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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Gegenstand der vorliegenden Endung
ist die Keratinase von Bacillus licheniformis PWD-1 kodierende DNA,
die zur Produktion einer Keratinase nützlich ist, die zum Abbau von
Keratinen, wie zum Beispiel Federn, und zur Produktion von Aminosäuren daraus
nützlich
ist.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Federn werden von der Geflügelindustrie
in großen
Mengen produziert. Diese Federn stellen eine preisgünstige Rohmaterialquelle
für eine
Reihe verschiedenster potenzieller Verwendungszwecke bereit. Unter
anderem bestand erhebliches Interesse an der Entwicklung von Verfahren
zum Abbau von Federn, damit sie als eine preisgünstige Quelle für Aminosäuren und
verdauliches Protein in Tierfutter verwendet werden können. Verfahren
zur Umwandlung von Federn in Tierfutter, die bisher entwickelt wurden,
schließen
sowohl Dampfhydrolyseverfahren als auch kombinierte Dampfhydrolyse-
und enzymatische Verfahren ein. Siehe z. B. Papadopoulos, M. C.,
Animal Feed Science and Technology 16: 151 (1986); Papadopoulos,
M. C., Poultry Science 64: 1729 (1985); Alderibigde, A. O. et al.,
J. Animal Scienie 1198 (1983); Thomas und Beeson, J. Animal Science
45: 819 (1977); Monis et al.,., Poultry Science 52: 858 (1973);
Moran et al., Poulry Science 46: 456 (1967); Davis et al., Processing
of poultry byproducts and their utilization in feeds, Teil I, USDA
Util. Res. Rep. Nr. 3, Washington, D. C. (1961). Nachteile dieser
Verfahren, wie zum Beispiel der Abbau hitzeempfindlicher Aminosäuren mittels
Dampfverfahren und die relativ geringe Verdaulichkeit der resultierenden
Produkte haben zu fortgesetztem Interesse an wirtschaftlichen neuen
Federabbauverfahren geführt,
die keine harsche Dampfbehandlung erforderlich machen.
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Lin et al., Appl. Environ. Microbiol.
58(10), 3271 (1992) schlagen ein Verfahren zum Isolieren einer Keratinase
aus dem Kulturmedium eines federabbauenden Fermentationsmediums
mit Bacillus licheniformis vor.
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Die internationale Patentanmeldung
Nr. WO 89/09278 schlägt
ein Verfahren zum Abbau von keratinhaltigem Material vor, das die
Schritte des Kombinierens des keratinhaltigen Materials mit Bacillus
licheniformis zur Bildung eines Fermentationsmediums und dann Fermentieren
des Mediums für
eine zum Abbau des Materials ausreichenden Zeitdauer umfasst.
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Es ist demgemäß eine erfindungsgemäße Aufgabe,
ein Verfahren zum Hydrolysieren von keratinhaltigem Material bereitzustellen,
das nicht von der Dampfhydrolyse abhängig ist.
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Es ist eine zusätzliche Aufgabe, ein Verfahren
zur Umwandlung von keratinhaltigem Material in Aminosäuren bei
hohen Aminosäureausbeuten
bereitzustellen.
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Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe,
ein hydrolysiertes Federprodukt bereitzustellen, das als ein Futterbestandteil
nützlich
ist, das hoch verdaulich ist und eine hochwertige Quelle von nutritivem
Protein und Aminosäuren
bereitstellt.
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Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe,
ein Keratinase-Enzym bereitzustellen, das als ein Futterzusatz zur
Verbesserung der Verdaulichkeit von Keratin und anderen Proteinen
in Futtermitteln verwendet werden kann.
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Es ist eine noch weitere erfindungsgemäße Aufgabe,
ein wirtschaftliches Tierfutter bereitzustellen, das ein hydrolysiertes
Federprodukt als eine nutritive Aminosäurequelle einsetzt. Vorstehendes
und andere erfindungsgemäße Aufgaben
und Aspekte sind in der folgenden „Zusammenfassung", „Ausführlichen
Beschreibung" und
im „Beispiel" ausführlich erklärt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Ein erster erfindungsgemäßer Aspekt
ist isolierte DNA, die eine Keratinase kodiert, wobei die isolierte DNA
die Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist.
