DE3850456T2

DE3850456T2 - Klonierung des isoamylaseenzym kodierenden Gens und seine Verwendung zur Herstellung dieses Enzyms.

Info

Publication number: DE3850456T2
Application number: DE3850456T
Authority: DE
Inventors: Barbara Camerini; Paolo Carrera; Gennaro Carlo Di; Giuliano Galli; Guido Grandi; Giuseppe Lucchese; Angelo Tognoni
Original assignee: Enichem Sintesi SpA
Current assignee: Enichem Sintesi SpA
Priority date: 1987-08-07
Filing date: 1988-07-26
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2008-07-27
Also published as: JP2777805B2; US5457037A; ATE107959T1; EP0302838A2; CA1308373C; EP0302838B1; DE3850456D1; EP0302838A3; JPH02457A; ES2056123T3

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Gentechnologie und betrifft Mittel und Verfahren unter Anwendung dieser Technik zur Isolierung der DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz, die von Isoamylase stammt, deren Produktion, das erhaltene Produkt und dessen Verwendung.
Insbesondere betrifft die Erfindung das Isolieren und Sequenzieren von dem das Isoamylaseenzym kodierenden Gen sowie das Spezifizieren des vorgenannten Enzyms hinsichtlich der Aminosäuresequenz.
Schließlich betrifft die Erfindung die Moleküle der replizierbaren rekombinanten DNA mit dem Isoamylasegen oder dessen Fragmenten sowie mit den vorgenannten rekombinanten DNA-Molekülen transformierte Mikroorganismen, die zur Expression und/oder Abscheidung des Genprodukts fähig sind.
Die Erfindung betrifft dann auch noch ein Verfahren zur Herstellung von voll entwickelter (reifer) Isoamylase oder Peptidfragmenten davon, die zur Expression einer biologischen, mit der von voll entwickelter Isoamylase äquivalenten Aktivität befähigt sind, sowie das Züchten von einem Mikroorganismus, der mit dem das Isoamylasegen oder dessen Fragmente enthaltenden rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, in einem geeigneten Kulturmedium und die Abtrennung des erhaltenen Genprodukts aus Kulturmedium oder Zellen.
Die aus einer Mischung von D(+)-Glukosepolymeren in geradkettiger Form (Amylose) oder verzweigtkettiger Form (Amylopektin) bestehende Stärke wird enzymatisch zur Herstellung von Dextrose, Maltose und andere Oligosaccharide enthaltenden Syrups oder Feststoffen hydrolysiert. Die zur Hydrolyse von Stärke hauptsächlich verwendeten Enzyme sind Amylasen, die die in der Amylose vorhandenen 1-4-Glukosebindungen spalten, sowie Isoamylasen und Pullulanasen, die die 1-6-Glukosidbindungen im Amylopektin angreifen.
Nachdem die für die industrielle Maltoseherstellung eingesetzte Stärke zumeist große Mengen an Amylopektin enthält, ist es notwendig, die beiden Enzymklassen gemeinsam zu verwenden, um die Maltose in hoher Ausbeute (> als 95%) zu gewinnen.
Im allgemeinen werden 1-6-Glukosid-Bindungen spaltende Enzyme von einer breiten Palette von Organismen gebildet, die von den einzelligen Eukaryoten, wie z. B. Hefe (B. Marno und T. Kobashi, Nature, 167, 606 (1951), Z.H. Gunja et al., Biochem. J., 81, 392 (1961)), bis zu höheren Pflanzen (F.N. Hobson et al., J. Chem. Soc., 1451 (1951)) und Bakterien (E.Y.C. Lee at al., Arch. Biochem. Biophys., 125, 1028 (1968)) reicht.
Insbesondere Isoamylase (E.C. 3.2. 1.68), ein Enzym mit einem Molekulargewicht von etwa 90 000 Dalton, wird durch Fermentation von einem Pseudomonas amyloderamosa- Stamm (T. Harada et al., Appl. Microbiol., 16, 1439 (1968)) gewonnen.
Auf Grund fehlender Sicherheitsanerkennung (non-GRAS(Generally Recognized As Safe)-character) für alle Arten von Pseudomonas ist diese Arbeitsweise nicht völlig zufriedenstellend.
Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer Technik zur Herstellung eines Isoamylaseproduzierenden Stammes, der die wesentlichen Sicherheitsbedingungen für dessen Anwendung auf dem Gebiet der Lebensmittelindustrie erfüllt. Ein Mikroorganismus mit den vorgenannten Charakteristiken kann durch Transformieren von einem Organismus mit Unbedenklichkeitserklärung (GRAS-organism) durch gen technische Verfahren (rekombinente DNA betreffende Praktiken) erhalten werden.
Dank der Entwicklung der Molekulargenetik wurde es - mittels der vorgenannten Techniken - möglich, Teile von genetischem Material verschiedener Herkunft in vitro zu kombinieren, also neue Kombinationen von Genen zu bilden, was zu neuen vererbbaren Eigenschaften in bestimmten Organismen führt. Im allgemeinen umfaßt die Gentechnik folgende Stufen:
- Isolieren des ein gegebenes Protein kodierenden DNA-Fragments,
- Einbringen des Fragments in einen Klonierungsvektor und Isolieren des resultierenden Hybridvektors oder Moleküls der gentechnischen DNA,
- Einbringen des Moleküls in einen Wirtsorganismus durch Transformationstechnik,
- Vermehren vom transformierten Organismus unter Expression des DNA- Fragments im Zuge der Herstellung des gewünschten Proteins und schließlich Isolieren und Reinigen des erhaltenen Expressions-Produkts aus dem Kulturmedium oder dem Wirtsorganismus.
Obgleich diese Technologie einen hohen Ausgereiftheitsgrad erreicht hat und zahlreiche Studien auf diesem speziellen Gebiet der Technik durchgeführt wurden, ist es immer noch schwierig, ohne geeignete experimentelle Grundlage einen Erfolg vorauszusagen. Zur Herstellung von heterologen Proteinen auf gentechnischem Weg ist es wichtig, über die kodierende DNA oder Gensequenz für das in Frage stehende Protein zu verfügen.
Bisher sind weder die Sequenz für das die Isoamylase kodierende Gen noch die Aminosäuresequenz für das vorgenannte Enzym bekannt.
Zu allererst offenbart die Erfindung die Isolierung vom Isoamylasegen, dessen Sequenzierung und Spezifikation sowie die aus der Nukleotidsequenz stammende Aminosäuresequenz des Isoamylaseenzyms.
Die Erfindung stellt auch Informationen über die Sequenzen oberhalb und unterhalb der 5'- und 3'-Enden des Isoamylasegens zu dessen Expression durch in vitro-Einbringung in einen Klonierungsvektor zur Verfügung.
Insbesondere wird durch die Erfindung die terminale 5'-Sequenz für das Sekretions- Signal-Peptid (Leader-Peptid) der kodierenden DNA geoffenbart, die unmittelbar der Aminosäuresequenz der vollständigen Isoamylase vorangeht und für deren Sekretion verantwortlich ist.
Als Ergebnis von allen diesen Erkenntnissen ist es möglich geworden, Mittel und Verfahren zur Herstellung von Isoamylase auf gentechnischem Weg zu entwickeln. Demzufolge ist ein Gegenstand der Erfindung ein DNA-Fragment, das in reiner Form isoliert und sequenziert wurde und das Isoamylasegen umfaßt.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Spezifikation der Aminosäuresequenzfolgen in dem entwickelten Isoamylaseenzym und der Sekretions- Signalsequenz dafür.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Molekül der replizierbaren rekombinanten DNA zur Expression in einem Wirtsorganismus, welches ein DNA- Fragment oder Bereiche davon umfaßt.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft Wirts-Mikroorganismen, die mit dem Molekül der rekombinanten DNA transformiert und zur Expression und/oder Sekretion des kodierten Genprodukts aus der heterologen Nukleotidsequenz in dem Molekül der rekombinanten DNA fähig sind.
Ein noch weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von vollständiger Isoamylase oder Polypeptiden, die eine der vollständigen Isoamylase äquivalente biologische Aktivität aufweisen, durch Vermehren von einem Wirtsorganismus, der durch ein Molekül von der rekombinanten DNA mit dem Isoamylase kodierenden Gen oder Abschnitten davon transformiert ist und zur Expression und/oder Sekretion von vollständiger Isoamylase oder einem Polypeptid mit einer der vollständigen Isoamylase äquivalenten biologischen Aktivität fähig ist, in einem geeigneten Kulturmedium mit anschließender Abtrennung und Reinigung des erhaltenen exprimierten Produkts aus dem Kulturmedium oder der mikrobiellen Zelle.
Schließlich betrifft die Erfindung noch das erhaltene vollständige Isoamylaseenzym sowie die Polypeptide mit einer der vollständigen Isoamylase äquivalenten biologischen Aktivität.
Diese Gegenstände werden erreicht durch das in den beiliegenden Ansprüchen 1 bzw. 9 definierte Isoamylase-Strukturgen bzw. DNA-Fragment. Weitere Ziele der Erfindung ergeben sich aus dem nachfolgenden Text und den Beispielen.
Zum besseren Verständnis der Erfindung folgt nachstehend eine kurze Erläuterung der verwendeten Begriffe.

Genom-Bank:

Dies ist der Term für alle Klone von einem Wirtsorganismus, von denen ein jeder ein Fragment der DNA trägt, die von dem in der Bank zu erfassenden Donor-Organismus stammt.
Eine Genom-Bank wird als repräsentativ definiert, sofern der Satz der individuellen Fragmente in jedem Klon das meiste (oder alles) der chromosomalen DNA vom Organismus rekonstruiert.

Restriktionsenzyme:

Dies sind hydrolytische Enzyme, die zum Schneiden der DNA- Moleküle an spezifischen Stellen fähig sind, welche als Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme bezeichnet werden.

