DE3942129C2 - Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Gen - Google Patents
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-GenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Gen von Glucose-
6-phosphat-dehydrogenase und ein Verfahren zur Herstellung von
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase unter Verwendung dieses Gens.
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, nachstehend abgekürzt als
G6PDH, ist ein Enzym, welches eine enzymatische Reaktion katalysiert,
durch welche Gluconsäurelacton-6-phosphat und die reduzierte
Form von NAD(P), d. h. NAD(P)H, aus Glucose-6-phosphat
und NAD oder NADP gebildet wird, welches nachstehend als NAD(P)
bezeichnet wird. Dieses Enzym ist im Tier- und Pflanzenreich
weit verbreitet, und seine hohe Aktivität wird in tierischen
Geweben beobachtet, beispielsweise in der Nebennierenrinde, in
der Milz und in der Brustdrüse während der Säugeperiode. Über
dieses Enzym, von dem angegeben wird, daß es gereinigt werden
kann, ist folgendes bekannt: G6PDH, gewonnen aus der Brustdrüse
[J. Biol. Chem. 236, 754-758 (1961)]; G6PDH, gewonnen aus der Leber
[Biochem. J. 55, 400-408 (1953); G6PDH, gewonnen aus roten
Blutkörperchen [J. Biol. Chem. 224, 1047-1064 (1957), Meth.
Enzymol. 9, 126-131 (1966) und J. Biol. Chem. 241, 4966-4976
(1966)]; G6PDH, gewonnen aus Bierhefe [J. Biol. Chem. 216, 67-79
(1955)]; G6PDH aus Candida utilis [Z. physiol. Chem., 350, 626-
634 (1969) und Biochim. Biophys. Acta, 191, 509-516 (1969)];
G6PDH aus Leuconostoc mesenteroides, Azotobactervinelandii und
Pseudomonas fluorescens [Meth. Enzymol. 1, 328-334 (1955)]
(Enzyme Handbook, Seiten 20-21, Asakura Press, 1984, dritte
überarbeitete Fassung der Erstausgabe); G6PDH, gewonnen aus
einem Bakterium, welches zur Gattung Bacillus gehört, ist ebenfalls
bekannt und beschrieben in Arch. Microbiol., 98, 275-287
(1974) sowie der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 43079/
1988. Bezüglich der Nucleotidsequenz des menschlichen G6PDG-
Gens und derjenigen des G6PDH-Gens von Ratten wird in Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 83, 4157-4161 (1986) und Nucleic Acids
Research 16, 7746 (1988) berichtet.
Das Enzym G6PDH wird derzeit ständig als ein Enzym zum Nachweis
von Kreatinkinase verwendet, um dadurch einen Myocardialinfarkt
zu diagnostizieren. Es ist daher ein außerordentlich nützliches
Enzym. Wenn G6PDH als ein diagnostisches Reagens eingesetzt
wird, so muß es aber sowohl eine Langzeitstabilität als auch
thermische Stabilität aufweisen. Es haben sich jedoch Probleme
bei der üblichen Herstellung von G6PDH-Enzym unter Verwendung
von dieses Enzym erzeugenden Bakterien ergeben. Die Produktivität
solcher Bakterien bezüglich der Erzeugung von G6PDH ist
nämlich so niedrig, daß es schwierig ist, dieses Enzym kostengünstig
in größerer Menge herzustellen, und außerdem ist es
schwierig, kontaminierende Enzyme, wie beispielsweise NAD(P)H-
oxidase und Lactat-dehydrogenase, daraus zu entfernen.
Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um
die vorstehend genannten Probleme zu lösen, und es ist ihnen gelungen,
aus einem Bakterium, welches nachstehend als zu der Gattung
Bacillus gehörend definiert wird, ein Gen zu isolieren und
zu reinigen, welches die Aminosäuresequenz desjenigen Polypeptids
kodiert, das das Enzym G6PDH aufbaut, und außerdem ist es
ihnen gelungen, speziell die Primärstruktur der DNA und derjenigen
der Aminosäuresequenz aufzuklären, aus welcher das besagte
Enzym aufgebaut ist. Die Erfinder bestätigen, daß die Nucleotidsequenz
der DNA und die Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden
Erfindung beides neue Substanzen sind, weil sie sich hinsichtlich
ihrer Konstitution und Homologie von den Nucleotidsequenzen
der Gene von Human-G6PDH und von Ratten-G6PDH und deren
Aminosäuresequenzen unterscheiden.