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Ein zweiter erfindungsgemäßer Aspekt
ist ein rekombinantes DNA-Molekül,
das eine Vektor-DNA und eine wie vorstehend angegebene DNA umfasst,
welche ein Keratinase-Enzym mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 kodiert.
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Ein dritter erfindungsgemäßer Aspekt
ist eine Wirtszelle, die eine wie vorstehend angegebene rekombinante
DNA-Sequenz enthält
und zur Expression eines Keratinase-Enzyms mit der Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 2 fähig
ist.
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Ein vierter erfindungsgemäßer Aspekt
ist ein Verfahren zur Herstellung eines Keratinase-Enzyms durch
Kultivieren einer Wirtszelle, wie vorstehend beschrieben, unter
Bedingungen, welche die Expression der kodierten Keratinase zur
Bereitstellung einer Zellkultur zulassen und Sammeln des exprimierten
Keratinase-Enzyms aus der Zellkultur.
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Vorstehendes und andere endungsgemäße Aspekte
sind ausführlich
in den nachstehend dargelegten „Zeichnungen", im „Beispiel" und in der „Ausführlichen
Beschreibung" ausführlich erklärt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 erläutert die
Sequenz und die kodierten Aminosäuren
einer isolierten DNA, die für
die Keratinase von Bacillus licheniformis PWD-1 kodiert. 1 erläutert außerdem die Abweichungen zwischen
den die Keratinase von Bacillus lichenifornis PWD-1 und Bacillus
licheniformis NCIB 6816 subtilis im Carlsberg-Gen kodierenden Aminosäuren.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Hierin offenbarte Aminosäuresequenzen
werden in der Richtung von Amino zu Carboxy, von links nach rechts,
dargestellt. Die Amino- und Carboxygruppen sind nicht in der Sequenz
dargestellt. Nukleotidsequenzen sind hierin nur durch einen Einzelstrang,
in der Richtung von 5' zu
3', von links nach
rechts, dargestellt. Nukleotide und Aminosäuren sind hierin in der von
der IUPAC-JUB Kommission für
Biochemische Nomenklatur empfohlenen Weise oder (für Aminosäuren) durch
einen aus drei Buchstaben bestehenden Code gemäß 37 CFR § 1.822 und dem etablierten
Gebrauch dargestellt. Siehe z. B. PatentIn User Manual, 99–102 (Nov.
1990) (U.S. Patent and Trademark Office, Office of the Assistant
Commissioner for Patents, Washington, D. C. 20231); US-Patent Nr.
4,871,670 an Hudson et al.,. in Spalte 3, Zeilen 20–43.
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A. KERATINASE-ENZYM KODIERENDE
DNAs
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DNAs, welche ein Keratinase-Enzym
kodieren, bauen eine Keratinquelle, wie zum Beispiel Federn ab. Es
ist beabsichtigt, dass diese Definition natürliche allelische Variationen
in den DNAs umassen soll. Bei Hybridisierungsbedingungen, welche
anderen nach Expression für
eine Keratinase kodierenden DNA-Sequenzen gestatten, an eine wie
hierin angegebene DNA-Sequenz zu hybridisieren, handelt
es sich im Allgemeinen um hohe Stringenzbedingungen. So kann zum
Beispiel die Hybridisierung solcher Sequenzen unter Bedingungen
durchgeführt
werden, die durch eine Waschstringenz von 0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat,
0,1% SDS bei 60°C
oder selbst 70°C
an eine hierin offenbarte DNA in einem Standard-Hybridisierungsassay
in situ dargestellt werden. Siehe J. Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (2. Auflage 1989) (Cold Spring Harbor
Laboratory)). Im Allgemeinen sind DNA-Sequenzen, die für eine Keratinase
kodieren und an die DNA-Sequenz hybridiseren, welche die hierin
offenbarte Keratinase von Bacillus licheniformis PWD-1 kodiert, mindestens
65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder selbst 95% oder mehr homolog mit
der Sequenz der hierin offenbarten Keratinase.