Klonierungsvektoren:

Dies sind DNA-Moleküle, die im Falle der Transferierung in einen Wirtsorganismus alle genetischen Informationen zu deren Replikation enthalten.
Plasmide und die DNA von einigen Bakteriophagen sind Beispiele für Klonierungsvektoren.
Bevorzugt wird in der Gentechnologie ein Plasmid mit einer DNA-Doppel-Helix in zirkulärer Form verwendet, weil eine Anzahl von Kopien davon je Zelle in den meisten Bakterien und anderen Mikroorganismen vorhanden sind. Auch enthält die Plasmid-DNA nicht nur den Replikations-Origin zu dessen Reproduktion in dem Wirtsorganismus, sonder auch Gene, die bestimmte phänotypische Charakteristiken, wie Beständigkeit gegen Antibiotika, kodieren. Das vorteilhafte Ergebnis ist das leichte Erkennen der Wirtszellen mit dem gewünschten Plasmid bei der Vermehrung in einem bestimmten Medium. Plasmide sind auch deswegen brauchbar, weil sie in spezifischer Art durch ein jedes der Restriktionsenzyme geschnitten werden können, die jeweils eine verschiedene Schnittstelle in der Plasmid-DNA erkennen.
Das heterologe Gen oder ein Fragment davon kann im Anschluß an das Schneiden in die Plasmid-DNA eingefügt werden und der Ring unter Bildung von einem größeren Molekül, dem Molekül der Rekombinanten-DNA oder Plasmid-Hybrid wieder geschlossen werden.
Die rekombinanten DNA-Moleküle werden danach in die Wirtszellen mittels des als Transformation bezeichneten Verfahrens eingebracht.
Die erhaltenen transformierten Zellen werden dann bei einem Fermentationsprozeß zur Bildung des kodierten Polypeptids aus dem in das Plasmid eingebauten Gen mittels der als Expression bezeichneten Arbeitsweise eingesetzt.

Expression:

Dies ist die Bezeichnung für einen Mechanismus, bei dem ein Wirtsorganismus zur Synthese des kodierten Proteins aus einem gegebenen Gen befähigt ist.
Der Ausdruck umfaßt den Vorgang der Transkription, d. h. die Übertragung genetischer Informationen aus der DNA in die messenger-RNA (mRNA), und der Translation, d. h. die Übertragung der Informationen von der mRNA in das Protein gemäß den Regeln vom genetischen Code (vgl. J.D. Watson in Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc. N.Y., 3. Aufl. 1976), der Bezug hat zu den Codons, d. h. den Tripletts zum Kodieren der Nukleotidbasen für eine gegebene Aminosäure.
Verschiedene Codons können dieselbe Aminosäure kodieren, aber für jede Aminosäure bestehen allein diese bestimmten Codons und keine anderen. Die Transkription beginnt in einem Bereich, der als Promotor bekannt ist und durch die RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird.
Die erhaltene mRNA wird danach in ein Polypeptid mit der kodierten Aminosäure-Sequenz der messenger-RNA übertragen.
Die Translation beginnt mit dem Startsignal (ATG) und endet bei den Terminationscodons.

Primer:

Dies ist ein Oligonukleotid, das üblicherweise 15 bis 20 Basen enthält und mit dem Bereich der Einzelhelix komplementär ist, der mittels der enzymatischen Methode sequenziert werden soll.

Gen:

Dies ist die Nukleotidsequenz, die das Strukturgen enthält, also die Sequenz zum Kodieren des vollständigen Proteins, oberhalb von dem angeordnet sind: die transkriptions-regulierenden Sequenzen (der Promotor und die Stelle, ab der die Transkription beginnt), die Ribosomen-Bindungsstelle und im Falle von bestimmten Proteinen die kodierende Nukleotidsequenz für das Sekretions- Signalpeptid des voll entwickelten (reifen), keine anderen Aminosäuresequenzen als das natürliche Protein aufweisenden Proteins.
Zu den Zeichnungen wird in Kürze folgendes angemerkt
Fig. 1 zeigt Platten von einem M9+Amylopektin-Agarmedium (pH 6,0) mit einigen Klonen aus der Sau3A-Genombank. Nach dem Anfarben mit Jod zeigten die Klone 9 (A) und 17 (B) den violetten Ring, der auf die Isoamylase-Aktivität hinweist.
Fig. 2 zeigt die Restriktionskaate vom aus dem Klon 9 extrahierten Plasmid pSM 257.
Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte des aus dem Klon 17 extrahierten Plasmid pSM 258.
Fig. 4 zeigt die Vergleichsanalyse der elektrophoretischen Profile der Plasmidhybride nach der Digestion mit Restriktionsenzymen. Das Plasmid aus dem Klon 9 (pSM 257) wurde mittels Sau3A (Probe 2) - und HpaII (Probe 5) - Enzymen digeriert und mit dem Plasmid aus dem Klon 17 (pSM 256) (Proben 3 und 6) sowie dem Einzelvektor pUC 12 (Proben 1 und 4) verglichen.
M: sind Molekulargewichtsmarken
Fig. 5 zeigt die Überprüfung der Anwesenheit von Isoamylase durch Behandlung mit Anti-Isoamylase-Antikörpern:
1. Proteine aus Klon 9,
2. Proteine aus E.coli 71/18,
3. 100 ng gereinigte Isoamylase.
Fig. 6 betrifft ein Diagramm zum Klonen von Smal-BamHI (1900bp)- und BamHI-XbaI (1300 bp)-Fragmenten vom Plasmid pSM 257 in den Vektor M 13mp8.
Fig. 7 gibt die Nukleotidsequenz des 3335 bp-Fragments der Chromosomen-DNA vom Pseudomonas SMP1 mit dem Isoamylasegen wieder.
Fig. 8 ist die Nukleotidsequenz vom Isoamylase kodierenden Strukturgen, gebildet aus der 2250 bp- und der Aminosäuresequenz des Enzyms, abgeleitet aus der Nukleotidsequenz (750 Aminosäuren).
Fig. 9 ist die Nukleotidsequenz des Fragments der Chromosomen-DNA, erhalten aus Pseudomonas SMP1, mit dem Gehalt an dem Isoamylase-Strukturgen und den Regulations- und Sekretionssequenzen.
Das Isoamylase kodierende Fragment und die Signalsequenz (LS) dafür umfassen 2328 bp und kodiert ein Protein mit 776 Aminosäuren.
In den Sequenzen werden folgende Symbole verwendet:
= Promotor
= angenommene Transkriptionsstelle
RBS = Ribosomen-Erkennungsstelle
LS = Signal-Sequenz
- - - - = Isoamylase-Strukturgen
= Terminator-Sequenz
Fig. 10 gibt die Restriktionskarte vom Plasmid pSM 262 wieder.
Fig. 11 gibt die Restriktionskarte vom Plasmid-Hybrid pSM 289 zur Expression und Sekretion in Escherichia coli wieder.
Fig. 12 gibt die Restriktionskarte vom Plasmid-Hybrid pSM 290 zur Expression und Sekretion im Bacillus subtilis wieder.
Gemäß der Erfindung kann jede zur Produktion von Isoamylase befähigte Spezies aus der Gattung Pseudomonas zur Isolierung des das vorgenannte Enzym kodierenden Gens verwendet werden.
Bevorzugt wurde der in unserem Laboratorium isolierte Pseudomonas-Stamm Pseudomonas SMPI verwendet, der zur Erzielung von hohen Ausbeuten (etwa 125 U/ml) an Isoamylase von guter Aktivität und thermischer Stabilität fähig ist.
Der Stamm wurde gemäß den Arbeitsweisen von Kado und Liu in J. of Bacteriol., 145, 1365 (1981), analysiert, um zu überprüfen, ob das Isoamylasegen in dessen Chromosom oder in einem Plasmid vorhanden ist. Die Ergebnisse ergaben, daß der in Frage stehende Stamm keine nicht-chromosomalen Formen der DNA enthält.
Demzufolge wurde gemäß der Erfindung das Isoamylasegen durch Bildung von Genombänken von Pseudomonas SMPI unter Einsatz von geeigneten Restriktionsenzymen zum Digerieren der chromosomalen DNA isoliert.
Insbesondere wurden zwei Genombänke von Pseudomonas SMPI durch Digerieren der aus dem Mikroorganismus extrahierten chromosomalen DNA gebildet, und zwar getrennt mit EcoRl (BRL)- und Sau3A (BRL)-Restriktionsenzymen. Die Reaktion wurde in einer Pufferlösung bei einer Temperatur von oder um etwa 37 ºC während einer für die gewünschte Digestion hinreichenden Zeit durchgeführt.
Aus den erhaltenen DNA-Fragmenten wurden die mit Dimensionen von 3000 und 4000 Basenpaaren (bp) gereinigt.
Die Wahl wurde durch die Tatsache diktiert, daß auf Grund des bekannten Molekulargewichts der Isoamylase die Größe von deren Gen mit etwa 3000 bis 4000 bp angenommen werden konnte.
Die erhaltenen beiden Populationen von den Fragmenten der EcoRI- und Sau3A-DNA wurden dann in einen Klonierungsvektor zur Expression in Escherichia coli (e.coli) eingebaut, und zwar unter solchen Bedingungen, die für die Kondensation eines Einzelfragments der DNA pro Vektor-Molekül geeignet sind.
Insbesondere wurde die Reaktion in einer Pufferlösung in Gegenwart vom T4DNA- Ligaseenzym (BRL) bei einer Temperatur zwischen 4 ºC und 37 ºC, vorzugsweise zwischen 13 und 18ºC durchgeführt.
Geeignete Vektoren für diesen Zweck können aus auf diesem Gebiet üblicherweise verwendeten E. coli-Plasmiden oder Bakteriophagen ausgewählt werden.
Insbesondere wurde von dem Plasmid pUC 12 (1800 bp), das von J. Messing et al. in Gene, 19, 159 (1982) beschrieben wurde, Gebrauch gemacht, was eine leichte und schnelle Methode zur Unterscheidung derjenigen Klone ist, die in sich ein Fragment einer nicht zugehörigen DNA enthalten.
Das Plasmid trägt Gene der β-Iactamase und β-Galaktoxidase und ermöglicht so dem E. coli-Wirtsstamm in einem Ampicillin enthaltenden Medium die Vermehrung. Wenn ein fremdes Fragment zwischen den im β-Galaktoxidase-Gen vorhandenen, zum Klonieren besonders geeigneten Restriktionsstellen eingefügt wird, wird das Gen gebrochen und vermag kein Enzym mehr zu bilden.
Es ist daher möglich, durch Verwendung von Substanzen, die Lactose ähnlich sind und abgebaute Moleküle färben, rekombinante Klone (nicht gefärbt) von Klonen mit dem Originalplasmid (blau gefärbt) zu unterscheiden.
Gemäß der Erfindung wurde die pUC 12-Plasmid-DNA durch Digerieren mit Restriktionsenzymen, die auf der Innenseite von der Nukleotidsequenz der β-Galaktoxidase schneiden, geradlinig gemacht und nach der Fällung und Abtrennung aus der Reaktionsmischung mit den Fragmenten der chromosomalen, zuvor durch Digerieren mittels EcoRI und Sau3A erhaltenen DNA von Pseudomonas SMPI verbunden.
Zur Vermeidung einer Rezyklisierung des Plasmids vor der Ligase-Reaktion wird das Plasmid-DNA-Molekül mit alkalischer Phosphatase, also dem Enzym, das Phosphatgruppen vom 5'-Ende des Moleküls entfernt und die Kondensation vom Terminalen 3'OH in Gegenwart der Ligase verhindert, behandelt.
Die Ligase-Reaktion wird unter Verwendung von einem für das Plasmid günstigen Plasmid : DNA-Fragment-Verhältnis, vorzugsweise 2 : 1 ausgeführt.
Am Ende der Reaktion werden die beiden Ligase-Mischungen zum Transformieren von E. coli-Zellen, die gemäß der von M. Mandel und Higa beschriebenen Methode (vgl. J. Mol.Biol. 53, 154) kompetent gemacht worden waren, verwendet; es wurden zwei Populationen von Kolonien (Genombänken) erhalten. Eine jede Kolonie wies ein Plasmid-Hybrid aus dem Plasmid pUC 12 und einem Fragment der chromosomalen DNA von Pseudomonas SMPI auf.
Geeignete E. coli-Zellen können ausgewählt werden aus:
Die transformierten Zellen werden auf ein selektiv gemachtes Medium aufgebracht und zum Isolieren der Plasmid-Hybrid enthaltenden Klone verwendet, wobei pUC 12 mit einer Effizienz von mehr als 2 · 10&sup6; Kolonien je ug DNA transformiert wird.
Die erhaltenen Genombänke werden danach zur Bestimmung von darin anwesenden, das Isoamylase-Gen enthaltenden Klonen untersucht. Dies kann mittels verschiedener Methoden, wie der Hybridisierung mit bestimmten DNA-Proben oder Screening durch direkte Expression erfolgen.
Die erste Methode basiert hauptsächlich auf der Bestimmung des letzten Teils von der Aminosäuresequenz der Isoamylase. Diese Information wird zum Synthetisieren von kurzen Nukleotidfragmenten verwendet, die im Falle einer geeigneten Markierung zur Ermittlung positiver Klone herangezogen werden; hierbei bedient man sich allgemein bekannter Arbeitsweisen (vgl. D.S. Hogness in P.N.A.S., 72, 3961(1975), P.J. Mason et al. in "Nucleic Acid Hybridization", 245 (1985), IRL PRESS Washington, D.C.).
Andererseits beruht die zweite Methode auf der Voraussetzung, daß das Isoamylasegen durch das in der es enthaltenden Genombank exprimiert werden kann.
Wenn dieser Klon in einem Amylopektin enthaltenden Medium vermehrt wird, wird das Amylopektin abgebaut und kann der Abbau mittels kolorimetrischer Methoden bestimmt werden. Demzufolge werden gemäß der Erfindung die rekombinanten Klone der beiden Genombänke von Pseudomonas SMPI durch direkte Expression geprüft, und zwar unter Verwendung von einem amylopektin-haltigen, auf pH 6,0 gepufferten minimalen Kulturmedium. Der auf die Anwesenheit des Enzyms zurückgehende Abbau wird durch Joddämpfe nachgewiesen.
Diese Methode diente zur Isolierung von zwei Klonen, beide aus der Sau3A- Genombank, die eine klar positiv Antwort bei dem Versuch auf einer Platte gaben. Die Fähigkeit der beiden Klone zur Bildung von Isoamylase wird auch belegt durch immunologische Versuche mit spezifischen Anti-Isoamylase-Antikörpern nach der Western-Blotting-Technik (vgl. B.D. Hames et al., Gel Electrophoresis of Proteins, 290 (1981), IRL PRESS, Washington, D.C.).
Als nächstes wurde dann die Restriktionskarte der Plasmid-Hybride von den beiden positiven Klonen bestimmt.
In der Praxis wurden diese Plasmide nach der Methode von H. C. Bornholm et al., Nucleids Acids Res., 7, 1513 (1979), isoliert und durch Elektrophorese nach der Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen analysiert.
Einer der beiden Plasmide (pSM 257) wies eine Insertion von etwa 3200 bp auf, die - wie gefunden wurde - eine EcoRi-Restriktionsstelle, eine BamHI-Stelle und eine SstI- Stelle enthält. Das andere Plasmid (pSM 258) wies eine Insertion von etwa 3000 bp auf, die dieselben Restriktionsstellen wie das erste Plasmid enthält.
Die Plasmide wurden dann mit zwei oft schneidenden Enzymen sukzessiv digeriert und zeigten - obgleich von etwas unterschiedlicher Größe - ein ähnliches Elektrophorese- Profil.
Gemäß der Erfindung wurde die Nukleotid-Sequenz der chromosomalen DNA- Fragmente mit etwa 3200 bp analysiert.
Dies kann z. B. unter Anwendung der Technik von Maxam und Gilbert (P.N.A.S., 74, 560 (1977)), mit einem chemischen System zum spezifischen Abbau der DNA oder gemäß der Arbeitsweise von F. Sanger et al. (P.N.A.S., 74, 5463 (1977)), die auf einem sequenzierenden Enzymsystem beruht, erfolgen.
Die letztere Methode, die besonders zum Sequenzieren von sehr langen und wenig bekannten DNA-Fragmenten bevorzugt wird, erfordert, daß das zu sequenzierende Fragment in der Form von einem Einzelstrang (template) und einem kleinen Oligonukleotid (15-20 Basen) als Primer und Komplementär zu der Initialregion des Einzelstrangs zur Verfügung steht. Demzufolge wurde gemäß der Erfindung das chromosomale DNA-Fragment mit etwa 3200 bp in einen Vektor subkloniert und mittels der Sanger-Methode sequenziert. Viren, Plasmide oder Bakteriophagen können hierfür geeignete Vektoren sein. Vorzugsweise werden die Bakteriophagen-Vektoren M 13mp8 (J. Messing et al., Gene, 19, 263 (1982)) und M 13mp9 (K.R. Yamamoto et al., Virology, 40, 734 (1970)) verwendet, bei denen die Klonierungsstellen in umgekehrter Art zur Verknüpfungsstelle des Primers angeordnet sind und die zur Bestimmung der Sequenz von einer Insertion von zwei entgegengesetzten Enden herangezogen werden können.
Der Bakteriophagen-Vektor M 13mp8 ist besonders geeignet für den Gegenstand der Erfindung, da dessen DNA im Falle des Vorliegens in E. coli-Zellen in Doppelhelix- Form isoliert werden kann, andererseits aber in der Form eines Einzelstranges beim Übergehen des Phagen von den Bakterienzellen am Ende vom Infektionszyklus in das überstehende Kulturmedium vorliegt.
Das Isoamylasegen wurde dann gemäß der Erfindung in zwei Fragmente geteilt, von denen ein jedes in den Bakteriophagen-Vektor M 13mp8 eingefügt wurde.
Im einzelnen wurde das Plasmid pSM 257 mittels BamHI-, SmaI- und XbaI- Restriktionsenzymen digeriert, wobei die Anwesenheit der BamHI-Stelle innerhalb von Gen und der beiden anderen Stellen vor und hinter dem Gen ausgenutzt wurde. Die Enden der erhaltenen Fragmente wurden durch Behandlung mit dem Polymerase I- Enzym (großes Fragment oder KIenow-Fragment) gerichtet und die Fragmente durch Elektrophorese und anschließende Elution nach bekannten Methoden getrennt.
Die erhaltenen Fragmente, enthaltend etwa 1900 bp (SmaI-BamHI) und etwa 1300 bp (BamHI-XbaI), wurden in den M 13mp8-Bakteriophagen-Vektor nach Geradstreckung durch SmaI-Enzym in Gegenwart von T4 DNA-Ligase eingefügt; die Ligasemischung wurde dann zum Transformieren kompetenter E. coli-Zellen verwendet.
Nach der Identifizierung der rekombinanten Klone, d. h. derjenigen mit den Hybridvektoren, wird die lage der beiden Fragmente durch geeignete Schnitte mittels Restriktionsenzymen bestimmt.
Insbesondere wird der Hybridvektor mit dem 1900 bp-Fragment mittels des EcoRI- Restriktionsenzyms digeriert, welches innerhalb des Fragments in asymmetrischer Weise und in dem Vektor in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem Fragment schneidet; das Ergebnis war - wie erwartet - ein Segment mit 300 bp oder 1600 bp in Abhängigkeit von der lage. Entsprechend gaben Plasmide mit dem 1300 bp-Fragment beim Digerieren mit SstI- und HindIII-Enzymen 500 bp- und 800 bp-Segmente in Abhängigkeit von der Lage.
Die Bestätigung für die entgegengesetzte Orientierung wurde mit der Methode von J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 20 (1983), gefunden. Die Einzelhelizes wurden aus den Klonen extrahiert und unter Anwendung der von E.C. Strauss et al., Analytical Biochem., 154, 353 (1986), beschriebenen Strategie von den sukzessiven Primern sequenziert.
Es wurde gefunden, daß das in das Plasmid pSM 257 eingefügte DNA-Fragment 3335 bp enthielt, wohingegen die kodierende Region für das Isoamylaseenzym 2328 bp, entsprechend 726 Aminosäuren enthielt.
Etwa 1000 Basen von einem Ende des 3335 bp-Fragments wurde eine Sequenz von 54 Nukleotiden, die der Aminoterminalen Sequenz des gegebenen Enzyms entspricht, nach bekannten Methoden mittels eines automatischen Proteinsequenzers untersucht. Dieses Vorgehen erfolgte zur genauen Identifizierung vom 5'-Anschluß vom Strukturgen der voll ausgebildeten Isoamylase, für die ein Gehalt von 2250 bp, entsprechend etwa 750 Aminosäure, gefunden wurde.
Wie erwartet, wurde in einem abgesonderten Protein, unmittelbar oberhalb vom Strukturgen der voll entwickelten Isoamylase, eine Kodierungszone für eine Signalfrequenz von 26 Aminosäure (LS) gefunden, die für die Sekretion des Proteins verantwortlich ist und mit Methionin (-ATG-) beginnt. Die genannte LS hat einen stark hydrophoben Aufbau, der zur Übertragung von dem Protein außerhalb der Zellmembran notwendig ist. Die LS wird durch eine Membranpeptidase nach Transiokation des Proteins entfernt, wobei die Erkennungsstelle der Peptidase in der Ala-His-Ala-Sequenz identifizierbar ist und der Schnitt nach dem zweiten Alanin erfolgt.
Dies wird bestätigt durch die Aminoterminalen Sequenzwerte des abgesonderten, von den Erfindern gereinigten Proteins, wonach die Sequenz Ala-Ile-Asn ist.
Zehn Nuklectide vor der -ATG- Translations-Initiation wurde auch noch eine typische Bindungsstelle für Ribosome (RBS) mit der Sequenz GGAGG gefunden.
Etwa 130 Nuklectide oberhalb von LS wurde ein Glied vom Typ (-GGATGT-) gefunden, das der "consensus"-Sequenz (-GGATGA-) von Promotoren für die Maltoseinduktion ähnlich ist.
35 Nukleotide vor dieser Sequenz befindet sich ein -G- Rest, der wohl der Anfang der Transkription sein könnte.
10 Nukleotide vor diesem -G- befindet sich ein dem analogen "-10-Bereich" von Pullulanase sehr ähnliches -TCTATT- Glied, ein durch Maltose induziertes Gen (vgl. C. Chapan et al., J. of Bacteriol., 164 (2), 639 (1985)). Hinter diesem Gen, etwa 10 Nukleotide nach dem STOP -TAG- Codon, befindet sich eine typische Translrriptions- Terminatorstruktur mit einer sich wiederholenden, invertierten und durch eine Zone von vier Nuklectiden getrennte Sequenz, die eine sekundäre Struktur mit einem ΔG für die Bildung in Höhe von -24,8 Kcal/Mol (berechnet nach der Methode von Tinoco et al., Nature New Biol., 246, 40 (1973)), zu bilden vermag.
Gemaß der Erfindung und auf der Grundlage der vorher angeführten Sequenzdaten kann das DNA-Fragment mit dem Isoamylase oder Bereiche davon kodierenden Gen zum Aufbau von rekombinanten DNA-Molekülen für die Isoamylase-Herstellung oder Polypeptiden mit einer der Isoamylase entsprechenden biologischen Aktivität mittels replizierbarer Klonierungs-Vektoren, wie Plasmiden, verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das kodierende Strukturgen für Isoamylase in einen Plasmid-Vektor eingefügt werden, und zwar durch Positionierung nach von Pseudomonas-Sequenzen abweichenden Promotor- und Sekretions-Sequenzen. Dies kann erreicht werden mittels starker Promotoren, die zur äußerst wirksamen Expression des Gens im Anschluß an sie fähig sind und aus den bekannten Promotoren ausgewählt werden.
Beispiele für solche Promotoren sind diejenigen im Triptophan-System (trp), im lactose-System (lac) oder in Bakteriophagen, wie P1 und T5.
Indessen wurden zahlreiche andere mikrobielle Promotoren identifiziert und verwendet, von denen Einzelheiten zu deren Sequenzen durch Siebenlist et al., Cell., 20, 269 (1980), veröffentlicht wurden.
Kodierende Nukleotide-Sequenzen für ein Sekretions-Signal-Protein können aus denen, die allgemein auf dem Gebiet der Gentechnologie Verwendung finden, ausgewählt werden.
Subtilisin und neutrale Protease sind Beispiele von für die Zwecke der Erfindung geeigneten Sequenzen.
Gemäß einer anderen Ausgestaltung der Erfindung können Moleküle der rekombinanten DNA durch Positionieren des Isoamylase-kodierenden Gens ohne die Regulationssequenzen in einem Plasmid-Vektor gebildet werden, und zwar unter Kontrolle von von Pseudomonas-Sequenzen abweichenden regulierenden Sequenzen.
Die beim Arbeiten nach einer jeden von diesen Ausführungsformen erhaltenen Moleküle von rekombinanter DNA werden dann eingesetzt zum Transformieren von Wirtsorganismen, die in der Regel aus in bekannter Weise kompotent gemachten Bakterien und Hefen ausgewählt werden.
Die so transformierten Mikroorganismen werden in Fermentationsprozessen zur Herstellung von Isoamylase oder Isoamylase-Aktivität aufweisenden Polypeptiden verwendet.
Vorzugsweise findet ein Mikroorganismus aus der E. coli K12 Bacilli und Saccharomyces umfassenden Gruppe Anwendung.
Von diesen werden die Stämme von Bacillus subtilis besonders bevorzugt, weil sie für Menschen nicht pathogen sind und weil sie das synthetisierte heterologe Protein direkt in das Kulturmedium abzugeben vermögen.
Dadurch können die nachfolgenden Operationen für die Gewinnung und Reinigung des gewünschten Proteins in vorteilhafter Weise vereinfacht werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden die Moleküle der rekombinanten DNA zur Expression der Isoamylase in E. coli und B. subtilis durch Einbringen des DNA-Fragments mit dem Gehalt an LS und Isoamylase-Strukturgen in in den vorgenannten Bakterien replizierbaren Klonierungsvektoren gebildet.
Insbesondere auf Grund der Anwesenheit von der NarI-Restriktionsstelle unmittelbar vor der Isoamylase-RBS war es möglich, ein DNA-Fragment von etwa 2400 bp des Plasmids pSM 257 zu isolieren, wobei dieses Fragment die kodierende Sequenz von dem Sekretions-Signalpeptid und der vollständigen Isoamylase ohne den Original- Promotor von Pseudomonas SMPI enthielt.
Das Fragment wurde nach der im Beispiel 4 beschriebenen Bildung von Zwischen- Plasmiden in den pUC 12-Klonierungsvektor zur Expression in E. coli eingebracht.
Das isolierte Molekül der rekombinanten DNA wurde mit dem Symbol pSM 289 bezeichnet und zum Transformieren von E. coli DHl-Zellen verwendet.
Diese kultivierten Zellen waren auf einer Platte in einem spezifischen flüssigen Medium in der Lage, Isoamylase zur Expression zu bringen und abzusondern (vgl. die Werte in Beispiel 6).
Gemäß der Erfindung wurde das DNA-Fragment mit dem Gehalt an dem Strukturgen für Isoamylase samt LS dem Plasmid-Hybrid pSM 289 als EcoRI-HindIII-Fragment entnommen und in einen Klonierungsvektor zur Expression und Replikation in B. subtilis eingefügt.
Hierbei wurde das in seinem Aufbau in nachfolgendem Beispiel 5 beschriebene Plasmid pSM 268 mit dem Gehalt an dem Origin für die Replikation in B. subtilis, dem kodierenden Gen für die Beständigkeit gegen Chloramphenicol und einem starken synthetischen Promotor verwendet. Das EcoRI-HindIII-Fragment wurde unter der Kontrolle des vorgenannten starken Promotors positioniert; das erhaltene Molekül der rekombinanten DNA (pSM 290) wurde isoliert und beschrieben.
Der Verbindungsbereich zwischen dem Isoamylasegen und dem Promotor wurde zwecks Abklärung dessen, daß keine Umlagerung der Sequenz im Verlaufe der Klonierungsoperation stattfand, entsprechend sequenziert.
Die Ergebnisse zeigten die erwartete Sequenz.
Zellen von B. subtilis, die gemäß der Methode von D. Dubnau und R. Davidoff- Abelson (J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)) kompetent gemacht worden waren, wurden dann mit pSM 290 transformiert.
Gemäß der Erfindung kann man die verschiedensten von den bei mehreren Stellen hinterlegten und der Öffentlichkeit zugänglichen Stämmen von B. subtilis einsetzen.
Insbesondere wurden der Stamm MS 108 Bacillus subtilis (rec&supmin;, Lis&supmin;, leu&supmin;) verwendet und die transformierenden Substanzen auf einem geeigneten Kulturmedium ausgesucht, z. B. VY plus Chloramphenicol.
Die positiven Klone wurden alsdann auf einer Platte aus einem M9 und MB-Medium und in flüssigen Medien bei einer Temperatur von oder um 37 ºC während 16 Stunden vermehrt.
Am Ende von dieser Zeit wurde die Isoamylase in dem Kulturmedium und dem Zellextrakt gemäß der Methode von A. Yokobayashi et al., Biochem. Biophis. Acta, 212, 458-469 (1970), bestimmt.
Wie die Ergebnisse zeigen, waren diese Mikroorganismen nicht nur befähigt zur Expression des Isoamylasegens, sondern auch zur Sekretion desselben in Mengen, die mit denen vom ursprünglichen Pseudomonas SMPI-Stamm vergleichbar waren.
Außerdem wurde gefunden, daß im Falle von Pseudomonas SMPI die optimale Bildung von Isoamylase etwa 72 bis 120 Stunden nach der Inkubation eintritt, dagegen mit B. subtilis (pSM290) nur 16 Stunden benötigt werden.
Das Plasmid-Hybrid pSM 257 (E. coli) 71/18 (pSM 257) und der Pseudomonas SMPI- Stamm wurden bei dem American Type Culture Centre am 24.07. 1987 hinterlegt und erhielten die Bezeichnungen ATCC 67474 bzw. ATCC 53 651.
Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern in nicht beschränkender Weise die Erfindung.