In den Figuren der Zeichnungen ist folgendes dargestellt:
Fig. 1 (Fig. 1A bis 1D) zeigt die Aminosäuresequenz des Polypeptids,
welches das G6PDH-Enzym aufbaut.
Fig. 2 (Fig. 2A bis 2C) zeigt die DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz
des Polypeptids codiert, das das G6PDH-
Enzym aufbaut.
Fig. 3 zeigt die Schnittstellenkartierung des Plasmids pG6DH1 für
Restriktionsenzyme.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher unter anderem die
folgenden Gegenstände:
Die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert;
ein Plasmid, welches gekennzeichnet ist durch die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert;
einen Transformand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäurefrequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist;
ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, umfassend die folgenden Maßnahmen: Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist, um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium;
ein Polypeptid, bestehend aus der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator.
Die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert;
ein Plasmid, welches gekennzeichnet ist durch die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert;
einen Transformand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäurefrequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist;
ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, umfassend die folgenden Maßnahmen: Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist, um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium;
ein Polypeptid, bestehend aus der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator.
Die Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, welche
in Fig. 1 wiedergegeben ist, kann sowohl am N-Terminator als
auch am C-Terminator Aminosäurereste oder Polypeptidreste aufweisen,
sie kann auch am N-Terminator von Thr aus rückwärts
gerichtet eine oder mehrere Aminosäurereste aufweisen und diese(r)
Aminosäurerest(e) können Met oder ein Signalpeptid sein.
Auch am C-Terminator von Ile aus rückwärts gerichtet können
ein oder mehrere Aminosäurereste vorhanden sein.
Die neue DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz
codiert, kann eine DNA sein, welche eine Serie von irgendwelchen
Codons umfaßt, welche jeweils einer Aminosäure entsprechen,
welche die betreffende Aminosäuresequenz aufbauen,
einschließlich Aminosäureresten oder Polypeptidresten am N-Terminator
und am C-Terminator.
Eine solche DNA wird wiedergegeben durch die in Fig. 2 angegebene
Nucleotidsequenz, ausgehend von dem 5′-Terminator. Diese
DNA kann eine solche DNA sein, welche einen oder mehrere Codons
aufweist, welche Aminosäuren codieren, die vom 5′-Terminator
aus rückwärts gerichtet sind, vorausgesetzt, daß es sich dabei
nicht um Codone der Struktur TAA, TAG und TGA handelt. Vorzugsweise
kann die DNA ein Codon ATG oder ein Startcodon außer ATG
aufweisen oder Codons, welche einem Signalpeptid entsprechen.
Die DNA kann am 3′-Terminator von ATA vorwärts gerichtet eine
oder mehrere Codons aufweisen, welche Aminosäuren codieren,
oder sie kann ein Translations-Stopcodon haben. Falls die
DNA ein oder mehrere Codons aufweist, welche Aminosäuren am
3′-Terminator codieren, kann die DNA außerdem vorzugsweise
am 3′-Terminator ein Translations-Stopcodon für dasjenige
Codon aufweisen, welches die Aminosäure codiert.
Die DNA, welche die in Fig. 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz
codiert bzw. die in Fig. 2 wiedergegebene DNA kann auf die
folgende Weise erhalten werden:
Die DNA, welche aus dem als Donator für das G6PDH-Gen eingesetzten
Bakterium, welches G6PDH bildet, isoliert und gereinigt
worden ist, wird mittels Ultraschallbehandlung oder mittels
Restriktionsenzymen gespalten und anschließend an ihren beiden
stumpfen Enden oder an den kohäsiven Enden mit einem Plasmid
mittels DNA-Ligase verknüpft und cyclisiert. Vorzugsweise handelt
es sich bei dem Plasmid um einen durch Spaltung linearisierten
Expressionsvector. Das dabei gebildete rekombinante Plasmid
wird durch Transfektion in ein Wirtsbakterium übertragen,
welches in der Lage ist, die DNA zu replizieren, und es wird
dasjenige Bakterium kultiviert, welches das rekombinante Plasmid
enthält, und dieses Bakterium wird durch Selektion unter
Verwendung eines Markers für den Vector und der G6PDH-Aktivität
als Indikatoren erhalten. Die DNA als das G6PDH-Gen kann
aus dem rekombinanten Plasmid gewonnen werden, welches aus
der Bakterienkultur isoliert und gereinigt wurde.
