CN107827977A - 一种基于离子交换树脂纯化乌司他丁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种基于离子交换树脂纯化乌司他丁的方法。该方法先用壳聚糖和甲壳素的混合物吸附分离得到乌司他丁粗品,然后将粗品与海藻酸盐混合后依次进行超滤、离子交接树脂纯化、超滤,最后将超滤后得到的截留液冷冻干燥,得到乌司他丁纯品。由本申请提供的基于离子交换树脂纯化乌司他丁的方法,缩短了纯化工艺,乌司他丁的收率和纯度高,其中,乌司他丁的收率达到88%;比活力达到5100IU/mg蛋白。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法。
背景技术
乌司他丁系从男性尿中分离纯化出的一种酸性糖蛋白。据文献报道,其是由143个氨基酸组成,在第10位丝氨酸和45位天冬氨酸上有糖链,结构表面含有大量非极性疏水基团,如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸等。乌司他丁的分子量经HPLC法测定为60~70KD,经SDS-PAGE测定为40~50KD,等电点位于2-3之间。
由于结构中的两个活性功能区均具有很广的抑酶谱,所以能同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性;而且,乌司他丁分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。乌司他丁不仅是一种广谱的蛋白酶抑制剂,还具有抑制心肌抑制因子的产生、改善休克时的循环状态、稳定溶酶体膜、抑制炎症介质的释放等功能。大量临床试验结果显示,乌司他丁在治疗急性胰腺炎、辅助治疗休克、改善手术刺激引起的免疫功能下降、尤其是减少体外循环并发症等方面有重要的作用,加上其本身来源于人体,无免疫原性,安全性高。
但由于尿液中乌司他丁的含量较少,其分离及纯化工艺成为制约其应用的关键因素。
关于乌司他丁的分离及纯化方法,国内报道较少。经检索,已公开的中国专利申请文献仅21篇。公开的乌司他丁的纯化方法均采用多次树脂柱进行纯化。但对于一定体积的尿液,纯化工艺越复杂,在一定程度上可以提高乌司他丁的纯度,而乌司他丁的收率却受到影响。如何协调乌司他丁的纯化工艺与其收率及纯度的关系,成为科研人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题,提供一种基于两性离子交换树脂纯化乌司他丁的方法,以在保证乌司他丁的纯度和收率的同时,减化其纯化工艺,达到节约成本、减少时间和人力成本的目的。
为了实现上述发明目的,本发明提供了一种基于离子交换树脂纯化乌司他丁的方法,其具体步骤如下:
1)取澄清尿液,调节pH至6-6.5,用纱布过滤,得滤液,边搅拌边加入壳聚糖-甲壳素混合物,调节pH为3-5,搅拌至吸附完全,过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
2)向乌司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,
向溶液中加入海藻酸盐,搅拌,静置,离心,得下层沉淀物1,向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5,超滤,得截留液1;
3)调节截留液1的pH=6-6.5,将其上两性离子交换树脂,然后用pH=6-6.520的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1;
4)将洗脱液1超滤,得截留液2;
5)将截留液2冷冻干燥,即得纯乌司他丁。
优选地,本发明提供的基于阴离子交换树脂纯化乌司他丁的方法,其具体步骤如下:
1)取澄清尿液,调节pH至6-6.5,以每t尿液用两层纱布过滤,得滤液,边搅拌边向滤液中以每t尿液加入8-12kg壳聚糖-甲壳素混合物的比例加入壳聚糖-甲壳素混合物,调节pH为3-5,搅拌至吸附完全过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
2)向乌司他丁粗品中加入pH=3-5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,得混合液1;
调节混合液1的pH=6-6.5,将其上阴离子交换树脂,然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1;
3)将洗脱液1浓缩,将其以80-120mL/min的速度通过两性离子交换树脂,然后用pH=6-6.5的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液2;
4)将洗脱液2在压力为0.1-0.5MPa、温度为4-30℃、截留分子量为3×104的条件下超滤,得截留液2;
5)将截留液2冷冻干燥,即得纯乌司他丁。
优选地,步骤1)所述壳聚糖与甲壳素的质量比为(3-8):1,所述壳聚糖的脱乙酰度大于95%,分子量为8万-15万;
优选地,超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜;
