CN108358989A - 一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,本发明属于生化分离技术领域,包括如下步骤:(1)胞苷发酵液加热后经陶瓷膜固液分离、超滤连续式处理得到预处理液;(2)将预处理液调酸后上强酸性阳离子交换树脂(氢型)吸附,再经氨水溶液洗脱得到洗脱液;(3)洗脱液经加热减压除氨、活性炭脱色、过滤得到脱色液;(4)脱色液经减压浓缩、醇沉结晶、过滤、淋洗、真空干燥得到含量98%以上的胞苷成品。
Description
技术领域
本发明属于生物化学分离技术领域,具体地,涉及一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法。
背景技术
胞苷(图1)是人体和动植物体内RNA的重要组成部分,在生物体内生理生化过程中起着重要的调节作用,具有多方面的生理活性。胞苷是胞磷胆碱的中间体,同时胞苷又是很多抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病等药物的原材料。随着其在应用范围上的不断扩大,对胞苷的需求也越来越大,自然对胞苷的制备研究也越来越深入。
目前国内外,关于胞苷的生产,主要有化学合成法、酶法合成法、微生物发酵合成法。虽然对于胞苷合成的方法报道有很多,但是对于胞苷分离纯化的方法却鲜有提及。
本发明中的胞苷来源于微生物,例如特定大肠杆菌发酵所得发酵液。通过基因工程手段改造大肠杆菌获得以葡萄糖或甘油为碳源合成胞苷的工业菌株,通过增殖,诱导,产物浓度中控等发酵、反应得到胞苷发酵液。此发酵液中,存在着大量的菌体与色素,以及没有被转化完的葡萄糖或甘油、无机盐等,乳清酸、尿苷、尿嘧啶等已知副产物和其他未知副产物,另外还有细胞自溶产生的杂质:蛋白和核酸等化合物。分离难度较大。本发明不仅成功实现了杂质多分离难的问题,还具备环保压力小、步骤少、成本低、品质好、收率高等优点。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的是提供一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法。此方法前期就进行***的除杂,保证胞苷结晶前就具有理想的纯度,只需进行一次结晶就能得到合格的胞苷产品。避免出现多次精制结晶导致工序繁多,以及影响收率的问题。
技术方案:本发明提供了一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,包括以下步骤:
(1)胞苷发酵液加热后经陶瓷膜固液分离、超滤膜超滤连续式预处理得到预处理液;
(2)将预处理液调酸后经过强酸性阳离子交换树脂吸附,再经氨水溶液洗脱得到洗脱液;
(3)洗脱液经加热减压除氨、活性炭脱色、过滤得到脱色液;
(4)脱色液经减压浓缩、醇沉结晶、过滤、淋洗、真空干燥得到胞苷成品。
本发明所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,方法合理,采用加热,陶瓷膜与超滤相结合的方式,除去菌体固渣、大部分色素与蛋白,得到了性状良好的预处理液,再进脱色、结晶、淋洗等步骤,可得到高纯度、高收率的胞苷成品。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述的微生物发酵液为大肠杆菌发酵液。除了可以分离大肠杆菌发酵液,还能用于其他生物发酵液的处理,适应性好,应用范围广。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(1)中胞苷发酵液加热温度为70-90℃,加热时间30-60min。条件温和,易于实现。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(1)中陶瓷膜过滤精度为0.05μm-0.8μm;超滤膜过滤精度为800-2000道尔顿。其中,0.2μm作为优选孔径。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(2)中强酸性阳离子交换树脂为氢型强酸性阳离子交换树脂;所述氢型强酸性阳离子交换树脂为001*7、Amberlite IR-120、Dowex-50、Lewatit-100、Diaion SK-1中的一种或几种。