CH668080A5 - Verfahren zur erzeugung eines proteins und rekombinante plasmid-vektoren. - Google Patents

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CH668080A5 CH8157/81A CH815781A CH668080A5 CH 668080 A5 CH668080 A5 CH 668080A5 CH 8157/81 A CH8157/81 A CH 8157/81A CH 815781 A CH815781 A CH 815781A CH 668080 A5 CH668080 A5 CH 668080A5
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Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Proteins gemäss dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und rekombinante Plasmid-Vektoren wie sie in den Patentansprüchen 6,10 und 11 definiert sind.
Die jüngste Entwicklung in der Molekularbiologie hat neue Möglichkeiten für die Erzeugung von Proteinen in Bakterien unter Benutzung der DNS-Rekombinations-Technik eröffnet. Mittels der DNS-Rekombinations-Technik ist es möglich, Proteine der Prokaryot- und Eukaryotzellen in Bakterien durch Fügen des Gens des gewünschen Proteins zu einer der Regelungseinheiten des eigenen Gens des Wirtbak-teriums zu erzeugen, wobei irgendein Fremdgen zum Ausdruck gebracht wird. Ausserdem kann die Menge der Kopien des gewünschten Gens in einer Zelle durch Fügen des Gens zu einem solchen Plasmid- oder Virus-DNS-Molekül, welches in der Zelle als mehrere, im allgemeinen als 10 bis 100 Kopien auftritt, erhöht werden. Wenn die Menge der Kopien eines gewissen Gens in einer Zelle höher wird, folgt daraus im allgemeinen auch eine entsprechende Steigerung der Synthese des vom Gen zum Ausdruck gebrachten Proteins.
Mehrere Versuche von diesem Typ sind schon unter Benutzung von E. coli als Wirtbakterium vorgenommen. In der Benutzung von E. coli als Klonungswirt im industriellen Massstab in der Erzeugung von Proteinen gibt es jedoch folgende Nachteile:
i) E. coli ist ein Darmkanalbakterium des Menschen und bildet so eine potentielle Gesundheitsgefährdung in der Massenproduktion.
ii) Wenn E. coli verwendet wird, werden die Produkte innerhalb der Zelle bleiben, weshalb die Zellen zuerst eingesammelt, zerbrochen und dann das erwünschte Produkt von den anderen Komponenten der Zelle gereinigt werden müssen; einige von diesen Komponenten sind toxisch (Endotoxin des E. coli).
iii) Bei Erzeugung von Proteinen im Inneren der Zelle kann das fremde Protein unter der Einwirkung der inneren Proteasen der Zelle gespaltet werden oder das fremde Protein kann das Wachsen der Zelle verhindern; in den beiden Fällen wird die Ausbeute des gewünschten Proteins kleiner sein.
Eine wichtige Besserung in der industriellen Produktion würde es sein, wenn das Wirtbakterium das gewünschte Genprodukt gerade in den Nährboden ausserhalb der Zelle absondern könnte und wenn man zum Gebrauch von einem anderen, nicht pathogenen Bakterium anstatt des E. coli übergehen könnte. Man hat feststellen können, dass die Absonderung des Proteins ausserhalb der Zelle aus der sogenannten Signalsequenz herkommt, die dem ersten Teil des abzusondernden Proteins vorangeht (Blöder, G. und Dobberstein, B., J. of Cell Biology 67: 835-862 [1975]) und die gleichartig in den Pro- und Eukaryotzellen ist (Wakesman et al., Biophysica Acta 604: 249-296 [1980]). Die DNS-Rekombinations-Technik hat es ermöglicht, dass man jedes beliebige DNS, das die Signalsequenz des abzusondernden Proteins kodiert, isolieren und dasselbe an das gewünschte Gen fügen kann.
In der veröffentlichten Patentanmeldung FI 791 842 wird dieser allgemeine Grundsatz angewendet durch Fügen eines fremden Gens (z.B. Insulin) zur Schnittstelle des Restriktionsenzyms, die in der Mitte der TEM ß-Laktamase des E. coli liegt, wobei das entstandene Fusionsprotein in den sogenannten periplasmischen Raum zwischen den zwei Zellmembranen des E. coli zur Absonderung gebracht werden kann.
Obwohl man auch auf diese Weise das Produkt von den inneren Proteasen der Zelle schützen könnte, bleiben auch in diesem Verfahren die Grundprobleme des Gebrauches von E. coli bestehen: die potentielle Gesundheitsgefährdung in der Massenproduktion und die schwierigen Isolierungs- und Reinigungsprobleme, weil auch in diesem Falle das Produkt noch innerhalb der E. coli-Zelle bleiben wird. Ähnliche abzusondernde Hybridproteine hat man in dem E. coli auch mittels Genfusionstechnik hergestellt (Casadaban, M. Proc. Nati. Acad. Sei. USA 72: 809-813 [1975]).
Die Verwendung der Bakterien der Gattung Bacillus als Klonungswirt steht erst nur an ihrem Anfang; dieses kommt 65 daher, dass man weniger von der Technik der Bakterien dieser Gattung weiss als von dem E. coli (Gryczan, T. et al., Molecular General Genet. 177: 459-467 [1979], Keggins, K.M. et al., Proc. Nati. Acad. Sei USA 75:1423-1427 [1978],
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Yoneda, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 91 : 1556-1564 [1979]). Weil die Bakterien der Gattung Bacillus jedoch mehrere verschiedene Proteine direkt in ihre Nährböden absondern, z.B. Proteasen, a-Amylase, Ribonuclease und Penicillinase (Priest, F., Bacteriol. Rev. 41:711-753 [1977]) und viele von diesen Bakterien Apathogene sind, stellen sie eine potentiell wichtige Klonungswirtgruppe in der Entwicklung der industriellen Proteinproduktion dar.