Beispiel 1

Extraktion der chromosomalen DNA aus Pseudomonas SMPI

100 ml eines HSM-Fermentationsmediums (aus 20 g/l Maltose, 4 g/l Na-Glutamat, 1,5 g/l (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l MgSO&sub1;7H&sub2;O, 0,1 g/l FeCl&sub3;, 0,1 g/l MnCl&sub2;·4H&sub2;O und 0, 1 g/l NaCl, pH 5,5) werden mit dem Stamm Pseudomonas SMPI beimpft und bei 30 ºC während 5 Tagen unter Bewegung (220 upm) gehalten. Am Ende dieser Zeit werden die Zellen von der Kultur mittels einer Sorvall RC-5B- Zentrifuge, Modell SS34 bei 4 ºC abzentrifugiert (10 Minuten, 5000 upm), zweimal mit 120 ml von einer Lösung mit 25% Saccharose, 100 mM NaCl und 50 mM Tris- HCl, pH 7,5, gewaschen, nochmals unter den oben angeführten Bedingungen zentrifugiert und in 10 ml einer Pufferlösung (pH 6,9) mit 100 mM EDTA und 50 mM NaCl sowie 1 mg/ml Lysozym (SIGMA) aufgenommen. Die erhaltene Suspension wird während 30 Minuten bei 37 ºC unter leichter Bewegung gehalten, dann mit 1 ml 10- prozentigem SDS (Natriumdodeeylsulfat) vermischt und 10 Minuten bei 60 ºC belassen sowie mit 1 mg/ml Pronase bei 37 ºC während 30 Minuten in 1 · SSC (1 · SSC = 0, 15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat) inkubiert und während 2 Stunden bei 37 ºC gehalten. Nach Zusatz von NaCl bis zur Endkonzentration von 1 M wird die DNA mit 2 oder 3 Volumen an kaltem Ethanol (-20 ºC) gefällt, mit einem Glasstab gesammelt und in 10 ml von 0,1 · SSC aufgenommen. Die Suspension wird unter leichter Bewegung bei Raumtemperatur (20 bis 25 ºC) über Nacht und nach Zusatz von RNAse (10 ug/ml) während 30 Minuten bei 37 ºC gehalten. Die Salzkonzentration der Lösung wird auf 1 · SSC gebracht. Nach der Extraktion des Proteins mit Phenol (1 Volumen) wird die DNA durch tropfenweise Zugabe von Isopropanol zur unter leichter Bewegung bei Raumtemperatur gehaltenen Lösung ausgefällt.
Die DNA wird dann durch Zentrifugieren gewonnen und mit 1 ml von 0,1 · SSC aufgenommen.
Die erhaltene Menge an chromosomaler DNA betrug - beurteilt durch Spektrophotometrie-Aufnahme bei OD260 mittels eines Perkin-Elmer- Spektrophotometers Modell 515-0,645 mg/ml.