优选的是001*7。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(2)中预处理液调酸至pH2.0-3.0经过强酸性阳离子交换树脂吸附柱处理,上柱流速为1-5BV/h;洗脱液氨水pH值为11.3-11.8,洗脱流速为0.5-3BV/h。优选的是:上柱流速1.5-2.5BV/h,洗脱氨水pH11.5,洗脱流速1-1.5BV/h。通过上述离子交换柱,可以去除绝大部分杂质与盐。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(3)中加热减压除氨的终点为料液pH7.2-7.8;所述活性炭为723、727、767药用活性炭、303糖用活性炭中的一种或几种,用量为0.05-0.2%,脱色温度为40-80℃,脱色时间为30-60min。优选的是303糖用活性炭,用量为0.1%,脱色温度为60℃,脱色时间为60min。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述步骤(4)中胞苷醇沉结晶浓度为300-500g/L;结晶条件是:加入料液体积1-3倍的甲醇或者乙醇,于4-15℃、120-250rpm的条件下搅拌6-24h;晶体过滤后用80-90%甲醇或者乙醇按体积比1:1淋洗。通过步骤(4),可将少量残留盐类及其他杂质留于母液中,从而得到HPLC纯度99.8%以上,含量98%以上的胞苷成品。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,所述真空干燥温度为45-60℃。
进一步的,上述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,超滤膜优选中空纤维超滤膜,膜材料为聚醚砜,孔径为800-2000道尔顿,800-1000道尔顿作为优选。超滤温度控制在30-45℃,通过上述预处理可将发酵液中大分子蛋白质、大分子色素等进行去除。
有益效果:本发明具有以下优点:
1)本发明充分利用膜分离的前沿技术来预处理发酵液,依靠连续膜分离来预处理发酵液,均可套用至下一批,减低了产品损失率,提高了分离效率和产物收率。
2)本发明采用强酸性阳离子树脂来吸附胞苷,可以实现胞苷与杂质的有效分离;用低浓度的氨水来洗脱,不仅不会引入盐类物质(洗脱液中的残留的氨水可通过减压加热法吸收再利用),而且能去除90%以上的盐类(发酵液中被吸附在树脂上的盐很少能够被低浓度氨水洗脱下来)。结晶料液中低含盐量正是胞苷一次结晶就能合格的前提。
3)本发明只使用了极少量活性炭脱色,整个工艺产生固废很少,符合环保理念。
4)本发明无需精制就能获得合格的胞苷产品,并且收率较高,总收率在80-85%之间。
附图说明
附图1:胞苷的结构示意图;
附图2:胞苷与副产物检测谱图。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例,进一步阐明本发明,这些实施例只是为了说明问题,并不是一种限制。
实施例1 胞苷发酵液的预处理
50L胞苷发酵结束后,用蒸汽加热至80℃,保温45min后放罐得37L胞苷发酵液,其中胞苷浓度为39.2g/L,共计1450.4g。发酵液过0.2μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液,工作压力为0.3-0.5MPa,工作温度为40-60℃,当截留液体积为15L时,开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为15L左右,待截留液中胞苷浓度为3.9g/L时,结束陶瓷膜微滤。将收集到的67L陶瓷膜清液(胞苷浓度为20.7g/L)过800道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液,超滤工作压力为0.7-1.0MPa,工作温度为35-40℃,当超滤截留液体积为8L时开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为8L左右,待截留液中胞苷浓度为3g/L时,停止超滤,得到80L预处理液,其中胞苷浓度为17.1g/L,总量为1368.0g,预处理收率为94.3%。
实施例2 离子交换树脂的纯化