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Ferner sind auch DNA-Sequenzen (oder
Oligonukleotide), die für
die gleiche Keratinase kodieren, wie für die durch die vorstehenden
Sequenzen kodierte, sich aber in der Codon-Sequenz von diesen aufgrund
der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden, ein erfindungsgemäßer Aspekt.
Die Degeneration des genetischen Code, welche erlaubt, dass verschiedene
Nukleinsäuresequenzen
für das
gleiche Protein oder Peptid kodieren, ist in der Literatur weithin
bekannt. Siehe z. B. US-Patent Nr.
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4,757,006 an Toole et al.,. in Spalte
2, Tabelle 1.
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DNA-Sequenzen (oder Oligonukleotide),
die für
die gleiche Keratinase kodieren, wie für die durch die vorstehenden
Sequenzen kodierte, die sich aber in der Codon-Sequenz von diesen
aufgrund gezielter Mutagenese unterscheiden, sind ein noch anderer
erfindungsgemäßer Aspekt.
Gezielte Mutagenese-Verfahren, die zur Verbesserung der Eigenschaften
des Keratinase-Enzyms nützlich
sind, sind wie nachstehend beschrteben, weithin bekannt. Siehe z.
B. US-Patent Nr. 4,873,192 an Kunkel.
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B. GENMANIPULATIONSVERFAHREN
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Die Produktion von klonierten Genen,
rekombinanter DNA, Vektoren, transformierten Wirtszellen, Proteinen
und Proteinfragmenten durch Genmanipulation ist weithin bekannt.
Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,761,371 an Bell et al.,. in Spalte 6,
Zeile 3 bis Spalte 9, Zeile 65; US-Patent Nr. 4,877,729 an Clark
et al.,. in Spalte 4, Zeile 38 bis Spalte 7, Zeile 6; US-Patent
Nr. 4,912,038 an Schilling in Spalte 3, Zeile 26 bis Spalte 14,
Zeile 12 und US-Patent Nr. 4,879,224 an Wallner in Spalte 6, Zeile
8 bis Spalte 8, Zeile 59.
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Die Keratinase kodierende DNA kann
gemäß jedwedem
der bekannten Verfahren hergestellt werden. So kann die DNA zum
Beispiel unter Verwendung des MUTA-GENETM-Phagemid
in vitro-Mutagenese-Kits
von BIO-RAD konstruiert werden. Das Kit basiert auf dem von Kunkel
in US-Patent Nr. 4,873,192 beschriebenen Verfahren. (Siehe auch
T. Kunkel, Proc. Natl Acad. Sci. USA 82: 488 (1985); T. Kunkel et
al., Methods in Enrymol. 154: 367 (1987)). US-Patent Nr. 4, 873,192
stellt eine sehr starke Selektion gegen den nicht mutagenisierten
Strang einer doppelsträngigen
DNA bereit. Wenn DNA in einem doppelt mutanten dut– ung–-Bakterium synthetisiert
wird, trägt
die naszierende DNA aufgrund der dut-Mutation, welche das Enzym
dUTPase inaktiviert und in hohen intrazellulären dUTP-Spiegeln resultiert,
eine Anzahl von Uracilen in den Thymin-Positionen. Die ung-Mutation
inaktiviert die Uracil-N-Glycosylase,
wodurch dem inkorporierten Uracil ermöglicht wird, in der DNA zu
bleiben. Dieser Uracilenthaltende Strang wird dann als die Matrize
für die
in vitro-Synthese eines komplementären Stranges verwendet, der
durch ein die gewünschte
Mutation enthaltendes Oligonukleotid geprimt wird. Wenn die resultierende
doppelsträngige
DNA in eine Zelle mit einer profizienten Uracil-N-Glycosylase transformiert
wird, wird der Uracil-enthaltende Strang mit hoher Effizienz inaktiviert,
wobei der nicht Uracil-enthaltende Überlebende zum Replizieren
zurückbleibt
(siehe im Allgemeinen Anleitungshandbuch, BIO-RAD-Katalog Nr. 170–3576).