Beispiel 2

Klonierung des Isoamylasegens

a) Vorbereitung einer Pseudomonas SMPI-Genombank in EcoRI

80 ug der gemäß Beispiel 1 erhaltenen chromosomalen DNA werden in 800 ul eines Puffers (Tris-HCl 100 mM, NaCl 50 mM und MgCl&sub2; 10 mM, pH 7,5) suspendiert und bei 37 ºC während 2,5 Stunden in Gegenwart von 375 Einheiten (U) EcoRI-Enzym (BRL) inkubiert.
Die DNA-Mischung wurde dann auf einen Saccharose-Gradienten (10 bis 40%) gebracht und in einem Beckman sw 28-Rotor bei 20ºC zentrifugiert (20 Stunden, 25000 upm).
Der Gradient wurde danach in Fraktionen geteilt; ein Teil jeder Fraktion wurde durch Elektrophorese an 0,7% Agarosegel bei 20 V über Nacht zur Feststellung der Fraktionen mit Fragmenten in den gewünschten Dimensionen (3000 bis 4000 bp) untersucht. Diese Fraktionen wurden gesammelt; die DNA wurde mit Ethanol bei -20 ºC gefällt und durch Zentrifugieren bei 12000 upm während 15 Minuten abgetrennt. Die DNA wurde in das vorher mit EcoRI digerierte E. coli-Plasmid pUC 12 eingefügt.
7 ug pUC 12 (2800 bp) wurden mit EcoRI-Enzym (BRL) in 70 ul einer Reaktionsmischung mit der vorher angeführten Zusammensetzung bei 37 ºC während 1 Stunde digeriert.
Die Plasmid-DNA wurde mit Ethanol bei -20 ºC gefällt, durch Zentrifugieren (15 Minuten, 1200 upm) in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 4 ºC abgetrennt, mit 50 ul eines TE-Puffers (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA) aufgenommen und der Behandlung mit 1 U CIP(Calf intestinal phosphatase)-Enzym (Boehringer) bei 37 ºC während 30 Minuten unterworfen.
Die Enzym-Reaktion wurde durch Zugabe von 40 ul H&sub2;O, 10 ul von 10 · STE (100 mM Tris-HCl, 1 m NaCl, 10 mM EDTA, pH 8) und 5 ul 10%-igem Natriumdodecylsulfat (SDS) abgebrochen.
2,6 ug des - wie oben angeführt - gefällten Plasmids wurden mit 1,3 ug einer die DNA- Fragmente mit 3000 bis 4000 bp enthaltenden Mischung aus dem Gradienten inkubiert, und zwar bei 14 ºC während 12 Stunden in Gegenwart von 20 U T4DNA-Ligase (Boehringer) bei einem Endvolumen von 130 ul eines Puffers (66 mM Tris-HCl, 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Dithiothreit, pH 7,6).
2 ul-Portionen der Ligasemischung wurden zum Transformieren von 300 ul E. coli 71/18-Zellen (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 1972, Co1d Spring Harbor Lab., New York) verwendet, die durch Behandlung mit 50 mM CaCl&sub2; kompetent gemacht worden waren (M. Mandel und Higa, J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)).
Die Transformanten wurden dann durch Aufbringen der Zellen auf ein 2 · YT-Medium (16 g/l Bacto-Trypton (DIFCO), 10 g/l Bacto-Hefeextrakt (D1FCO) und 10 g/l NaCl) - durch Zusatz von 50 ug/ml Ampicillin, 0,05 mM IPTG (Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid) und 0,2% X-Gal (5-Brom4-chlor-3-indolyl-D-galactopyranosid) auswählbar gemacht - selektiert und während 12 Stunden bei 37 ºC in einem thermostatisch geregelten Raum inkubiert.
Aus der gesamten Ligasemischung wurden 6000 rekombinante Kolonien erhalten.
Die Kolonien wurden in Gruppen von je 100 auf Platten von einem 50 ug/ml Ampicillin enthaltenen Luria-Agarmedium (Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt und 5 g/l NaCl) übertragen.
b) Vorbereitung einer Genombank von Pseudomonas SMPI in Sau3A
78 ug chromosomaler DNA von Pseudomonas SMPI wurden partial mit 16 U des Enzyms Sau3A (BRL) in 100 ul von einem Reaktionspuffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl und 5 mM MgCl&sub2;) während 30 Minuten bei 37 ºC digeriert.
Die so digerierte DNA-Mischung wurde auf einen Saccharose-Gradienten gebracht; die Fraktionen mit den 3000 bis 4000 bp enthaltenden DNA-Fragmenten wurden durch Elektrophorese auf Agargel identifiziert. Die experimentellen Bedingungen entsprachen denen im Teil a).
7 ug pUC 12 wurden in 70 ul einer Reaktionsmischung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl und 5 mM MgCl&sub2;) mit 50 U Bamin-Enzym (BRL) während 2 Stunden bei 37 ºC digeriert.
Die Plasmid-DNA wurde dann mit Ethanol bei -20 ºC gefällt, zentrifugiert und mit CIP (Calf intestinal phosphatase)-Enzym zur Verhinderung der Rezyklisierung - wie in Teil a) beschrieben - behandelt. 160 ng DNA wurden dann mit 80 ng einer Mischung aus dem Gradienten mit dem Gehalt an den Fragmenten mit 3000 bis 4000 bp in 100 ul der Reaktionsmischung in Gegenwart von 10 U T4DNA-Ligase während 18 Stunden bei 4 ºC inkubiert.
2 ul-Portionen der Ligase-Mischung wurden dann zum Transformieren von 300 ul E. coli 71/18-Zellen, die gemäß der zuvor beschriebenen Methode kompetent gemacht worden waren, verwendet, auf ein 2 · YT-Agarmedium plaziert und während 12 Stunden bei 37 ºC inkubiert.
Aus der gesamten Ligase-Mischung wurden 6300 rekombinante Kolonien erhalten.
Die Kolonien wurden in Gruppen von je 100 auf Platten von 50 ug/l Ampicillin enthaltendem Luria-Agarmedium (Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) übertragen.
c) Screening durch direkte Expression der EcoRI- und Sau3A-Genombänke
Die Kolonien aus den EcoRI- und Sau3A-Genombänken wurden durch Replikaplattierung (vgl. W. Hayes, The genetics of bacteria and their viruses, 187 (1968), Wiley New York) auf Platten von einem M9 + Glukoseminimum-Medium (6 g/l Na&sub2;HPO, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;,0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH&sub4;Cl, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM CaCl&sub2;, 0,2% Glukose, 0,5% Agar und 1% Amylopektin, pH 6,0) übertragen und während 48 Stunden bei 37 ºC inkubiert.
Die Kolonien wurden dann für 1 bis 2 Minuten unter Verwendung einer Lösung mit der nachfolgenden Zusammensetzung:
Jodplättchen 2 g
KI 1 g
Ethanol (95%ig) 25 ml
H&sub2;O 75 ml
(vgl. T. Harada et al., Appl. Microbiol., 28, 336 (1974)) Joddämpfen ausgesetzt. Die Kolonien aus der EcoRI-Genombank gaben ein negatives Resultat, wohingegen zwei Klone, mit 9 und 17 bezeichnet, aus der Sau3A-Genombank einen Amylopektin- Degradationsring (Fig. 1) zeigten, der mit dem im Falle von unter entsprechenden Bedingungen gewachsenen Pseudomonas SMPI identisch war. Dies belegt das Isoamylase-Bildungsvermögen von diesen Klonen und demzufolge die Anwesenheit des das vorgenannte Enzym kodierenden Gens innerhalb von diesen Klonen.
Nicht transformierte E. coli 71/18-Zellen wurden zur Kontrolle auf dem M 9 + Amylopektin Minimum-Medium bei pH 6,0 während 48 Stunden bei 37 ºC vermehrt und den Joddämpfen ausgesetzt; es zeigte sich jedoch kein Degradationsring.
Ferner wurde gefunden, daß die Klone 9 und 17 bei der Vermehrung auf Minimum- Medien bei anderen pH-Werten keinen Degradationsring bei pH > 6 zeigten.
d) Analyse durch Restriktion der positiven Klone
Die in den Klonen 9 und 17 anwesenden rekombinanten Plasmide wurden alsdann durch großtechnische Extraktion isoliert und nach Behandlung mit den folgenden Restriktionsenzymen PstI, EcoRI, HindIII, SstI, SmaI, BamHI, XbaI und SaII mittels Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel bei 100 V während 2 Stunden analysiert. Das aus dem Klon 9 isolierte Plasmid pSM 257 enthielt eine Einfügung von etwa 3200 bp, in der das Vorhandensein einer EcoRI-Stelle, einer BamHI-Stelle und einer SstI-Stelle, deren exakte Positionen in Fig. 2 gezeigt sind, ermittelt wurde.
Das aus dem Klon 17 isolierte Plasmid pSM 258 enthielt eine Einfügung von etwa 3000 bp, in der dieselben Restriktionsstellen wie beim Plasmid pSM 257 gefunden wurden.
Die Restriktionskarte von diesem Plasmid ist in Fig. 3 wiedergegeben.
Die beiden Plasmide wurden mit zwei oft schneidenden Enzymen, wie Sau3A und HpaII, digeriert und mit dem mit denselben Enzymen behandelten Plasmid pUC 12 sowie mit Molekulargewichtsmarkern (Boehringer) verglichen.
Die Analyse der erhaltenen digerierten Plasmid-Hybride auf Polyacrylamid zeigte ein in jedem Fall ähnliches Elektrophoreseprofil, mit Ausnahme von dem mit pUC 12 erhaltenen (vgl. Fig. 4).
e) Analyse mittels "Western-Blotting"
Zellen von denen Klonen 9 und 7 wurden von Platten des M 9-Amylopektin(pH 6,0)- Mediums entnommen und in 10 ul STS-Puffer (125 mM Tris-HCl, 3% 2- Mercaptocthanol, 3% Natriumdodecylsulfat und 20% Glycerin, pH 6,8) gelöst.
Die Lösung wird auf ein diskontinuierliches Polyacrylamid-Gel (B.D. Hames et al., Gel Electrophoresis of Proteins, 290 (1981), IRL Press Washington D. C.) gebracht und während 2 Stunden 125 V unterworfen.
Die Proteine wurden danach vom Gel auf Schleicher "low melting"-Nitrocellulose- Filter gemäß der von R.G. Parker et al., Methods Enzymology, 65, 358 (1980), beschriebenen Methode übertragen. Gleichzeitig wurden 2 ug M 13mp8 in 30 ul einer Mischung mit 10 U SmaI-Restriktionsenzym während 1,5 Stunden bei 25 ºC digeriert.
10 ng von jedem Fragment wurden dann mit 200 ng M 13mp8-Bakeriophagen-DNA in 50 ul Ligasemischung in Gegenwart von 1 U T4DNA-Ligase während 18 Stunden bei 23ºC ligiert.
Alle Ligasemischungen wurden danach zum Transformieren von kompetenten E. coli 71/18-Zellen verwendet; die rekombinanten Klone wurden auf L. Agar-Platten selektiert.
Die Klone mit den Bakteriophagen-Hybrid-Vektoren wurden dann zur Bestimung der Lage der Fragmente durch geeignete Schnitte mittels Restriktionsenzymen untersucht.
Wenn z. B. der Hybrid-Vektor mit dem 1900 bp-Fragment mit EcoRI-Restriktionsenzym, das im Fragment asymmetrisch und im Vektor in unmittelbarer Nachbarschaft zum Fragment schneidet, digeriert wird, ist das Ergebnis in Abhängigkeit von der Lage ein 300 bp- oder ein 1600 bp-Fragment. Ähnlich wurden beim Digerieren des Fragments mit 1300 bp mit Ssti- und Hindili-Enzymen Schull-45 um Fragmente und Filter erhalten, die mit Anti-Isoamylase-Antikörpern und Kaninchen-anti-IgG-Antikörper konjugiert mit Peroxidase (Miles) gemäß H. Towbin et al. (vgl. PNAS, USA, 76, 4350-4354 (1979)) behandelt wurden.
Die in Fig. 5 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen ein positives Signal, d. h. eine spezifische Reaktion des Proteins mit den Anti-Isoamylase-Antikörpern.