经试验验证,强酸性阳离子交换树脂001*7(氢型)对胞苷的吸附能力约为130mg/ml(湿树脂)。
将实施例1所得80L胞苷预处理液用盐酸调节pH3.0,以2BV/h的流速上强酸性阳离子交换树脂001*7(氢型)(15L层析柱装入11L湿树脂)。用2BV去离子水水洗树脂,水洗流速为5BV/h;然后用pH 11.5的氨水溶液对树脂进行洗脱,洗脱流速为0.5BV/h,HPLC检测流出组分,并收集HPLC纯度大于90%的高纯度组分,合并得淡黄色洗脱液37.9L,胞苷浓度为35.0g/L,胞苷总量为1326.5g,离子交换柱纯化收率为97.0%。
实施例3 离子交换洗脱液的除氨与脱色
将实施例2中所得37.9L洗脱液,减压蒸馏,水浴温度60℃,料液pH至7.2时停止旋蒸,此时体积为20L,转入到脱色罐,加入303糖用活性炭40g,60℃搅拌脱色45min,布氏漏斗抽滤得水绿色脱色液,少量热水淋洗炭饼,得到21L脱色液,胞苷浓度为61.1g/L,胞苷总量为1283.1g,脱色收率为96.7%。
实施例4 脱色液的浓缩、结晶、过滤、干燥
将实施例3所得21L胞苷脱色液,经60℃真空旋蒸至3.3L,此时胞苷浓度在400g/L左右,加入料液2倍体积的乙醇6.6L,于4℃、120rpm的条件下搅拌析晶12h;析出晶体减压抽滤并用1L 80%乙醇淋洗,淋洗后减压抽干得固体胞苷。将结晶母液与淋洗母液合并得10L,胞苷浓度为24.3g/L,留作备用。所得固体胞苷经50℃真空干燥6h后得到胞苷成品1058.1g,经检测含水量为0.09%,HPLC纯度为99.88%,含量为98.5%。胞苷结晶收率为81.2%。胞苷发酵液的一次结晶总收率为71.9%。
实施例5 母液回收
通过实施例4中合并母液的回收来提高胞苷总收率。
将实施例4中,10L胞苷浓度为24.3g/L的母液60℃减压旋蒸去除乙醇, 直至2L时停止浓缩,加入5L水,并调节pH3.0,重复实施例2,3,4步骤,进行离子交换柱纯化,洗脱液除氨脱色,浓缩,结晶,过滤,干燥等步骤,得到胞苷成品182.2g,HPLC纯度99.84%,含量98.3%,母液回收收率为73.7%。
胞苷总收率84.2%。
实施例6 胞苷发酵液的预处理
50L胞苷发酵结束后,用蒸汽加热至90℃,保温30min后放罐得38L胞苷发酵液,其中胞苷浓度为38.0g/L,共计1444.0g。发酵液过0.05μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液,工作压力为0.3-0.5MPa,工作温度为40-60℃,当截留液体积为14L时,开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为14L左右,待截留液中胞苷浓度为3.6g/L时,结束陶瓷膜微滤。将70L陶瓷膜清液(胞苷浓度为19.8g/L)过1000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液,超滤工作压力为0.7-1.0MPa,工作温度为40-45℃,当超滤截留液体积为9L时开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为9L左右,待截留液中胞苷浓度为2.7g/L时,停止超滤,得到83.6L预处理液,其中胞苷浓度为16.3g/L,总量为1362.7g,预处理收率为94.4%。
实施例7 离子交换树脂的纯化
经试验验证,强酸性阳离子交换树脂Amberlite IR-120(氢型)对胞苷的吸附能力约为125mg/ml(湿树脂)。
将实施例6所得83.6L胞苷预处理液用盐酸调节pH2.0,以1BV/h的流速上强酸性阳离子交换树脂Amberlite IR-120(氢型)(15L层析柱装入11L湿树脂)。用2BV去离子水水洗树脂,水洗流速为3BV/h;然后用pH 11.8的氨水溶液对树脂进行洗脱,洗脱流速为1.5BV/h,HPLC检测流出组分,并收集HPLC纯度大于90%的高纯度组分,合并得洗脱液35.2L,胞苷浓度为37.3g/L,胞苷总量为1313.0g,离子交换柱纯化收率为96.4%。
实施例8 离子交换洗脱液的除氨与脱色
将实施例7中所得35.2L洗脱液,减压蒸馏,水浴温度60℃,料液pH至7.8时停止旋蒸,此时体积为24.2L,转入到脱色罐,加入767药用活性炭24g,80℃搅拌脱色30min,布氏漏斗抽滤得脱色液,少量热水淋洗炭饼,得到25.5L脱色液,胞苷浓度为50.0g/L,胞苷总量为1275.0g,脱色收率为97.1%。