In der veröffentlichten Patentanmeldung FI 810 722 hat man einen entsprechenden allgemeinen Grundsatz verwandt durch Bilden von einem Bacillus-Vektor, wo ein Fremdgen an den Promotor- und Signalteil des penP-Gens, der aus dem B. licheniformis herstammt, gefügt ist. Abgesehen davon, dass der Ausdruckgrad des Gens bedeutend geringer als derjenige des a-Amylasegens des erfindungsgemässen Verfahrens ist (Palva, I, Gene - im Druck), hat das Absonderungssignal des Produktes des penP-Gens eine ganz exzeptionelle Struktur (Lai et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 78:3506-3510 [1981]), weshalb es vorkommen kann, dass ein grosser Teil von dem synthetisierten Protein fest an der Wand der Zelle bleiben wird. Die Befreiung der Penicillinase oder des Produktes des Fremdgens, das an das Signal der Penicillinase gefügt ist, an die Nährböden fordert offensichtlich die Einwirkung der unspezifischen Exoproteasen der Zelle, von denen man unbedingt wegen des Erhaltens des fremden Genproduktes befreit werden soll (Palva, I. - Doktorarbeit). Somit wird der bemerkenswerte Vorteil des Gebrauches von Bacillus, die Absonderung des Produktes direkt an den Nährboden, bei der Verwendung von penP-Gen nicht erzielt. Die a-Amylase und die Produkte, die an die Signalsequenz derselben gefügt sind, werden dagegen effektiv direkt an den Nährboden abgesondert.
In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Proteins durch Bakterien der Gattung Bacillus unter Einfügen von DNS, die das Protein codiert, mittels DNS-Rekombinations-Technik in einen rekombinanten Plasmid-Vektor nach dessen Absonderungssignal, welches dem Regelungsteil folgt, Transformieren von Bakterien der Gattung Bacillus mit dem erhaltenen Vektor und Kultivierung der transformierten Bakterien dargestellt. Das Gen der a-Amylase des B. amyloliquefaciens wurde zur Erzeugung des Absonderungsvektors gewählt, weil es einen effektiven Promotorteil enthält und weil all das synthetisierende Enzym in den Nährboden abgesondert wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren der eingangs beschriebenen Art zeichnet sich dadurch aus, dass der rekombinante Plasmid-Vektor, dem die für das Protein codierende DNS eingefügt wird, ein Plasmid ist, das in Bakterien der Gattung Bacillus in mehreren Kopien auftritt und den Regelungsteil des Gens, das die a-Amylase des Bacillus amyloliquefaciens codiert und dessen Absonderungssignal enthält.
Das in Figur 1 dargestellte Flussschema, veranschaulicht schematisch die Isolierung des Gens, das die a-Amylase des Bacillus amyloliquefaciens codiert. Aus einem a-Amylase erzeugenden Bakterium der Gattung Bacillus wird das ganze Genom des Bakteriums isoliert, welches Genom mittels eines Restriktionsenzyms gespalten wird. Die DNS-Abschnitte von erwünschter Grösse werden mit einem mittels eines Restriktionsenzyms geöffneten Plasmidmolekül zusammengefügt. Das Genom des Bakteriums kann mit dem Restriktionsenzym Mbo I gespaltet und als Plasmid pUB 110 verwendet werden, welches pUB 110 mit dem Restriktionsenzym BamH I geöffnet werden kann. Es ist zu beachten, dass ein entsprechendes rekombinantes DNS-Molekül auch unter Benutzung von anderen Restriktionsenzymen oder Plasmiden erzeugt werden kann, und ein mit diesem Gebiet vertrauter Fachmann verschiedene Restriktionsenzym-Plasmid-Kombinationen wählen kann.
Die nach der Zusammenfügung der DNS-Abschnitte und der Plasmidmoleküle entstandenen rekombinanten DNS-Moleküle werden zum Wirtbakterium übertragen, und unter diesen werden die Bakterienzellen gesiebt, die das ans Plas-5 mid gefügte, a-Amylase kodierende Gen erhalten haben. Das Sieben gründet sich auf die von der transformierten Zelle erhaltene Fähigkeit a-Amylase zu erzeugen.
Als Wirtbakterium wird vorzugsweise ein B.-subtilis-Stamm verwendet. Nachdem zum Stamm das oben genannte 10 rekombinante DNS-Molekül übertragen worden ist, tritt das a-Amylase kodierende Gen im Stamm als etwa 50 Kopien auf. Dies macht die a-Amylasenerzeugung des Stammes etwa 500fach im Vergleich zu einem normalen B.-subtilis-Stamm. Die Erhöhung der a-Amylasenerzeugung aufs 500fache 15 kommt teils aus dem Regelungsteil des a-Amylasegens des B-amyloliquefaciens-Stammes, der etwa lOmal effektiver ist als der Regelungsteil des B.-subtilis-a-Amylasegens, und teils aus der Zunahme der Anzahl des a-Amylasegens aufs 50fache. Unter Laborverhältnissen erzeugt ein B.-subtilis-20 Stamm, der ein rekombinantes DNS-Molekül enthält, etwa 3-bis 5mal mehr a-Amylase als der für die Isolierung des Gens benutzte B.-amyloliquefaciens-Stamm.
Das rekombinante DNS-Molekül wird aus dem B.-subti-lis-Stamm isoliert und mittels der Ermittlung der Restriktionsenzyme und der Basenordnung charakterisiert. In der Figur 2 werden die im a-Amylasegen des erhaltenen rekombinanten DNS-Moleküls pKTHlO oder im Regelungsteil desselben gelegenen einmaligen Schnittstellen der Restriktionsenzyme und die allgemeine Struktur des rekombinanten 30 DNS-Moleküls dargestellt. In der Figur 3 wird ein Teil der Basenordnung des a-Amylasegens mit Beginn vom Schnittpunkt des Restriktionsenzyms EcoR I dargestellt.