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Das Keratinase-Gen, das sowohl die
Keratinase kodierende DNA als auch regulierende Elemente enthält, kann
durch Amplifikation einer ausgewählten
oder targetierten Nukleinsäuresequenz
konstruiert werden. Amplifikation kann mithilfe jeglicher geeigneter
Mittel durchgeführt
werden. Siehe im Allgemeinen D. Kwoh und T. Kwoh, Am. Biotechnol.
Lab. 8: 14 (1990). Beispiele geeigneter Amplifikationsverfahren
schließen
die Polymerasekettenreaktion, Ligasekettenreaktion, Strang-Displacement-Amplifikation,
(siehe im Allgemeinen G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 392 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20: 1691 (1992)), Transkriptions-basierte
Amplifikation (siehe D. Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA
86: 1173 (1989)), selbstunterhaltende Sequenzreplikation (oder „ 3SR") (siehe J. Guatelli
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)), das Qa-Replikase-System
(siehe P. Lizardi et al., Biotechnology 6: 1197 (1988)), Nucleic Acid-Based
Amplification (oder „NASBA") (siehe R. Lewis,
Genetic Engineering News 12 9: 1 (1992)), die Repair Chain Reaction
(oder „RCR") (siehe R. Lewies,
vorstehend) und Boomerang DNA Amplification (oder „BDA") (siehe R. Lewis,
vorstehend) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Polymerasekettenreaktion
ist derzeit bevorzugt.
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DNA-Amplifikationsverfahren, wie
zum Beispiel die vorstehenden, können
die Verwendung von einer Sonde, einem Sondenpaar oder zwei Sondenpaaren
beinhalten, die spezifisch an die das gewünschte Zielprotein kodierende
DNA binden.
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Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
kann gemäß den bekannten
Verfahren durchgeführt
werden. Siehe z. B. US-Patente Nr. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159
und 4,965,188. Im Allgemeinen beinhaltet PCR zuerst die Behandlung
einer Nukleinsäureprobe
(z. B. in Gegenwart einer hitzestabilen DNA-Polymerase) mit einem
Oligonukleotid-Primer für
jeden Strang der nachzuweisenden spezifischen Sequenz unter Hybridisierungsbedingungen,
so dass ein Verlängerungsprodukt
von jedem Primer synthetisiert wird, das komplementär zu jedem
Nukleinsäurestrang
ist, wobei die Primer zu jedem Strang der spezifischen Sequenz ausreichend komplementär sind,
um damit zu hybridisieren, so dass das von jedem Primer, wenn er
von seinem Komplement getrennt wird, synthetisierte Verlängerungsprodukt
als eine Matrize für
die Synthese des Verlängerungsprodukts
des anderen Primers dienen kann, und dann Behandlung der Probe unter
Denaturierungsbedingungen zum Trennen der Primer-Verlängerungsprodukte
von ihren Matrizen, wenn die nachzuweisende(n) Sequenz oder Sequenzen
anwesend sind. Diese Schritte werden zyklisch wiederholt, bis der
gewünschte
Amplifikationsgrad erhalten wird. Der Nachweis der amplifizierten
Sequenz kann durch Zufügen
zu dem Reaktionsprodukt einer Oligonukleotidsonde, die zur Hybridisierung
an das Reaktionsprodukt (z. B. eine erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde)
fähig ist,
wobei die Sonde eine nachweisbare Markierung trägt und dann Nachweis der Markierung
gemäß bekannten
Verfahren oder durch direkte Sichtbarmachung auf einem Gel durchgeführt werden.
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Die Ligasekettenreaktion (LCR) wird
auch gemäß bekannten
Verfahren durchgeführt.