实施例9 脱色液的浓缩、结晶、过滤、干燥
将实施例8所得25.5L胞苷脱色液,经60℃真空旋蒸至4.3L,此时胞苷浓度在300g/L左右,加入料液3倍体积的乙醇12.9L,于10℃、200rpm的条件下搅拌析晶24h;析出晶体减压抽滤并用1L 90%乙醇淋洗,淋洗后减压抽干得固体胞苷。将结晶母液与淋洗母液合并得17.0L,胞苷浓度为17.3g/L,留作备用。所得固体胞苷经60℃真空干燥5h后得到胞苷成品1005.1g,经检测含水量为0.06%,HPLC纯度为99.84%,含量为98.2%。胞苷结晶收率为77.4%。胞苷发酵液的一次结晶总收率为68.4%。
实施例10 母液回收
通过实施例9中合并母液的回收来提高胞苷总收率。
将实施例9中,17.0L胞苷浓度为17.3g/L的母液60℃减压旋蒸去除乙醇,直至2.2L时停止浓缩,加入5L水,并调节pH2.0,重复实施例7,8,9步骤,进行离子交换柱纯化,洗脱液除氨脱色,浓缩,结晶,过滤,干燥等步骤,得到胞苷成品224.3g,HPLC纯度99.80%,含量98.0%,母液回收收率为74.7%。
胞苷总收率83.6%。
实施例11 胞苷发酵液的预处理
50L胞苷发酵结束后,用蒸汽加热至70℃,保温60min后放罐得38.2L胞苷发酵液,其中胞苷浓度为41.2g/L,共计1573.8g。发酵液过0.8μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液,工作压力为0.3-0.5MPa,工作温度为40-60℃,当截留液体积为16L时,开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为16L左右,待截留液中胞苷浓度为4.0g/L时,结束陶瓷膜微滤。将收集到的70.2L陶瓷膜清液(胞苷浓度为21.5g/L)过2000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液,超滤工作压力为0.9-1.2MPa,工作温度为30-35℃,当超滤截留液体积为8L时开始往截留液中补去离子水,补水速度与清液流出速度相当,尽量维持截留液体积为8L左右,待截留液中胞苷浓度为3g/L时,停止超滤,得到81.6L预处理液,其中胞苷浓度为18.2g/L,总量为1485.0g,预处理收率为94.4%。
实施例12 离子交换树脂的纯化
经试验验证,强酸性阳离子交换树脂Diaion SK-1(氢型)对胞苷的吸附能力约为120mg/ml(湿树脂)。
将实施例11所得81.6L胞苷预处理液用盐酸调节pH2.5,以5BV/h的流速上强酸性阳离子交换树脂Diaion SK-1(氢型)(15L层析柱装入11L湿树脂)。用2BV去离子水水洗树脂,水洗流速为5BV/h;然后用pH 11.3的氨水溶液对树脂进行洗脱,洗脱流速为3BV/h,HPLC检测流出组分,并收集HPLC纯度大于90%的高纯度组分,合并得淡黄色洗脱液45.7L,胞苷浓度为31.2g/L,胞苷总量为1425.8g,离子交换柱纯化收率为96.0%。
实施例13 离子交换洗脱液的除氨与脱色
将实施例12中所得45.7L洗脱液,减压蒸馏,水浴温度60℃,料液pH至7.5时停止旋蒸,此时体积为21L,转入到脱色罐,加入723药用活性炭23g,40℃搅拌脱色60min,布氏漏斗抽滤得水绿色脱色液,少量热水淋洗炭饼,得到22L脱色液,胞苷浓度为62.8g/L,胞苷总量为1381.6g,脱色收率为96.9%。
实施例14 脱色液的浓缩、结晶、过滤、干燥
将实施例13所得22L胞苷脱色液,经60℃真空旋蒸至2.9L,此时胞苷浓度在500g/L左右,加入料液1倍体积的甲醇2.9L,于15℃、250rpm的条件下搅拌析晶6h;析出晶体减压抽滤并用1L 85%甲醇淋洗,淋洗后减压抽干得固体胞苷。将结晶母液与淋洗母液合并得5.3L,胞苷浓度为29.4g/L,留作备用。所得固体胞苷经45℃真空干燥6h后得到胞苷成品1250.0g,经检测含水量为0.10%,HPLC纯度为99.88%,含量为98.1%。胞苷结晶收率为88.8%。胞苷发酵液的一次结晶总收率为77.9%。
实施例15 母液回收