Das rekombinante DNS-Molekül besteht aus Regelungs-35 und Absonderungssignalen des Bacillus-a-Amylasegens und aus einem in Bakterien der Gattung Bacillus als mehrere Kopien auftretenden Plasmidmolekül so, dass das Gen jedes beliebigen Proteins nach dem Absonderungssignal des a-Amylasegens gefügt werden kann, wobei das erwünschte Pro-40 tein in Bakterien der Gattung Bacillus erzeugt werden kann. Die Erzeugung dieses rekombinanten DNS-Molekül wird in der Figur 4 dargestellt.
Aus dem rekombinanten DNS-Molekül, das das a-Amyla-segen enthält, wird zunächst der grösste Teil des Strukturgens 45 von a-Amylase durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym EcoR I entfernt. Das somit erhaltene DNS-Molekül wird mit dem Restriktionsenzym geöffnet, und zur Entfernung des restlichen Strukturteils des a-Amylasegens wird das Molekül mit Exonuklease III und Sl-Nuklease abgekürzt, wonach die so Zweifaserigkeit der Molekülenden mit Inverttranskriptase-nenzym sichergestellt wird. Hiernach wird zum geöffneten und abgekürzten Molekül ein die Schnittstelle EcoR I enthaltendes DNS-Fugenmolekül (DNA-Linker) gefügt. Die . Lage des Fugenmoleküls im rekombinanten DNS-Molekül 55 wird dadurch ermittelt, dass die DNS-Basenordnung der Fugenstelle untersucht wird. Die letzten Nukleotide im Strukturgen der a-Amylase werden durch DNS-Polymerase-I-Be-handlung entfernt, und das neue Fugenmolekül wird zum Schlusspunkt des Absonderungssignals des a-Amylasegens 6o gefügt. Zu diesem im Fugenmolekül vorkommenden Öffnungspunkt des Restriktionsenzyms kann das Strukturgen jedes beliebigen anderen Proteins gefügt werden, z.B. das ß-Laktamasegen von E-coli, oder eine die Aminosäuren von jedem beliebigen a-, ß- oder y-Interferon kodierende DNS-65 Sektion oder deren Teil. Das vom gefügten Gen kodierte Protein entsteht jetzt in Bakterien der Gattung Bacillus mittels der Regelungs- und Absonderungssignale des a-Amylase-gens.
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Isolierung, Reinigung und Spaltung des Genoms aus Bakterien der Gattung Bacillus
Als Bakterienstamm wurde ein B.-amyloliquefaciens-Stamm verwendet. Der Stamm wurde über Nacht in einer reichen Nahrungsflüssigkeit kultiviert, die Zellen wurden gesammelt und mit einem 0,0015 M Natriumzitrat-0,015 m-NaCl-Puffer gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden suspendiert (2-1011 Zellen, d.h. eine Kulturmenge von 200 ml) in 2 ml von 20% w/v Saccharose-50 mM Tris-HCL-Lösung bei pH 8,0). Hierzu wurden 20 mg Lysozym, 20 mg Pronase und 2 ml 1% w/v Sarkosyl ®-0,l m-EDTA-Lösung (pH 8,0) hinzugesetzt, und die Mischung wurde 15 h bei 37 °C inkubiert. Zum erhaltenen Lysat wurden hinzugesetzt 6,5 ml H2O sowie eine solche Menge von festem CsCl, dass der Refraktionsindex des Lysats 1,4100 wurde, wonach das Lysat zentrifugiert wurde; Beckman Ti 50-Rotor, 36 000 U/min 48 h 10 °C. Das zentrifugierte Lysat wurde in Fraktionen eingeteilt, und die Fraktionen, in denen das Genom der Bakterien, nach Bewertung aufgrund der Viskosität, gelegen war, wurden gewonnen und 30 Stunden lang gegen eine 10 mM-Tris-HCl-1 ml-EDTA-0,1 M-NaCl-Puffer (pH 8,0) bei 4 °C dialysiert.
Das somit erhaltene Genompräparat wurde dreimal mit Phenol extrahiert, und das Phenol wurde mittels Ätherextraktion entfernt. Die DNS wurde zur Zentrifugierung in einem linearen 15—>-30% w/v Saccharose-0,1 M NaCl-50 mM Tris-HC1-1 mM EDTA, 0,1% Natriumlaurylsulfat (pH 8,0)-Gra-dienten gereinigt; Beckman SW27-Rotor, 22 000 U/min, 16 h bei 22 °C, wonach der Gradient fraktioniert wurde, und die Fraktionen, in denen die Grösse der DNS-Abschnitte > 15 • 106 Dalton betrug, gewonnen wurden, und die DNS wurde mit Äthanol gefällt.
Das somit isolierte B.-amyloliquefaciens-Genompräparat wurde unvollständig mit dem Restriktionsenzym Mbo I gespaltet, und die gespalteten DNS-Abschnitte wurden je nach ihrer Grösse im oben beschriebenen Saccharose-Gradienten separiert, Beckman SW 27-Rotor 22 000 U/min, 16 h bei 22 °C. Die Fraktionen, in denen die Grösse der DNS-Abschnitte 1,5 bis 5 • 106 Dalton betrug, wurden gewonnen, und die DNS wurde mit Äthanol gefällt.