Beispiel 3

Klonieren des chromosomalen DNA-Fragments mit etwa 3200 bp in M 13mp8 und Sequenzierung 5,2 ug des Plasmids pSM 257 werden in 20 ul eines 10 U SmaI-Enzym (BRL) enthaltenden Puffers während 1 Stunde bei 25 ºC digeriert; nach der Reaktion wird das Volumen auf 15 ul mit 10 U BamHI (BRL) während 1 Stunde bei 37 ºC gebracht. 2,6 ug Plasmid pSM 257 werden mit 10 U BamHI und XbaI (BRL) in dieser Reihenfolge in 50 ul Puffer während 2 Stunden bei 37 ºC digeriert.
Die Enzymrekktionen werden durch Erwärmen auf 65 ºC während 10 Minuten inaktiviert und die erhaltenen DNA-Fragmente mit 2 U DNA-Polymerase I-Enzym (großes Fragment oder Klenow-Fragment) zwecks Einebnung von deren Enden behandelt.
Die Smal-BamHI-Fragmente (etwa 1900 bp) und BamHI-XbaI-Fragmente (etwa 1300 bp) werden danach durch Elektrophorese an Agarosegel getrennt.
Die erhaltenen Fragmente mit etwa 1900 bp (SmaJ-BamHI) beziehungsweise etwa 1300 bp (BamHl-XbaI) werden in M 13mp8-Bakteriophagen nach dessen Ausrichtung mittels SmaI-Enzym in Gegenwart von T4 DNA-Ligase eingefügt; die Ligasemischung wird danach zum Transformieren kompetenter E. coli-Zellen verwendet.
Nach der Identifizierung der rekombinanten Klone, d. h. de&ijlig;enigen mit den Hybrid- Vektoren, wird die lage der beiden Fragmente durch geeignete Schnitte mittels Restriktionsenzymen bestimmt.
Im einzelnen wurde dabei der Hybrid-Vektor mit dem 1900 bp-Fragment mit dem EcoR1-Restriktionsenzym, das innerhalb vom Fragment in asymmetrischer Weise und in dem Vektor in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem Fragment schneidet, digeriert; das Ergebnis waren - wie erwartet - ein Segment mit 300 bp oder 1600 bp in Abhängigkeit von der lage. In entsprechender Weise ergeben die Plasmide mit dem 1300 bp- Fragment beim Digerieren mit SstI- und HindIII-Enzymen je nach der Orientierung 500 bp- und 800 bp-Segmente.
Die Plasmide mit den beiden, in den zwei möglichen Arten orientierten Fragmenten wurden als Alpha, Beta, Gamma und Delta bezeichnet (vgl. Fig. 6).
Die Bestätigung der gegensätzlichen Orientierung wurde danach gemäß der Methode von Messing (Methods in Enzymology, 101, 20 (1983)) erhalten.
Die Einzelhelices wurden dann gemäß der Methode von F. Sanger et al., P.N.A.S., 74, 5463 (1977), sequenziert, und zwar unter Anwendung der Taktik mit sukzessiven Primern (vgl. Strauss et al., Anal. Biochem. 154, 353 (1986)). Die als Primer verwendeten Oligonukleotide wurden mittels des "Automatic System I Plus Synthesizers"(Beckmann) synthetisiert.
Die Sequenzierungsreaktionen erfolgten in der üblichen Weise unter Verwendung des "DNA sequenzing system (NEN)"-Ausrüstungssatzes mit α(³²P)dATP als Isotopen- Indikator.
Bei der für die elektrophoretische Trennung verwendeten Apparatur handelte es sich um das "Macrophor sequencing system LKB".
Es bestehen einige Probleme mit der Nukleotid-Sequenz des Isoamylasegens, die zu anomalen Migrationen der Fragmente auf dem Gel führen könnten. Diese werden vermieden durch Anwendung der Technik von S. Mizusaw et al., Nucleic Acids Reser., 14 (3), 1319 (1986), unter Einsatz eines Analogons zum Guanosin, nämlich "C7 deaza dGTP", das keinen Stickstoff in 7-Stellung enthält und daher die Eigenschaft der Nuklectide zur Bildung von sekundären Strukturen mit benachbarten Nukleotiden beträchtlich vermindert. Eine andere Methode zur Abklärung einiger komplexer Sequenzflächen ist die Verwendung des inversen Transkriptase-Enzyms anstelle von DNA-Polymerase I (großes Fragment).
Das erhaltene sequenzierte Fragment der chromosomalen DNA von Pseudomonas SMPI enthielt 3335 Basenpaare, wohingegen der durch das Enzym kodierte Bereich 2328 bp, entsprechend 776 Aminosäuren enthielt (Fig. 7 und 8).
Fig. 9 zeigt die Nukleotidsequenz vom Strukturgen der Isoamylase mit den möglichen genregulierenden Sequenzen.
Die Aminosäurezusammensetzung des Proteins, abgeleitet aus der Nukleotidzusammensetzung mit der in Fig. 9 gezeigten Sequenz, wird in der nachstehenden Tabelle I angeführt und zeigt ausgeprägte hydrophobe Charakteristiken auf Grund der Anwesenheit von 30% gesättigter aromatischer und aliphatischer Gruppen. Tabelle I Anzahl der Reste gesamtprozentualer Anteil Säuren basische Substanzen Aromaten hydrophobe Substanzen (Aromaten + Ile + Leu + Met + Val) Molekulargewicht

Beispiel 4

Aufbau des pSM 289 rekombinanten DNA-Moleküls zur Expression und Sekretion in E. coli

A) Bildung des Plasmids pSM 221

5 ug vom Plasmid pUC 12 wurden mit EcoRI- und HindIII-Restriktionsenzymen (BRL) gemäß der von der Lieferfirma empfohlenen Arbeitsweise digeriert, um so den Polylinker aus dem vorgenannten Plasmid zu isolieren und abzutrennen.
Die von dem EcoRI-HindIII-Fragment freie Plasmid-DNA wurde danach mit einem synthetischen Nukleotide ligiert, das 18 Basenpaare enthält und die nachfolgende Sequenz hat:
wobei sich an den Enden die EcoRI- und HindIII-Stellen sowie in der Mitte die SphI- und AvaI-Stellen befinden.