Als Donatorenbakterium für die DNA wird vorzugsweise Bacillus
sp.HT-3 eingesetzt, welcher die nachstehend erläuterten taxonomischen
Eigenschaften aufweist, und unter der Nr. FERM BP-2172
bei der Agency of Industrial Science and Technology, the
Fermentation Research Institute, hinterlegt wurde.
Der vorstehend erläuterte Bacillus sp. HT-3-Stamm hat die folgenden
taxonomischen Eigenschaften:
Gutes Wachstum in Filamentform. Die Farbentwicklung führt zu
einer Ockerfarbe oder einer grau-weißen Anfärbung. Es wird kein
löslicher Farbstoff erzeugt.
Es bilden sich kreisförmige Kolonien, und deren Umfang liegt
vollständig in konvexer Form vor. Die Farbe der Kolonien ist
ockerfarben oder grau-weiß. Es wird kein löslicher Farbstoff
gebildet.
Es wird keine Veränderung beobachtet.
Es findet ein gutes Wachstum mit gleichförmigem Trübungsgrad
statt.
Der Bazillus mit einer runden oder etwas gekrümmten Umfangsregion
existiert in Form einfacher oder doppelter Zellketten,
gelegentlich treten auch kurzkettige Formen auf, wobei kaulquappenartige
Zellen und spheroidale Zellen gleichzeitig anwesend
sind. Stäbchenzellen haben die folgenden Abmessungen:
0,5 bis 0,8 µm × 2,0 bis 3,0 µm; eine Coccobacillus-Zelle hat
eine Größe von 1,4 µm. Zusätzlich werden am Umfang oder einem
Subumfang einer Stäbchenzelle indogene Sporen gebildet, aber
diese Sporen treiben die Zelle nicht auf. Der Bazillus ist
peritrich begeißelt und beweglich.
Gram-Färbung | ||
+ | ||
KOH-Reaktion | - | |
Kapselbildung | - | |
Säurefeste-Anfärbung | - | |
OF-Test | 0 (oxidiert) | |
Wachstum unter anaerobischen Bedingungen | - | |
Wachstum unter aerobischen Bedingungen | + | |
Wachstumstemperatur @ | 52°C | + |
45°C | + | |
37°C | - | |
Wachstums-pH-Wert @ | 9,0 | - |
8,0 | + | |
5,2 | + | |
4,7 | - | |
Salzbeständigkeit @ | 0% | + |
10% | + | |
Katalase-Erzeugung | + | |
Oxidase-Erzeugung | + | |
Urease-Erzeugung (SSR) | - | |
Urease-Erzeugung (Chris) | (+) | |
Indol-Erzeugung | - | |
Schwefelwasserstoff (Bleiacetatpapier) | - | |
Acetoin-Erzeugung | - | |
MR-Test | - | |
Nitratreduktion | + | |
Denitrifizierungsreaktion | - | |
Gelatine-Zersetzung | - | |
Kohlehydrat-Zersetzung | + | |
Casein-Zersetzung | (+) | |
Äsculin-Zersetzung | + | |
Cellulose-Zersetzung | - | |
Tyrosin-Zersetzung | (+) | |
Wirksamkeitstest (Shimmons' Medium) @ | Citrate | - |
Maleate | - | |
Malate | - | |
Gluconate | - | |
Propionate | - | |
Malonate | - | |
Succinate | - | |
Wirksamkeitstest (Christensen′s Medium) @ | Citrate | - |
Maleate | - | |
Malate | - | |
Gluconate | - | |
Propionate | - | |
Malonate | - | |
Succinate | - | |
Gas-Bildung aus Glucose | - | |
Säure-Bildung aus Zucker (NH₄H₂PO₄ dient als Lieferant für N) @ | Adonit | - |
L(+)-Arabinose | + | |
Cellobiose | + | |
Durcit | - | |
Mesoerythrit | - | |
Fructose | + | |
Galactose | + | |
Glucose | + | |
Glycerin | + | |
Inosit | + | |
Inulin | - | |
Lactose | - | |
Maltose | + | |
Mannit | + | |
Mannose | + | |
Melezitose | + | |
Melibiose | + | |
Raffinose | + | |
L(+)-Rhamnose | - | |
D-Ribose | + | |
Salicin | + | |
L-Sorbose | - | |
Sorbit | - | |
Kohlehydrate | + | |
Saccharose | + | |
Treharose | + | |
Xylose | + | |
(+ positiv; (+) schwach positiv; - negativ) |
Der erfindungsgemäße Bakterienstamm ist ein grampositiver
Bazillus mit runder Umfangskontur und er existiert in einzelnen
Zellketten oder in kurzkettiger Form. Dieser Stamm ist
in die Gruppe der sporenbildenden Bakterien eingeordnet worden
und besitzt das Charakteristikum der Katalase-Erzeugung.