进一步优选为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜。
优选地,所述超滤膜的结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种;进一步优选为内压式中空纤维超滤膜。
优选地,步骤2)中所述的海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾,分子量为2万-5万。
优选地,步骤3)中所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠或磷酸氢二钾缓冲液。
优选地,步骤2)中所述的阴离子交换树脂选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂或强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂的混合物;
优选地,步骤3)中所述的两性离子交换树脂选自强碱-弱酸型、强酸-弱碱型或弱酸-弱碱型;
进一步优选地,强碱性阴离子交换树脂为Amberlite IRA400、Amberlite25IRA402、Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一种;
弱碱性阴离子交换树脂为Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、Amberlite IRA68和Amberlite IRA63中的至少一种。进一步优选地,两性离子交换树脂选自强碱-弱酸型。
进一步优选地,强碱-弱酸型两性离子交换树脂中的强碱选自SO4 2-、NO3 -、Cl-、OH-、F-或HCO3 -强碱性阴离子交换树脂,强碱-弱酸型两性离子交换树脂中的弱酸选自H+、Fe3+、Al3+、Ca2+、Mg2+、K+或Na+弱酸性阳离子交换树脂
优选地,步骤4)中截留液2的体积为洗脱液1体积的1/10-1/20。其中,步骤1)中操作“氨水洗脱、硫酸铵盐析、静置、沉淀、干燥”按本领域常规技术手段进行。
超滤过程中每隔2-3小时对滤膜进行反洗。
与现有技术相比,本申请所提供的基于两性离子交换树脂纯化乌司他丁的方法具有如下优点:
(1)利用壳聚糖与甲壳素的混合物进行吸附,提高了乌司他丁的收率。
(2)利用海藻酸盐与酸性糖蛋白(乌司他丁)的静电吸附作用,增大超滤膜的截留分子量,同时可除去与乌司他丁分子量较接近的杂质分子,提高了超滤的精确度。
(3)本申请采用两性离子交换树脂的方法,与单独采用一种阴离子交换树脂或阳离子交换树脂相比,提高了产物的纯化效率,并且两性树脂在反应失效后,不需要用酸、碱等再生剂,只需用大量的水淋洗,即可使树脂得到再生,恢复原有的交换能力。
(4)本申请纯化工艺简单,且乌司他丁的比活力高达到4900IU/mg蛋白(1个IU的定义为:以BAEE为底物,在25度时,每分钟使△A253增加0.001所需的乌司他丁的量);收率高达90%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的,而不限制本发明的范围和实质。
实施例1
1)取1t澄清尿液,调节pH至6,用纱布过滤,边搅拌边向滤液中加入8kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖:甲壳素=3:1),调节pH为4,搅拌至吸附完全,过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
2)向乌司他丁粗品中加入pH=5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,继续向溶液中以乌司他丁粗品:海藻酸钠=1:0.01的比例加入海藻酸钠(分子量为2万),搅拌,静置,离心,得下层沉淀物1,向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH=6,超滤得截留液1;其中,超滤的压力为0.2MPa、温度为30℃、截留分子量为5×104;
3)调节截留液1的pH=6,将其以80mL/min的速度通过两性离子交换树脂(CaSO4),然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1,
4)将洗脱液1在压力为0.1MPa的条件下,用截留分子量为3×104的超滤膜超滤得截留液2,其中,截留液2为截留液体积的1/20,
5)将截留液2冷冻干燥,所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
其中,本实施例所用超滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜(聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的活化层同向设置),膜结构为内压式中空纤维超滤膜;超滤膜的具体结构参数及超滤具体工艺采用本领域常规技术手段。
实施例2