B) Bildung des Plasmids pSM 262

5 ug des Plasmids pSM 257 werden mit 20 U der Restriktionsenzyme SphI und SmaI (BRL) nach der von der Lieferfirma vorgeschlagenen Arbeitsweise digeriert.
Die Digestionsmischung wird im Anschluß an eine 10-minütige Behandlung bei 65 ºC zum Blockieren der Enzymreaktion auf ein 5% Acrylamidgel gebracht zur Elution des etwa 2400 bp-SphI-SmaI-Fragments mit dem Isoamylasegen.
1 ug dieses Fragments werden in das Plasmid 221 (1 ug) eingefügt, nachdem zuvor eine Digestion mit Aval-Enzym und eine Behandlung mit dem Kienow-Fragment der DNA- Polymerase zur Erzielung einer Verträglichkeit mit dem SmaI-Ende der Einfügung und schlußendlich mit dem Restriktions-Enzym SphI erfolgten.
Die Ligase-Reaktion zwischen dem SphI-SmaI-Fragment und dem digerierten Plasmid pSM 221 wird in einem Ligase-Puffer (50 ul) in Anwesenheit von 1 U T4 DNA-Ligase während 18 Stunden bei 14 ºC vorgenommen. Am Ende der Reaktion werden 10 ul von der Ligase-Mischung zum Transformieren von 200 ul E. coli 71/18-Zellen, die durch Behandlung mit 50 mM CaCl&sub2; kompetent gemacht worden waren, verwendet.
Die Zellen werden auf ein 2 · YT-Medium (16 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l Bacto- Hefeextrakt, 1 g/l NaCl), das durch Zugabe von 50 mg/l Apicillin, 0,05 mM IPTG (Isopropyl-D-thiogalaktopyranosid) und 0,02% X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D- galaktopyranosid) selektiv gemacht wurde, aufgesprüht und in einem Thermostat bei 37 ºC während 12 Stunden inkubiert. Die gemäß der Methode von H.C. Birnholm und J. Doly (vgl. Nucleids Acids Res., 7, 1513 (1979)) extrahierten rekombinanten Plasmide wurden einer Restriktionsanalyse unterworfen.
Es wurde gefunden, daß ein hoher Prozentanteil der Klone das erwünschte Fragment in der erwarteten Weise enthält.
Eines von diesen Plasmiden, bezeichnet als pSM 262, ist gekennzeichnet durch die in Fig. 10 wiedergegebene Karte.

C) Bildung des Plasmids pSM 289

10 ug des Plasmids pSM 257 werden mit 40 U NarI-Restriktions-Enzym (BRL) während 1 Stunde bei 37 ºC digeriert und dann mit I "Klenow"-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 100 ul eines spezifischen Puffers während 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 25 ºCBS) zwecks Abflachung der Enden zur Reaktion gebracht.
Die Mischung wird danach mit 40 U BamHI-Restriktions-Enzym während 1 Stunde bei 37 ºC digeriert und auf ein 5% Acrylamidgel geladen zur Elution des 511 bp-NarI- BamI-Fragments (a) mit der Leader-Sequenz und den ersten 390 Nukleotiden des Strukturgens der Isoamylase.
Der verbleibende Teil, 2010 bp des Gens (b) werden erhalten durch Digestion des Plasmids pSM 262 (5 ug) mit 20 U BamI- und 20 U HindIII-Restriktions-Enzym (BRL).
Zur gleichen Zeit werden 5 ug des Vektors pUC 12 (c) digeriert, zuerst mit 20 U SmaI- Restriktions-Enzym während 1 Stunde bei 25 ºC in einem von der Lieferfirma empfohlenen Puffer; nach der Modifizierung der Salz-Konzentration durch Zugabe von NaCl bis zu einer Endkonzentration von 50 mM wird der Vektor mti 20 U HindIII- Restriktions-Enzym während 1 Stunde bei 37 ºC digeriert.
100 ng des Vektors (c), 100 ng des Inserts (b) und 35 ng vom Insert (a) werden über Nacht bei 14 ºC miteinander zur Reaktion gebracht bei einer Endkonzentration von 50 ul Ligasepuffer in Gegenwart von 1 U T4 DNA-Ligase.
Nach Beendigung der Reaktion werden 10 ng der Ligierungs-Mischung zum Transformieren von 100 ul E. coli DHI-Zellen (F rec Al, emd Al, gyr A 96, thi-1, sup E44, hsd R 17 ( ), die mittels Rubidiumchlorid gemäß Hanahan, J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983), kompetent gemacht worden waren, eingesetzt.
Die Transformanten wurden danach auf Platten von einem 2X YT-Medium während 18 Stunden bei 37 ºC selektiert. Das rekombinante Plasmid wurde aus einem transformierten Klon extrahiert und zeigte das erwartete Muster bei der durch Restriktion erfolgten Analyse.
Die Karte von diesem rekombinanten Plasmid, als pSM 289 bezeichnet, wird in Fig. 11 wiedergegeben.

Beispiel 5

Bildung des pSM 290-Moleküls der rekombinanten DNA zur Expression und Sekretion in B. subtilis

A) Bildung des Plasmids pSM 268

3 Portionen zu je 1 ug pSM 214 ATCC 67 320 werden mit 5 U BgIII und 5 U BamHI während 1 Stunde bei 37 ºC digeriert.
Die Enden des resultierenden DNA-Fragments werden durch Inkubation mit 0,3 U BaI 31-Nuklease während 2, 3 und 4 Minuten bei 20ºC erodiert und anschließend mit dem DNA-Polymerase I-"large" Fragment unter Standard-Bedingungen repariert.
Die erhaltenen Moleküle mit verschiedener lange werden durch Behandlung mit T4 DNA-Ligase bei 14 ºC über Nacht rezyklisiert.
Die Ligase-Mischungen werden alsdann zum Transformieren von Zellen des B. subtilis SMS 108-Stammes (rec&supmin;, his&supmin;, leu&supmin;) verwendet, die gemäß der von D. Dubnau und R. Davidoff-Abelson beschriebenen Arbeitsweise (J. Mol. Biol. 56, 209 (1971)) kompetent gemacht worden waren.
Die Transformanten werden anschließend auf VY-Platten (25 g/l Kalbsinfusionsbrühe (veal infusion broth) 5 g/l Hefeextrakt) mit einem Chloramphenicol-Gehalt von 5 ug/ml selektiert.
Die aus den resultierenden Klonen extrahierten Plasmide werden durch Restriktion mittels verschiedener Enzyme untersucht.
Das als pSM 268 bezeichnete rekombinante Plasmid war mit etwa 5000 bp das Kleinste von diesen, die das Replikations-Origin von B. subtilis und auch das die Beständigkeit gegen Chloramphenicol-Antibiotika regelnde Gen (das CAT-Gen) enthielten.
10 ug des vorgenannten Plasmids werden während 1 Stunde bei 37 ºC digeriert, und zwar mit je 4 U der nachfolgenden Restriktionsenzyme: EcoRI und HindIII.
Nach dem Abbrechen der Enzymreaktion durch Erhitzen auf 65 ºC während 10 Minuten wird die Digestionsmischung auf ein "niedrig-schmelzendes" Agarosegel gebracht; das 4200 bp EcoRI-HindIII-Fragment mit dem Replikations-Origin von B. subtilis und dem CAT-Gen wird sodann eluiert und gemäß dem "Gene clean"-Verfahren (vgl. B. Vogelstein und D. Gillespie, P.N.A.S., 76, 615 (1979)) gereinigt.
5 ug Plasmid pSM 289 werden simultan in 20 ul einer Puffermischung mit 10 U HindIII während 1 Stunde bei 37 ºC und nach dem Abchecken des erhaltenen Schnittes durch Elektrophorese mit Agarosegel mit 5 U EcoRI während 15 Minuten bei 37 ºC digeriert.
Das erhaltene DNA-EcoRI-HindIII-Fragment mit etwa 2400 bp wird alsdann durch Elektrophorese der Digestionsmischung an Agarosegel und anschließende Elektro- Elution abgetrennt.

B) Bildung von pSM 290

500 ng des 4200 bp-Fragments und 1 ug des 2400 bp-Fragments werden danach in 15 ul eines Ligations-Puffers in Gegenwart von 1 U T4 DNA-Ligase über Nacht bei 15ºC ligiert. 300 ng der vorgenannten Mischung werden zum Transformieren von 100 ul von kompetent gemachten B. subtilis SMS 108-Zellen verwendet; die Transformanten werden auf einem mit Chloramphenicol versetzten VY-Medium selektiert.
Die Plasmid-DNA wird aus den erhaltenen Klonen extrahiert und anschließend der Restriktions-Analyse unterworfen.
Zwei von den analysierten Plasmiden besaßen das EcoRI-HindIII-Fragment mit dem Isoamylasegen in der erwarteten Struktur.
Eines dieser Plasmide, als pSM 290 bezeichnet, ist durch die Restriktionskarte in Fig. 12 charakterisiert.
Die Nuklectid-Sequenz zum Abchecken der genauen Zusammenstellung des Plasmids pSM 290 wurde unter Verwendung des "puc Sequencing"-Kastens von Beehringer ermittelt.

Beispiel 6

Expression und Sekretion der Isoamylase

A) Prüfung der Isoamylase-Aktivität auf einer Platte

Die von Harada beschriebene Methode zum Nachweis der Isoamylase-Aktivität (vgl. T. Sugimoto et al., Appl. Microbiol., 28, 336 (1974)) wurde zum Herausfinden von zur Produktion von Isoamylase befähigten Klonen aus den verschiedenen rekombinanten Kolonien modifiziert.
Zellen von E. coli DHI mit einem Gehalt an Plasmid pSM 289 wurden in einem Minimum-Medium M 9 + 0,2% Glukose und/oder Maltose (6 g/l Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH&sub4;Cl, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM CaCl&sub2;, 1,5% Agar) plus 1% Amylopektin als Substrat und Induktor sowie 50 ug/ml Ampicillin gezüchtet. Der pH-Wert des Medium wurde mit HCl auf 6,8 eingestellt.
Die durch das Plasmid pSM 290 transformierten Zellen von B. subtilis SMS 108 werden auf einem M 9-Medium + 0,2% Glukose und/oder Maltose, vermischt mit 1% Amylopektin, 5 ug/ml Chloramphenicol und 50 ug/ml Nisidin und Leucin gezüchtet.
Ein anderes für B. subtilis verwendetes Medium bestand aus MB mit einem Gehalt von 0,2% Glukose und/oder Maltose (2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 18,3 g/l K&sub2;HPO&sub4;· 3 H&sub2;O, 6 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l Nacitrat. 2 H&sub2;O, 0,2 g/l MgSO&sub4;.7 H&sub2;O) plus 1% Amylopektin, 1,5% Agar, 5 ug/ml Chloramphenicol und 50 ug/ml der vorgenannten Aminosäuren.
Der pH-Wert beider Medien wurde auf 6,0 eingestellt.
Die Kolonien wurden während 24 Stunden bei 37 ºC wachsen gelassen und danach Joddämpfen (2 g Jodplättchen, 1 g KJ, 25 ml Ethanol (95%-ig), 25 ml Wasser) ausgesetzt.
Nach 2-minütiger Aussetzung zeigten die Isoamylase bildenden E. coli DH2 (pSM 289)-Klone einen deutlichen blauen Ring, wohingegen die B. subtilis SMS 108 (pSM 290)-Klone einen helleren Ring auf Grund der Interferenz mit der vom letzteren Stamm gebildeten alpha-Amylase ergaben.