Der Stamm zersetzt Glucose oxidativ unter Erzeugung von Säuren.
Der erfindungsgemäße Bakterienstamm wurde gemäß seinen Haupteigenschaften,
d. h. grampositiv, katalaseerzeugend und sporenbildend,
als zur Gattung Bacillus gehörend identifiziert und
als Stamm Bacillus sp. HT-3 gekennzeichnet. Er wurde unter der
Nr. FERM BP 2172 bei der Agency of Industrial Science and
Technology, The Fermentation Research Institute, hinterlegt.
Die DNA wird aus einem Bakterium, welches als Gendonator
dient, wie folgt erhalten. Beispielsweise kann irgendein
der Bakterienspezies der vorstehend beschriebenen Art als
Donator verwendet werden und unter Bewegung in einem flüssigen
Medium unter Belüftungsbedingungen während etwa 1 bis 3 Tagen
kultiviert werden. Das Kulturmedium wird dann zwecks Abtrennung
der Bakterienmasse zentrifugiert, worauf eine Lysis durchgeführt
wird, um ein Lysat zu erhalten, welches das G6PDH-Gen
enthält. Für die Lysis der Bakterienmasse werden die Zellwände
mit solubilisierenden Enzymen behandelt, beispielsweise mit
Lysozym und β-Glucanase. Erforderlichenfalls können auch andere
Enzyme, wie Protease, und grenzflächenaktive Stoffe, wie Natriumlaurylsulfat,
allein oder in Kombination mitverwendet werden.
In Kombination mit der vorstehend erläuterten Solubilisierungsmethode
kann auch eine Ausfrier-Auftaubehandlung (vgl.
GB-PS 21 96 018) oder eine Behandlung mittels einer Presse
(French Press) angewendet werden, um die Zellwände physikalisch
aufzubrechen.
Um aus dem so erhaltenen Lysat die DNA zu isolieren und zu reinigen,
wird das Lysat einer geeigneten Kombination der folgenden
Behandlungsmethoden unterworfen, beispielsweise einer
Deproteinisierungsbehandlung mittels Phenolextraktion, einer
Protease-Behandlung, einer Ribonuclease-Behandlung, einer Ausfällung
mittels Alkohol oder einer Zentrifugierung. Es handelt
sich dabei um auch sonst routinemäßig durchgeführte Behandlungsmethoden.
Die auf diese Weise isolierte und gereinigte bakterielle DNA
läßt sich mittels verschiedener Methoden spalten, beispielsweise
einer Ultraschallbehandlung oder einer Behandlung mit
einem Restriktionsenzym. Vorzugsweise wird hierfür ein Restriktionsenzym
eingesetzt, insbesondere ein solches des Typs II,
beispielsweise EcoRI, HindIII und BamHI. Ein solches Restriktionsenzym
beeinflußt spezifische Nucleotidsequenzen, so daß
das dabei entstehende DNA-Fragment leicht mit einem Vector
verknüpft werden kann.
Als Vectoren werden solche bevorzugt, welche aus Phagen oder
Plasmiden erhalten worden sind und sich zur autonomen Vermehrung
für die genetische Rekombination eignen.
Falls Escherichia coli als Wirtsbakterium verwendet wird,
können die Phagen-Vectoren λgt · λC und λgt · λB verwendet
werden.