Isolierung des Übertragungsvektors und dessen Spaltung mit Restriktionsenzym
Als rekombinanter Plasmid-Vektor wurde das Plasmid pUBl 10 verwendet. Das Plasmid wurde aus dem Bacillus-subtilis-Stamm SB202 in der früher beschriebenen Weise isoliert und gereinigt (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134,318-329, 1978). Das gereinigte Plasmidpräparat wurde mit dem Restriktionsenzym BamH I gespaltet, das nur eine Schnittstelle im Plasmidmolekül aufweist. Die Linearität des Plas-midmoleküls wurde mittels Gelelektrophorese überprüft. Fügung der Abschnitte des B.-amyloliquefaciens-Genoms an den rekombinanten Plasmid-Vektor
Die mit dem Mbo I-Enzym gespalteten und je nach der Grösse ausgewählten Abschnitte des B.-amyloliquefaciens-Genoms wurden mit dem durch das BamH I-Enzym geöffneten pUBl 10-Plasmid an einem 10 mM-Tris-HCl-1 mM-EDTA-Puffer (pH 8,0) beim DNS-Konzentrationsverhältnis von 1:3 zusammengemischt, indem das Gesamtvolumen 120 (j.1 und die Gesamtkonzentration der DNS 180 (ig/ml betrugen. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 65 °C geheizt, und zur gekühlten Mischung wurden 13 jj.1 von 66 mM-Tris-HCl-6,6 mM MgCh-100 mM Dithiotreithold-10 mM ATP-Puffer (pH 7,8) und 5 yd von Tt-DNS-Ligase (20 Weiss-Einheiten) hinzugesetzt. Die Ligationsmischung wurde 3 Stunden bei 23 °C inkubiert, und das Ergebnis des Liga-tionsvorganges wurde mittels Gelelektrophorese überprüft.
Übertragung des rekombinanten DNS-Moleküls ans Wirtbakterium
Als Wirtbakterium wurde der B.-subtilis-lA197-Stamm verwendet, dessen Genotype sacA321, metB5, aroI1907, amy" 5 war. Der Stamm wurde aus dem Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State University, USA) bezogen, und der darin vorkommende Ausdruck Amy wurde durch bakteriogenetische Verfahren als Mutationen im Strukturgen des a-Amylase kodierenden Enzyms erforscht. Der Stamm wurde durch ein io früher beschriebenes Verfahren (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81,741-746,1961) dazu kompetent bzw. fähig gemacht, DNS in sich aufzunehmen. Die im vorigen Absatz durch Ligation erzeugten rekombinanten DNS-Moleküle wurden mit den kompetent gemachten Wirtbakterien zusam-15 mengemischt, und die Mischung wurde 30 min bei 37 °C gehalten. Hiernach wurde die Mischung auf Bakterienschalen «angebracht, wo das Kanamycin-Antibiotikum dazu verwendet wurde, das Wachstum aller der Bakterien zu verhindern, die Plasmid in sich nicht erhielten. Die Schalen wurden 30 h bei 20 37 °C gehalten, wobei die Wirtbakterien, die ein Plasmid oder einen damit verbundenen Abschnitt von B.-amyloliquefa-ciens-Genom erhalten hatten, zu kleinen Kolonien wuchsen.
Entdeckung von solchen Wirtbakterien, die ein B.-amyloli-25 quefaciens-a-Amylase kodierendes Gen als mit dem Plasmid pUBl 10 verbunden aufweisen.
Die im vorigen Absatz beschriebenen Bakterienkolonien wurden auf neuen Nährstoffschalen repliziert, die 30 h bei 37 °C kultiviert wurden. Die erhaltenen Bakterienkulturen 30 wurden gemäss einem früher beschriebenen Verfahren (J. Bacteriol. 119,416-424,1974) mit I-KI-Lösung behandelt, wobei um solche Bakterienkolonien, die ein a-Amylase kodierendes Gen enthaltendes rekombinantes DNS-Molekül erhalten hatten, ein weisser Ring gebildet wurde. Die einer 35 solchen Kolonie entsprechende Kolonie wurde aus der ursprünglichen Bakterienschale entnommen, und mit den darin gelegenen Bakterien wurden mehrere aufeinander folgende Reinigungskulturen ausgeführt.
40 Isolierung und Charakterisierung des rekombinanten DNS-Moleküls
Das rekombinante DNS-Molekül wurde durch ein früher beschriebenes Verfahren (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134, 318-329,1978) aus dem Wirtbakterium isoliert und gereinigt. « Das Molekül wurde mit Hilfe von verschiedenen Restriktionsenzymen charakterisiert, und die Lage des a-Amylase kodierenden Gens wurde provisorisch dadurch ermittelt, dass die Inaktivierung des Gens bei Fügung von überzähligen DNS-Abschnitten an verschiedenen Stellen des rekombinan-5o ten DNS-Moleküls beobachtet wurde. Danach wurde die Basenordnung des a-Amylase kodierenden Gens durch ein früher beschriebenes Verfahren ermittelt (Maxim, A und Gilbert, W, Proc. Nati. Acad. Sei (US) 74, 560-564 (1977).
55 Bestimmung der a-Amylase-Aktivität
Das modifizierte Wirtbakterium B.-subtilis-IHO 6064 (sacA321, metB5), das ein a-Amylase kodierendes Gen im Plasmid pUBl 10 aufweist, wurde in flüssigem Nährstoff (Luria-Fleischbrühe) unter Aération bei 37 °C kultiviert. Aus 60 der Kulturflüssigkeit wurden Proben mit Zeitabständen von 2 Stunden entnommen, und aus diesen wurde die a-Amylase-Aktivität unter Benutzung von Phadebas ®-Tabletten ermittelt.
65 Entfernung des EcoR I-Fragments aus dem Plasmid pKTHlO
Das Plasmid pKTHlO wurde an der Schnittstelle EcoR I geöffnet (Fig. 2). Die erhaltenen DNS-Abschnitte (etwa 1 jig) wurden wieder zusammenligiert in 66 mM-Tris-HCl-6,6 mM
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MgCk-100 mM Dithiotreithol-10 mM ATP-Puffer (pH 7,8), wozu 0,5 |al T4-DNS-Ligase (2 Weiss-Einheiten) hinzugesetzt wurden. Die Ligationsmischung wurde 3 h bei 23 °C inkubiert, wonach damit ein kompetenter B.-subtilis-IHO-6064-Stamm in der oben beschriebenen Weise transformiert wurde. Die Zellen wurden auf Kanamycin enthaltende Bakterienschalen angebracht und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Aus den erhaltenen Transformaten wurde mit dem I-KI-Verfahren auf Stärkeschalen in der oben beschriebenen Weise die a-Amylase-negative Kolonie gesiebt, und daraus wurde das Plasmid in der oben beschriebenen Weise (Cryczan, et al., J. Bacteriol. 134,318-329 (1978). Aus dem erhaltenen Plasmid-präparat pKTH29 wurde das Fehlen des EcoR I-Kpn I-Hind III-Ecor I-Fragments (Fig. 4) mittels Gelelektrophorese überprüft.