Siehe z. B. R. Weiss, Science 254: 1292 (1991). Im Allgemeinen wird
die Reaktion mit zwei Oligonukleotid-Sondenpaaren durchgeführt: ein
Paar bindet an einen Strang der nachzuweisenden Sequenz; das andere
Paar bindet an den anderen Strang der nachzuweisenden Sequenz. Jedes
Paar zusammen überlappt
vollkommen den Strang, dem es entspricht. Die Reaktion wird zuerst
durch Denaturieren (z. B. Trennen) der Stränge der nachzuweisenden Sequenz,
dann zur Reaktion bringen der Stränge mit den beiden Oligonukleotid-Sondenpaaren
in Gegenwart einer hitzestabilen Ligase, so dass jedes Oligonukleotid-Sondenpaar
zusammen ligiert wird, dann Trennen des Reaktionsproduktes, und
dann zyklische Wiederholung des Verfahrens, bis die Sequenz zu dem gewünschten
Grad amplifiziert wurde, durchgeführt. Der Nachweis kann dann
auf die gleiche Weise wie vorstehend in . Bezug auf die PCR beschrieben
durchgeführt
werden.
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Ein Vektor ist ein replizierbares
DNA-Konstrukt. Vektoren werden hierin entweder zum Amplifizieren einer
Keratinase kodierenden DNA und/oder zum Exprimieren von DNA, welche
eine wie hierin angegebene Keratinase kodiert, verwendet. Ein Expressionsvektor
ist ein replizierbares DNA-Konstrukt, worin eine Keratinase kodierende
DNA-Sequenz operabel mit geeigneten Kontrollsequenzen verknüpft ist,
die zum Bewirken der Expression der Keratinase in einem geeigneten
Wirt fähig
sind. Der Bedarf an derartigen Kontrollsequenzen variiert in Abhängigkeit
vom ausgewählten
Wirt und gewählten
Transformationsverfahren. Im Allgemeinen schließen Kontrollsequenzen einen
transkriptionalen Promotor, eine optionale Operator-Sequenz zur
Kontrolle der Transkription, eine Sequenz, die geeignete ribosomale
mRNA-Bindungsorte kodiert und Sequenzen, welche die Terminierung
von Transkription und Translation kontrollieren, ein.
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Amplifikationsvektoren erfordern
keine Expressionskontrolldomänen.
Es wird lediglich die Fähigkeit zum
Replizieren in einem Wirt benötigt,
die gewöhnlich
durch einen Startpunkt für
die Replikation und ein Selektionsgen zur Förderung der Erkennung von Transformanten
verliehen wird.
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Vektoren umfassen Plasmide, Viren
(z. B. Adenovirus, Cytomegalovirus), Phagen und integrierbare DNA-Fragmente
(d. h. Fragmente, die in das Wirtsgenom durch Rekombination integrierbar
sind). Der Vektor repliziert und funktioniert unabhängig vom
Wirtsgenom oder kann in einigen Fällen in das Genom selbst integriert
werden.
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Expressionsvektoren sollten einen
Promotor und RNA-Bindungsorte enthalten, die operabel mit dem zu
exprimierenden Gen verknüpft
und im Wirtsorganismus operabel sind.
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DNA-Regionen sind operabel verknüpft oder
operabel assoziiert, wenn sie funktionell zueinander in Beziehung
stehen. So ist zum Beispiel ein Promotor operabel mit einer Kodiersequenz
verknüpft,
wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; oder ein Ribosomenbindungsort
ist operabel mit einer Kodiersequenz verknüpft, wenn er so positioniert
ist, um Translation zu erlauben.
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Transformierte Wirtszellen sind Zellen,
die mit Vektoren, die eine DNA-Sequenz wie hierin offenbart enthalten,
die unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren konstruiert sind,
transformiert oder transferiert wurden. Transformierte Wirtszellen
exprimieren gewöhnlich
die Keratinase, während
Wirtszellen, die zu Zwecken der Klonierung oder Amplifikation der
Keratinase-DNA transformiert wurden, die Keratinase nicht zu exprimieren
brauchen. Geeignete Wirtszellen können dem Durchschnittsfachmann
bekannte Wirtszellen, wie zum Beispiel prokaryotische Wirtszellen,
einschließen.