1)取1t澄清尿液,调节pH至6.5,用纱布过滤,边搅拌边向滤液中加入12kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖:甲壳素=8:1),调节pH为5,搅拌至吸附完全,过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
2)向乌司他丁粗品中加入pH=5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,继续向溶液中以乌司他丁粗品:海藻酸钠=1:0.03的比例加入海藻酸钠(分子量为5万),搅拌,静置,离心,得下层沉淀物1,向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH=6.5,超滤得截留液1;其中,超滤的压力为0.2MPa、温度为30℃、截留分子量为5×104;
3)调节截留液1的pH=6,将其以120mL/min的速度通过两性离子交换树脂(NaHCO3),然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1,
4)将洗脱液1在压力为0.1MPa的条件下,用截留分子量为3×104的超滤膜超滤得截留液2,其中,截留液2为截留液体积的1/10,
5)将截留液2冷冻干燥,所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
其中,本实施例所用超滤膜为聚偏氟乙烯膜,具体结构参数及超滤具体工艺同实施例1。
实施例3
1)取1t澄清尿液,调节pH至6.5,用纱布过滤,边搅拌边向滤液中加入12kg壳聚糖-甲壳素混合物(壳聚糖:甲壳素=5:1),调节pH为4,搅拌至吸附完全,过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
2)向乌司他丁粗品中加入pH=5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,得混合液1;
调节混合液1的pH=6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂AmberliteIRA400,然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1;
3)将洗脱液1浓缩至原体积的1/40,将其以120mL/min的速度通过两性离子交换树脂(Fe(OH)3),然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和1mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液2,
4)将洗脱液2在压力为0.1MPa的条件下,用截留分子量为3×104的超滤膜超滤得截留液2,其中,截留液2为截留液体积的1/10,
5)将截留液2冷冻干燥,所得白色固体粉末即为乌司他丁纯品。
其中,本实施例所用超滤膜为聚偏氟乙烯膜,具体结构参数及超滤具体工艺同实施例1。
实施例4
1)取1t澄清尿液,调节pH至6,加入8kg甲壳素,搅拌至吸附完全,过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
2)向乌司他丁粗品中加入pH=5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,得混合液1;
调节混合液1的pH=6,将其以120mL/min的速度通过阴离子交换树脂AmberliteIRA400,然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1;
3)将洗脱液1浓缩至原体积的1/30,以120mL/min的速度通过两性离子交换树脂(Al(OH)3),然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液2;
4)将洗脱液2在压力为0.1MPa的条件下、温度为4-30℃、用截留分子量为3×104的超滤膜超滤得截留液2,其中,截留液2为截留液体积的1/20;
5)将截留液2冷冻干燥,所得淡黄色固体粉末即为乌司他丁纯品。
实施例5:结果表征
对实施例1-4回收得到的乌司他丁纯品的收率、活性、纯度及人尿激肽原酶的含量进行测定,具体结果如下表1。
其中,取实施例1-4制得的乌司他丁纯品采用《中国药典》(2010)乌司他丁项目下的激肽原酶含量方法进行测定。
表1、实施例1-4分离纯化得到的乌司他丁的收率、活性、纯度及人尿激肽原酶的含量测定结果
上述实施例仅作为解释本发明的目的,本发明的范围不受此限制。对本领域的技术人员来说所做的修改是显而易见的,本发明仅受所附权利要求范围的限制。
Claims (9)
1.一种基于离子交换树脂纯化乌司他丁的方法,其具体步骤如下:
(1)取澄清尿液,调节pH至6-6.5,以每t尿液用两层纱布过滤,得滤液,边搅拌边向滤液中以每t尿液加入8-12kg壳聚糖-甲壳素混合物的比例加入壳聚糖-甲壳素混合物,调节pH为3-5,搅拌至吸附完全过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
