm微孔滤膜去除固形不溶物，得到澄清粗肽溶液；利用疏水性离子交换树脂作为分离介质，高径比为5∶1～20∶1；将粗肽溶液上柱进行离子交换吸附，再采用适当的洗杂与洗脱；根据被分离多肽的分子量大小，选择不同截留分子量的纳滤膜，将离子交换洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后，将浓缩的多肽溶液经冷冻干燥得到纯度95％以上的多肽冻干粉。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中粗肽溶于水时，粗肽与水的质量体积比为1∶5～1∶15。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中分离介质以聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯作为疏水作用骨架。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中分离介质的活性基团是二乙胺乙基、二乙胺基、三乙胺乙基、季铵乙基、磺酸基、磺丙基、磷酸基或羧甲基。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中采用0.001M～0.2M的无机盐溶液进行洗杂。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中无机盐为pH2～14的氯化钠、氯化铵或硫酸铵溶液。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中采用0.5M～2M的无机盐溶液进行洗脱。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中无机盐为pH2～14的氯化钠、氯化铵或硫酸铵溶液。
所述的对化学合成多肽大规模分离的技术，其中采用的纳滤膜截留分子量为150～1000道尔顿，进行浓缩脱盐。
本发明相比现有技术具有如下优点：
本发明突破国内外同行对化学合成多肽分离纯化方式的死板和模式化，将离子交换与纳滤膜分离相结合，使得本发明的分离纯化技术简便易行，效果佳，不仅其设备投资、运行成本低廉，可以实现百克级、公斤级化学合成多肽的分离，现有技术与本发明对比，如表1所示。通过本发明所得产品在产品收率和产品质量方面都获得了极好的结果，保证了产品的高品质，本发明的分离成本只有现有技术的7％左右，大幅度降低了化学合成多肽的分离成本。
表1现有技术与本发明的对比
| 项目 | 现有技术 | 本发明 |
| 单套制备设备成本 | 160,000～600,000元 | 20,000元 |
| 10克级色谱柱成本 | 200,000～400,000元 | 5000元 |
| 柱压力 | 中、高压 | 常压、低压 |
| 分离介质平均粒径 | 5μm | 0.7mm |
| 单批次运行成本 | 2000～4000元 | 150元左右 |
| 规模放大 | 不易放大，且成本高 | 易于放大，且成本低 |
本发明的其他优点将在下面的说明实例中进一步阐述。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的阐述。实施实例是为说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施实例不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。
实施例1
1.2千克胸腺五肽粗肽与纯水(质量体积比为1∶5)混和，室温条件下超声波振荡，并用0.22μm微孔滤膜过滤，得到澄清粗肽溶液。将6千克磺丙基聚苯乙烯离子交换树脂装柱(高径比为7∶1)备用，然后将粗肽澄清溶液以10ml/min流速上柱吸附。以pH11、0.1M硫酸铵水溶液，20ml/min流速淋洗树脂，至无杂峰出现；接着用1.0M氯化钠溶液(pH＝10～12)，10ml/min进行洗脱，离子交换过程采用275nm波长检测，操作压力维持在0.2MPa以下，收集胸腺五肽离子交换洗脱液；以截留分子量为150道尔顿的纳滤膜，在常温条件下，对洗脱液进行纳滤浓缩脱盐，纳滤操作条件：压力为2.0MPa，流量为3000ml/min；最后将浓缩液冷冻干燥，得到纯度为99.1％胸腺五肽纯品。
实施实例2
150克胸腺素α1粗肽与纯水(质量体积比为1∶15)混和，室温条件下超声波振荡，并用0.22μm微孔滤膜过滤，得到澄清粗肽溶液。将700克磺酸基聚丙烯酰胺离子交换树脂装柱(高径比为12∶1)备用，然后将粗肽澄清溶液以1.5ml/min流速上柱吸附。以pH5、0.15M氯化钠溶液，2ml/min流速淋洗树脂，至无杂峰出现；接着用1.4M氯化铵溶液(pH＝7～10)，1.5ml/min进行洗脱，离子交换过程采用在常压条件下，214nm波长检测；收集胸腺素α1离子交换洗脱液；以截留分子量为1000道尔顿的纳滤膜，在常温条件下，对洗脱液进行纳滤浓缩脱盐，纳滤操作条件：压力为1.5MPa，流量为1000ml/min；最后将浓缩液冷冻干燥，得到纯度为97.8％胸腺素α1纯品。
实施实例3
500克亮丙瑞林粗肽与纯水(质量体积比为1∶10)混和，室温条件下超声波振荡，并用0.22μm微孔滤膜过滤，得到澄清粗肽溶液。将2500克二乙胺乙基聚丙烯酸酯离子交换树脂装柱(高径比为15∶1)备用，然后将亮丙瑞林粗肽澄清溶液以2ml/min流速上柱吸附。以pH9 0.2M氯化铵水溶液，4ml/min流速淋洗树脂，至无杂峰出现。接着用2.0M硫酸铵溶液(pH＝9～13)，1ml/min流速进行洗脱，离子交换过程采用220nm波长检测，操作压力维持在0.1MPa以下；收集亮丙瑞林离子交换洗脱液，以截留分子量为300道尔顿的纳滤膜，在常温条件下，对洗脱液进行纳滤浓缩脱盐，纳滤操作条件：压力为0.6MPa，流量为800ml/min；最后将浓缩液冷冻干燥，得到纯度为98.3％亮丙瑞林纯品。
Claims (9)
1、一种对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征在于采用常压或低压离子交换色谱与纳滤相结合的分离方法分离化学合成多肽，具体方法为：粗肽溶于水时，采用超声波振荡辅助溶解，再以0.22μm微孔滤膜去除固形不溶物，得到澄清粗肽溶液；利用疏水性离子交换树脂作为分离介质，高径比为5∶1～20∶1；将粗肽溶液上柱进行离子交换吸附，再采用适当的洗杂与洗脱；根据被分离多肽的分子量大小，选择不同截留分子量的纳滤膜，将离子交换洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后，将浓缩的多肽溶液经冷冻干燥得到纯度95％以上的多肽冻干粉。
2、根据权利要求1所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是粗肽溶于水时，粗肽与水的质量体积比为1∶5～1∶15。
3、根据权利要求1所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是分离介质以聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯作为疏水作用骨架。
4、根据权利要求1所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是分离介质的活性基团是二乙胺乙基、二乙胺基、三乙胺乙基、季铵乙基、磺酸基、磺丙基、磷酸基或羧甲基。
5、根据权利要求1所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是采用0.001M～0.2M的无机盐溶液进行洗杂。
6、根据权利要求5所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是无机盐为pH2～14的氯化钠、氯化铵或硫酸铵溶液。
7、根据权利要求1所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是采用0.5M～2M的无机盐溶液进行洗脱。
8、根据权利要求7所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是无机盐为pH2～14的氯化钠、氯化铵或硫酸铵溶液。
9、根据权利要求1所述的对化学合成多肽大规模分离的方法，其特征是采用的纳滤膜截留分子量为150～1000道尔顿，进行浓缩脱盐。
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