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Prokaryotische Wirtszellen schließen gramnegative
oder grampositive Organismen, wie zum Beispiel Escherichia coli
(E. coli) oder Bacilli ein. Höhere
eukaryotische Zellen schließen,
wie nachstehend beschrieben, etablierte, von Säugern stammende Zelllinien
ein. Beispielhafte Wirtszellen sind E. coli W3110 (ATCC 27,325),
E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), E. coli 294 (ATCC 31,446).
Eine breite Reihe verschiedener geeigneter prokaryotischer und mikrobieller
Vektoren stehen zur Verfügung.
E. coli wird typischerweise mithilfe von pBR322 transformiert. Die
am häufigsten
in rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendeten Promotoren
schließen
die β-Laktamase
(Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature
275: 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979)), ein
Tryptophan-(trp)-Promotor-System (Goeddel et al., Nucleic Acids
Res. 8: 4057 (1980) und EPO-Anmeldung,
Veröffentlichung
Nr. 36, 776) und den tac-Promotor (H. De Boer et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80: 21 (1983)) ein. Der Promotor und die Shine-Dalgarno-Sequenz
(für die
prokaryotische Wirtsexpression) sind operabel mit der die Keratinase
kodierenden DNA verknüpft,
d. h. sie sind dergestalt positioniert, um die Transkription der
Keratinase-messenger-RNA aus der DNA zu fördern.
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Eukaryotische Mikroben, wie zum Beispiel
Hefekulturen, können
auch mit Vektoren transformiert werden, welche die hierin offenbarten
isolierten DNAs tragen, siehe z. B. US-Patent Nr. 4,745,057. Sacharomyces cerevisisae
ist der am häufigsten
verwendete unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen,
obwohl eine Anzahl anderer Stämme
allgemein zur Verfügung
stehen. Hefevektoren können
einen Replikationsstartpunkt von dem 2-Mikron-Hefeplasmid oder einer
autonom replizierenden Sequenz (ARS), einem Promotor, die Keratinase
kodierende DNA, wie hierin angegeben, Sequenzen für die Polyadenylierung
und Transkriptionsterminierung und ein Selektionsgen enthalten.
Ein beispielhaftes Plasmid ist YRp7, (Stinchcomb et al., Nature
282: 39 (1979), Kingsman et al., Gene 7: 141 (1979); Tschemper et
al., Gene 10: 157 (1980)). Geeignete Promotor-Sequenzen in Hefevektoren
schließen
die Promotoren für
Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol.
Chem. 255: 2073 (1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et
al., J. Adv. Enryme Reg. 7: 149 (1968); und Holland et al., Biochemistry
17: 4900 (1978)) ein. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung
in der Hefe-5-Expression sind weiter in R. Hitzeman et al., EPOVeröffentlichung Nr.
73,657, beschrieben.
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C. HERSTELLUNG UND VERWENDUNG
DES KERATINASE-ENZYMS
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Wie vorstehend angemerkt, kann das
Keratinase-Enzym durch Kultivieren einer wie vorstehend beschriebenen
Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression der kodierten
Keratinase erlauben und Sammeln der exprimierten Keratinase, hergestellt
werden. Die Wirtszelle kann unter Bedingungen kultiviert werden,
unter denen die Zelle wächst
und dann unter Bedingungen kultiviert werden, welche die Expression der
kodierten Keratinase veranlassen, oder die Zellen können zur
gleichen Zeit zum Wachsen und Exprimieren der kodierten Keratinase
veranlasst werden. Die Keratinase kann an eine geeignete sekretorische
Leader-Sequenz fusioniert oder anderweitig in das Kulturmedium exprimiert
und aus dem Medium gesammelt werden, oder die Keratinase kann intrazellulär exprimiert,
die Zellen dann lysiert und die Keratinase aus dem Zelllysat gesammelt
werden. Wie vom Durchschnittsfachmann erkannt werden wird, können im
Allgemeinen jedwede geeignete Verfahren zum Kultivieren und Exprimieren
eines transgenen Proteins verwendet werden.