Verkleinerung des Plasmids pKTH29 mittels Exonukleasebe-handlung
Das Plasmid pKTH29 (100 jxl, 500 (ig/ml) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoR I geöffnet. Nach dieser Behandlung wurden zur Lösung 0,5 (xl 1 M Dithiotreithol und 10 (j.1 Exo-nuklease III (0,25 Einh., Biolabs) hinzugesetzt. Die Lösung wurde 1 bis 3 Minuten bei 37 °C inkubiert, und die Reaktion wurde in einem 70 °C Wasserbad angehalten. Die DNS wurde aus der Lösung mit Äthanol gefällt und in 0,3 M NaCl-0,03M Natriumacetat-3 mM ZnCh-Puffer (pH 4,5) gelöst. Hierzu wurde 10 pl Sl-Nuklease (25 Einh./ml, Boehringer Mannheim) hinzugesetzt, und die Mischung wurde 30 Minuten bei 37 °C nnd 10 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach den Inkubationen wurde das Präparat mit Phenol extrahiert, das Phenol wurde durch Extraktion mit Äther entfernt, und die DNS wurde mit Äthanol gefällt. Die getrocknete DNS wurde in 40 \il 10 mM Tris-HCl-1 mM EDTA-Puffer (pH 8,0) gelöst, hierzu wurden 10 jxl 150 mM Tris-180 mM KCl -40 mM MgCh-3,0 mM Dithiotreithol-Puffer (pH 8,3), 5 |il dNTP-Mischung,worin eine 10 mM-Lösung jedes Nuleotidtri-phosphates in äquimolarem Verhältnis gemischt worden ist, und 2 jil vom Invert-Transkriptasenenzym (Beard, 13 Einh./ jj.1) hinzugesetzt. Die Lösung wurde 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, und die Reaktion wurde durch Inkubation 7 min bei 65 °C angehalten. Die DNS wurde mittels präparativer Agarose-Elektrophorese (LTG, Low Gelling Temperature) gereinigt, und die mit Äthidiumbromid gefärbten Plasmidzo-nen wurden aus dem Gel abgeschnitten. Die DNS wurde aus der Agarose mit Phenol bei 65 °C extrahiert, die Phenolextraktion wurde bei 20 °C wiederholt, und das Phenol wurde durch Ätherextraktion entfernt. Die DNS wurde mittels Äthanols gefällt, der Niederschlag wurde mit 70%igem Äthanol gewaschen und getrocknet.
Phosphorylation des EcoR I-Fugenmoleküls und dessen Fügung zum Plasmid
Zu 10 jxl von EcoR I-Fugenmoleküllösung (EcoR I linker, Collaborative Research, 50 (ig/ml) wurden 5 jil 32Py-ATP (10 mCi/ml, 3000 Ci/mol), 1,7 ul 660 mM Tris-HCl-66 mM MgCh-100 mM Dithiotreithol-Puffer (pH 8,0) und 0,5 p.1 T4-Polynukleotid-Kinase hinzugesetzt. Die Lösung wurde 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, wonach 5 jj.1,10 mM ATP hinzugesetzt wurde, und die Inkubation wurde 30 Minuten bei 37 °C fortgesetzt. Das oben beschriebene getrocknete exonu-kleasebehandelte pKTH29-Präparat wurde in 5 jil von der oben beschriebenen, phosphoryliertes EcoR I-Fugenmolekül enthaltenden Lösung gelöst. Zur Lösung wurden 0,5 jil, 10 mM ATP, 0,5 jj.1, 1 mM Spermidin und 0,5 jxl T4-DNS-Ligase (2 Weiss-Einheiten) hinzugesetzt. Die Lösung wurde 3 h bei 23 °C inkubiert, wonach sie zu einem Volumen von 20 p.1 mit dem 40 mM Tris-HCl-100 mM MgCh-Puffer (pH 7,6) verdünnt wurde. Hierzu wurden 15 Einheiten vom
EcoR I-Enzym (Biolabs) hinzugesetzt, und die Lösung wurde 12 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Inkubation von 10 Minuten bei 65 °C angehalten. Das mit EcoR I behandelte Präparat wurde durch ein 1 ml Sepharos 4B-Ko-lonne gelfiltriert. Bei der Filterung wurde als Elutionspuffer der 2 mM Tris-HCl-0,1 mM EDTA-Puffer (pH 7,5) verwendet. Das Filtrat wurde als Fraktionen von 35ul gesammelt, und die Plasmid enthaltenden Fraktionen wurden auf Grundlage der Radioaktivität identifiziert, zusammengesammelt und getrocknet. Die getrocknete DNS wurde in 20 jj.1 vom 66 mM Tris-HCl-6,6 mM MgCh-10 mM-Dithiotreithol-Puffer (pH 8,0) gelöst, und hierzu wurden 1,5 jj.1, 10 mM ATP und 0,3 |xl T4-DNS-Ligase hinzugesetzt. Die Lösung wurde 3 h bei 23 °C inkubiert, und hiernach wurde mit dem Plasmidpräpa-rat ein kompetenter B.-subtilis-IH06064-Stamm transformiert, und die Zellen wurden auf Kanamycin enthaltenden Bakterienschalen kultiviert.