Wenn Escherichia coli als Wirtszelle oder Wirtsbakterium verwendet
wird, können die nachstehenden Plasmidvectoren verwendet
werden: pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18 und
pUC19. Falls hingegen Bacillus subtilis als Wirtsbakterium
verwendet wird, dann eignen sich die folgenden Plasmidvectoren:
pUB110 und pC194. Zusätzlich kann auch ein Schaukelvector
verwendet werden, welcher sich autonom in zwei oder
mehr Arten von Wirtsbakterien repliziert, beispielsweise in
Escherichia coli und Sacchromyces cerevisiae. Solche Vectoren
werden vorzugsweise mittels der gleichen Restriktionsenzyme
verdaut, wie sie auch für die Spaltung der bakteriellen DNA
als Donator für das G6PDH-Gen verwendet werden, um entsprechende
Vectorfragmente zu erhalten.
Zur Verbindung der bakteriellen DNA-Fragmente mit den Vectorfragmenten
kann eine an sich bekannte Methode verwendet werden,
beispielsweise eine Methode, bei der die Verknüpfung mittels
DNA-Ligase erfolgt. Nach der Verknüpfung der kohäsiven Enden
der bakteriellen DNA-Fragmente mit denjenigen der Vectorfragmente
dient beispielsweise eine geeignete DNA-Ligase dazu,
eine rekombinante DNA zu erzeugen, welche aus den Fragmenten
der bakteriellen DNA und den Vectorfragmenten besteht. Falls
erforderlich, werden die DNA- und die Vectorfragmente nach der
Verknüpfung durch Transfektion in ein Wirtsbakterium übertragen,
um dort die rekombinante DNA unter Verwendung einer DNA-
Ligase zu bilden, welche in den lebenden Organismen vorhanden
ist.
Es kann jedes Wirtsbakterium verwendet werden, in welchem die
rekombinante DNA stabil und autonom wachsen kann und in dem
die Eigenschaften der Fremd-DNA exprimiert werden können. Beispielsweise
können als Wirtsbakterien, welche zu Escherichia
coli gehören, die folgenden Spezies eingesetzt werden:
Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli
W3110 und Escherichia coli C600. Die Methoden zur Einführung
der rekombinanten DNA in ein Wirtsbakterium umfassen eine
Methode unter Verwendung von Calciumion, falls das Bakterium
zur Gattung Escherichia coli gehört, während im Fall eines
Bakteriums, welches zur Gattung Bacillus gehört, auch die mit
kompetenten Zellen arbeitende Methode angewendet werden kann,
während andererseits zur Einführung einer liposomalen rekombinanten
DNA in eine Protoplast-Wirtszelle die elektrische
Fusions-Transfer-Methode besonders geeignet ist. Man kann aber
auch die Methode der Mikroinjektion für diesen Zweck wählen.
Ob die betreffende rekombinante DNA in ein Wirtsbakterium eingeschleust
worden ist, kann unter Verwendung eines Markers für
den Vector, welcher die betreffende rekombinante DNA enthält,
beispielsweise ein Marker für einen pharmakologischen Wirkstoff,
festgestellt werden. Ein Bakterium, welches fähig ist,
G6PDH zu exprimieren, beispielsweise ein Bakterium, welches
in einem Medium wächst, das selektiv für den wirkstoffresistenten
Marker ist, und welches das Enzym G6PDH erzeugt, kann vorzugsweise
unter Verwendung von Farbstoffen selektiert werden.
Die bei einer solchen genetischen Manipulation im allgemeinen
angewendete quantitative Beziehung kann wie folgt beispielsweise
angegeben werden: ein Restriktionsenzym mit einer Aktivität
von etwa 1 bis 10 U, eine Ligase mit einer Aktivität von
etwa 300 U und andere Enzyme mit einer Aktivität von etwa 1
bis 10 U werden für jeweils 0,1 bis 10 µg DNA aus dem Donator-
Bakterium und je Plasmid-DNA eingesetzt.