通过实施例14中合并母液的回收来提高胞苷总收率。
将实施例14中,5.3L胞苷浓度为29.4g/L的母液60℃减压旋蒸去除甲醇, 直至2L时停止浓缩,加入5L水,并调节pH2.5,重复实施例12,13,14步骤,进行离子交换柱纯化,洗脱液除氨脱色,浓缩,结晶,过滤,干燥等步骤,得到胞苷成品120.1g,HPLC纯度99.82%,含量98.5%,母液回收收率为75.9%。
胞苷总收率85.4%。
实施例16 HPLC测定胞苷和相关副产物
样品用去离子水稀释一定的倍数,离心过0.22μm的滤膜,用高效液相色谱(HPLC)检测,HPLC的参数如下:采用Agilent SB C18 4.6*150mm 5μm,流动相为甲醇和10mM PBS(pH4.0),流动相比例0.01-2.80分钟甲醇比例为2%,2.80-3.50分钟甲醇比例由2%上升到10%,3.50-3.60分钟甲醇比例由10%降至2%,3.60-8.5分钟甲醇比例为2%,利用紫外检测器检,测波长260 nm;初始流动相的流速为1.0 mL/min,发酵液的上样量5μL,柱温30℃。胞苷出峰时间为 3.580分钟,尿嘧啶出峰时间为2.581分钟,乳清酸出峰时间为1.780分钟,HPLC图谱如图2所示。
以上所述仅是发明的几个实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)胞苷发酵液加热后经陶瓷膜固液分离、超滤膜超滤连续式预处理得到预处理液;
(2)将预处理液调酸后经过强酸性阳离子交换树脂吸附,再经氨水溶液洗脱得到洗脱液;
(3)洗脱液经加热减压除氨、活性炭脱色、过滤得到脱色液;
(4)脱色液经减压浓缩、醇沉结晶、过滤、淋洗、真空干燥得到胞苷成品。
2.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述的微生物发酵液为大肠杆菌发酵液。
3.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(1)中胞苷发酵液加热温度为70-90℃,加热时间30-60min。
4.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(1)中陶瓷膜过滤精度为0.05μm-0.8μm;超滤膜过滤精度为800-2000道尔顿。
5. 根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(2)中强酸性阳离子交换树脂为氢型强酸性阳离子交换树脂;所述氢型强酸性阳离子交换树脂为001*7、Amberlite IR-120、Dowex-50、Lewatit-100、Diaion SK-1中的一种或几种。
6.根据权利要求1或5所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(2)中预处理液调酸至pH2.0-3.0经过强酸性阳离子交换树脂吸附柱处理,上柱流速为1-5BV/h;洗脱液氨水pH值为11.3-11.8,洗脱流速为0.5-3BV/h。
7.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(3)中加热减压除氨的终点为料液pH7.2-7.8;所述活性炭为723、727、767药用活性炭、303糖用活性炭中的一种或几种,用量为0.05-0.2%,脱色温度为40-80℃,脱色时间为30-60min。
8.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述步骤(4)中胞苷醇沉结晶浓度为300-500g/L;结晶条件是:加入料液体积1-3倍的甲醇或者乙醇,于4-15℃、120-250rpm的条件下搅拌6-24h;晶体过滤后用80-90%甲醇或者乙醇按体积比1:1淋洗。
9.根据权利要求8所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述真空干燥温度为45-60℃。
10.根据权利要求1或4所述的从微生物发酵液中分离纯化胞苷的方法,其特征在于:所述超滤膜为中空纤维超滤膜,膜材料为聚醚砜;超滤温度为30-45℃,超滤压力为0.7-1.2MPa。
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