Aus den Transformaten wurden die Plasmide durch ein früher beschriebenes Verfahren isoliert (Cryczan et al., J. Bacteriol. 134,318-329 [1978]), und die Plasmide wurden zunächst mittels Gelelektrophorese charakterisiert, und dann wurde ihre DNS-Basenordnung zu beiden Seiten des EcoR I-Fugenmoleküls ermittelt. Somit wurde aus dem Plasmid pKTH 29 das Plasmid pKTH 38 erhalten, in welchem das EcoR I-Fugenmolekül 90 Nukleotidpaare nach dem Abschneidepunkt des Ausscheidungssignals im Gebiet des Strukturgens der a-Amylase gelegen ist. Damit man das Fugenmolekül zur Fugenstelle des Ausscheidungssignals oder zu ihrer unmittelbaren Nähe bringen könnte, wurde das Plasmid mit pKTH 38 EcoRl geöffnet. Drei 10 jig Mengen vom geöffneten Plasmid wurden je in 115 jjl vom 20 mM Tris, 600 mM NaCl, 12 mM MgCh, 12 mM EDTAph 8,1-Puffer suspendiert. Zu jeder Plasmidmenge wurde je 10 jxl BAL-31 Enzym (Bethesda Research Laboratories, BRL, 40 U/ml) hinzugesetzt, und die Gläser wurden 5,6 und 7 Minuten in einem 30 °C Wasserbad inkubiert. Die Reaktion wurde dadurch angehalten, dass 0,5 M EDTA, pH 8,0, so hinzugesetzt wurde, dass die Schlusskonzentration 12 mM war. Die mit BAL-31 behandelten DNS-Mengen wurden zusammengebracht, zweimal mit Phenol extrahiert, und mit Äthanol gefällt. Der Äthanolniederschlag wurde in 75 jxl, 63 mM Tris, 6,3 mM MgCh, pH 8,0-Puffer suspendiert, und zur Lösung wurden 5 jxl von
I mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP und 1 mM dTTP sowie zum Schluss 5 jil T4-Polymerase (PL-Biochemicals, 5 U/p.1) hinzugesetzt. Die Lösung wurde 80 Minuten bei
II °C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 0,5 M EDTA angehalten, wie oben, und die Mischung wurde mit Phenol extrahiert, und die DNS wurde mit Äthanol gefällt. Der Äthanolniederschlag wurde in 250 jil von 10 mM Tries, 1 mM EDTA, pH8,0-Puffer gelöst. Daraus wurde 55 [il genommen, wozu 50 jil von phosphoryliertem Hind III-Fugenmolekül (BRL, 75 pmol), 5 jj.1 vom 660 mM Tris, 100 mM MgCh, 50 mM Dithiotreithol, pH 7,5-Puffer und 10 jj.1 von T4-DNS-Ligase (BRL 2 U/jxl) hinzugesetzt wurden. Die Mischung wurde 15 Stunden bei 15 °C und 10 Minuten bei 65 °C inkubiert. Die DNS wurde mit Isopropanol gefällt, der DNS-Niederschlag wurde mit 70%igem Äthanol gewaschen und nach Vakuumtrocknung in 100 jil vom 10 nM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl, 5 mM Dithiotreithol, pH 8,0-Puffer suspendiert. Zur Suspension wurde 3 (il Hind III-Restriktionsenzym (10 U/jj.1, BRL) hinzugesetzt, und die Mischung wurde 4 Stunden bei 37 °C und 10 Minuten bei 65 °C inkubiert, die DNS wurde mittels Elektrophorese gereinigt, 0,8% LGT-Agarosegel (Marine Colloids Inc.), 30 V, 15 h. Eine lineare Plasmidzone wurde aus dem Gel geschnitten, die DNS wurde bei 65 °C mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt. Der Äthanolniederschlag wurde in 35 jj.1 vom 66 mM Tris, 10 mM MgCl,
5 mM Dithiotreithol, pH 75-Puffer gelöst, wozu 1,5 jil, 10 mM
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
7
668 08C
rATP und 1,5 (il T4-DNS-Ligase (Bethesda Research Laboratories, 2 U/(il) hinzugesetzt wurden. Die Mischung wurde 3 Stunden bei 22 °C inkubiert und zu einem kompetenten B.-subtilis-IHO 6135-Stamm transformiert, und die Zellen wurden auf Kanamycin enthaltenden Nährstoffschalen kultiviert. Aus den Transformanten wurden die Plasmide durch das früher beschriebene Verfahren isoliert, und die Lage des
Hind III-Fugenmoleküls in den Plasmiden wurde mittels DNS-Sequentierung ermittelt. Somit wurde eine Reihe von Plasmiden erhalten, in denen das Hind III-Fugenmolekül unmittelbar nach dem Ausscheidungssignal oder in verschie-5 denen Stellungen nach dem Abschneidepunkt des Ausscheidungssignals im Gebiet des Strukturgens de a-Amylase gelegen ist.
1
Het Phe Gin pKTH 10 ATG ATT CAA
pKTH 50 ATG ATT CAA-
-3 -1 Ihr Ser Ala -ACA TCA GCC
-ACA TCA GC
3CAAGCTTGC
pKTH 51 ATG ATT CAA ACA TCA GCC1
pKTH 52 ATG ATT CAA ACA TCA GCC1
pKTH 53 ATG ATT CAA ACA TCA GCC
pKTH 51 ATG AIT CAA ACA TCA GCC
pKTH 55 ATG ATT CAA ACA TCA GCC
pKTH 56 ATG ATT CAA ACA TCA GCC
pKTH 57 ATG ATT CAA ACA TCA GCC
pKTH 58 ATG ATT CAA ACA TCA GCC
pKTH 59 ATG ATT CAA ACA TCA GCC
Val Asn Gly Ihr Leu Het Gin Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn GTA AAT GGC ACG ÇTG ATG CAG TAT TTT GAA TGG TAT ACG CCG AAC
IGCAAGCTTGC |
G IGCAAGCTTGC 1
GTA AAT GGC AC IGCAAGCTTGC|
GTA AAT GGC ACG IGCAAGCTTGC|
GTA AAT GGC ACG C |GCAAGCTTGC|
GTA AAT GGC ACG CT |GCAAGCTTGC|
GTA AAT GGC ACG CTG ATG CAG TAI TTT G IGCAAGCTTGC!