B) Prüfung der Isoamylase-Aktivität in flüssigem Medium

Zellen von E. coli DH2 (pSM 289) und B. subtilis SMS 108 (pSM 290) wurden in 50 ml M 9-Medium und M 9 und MB inokuliert und unter leichter Bewegung während 16 Stunden bei 37 ºC gezüchtet.
Als nächstes erfolgte eine Extraktion der Periplasma-Fraktion aus E. coli-Zellen und der Gesamtproteine aus E. coli und B. subtilis.
Bei der praktischen Durchführung wurden die periplasmatischen Proteine gemäß der Methode von Koshland und Botstein (vgl. Cell, 20 (3), 749, 780 (1980)) extrahiert, und zwar wie folgt: 2 ml der bakteriellen Kultur wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 12000 upm 30 Sekunden lang zentrifugiert.
Die Pellets wurden aufgenommen, zweimal mit einem 30 mM Acetat-Puffer (pH 4) und 50 mM NaCl gewaschen, wie zuvor angegeben zentrifugiert und abschließend aufgenommen in 1 ml 20%-iger Saccharose, 30 mM Acetat-Puffer (pH 4) und 1 mM EDTA.
Die resultierende Suspension wurde während 5 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 25 ºC) belassen, in Intervallen bewegt, während 5 Minuten bei 4 ºC zentrifugiert und wieder aufgenommen in 1 ml destilliertem, bei 4 ºC gehaltenem Wasser.
Die erhaltene Suspension wurde in einem Eisbad während 10 Minuten inkubiert und danach bei 300 upm während 10 Minuten zentrifugiert; die gewünschte periplasmatische Fraktion wurde im Überstehenden erhalten.
Alle verwendeten Lösungen enthielten Protease-Inhibitoren, nämlich PMSF (Phenylmethylsulfonylchlorid) und EDTA in Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 5 mM.
400 ul von dieser Fraktion, gewünschtenfalls durch das AMYCON-System konzentriert, wurden zur Prüfung der Isoamylase-Aktivität verwendet.
Die Gesamtproteine wurden durch Zentrifugieren von 10 ml von einer jeden der bakteriellen Kulturen bei 5000 upm und 4 ºC während 5 Minuten extrahiert.
Die erhaltenen Zellpellets wurden zweimal gewaschen mit 1 Volumen eines 10 mM Acetat-Puffers (pH 4,0), 50 mM NaCl, 1 mM PSMF und 5 mM EDTA und nochmals - wie zuvor angeführt - zentrifugiert. Die Pellets wurden in 5 ml eines 10 mM Acetat- Puffers (pH 4,0) in Gegenwart von 1 mM PMSF erneut suspendiert.
Die Zell-Suspensionen wurden danach einer "French-press" (AMINCO)-Behandlung bei 2500 psi (= 176 bar) zum Aufbrechen der Bakterienwände und Ausstoßen der Zellkomponenten unterworfen.
Im Falle der B. subtilis-Zellen wurde die Lysierungs-Behandlung durch "French- Pressen" unter Inkubation mit 5 mg/ml Lysozym während 10 Minuten bei 37 ºC zwecks Verminderung der Festigkeit der Zellwände durchgeführt.
Die Isoamylase-Aktivität wurde alsdann in dem Überstehenden, in dem Zellextrakt und in dem periplasmatischen Extrakt entsprechend der von A. Yokobayashi et al. beschriebenen Methode (vgl. B.B.A., 212, 458-459 (1970)) bestimmt.
Bei der praktischen Durchführung wurden 2 ml einer 1-prozentualen Lösung von Amylopektin (Sigma) in Wasser (w/v), bei 40 ºC gehalten, mit 400 ul eines mM Acetat-Puffers (pH 4) und 400 ul der Versuchslösung vermischt.
Die erhaltene Mischung wurde 1 Stunde bei 4 ºC belassen; für die Analyse wurde eine Probe (400 ul) bei der Anfangszeit (t&sub0;) und am Ende der Reaktion (t&sub1;) entnommen.
Vor der kolorimetrischen Reaktion und Spelttrophotometer-Ablesung wurden die Proben in einer Eppendorf-Zentrifuge bei Raumtemperatur während 30 Minuten bei 10000 upm zwecks Entfernung von suspendiertem, die Absorptionsmessung störendem Material zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren wurden die Proben mit 400 ul Jod-Regenz (mit 0,2% J (w/v), 2% KJ (w/v) und 0,2 H SO (w/v)) vermischt, auf 20 ml mit Wasser aufgefüllt und 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen.
Die Ablesung erfolgte mit einem Perkin-Elmer Mod. 551 S-Spektrophotometer bei 610 nm gegen eine wie zuvor beschrieben hergestellte Blinprobe; die Versuchsprobe wurde durch den Acetat-Puffer ersetzt.
Eine positive Kontrolle wurde unter Verwendung von gereinigter Isoamylase ebenfalls durchgeführt.
Der Ausdruck "Isoamylase-Einheit" bedeutet die Isoamylase-Menge, die eine Erhöhung des Spektrophotometer-Wertes bei 610 nm um 0,01 OD in einer Stunde bei 40 ºC bewirkt.
Die Ergebnisse für E. coli und B. subtilis sind in den nachfolgenden Tabellen I und II angeführt.

Tabelle I

Einheiten/ml
Blindprobe 0
Isoamylase (50 ng) 78 (positive Kontrolle)
E. coli (pSM 289) Medium 4,2
E. coli (pSM 289) Zellextrakt 13,5
E. coli (pSM 289) Periplasma 8,2

Tabelle II

Einheiten/ ml
Blindprobe 0
Isoamylase (20 ng) 8,9
B. subtills (pSM 268) Medium 0
B. subtills (pSM 268) Zellextrakt 0
B. subtills (pSM 290) Medium 89,4
B. subtills (pSM 290) Zellextrakt 7,8
Pseudomonas SMPI Medium 102,3
Wie durch die Werte in Tabelle II belegt wird, vermag durch das Plasmid pSM 290 transformierter B. subtilis nicht nur Isoamylase in Mengen zu synthetisieren, die mit denen vom Originalstamm Pscudomonas SMPI vergleichbar sind, sondern kann insbesondere auch das Enzym in das Kulturmedium absondern. Darüberhinaus benötigt B. subtilis (pSM 290) nur 16 Stunden bis zur Erreichung des optimalen Produktionsniveaus vom vorgenannten Enzym gegenüber 5 Tagen bei Pseudomonas SMPI.

Claims

1. Isoamylase-Strukturgen, gekennzeichnet durch die Nukleotid-Sequenz gemäß der nachfolgenden Formel I:

2. Isoamylase-Strukturgen gemäß Anspruch 1, wobei das Gen an seinem 5'-Ende eine ATG-Gruppierung aufweist.

3. Iscamylase-Strukturgen gemäß Anspruch 1, wobei das Gen an seinem 5'-Ende eine Sequenz gemäß der Formel (II)

aufweist und diese Sequenz das Sekretionssignal-Peptid von Isoamylase kodiert.

4. Isoamylase-Strukturgen gemäß Anspruch 1, erhalten aus der chromosomalen DNA von einem Bakterium der Gattung Pseudomonas.

5. Isoamylase-Strukturgen gemaß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Bakterium um Pseudomonas SMPI ATTC 53 651 handelt.

6. Isoamylase-Strukturgen gemäß Anspruch 1, wobei das Gen das Polypeptid entsprechend der Formel III kodiert:

7. Isoamylase-Strukturgen gemäß Anspruch 1, wobei das Gen das Polypeptid der Formel (III) kodiert und das aminoendständige Alanin (Ala) an Methionin (Met) gebunden ist.

8. Isoamylase-Strukturgen gemäß Anspruch 3, wobei das Gen das Polypeptid der Formel (III) kodiert und das aminoendständige Alanin (Ala) an das Sekretionssignal-Peptid entsprechend

gebunden ist.

9. DNA-Fragment, enthaltend das Isoamylase-Strukturgen gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch die Nukleotidsequenz entsprechend der Formel IV:

wobei

GGATG auf den Promoter hinweist,

die angenommene Stelle für die Initiation der Transkription anzeigt,

RBS die Ribosom-Verknüpfungsstelle ist,

LS der Sekretionssignal-Sequenz entspricht und

T die Terminator-Sequenz der Transkription vom Isoamylasegen ist.

10. DNA-Fragment gemäß Anspruch 9, erhalten aus der chromosomalen DNA von einem Bakterium der Gattung Pseudomonas.

11. DNA-Fragment gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei dem Bakterium um Pseudomonas SMPI ATCC 53 651 handelt.

12. Molekül der kopierbaren Rekombinanten-DNA zur Expression in einem Wirts- Mikroorganismus, erhalten durch Vereinigung von einem Klonierungsvektor mit einer DNA gemäß einem jeden der Ansprüche 1, 2, 3 oder 9.

13. Molekül der Rekombinanten-DNA gemäß Anspruch 12, wobei sich das Isoamylasegen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 unter der Kontrolle von einem/einer von Pseudomonas unterschiedlichen Promoter und/oder Sekretionssignalsequenz befindet.

14. Molekül der Rekombinanten-DNA gemäß den Ansprüchen 12 und 13, wobei der Klonierungsvektor aus Plasmiden oder Bakteriophagen ausgewählt ist.

15. Molekül der Rekombinanten-DNA gemäß dem Anspruch 14, wobei der Klonierungsvektor ein kopierbares Plasmid zur Expression in Escherichla coli, Bazillen und Hefen ist.

16. Molekül der Rekombinanten-DNA gemäß den Ansprüchen 12 bis 14, hinterlegt bei dem American Type Culture Centre als Escherichia coli 75/18 (pSM 257) ATCC 64 474.

17. Mit einem DNA-Molekül gemäß den Ansprüchen 12 bis 16 transformierter Mikroorganismus, wobei der Mikroorganismus aus der Escherichia coli, Bazillen oder Hefen umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

18. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß den Ansprüchen 6 bis 8, umfassend das Transformieren von einem Wirts-Mikroorganismus mit einem Molekül der Rekombinanten-DNA gemäß einem jeden der Ansprüche 12 bis 16, Züchten vom Mikroorganismus in einem flüssigen Medium in der Gegenwart von

TEXT FEHLT