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Das hergestellte Keratinase-Enzym
ist in Verfahren zum Abbau von keratinhaltigem Material nützlich. Beispielhafte
Hydrolyseverfahren sind in US-Patenten Nr. 5,063,161 und 4,959,311
an Shih et al.,. beschrieben. Die vorstehenden Patente an Shih et
al.,. offenbaren auch Fermentationsmedien, welche das Keratinase-Enzym
einschließen.
Das erfindungsgemäße Keratinase-Enzym
ist demgemäß bei der
Herstellung von Fermentationsmedien nützlich.
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Das hergestellte Keratinase-Enzym
kann auch zur Herstellung eines hydrolysierten Federproduktes verwendet
werden. Ein hydrolysiertes Federprodukt besitzt mehrere bekannte
Verwendungszwecke. So können
hydrolysierte Federn beispielsweise als ein Bestandteil in Tierfutterzubereitungen
verwendet werden. Das hergestellte Keratinase-Enzym selbst kann
auf ähnliche
Weise in Tierfutterzubereitungen inkorporiert werden. US-Patent
Nr. 5,186,961 an Shih et al., offenbart geeignete Tierfutterzubereitungen,
die das Keratinase-Enzym einschließen.
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Das hergestellte Keratinase-Enzym
ist auch bei der Herstellung von Aminosäuren aus Federprodukten nützlich 10,
wie vorstehend im „Hintergrund
der Endung" besprochen
wurde.
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Die vorliegende Erfindung wird in
größerer Einzelheit
in dem folgenden nicht einschränkenden
Beispiel erklärt.
Das Beispiel ist lediglich für
erläuternde
Zwecke vorgesehen.
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BEISPIEL 1
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Isolieren und Sequenzieren des Keratinase-Gens
aus Bacillus licheniformis PWD-1 durch PCR-Walking Das Keratinase-Enzym
wird unter Verwendung von Cyanogenbromid gemäß dem Durchschnittsfachmann
bekannten Verfahren gespalten. Danach wird die der N-terminalen
Aminosäuresequenz
entsprechende 5'-DNA-(N10)-Sequenz
als ein fixierter Primer zusammen mit einer Reihe von Random-Primers,
die zur Durchführung
der Polymerasekettenreaktion (PCR) individuell gepaart werden, verwendet.
Die Hybridisierung mit einer 25-mer-Oligonukleotidsonde unterstromig
von N10 ergibt ein mittels N10 und einem der Random-Primer amplifiziertes
PCR-Produkt mit 683 bp, das als einen Teil des Keratinase-Gens enthaltend
identifiziert wurde. Der distale 3'-Anteil des Gens wird mittels des gleichen
Verfahrens, unter Verwendung eines zweiten fixierten Primers (I10),
der an Position +548 ausgelegt und mit Random-Primers zur Durchführung der
PCR gepaart wurde, amplifiziert und sequenziert. Die oberstromige
Sequenzanalyse wurde auf ähnliche
Weise durchgeführt.
Eine oberstromige Region von 575 by wird mittels PCR unter Verwendung
eines fixierten Antisense-l0-mer-Primers (R10) gepaart mit Random-Primers
amplifiziert. Die komplette Sequenz mit 1457 bp, welche das Keratinase-Gen
von Bacillus licheniformis und regulierende Elemente umfasst, wird
anhand der kombinierten PCR-Produkte bestimmt.
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Das identifizierte Gen ist, wie in 1 gezeigt, dem Bacillus
licheniformis NCTB 6816 subtilis im Carlsberg-Gen sehr ähnlich.
Die Abweichungen sind mit den sich unterscheidenden Aminosäuren des
Carlsberg-Gens im Fettdruck über
der entsprechenden Aminosäure
der identifizierten keratinolytischen Protease von Bacillus licheniformis
identififiziert.
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