GTA AAT GGC ACG CTG ATG CAG TAT TTT GAA TGG IGCAAGCTTGC
GTA AAT GGC ACG CTG ATG CAG TAT TTT GAA TGG TAT ACG CCG |GCA
An diese vom Hind III-Fugenmolekül gebildeten Abschneidepunkte kann die die Aminosäuren jedes beliebigen gewünschten Proteins kodierende DNS-Sektion gefügt werden, und dadurch, wie aus den oben gegebenen Anwendungsbeispielen hervorgeht, dann ein Bakterium der Gattung Bacillus dazu gebracht werden, das beteffende Protein zu erzeugen und in seinen Nährboden abzusondern.
Beispiel 1
Erzeugung vom ß-Laktamase-Enzyms des E. coli aus einem Bacillus-subtilis-Stamm
Das Plasmid pKTH 50 wurde mit dem Hind III-Enzym geöffnet, und zur Öffnungsstelle wurde das ß-Laktamase kodierende Gen des e. coli gefügt, aus welchem Gen der Promotor und die Ausscheidungssignalgebiete entfernt worden waren. Das erhaltene Hybridplasmid wurde zu einem kompetenten B.-subtilis-IHO 6140-Stamm transformiert, indem die Zellen, die das Plasmid erhalten hatten, auf der Grundlage der Kanamycinresistenz ausgewählt wurden, und die Zellen wurden auf Kanamycin enthaltenden Nährstoffschalen kultiviert. Die Transformante wurden bezüglich der Erzeugung von Laktamase gesiebt, indem jede Kolonie in 100 jil von 0,1 mM Nitrosefin, 0,1 M K-Phosphat, pH 7,0-Lösung suspendiert wurde. Von den Kolonien, die im Nitrosefintest ein positives Ergebnis ergaben (die Farbe der Lösung wurde rot), wurden Flüssigkeitskulturen gemacht, um die Aktivität des erzeugten ß-Laktamaseenzyms zu ermitteln. Als Kontrolle wurde ein IHO 6140-B.-subtilis-Stamm verwendet, der mit 45 dem Plasmid pKTH 50 transformiert worden war. Die Stämme wurden in einer SMS-Lösung (Spizizen minimal salts), zu der 0,5% Glycerol, 1% löslicher Stärke und 5 (ig/ml Kanamycin hinzugesetzt worden waren, kultiviert. Die Kulturen wurden unter Schütteln bei 37 °C kultiviert. Etwa 5 Stun-50 den nach dem logarithmischen Wachstumsstadium (Klett67 ~ 250) wurden die Kulturen zentrifugiert 10 000 g 5 min, und das Supernatant wurde gewonnen. Die Zellen wurden in 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0) zu ihrem ursprünglichen Wachstumsvolumen suspendiert. Von den 55 Zellen- und Supernatantfraktionen wurde die ß-Laktamaseak-tivität dadurch ermittelt, dass die Auflösung des Kefalotins spektrophotometrisch beobachtet wurde. Aus der Ermittlung wurden folgende Ergebnisse erhalten.
ß-Laktamaseaktivität (U/ml)*
Zellen
Supernatant
B.-subtilis-IHO 6140/pKTH 50-ß-Lakt.
60
3000
B.-subtilis-IHO 6140/pKTH 50
<10
<10
*1U ß-Laktamase löst auf 1 |i-Mol von Penizillin G in 1 Minute bei 37 °C.
668 080
8
Beispiel 2
Erzeugung von Leukozyt-Interferon in einem Bacillus-subti-lis-Stamm
Das Plasmid pKTH 53 wurde mit dem Hind III-Enzym geöffnet, und zur Öffnungsstelle wurde eine das Leukozyt-Interferon (a-2) kodierende DNS-Sektion gefügt, aus dem der das Ausscheidungssignal kodierende Teil entfernt worden ist. Das erhaltene Hybridplasmid wurde zu einem kompetenten IHO 6140-B.-subtilis-Stamm dadurch tranformiert, dass die Zellen, die das Plasmid erhalten hatten, auf Grundlage der Kanamycinresistenz gewählt wurden. Die Transformante wurden durch das Kolonienhybridisationsverfahren (Grünstein, M. und Hogness, D.S., Proc. Nati. Acad. Sei. (US) 72, 3961-3965 [1975]) gesiebt, indem als Probe eine 125J-markier-tes Interferon kodierende DNS verwendet wurde. Die Interferon-DNS enthaltenden Bakterienkolonien wurden in Luria-Brühe kultiviert, zu welcher Brühe 2% von löslicher Stärke und 5 jig/ml Kanamycin hinzugesetzt worden waren, unter
Schütteln bei 37 °C. Die Kultur wurde 4 Stunden nach dem logarithmischen Wachstumsstadium zentrifugiert (Klett67 ~ 300), 10 000 g, 5 min. Das Supernatant wurde gewonnen, und die Zellen wurden zu ihrem ursprünglichen
5 Wachstumsvolumen in eine 0,9% NaCl-Lösung suspendiert. Von den Zellen- und Supernatantfraktionen wurde die Interferonaktivität ermittelt. Als Kontrolle bei den Ermittlungen wurde der B.-subtilis-IHO 6140/pKTH 53-Stamm verwendet. Aus den Ermittlungen wurden folgende Ergebnisse erhalten:
10
Interferonaktivität (I.U./ml)
Zellen
Supernatant
B-subtilis-IHO 6140/pKTH 53-IF B.-subtilis-IHO 6140/pKTH 53
3000 <20
200 000 <20
g
2 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

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1
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die in den Plasmid-Vektor eingeführt wird, für
2
PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Erzeugung eines Proteins durch Bakterien der Gattung Bacillus unter Einfügen von DNS, die das Protein codiert, mittels DNS-Rekombinations-Technik in einen rekombinanten Plasmid-Vektor nach dessen Absonderungssignal, welches dem Regelungsteil folgt, Transformieren von Bakterien der Gattung Bacillus mit dem erhaltenen Vektor und Kultivierung der transformierten Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass rekombinante Plasmid-Vektor, dem die für das Protein codierende DNS eingefügt wird, ein Plasmid ist, das in Bakterien der Gattung Bacillus in mehreren Kopien auftritt und den Regelungsteil des Gens, das die a-Amylase des Bacillus amyloliquefaciens codiert und dessen Absonderungssignal enthält.