(2)向乌司他丁粗品中加入pH=5-5.5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,继续向溶液中以乌司他丁粗品:海藻酸盐=1:(0.01-0.03)的比例加入海藻酸盐,搅拌,离心,得下层沉淀物1,向沉淀物1中加入硫酸铵缓冲溶液使pH至6-6.5,超滤,得截留液1;超滤条件为:压力为0.2-0.6MPa、温度为4-30℃、截留分子量为5×104-7×104;
(3)调节截留液1的pH至6-6.5,将其以80-120mL/min的速度通过两性离子交换树脂,然后用pH=6-6.5的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1;
(4)将洗脱液1在压力为0.1-0.5MPa、温度为4-30℃、截留分子量为3×104的条件下超滤,得截留液2;
(5)将截留液2冷冻干燥,即得纯乌司他丁。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,该方法具体步骤如下:
(1)取澄清尿液,调节pH至6-6.5,以每t尿液用两层纱布过滤,得滤液,边搅拌边向滤液中以每t尿液加入8-12kg壳聚糖-甲壳素混合物的比例加入壳聚糖-甲壳素混合物,调节pH为3-5,搅拌至吸附完全过滤,弃去尿液,用水洗涤去除残尿及杂质,至澄清;用氨水搅拌洗涤壳聚糖-甲壳素,过滤得滤液;滤液加入硫酸铵盐析,搅拌溶解后,静置、沉淀,将过滤所得固体干燥后即得乌司他丁粗品;
(2)向乌司他丁粗品中加入pH=3-5的醋酸钠-醋酸缓冲溶液至完全溶解,得混合液1;
调节混合液1的pH=6-6.5,将其上阴离子交换树脂,然后用pH=6的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和2mol/L NaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液1;
(3)将洗脱液1浓缩,将其以80-120mL/min的速度通过两性离子交换树脂,然后用pH=6-6.5的磷酸盐缓冲液和0.8-2mol/LNaCl的混合溶液进行洗脱,得洗脱液2;
(4)将洗脱液2在压力为0.1-0.5MPa、温度为4-30℃、截留分子量为3×104的条件下超滤,得截留液2;
(5)将截留液2冷冻干燥,即得纯乌司他丁。
3.根据权利要求1或2所述的方法,超滤所用的超滤膜为聚醚砜膜、聚丙烯膜、再生纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚砜膜和聚偏氟乙烯膜中的一种或至少两种的复合膜;所述超滤膜的结构为中空纤维式、平板式、管式和卷式中的一种。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述超滤膜为聚醚砜膜和醋酸纤维素膜的复合膜;所述超滤膜的结构为内压式中空纤维超滤膜。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤(1)中所述的壳聚糖与甲壳素的质量比为(3-8):1,所述壳聚糖的脱乙酰度大于95%,分子量为8-15万;步骤(2)中所述的海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾,分子量为2-5万。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤(3)中所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠或磷酸氢二钾缓冲液;
步骤(2)中所述的阴离子交换树脂选自强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂或强碱性阴离子交换树脂与弱碱性阴离子交换树脂的混合物;
步骤(3)中所述的两性离子交换树脂选自强碱-弱酸型、强酸-弱碱型或弱酸-弱碱型。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述的强碱性阴离子交换树脂为AmberliteIRA400、Amberlite IRA402、Amberlite IRA900和Amberlite IRA910中的至少一种;
所述的弱碱性阴离子交换树脂为Amberlite IRA93、Amberlite IRA94、15 AmberliteIRA68和Amberlite IRA63中的至少一种;所述的两性离子交换树脂选自强碱-弱酸型。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其中,所述的强碱-弱酸型两性离子交换树脂中的强碱选自SO4 2-、NO3 -、Cl-、OH-、F-或HCO3 -强碱性阴离子交换树脂,强碱-弱酸型两性离子交换树脂中的弱酸选自H+、Fe3+、Al3+、Ca2+、Mg2+、K+或Na+弱酸性阳离子交换树脂。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤(4)中的截留液2的体积为洗脱液1体积的1/10-1/20。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180323 |
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