3
TGCAGTftTTT TGAATGGTAT ACGCCGAACG ACGGCCAGCA TTGGAAACGA TTGCAGAATG
ACGTCATAAA ACTTACCATA TGCGGCTTGC TGCCGGTCGT AACCTTTGCT AACGTCTTAC
668 080
ATGCGGAACA TTTATCGGAT ATCGGAATCA CTGCCGTCTG GATTCCTCCC GCATACAAAG TACGCCTTGT AAATAGCCTA TAGCCTTAGT GACGGCAGAC CTAAGGAGGG CGTATGTTTC
GATTGAGCCA ATCCGATAAC GGATACGGAC CTTATGATTT GTATGATTTA GGAGAATTCC CTAACTCGGT TAGGCTATTG CCTATGCCTG GAATACTAAA CATACTAAAT CCTCTTAAGG
AGCAAAAAGG GACGGTCAGÀ ACGAAATACG GCACAA TCGTTTTTCC CTGCCAGTCT TGCTTTATGC CGTGTT
15
worin der Pfeil des Anfangskodon der Signalsequenz des a-Amylasegens zeigt, und wo die Sequenz, die diesem folgt und das a-Amylasegen codiert, unterstrichen ist.
3' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GTA PJ\ 5' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CAT Tf worin die Pfeile die Öffnungsstelle der Signalsektion von dem a-Amylasegen zeigen.
3« CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GTA A 5' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CAT T
* i
3* CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GTA S' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CAT
3' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GT 5' GAC AAT AAA. CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CA
l
3' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC G 5' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG C
i
3* CTG TTA TTT GTC'AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC 5* GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CCG
l '
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNS, die in den Plasmid-Vektor eingeführt wird, für die E. coli ß-Laktamase codiert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch io gekennzeichnet, dass die DNS-Sektion, welche die Aminosäuren codiert, an irgendeine der nachstehenden Nukleotid-sektionen des a-Amylasegens gefügt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als zu transformierende Bakterien Bacillus subtilis eingesetzt wird.
5 a-, ß- und y-Interferone codiert.
6. Zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 geeigneter, rekombinanter Plasmid-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Plasmid ist, das in Bakterien der Gattung
Bacillus in mehreren Kopien auftritt und den Regelungsteil 40 des Gens, das die a-Amylase des Bacillus amyloliquefaciens codiert, sowie dessen DNS-Sektion für die Absonderung enthält.
7. Rekombinanter Plasmid-Vektor nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass er die folgende Nuleotidord-45 nung enthält:
AAGCCCCGCA „CATACGAAAA GACTGGCTGA AAACATTGAG CCTTTGATGA CTGATGATTT TTCGGGGCGT GTATGCTTTT CTGACCGACT TTTGTAACTC GGAAACTACT GACTACTAAA
GGCTGÂAGAA GTGGATCGAT TGTTTGAGAA AAGAAGAAGA CCATAAAAAT ACCTTGTCTG CCGACTTCTT CACCTAGCTA ACAAACTCTT TTCTTCTTCT GGTATTTTTA TGGAACAGAC
TCATCAGACA GGGTATTTTT TATGCTGTCC AGACTGTCCG CTGTGTAAAA ATAAGGAATA AGTAGTCTGT CCCATAAAAA ATACGACAGG TCTGACAGGC GACACATTTT TATTCCTTAT
AAGGGGGGTT GTTATTATTT TACTGATATG TAAAATATAA TTTGTATAAG AAAATGAGAG TTCCCCCCAA CAATAATAAA ATGACTATAC ATTTTATATT AAACATATTC TTTTACTCTC
GGAGAGGAAA CATGATTCAA AAACGAAAGC GGACAGTTTC GTTCAGACTT GTGCTTATGT CCTCTCCTTT GTACTAAGT.T TTTGCTTTCG CCTGTCAAAG CAAGTCTGAA ÇACGAATACA
GCACGCTGTT ATTTGTCAGT TTGCCGATTA CAAAAACATC AGCCGTAAAT GGCACGCTGA CGTGCGACAA TAAACAGTCA AACGGCTAAT GTTTTTGTAG TCGGCATTTA CCGTGCGACT
8. Rekombinanter Plasmid-Vektor nach Anspruch 6 oder 7, gekennzeichnet dadurch, dass er die Nukleotidordnung, die im Anspruch 4 angegeben ist, enthält.
9. Rekombinanter Plasmid-Vektor nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass das Plasmid das Plasmid pUB 110 ist.
10. Rekombinanter Plasmid-Vektor als Zwischenprodukt im Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass er ein Plasmid ist, das in Bakterien der Gattung Bacillus in mehreren Kopien auftritt und den Regelungsteil des Gens, das die a-Amylase des Bacillus amyloliquefaciens codiert, sowie dessen DNS-Sektion für die Absonderung und eine DNS-Sektion, die jedes beliebige von den Interferonen a-, ß-, und y-Interferon codiert, enthält.
11. Rekombinanter Plasmid-Vektor als Zwischenprodukt im Verfahren nach Anspruch Ì, gekennzeichnet dadurch, dass er ein Plasmid ist das in Bakterien der Gattung Bacillus in mehreren Kopien auftritt und den Regelungsteil des Gens, das die a-Amylase des Bacillus amyloliquefaciens codiert, sowie dessen DNS-Sektion für die Absonderung und eine DNS-Sektion, die ß-Laktamase des E. coli codiert, enthält.
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