Das auf diese Weise als Transformand erhaltene Bakterium, beispielsweise
ein Bakterium, welches zur Species Escherichia coli
oder, breiter gefaßt, zur Gattung Escherichia gehört, ist in
der Lage, eine große Menge an G6PDH-Enzym in einem Nährmedium
stabil zu erzeugen, in welchem es kultiviert wird. Nachstehend
wird ein spezifisches Beispiel für einen solchen Transformanden
gegeben: die in Fig. 2 dargestellte DNA wird in das Plasmid
pACYC184 [vgl. J. Bacteriol., 134, 1141 (1981)] insertiert,
transformiert dann das Wirtsbakterium Escherichia coli DHl [vgl.
T. Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982),
504-506] und anschließend wird das Bakterium, welches
in der Lage ist, das Enzym G6PDH zu erzeugen, selektiert, und dieses Bakterium
ist definiert worden als Escherichia coli DHl.pG6PDHl, und
es ist als FERM BP-2174 bei der Agency of Industrial Science
and Technology, the Fermentation Research Institute hinterlegt
worden.
Die einmal auf diese Art und Weise ausgewählte rekombinante
DNA kann leicht aus dem Transformanden isoliert werden, welcher
die rekombinante DNA enthält, und kann dann in andere Wirtsbakterien
eingeführt werden. Außerdem kann die rekombinante
DNA mit Restriktionsenzymen gespalten werden, um so diejenige
DNA herauszuschneiden, welche die Aminosäuresequenz desjenigen
Polypeptids codiert, das das Enzym G6PDH aufbaut. Anschließend
erfolgt eine Verknüpfung mit den Enden eines linearisierten
Vectors, welcher durch Verdauung in der gleichen Art
und Weise erhalten worden ist, wie vorstehend beschrieben, und
auf diese Weise läßt sich eine rekombinante DNA herstellen,
welche ein ganz neues Merkmal aufweist. Diese neue rekombinante
DNA kann auch in einfacher Weise in andere Wirtsbakterien eingeschleust
werden.
Die betreffende rekombinante DNA und der Vector, welcher diese
rekombinante DNA enthält, können durch Kolonie-Hybridisierung
selektiert werden; wobei man eine Probe verwendet, die aus
einer partiellen Nucleotid-Sequenz derjenigen DNA hergestellt
worden ist, welche die in Fig. 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz
codiert oder der in Fig. 2 dargestellten DNA.
Das G6PDH-Enzym, welches gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten
worden ist, kann mittels bekannter gentechnologischer
Techniken bezüglich seines Peptids variiert werden und die
so erhaltene codierende Mutanten-DNA bedeutet, daß aus dem
G6PDH-Gen der vorliegenden Erfindung mittels gentechnologischer
Maßnahmen eine künstliche Genvariante erzeugt wird. Eine solche
künstliche Genvariante kann unter Verwendung einer Vielzahl
gentechnologischer Maßnahmen erhalten werden, beispielsweise
mittels Punktmutation an lokalisierten Basenbereichen oder
durch Ersatz eines spezifischen DNA-Fragmentes des betreffenden
objektiven Gens durch ein künstlich variiertes Fragment. Von
den so erhaltenen künstlichen Genvarianten wird eine mutierte
DNA von G6PDH mit besonders ausgezeichneten Eigenschaften
schließlich in einen Vector insertiert, um so eine rekombinante
DNA zu erzeugen und anschließend ermöglicht die Einführung der
so resultierenden rekombinanten DNA die Erzeugung eines G6PDH-
Muteins. Ein spezifisches Beispiel für Vectoren, welche eine
G6PDH-codierende DNA enthalten, ist ein Plasmid, nachstehend
als pG6PDH1 bezeichnet, welches aus Escherichia coli DH1.G6PDH
erhalten worden ist. Die Schnittstellenkartierung dieses Plasmids
pG6PDH1 ist in Fig. 3 dargestellt.
Die Nucleotidsequenz der DNA, welche die Aminosäuresequenz desjenigen
Polypeptids codiert, das das Enzym G6PDH aufbaut, und
welche mittels der vorstehend erläuterten Methoden erhalten
worden ist, wurde mittels der Dideoxy-Methode bestimmt (vgl.
"Science", 214, S. 1205-1210 (1981)). Hingegen wurde die Aminosäuresequenz
desjenigen Polypeptids, das das Enzym G6PDH aufbaut,
aus der Nucleotidsequenz abgeschätzt und bestimmt. Nach
einer anderen Arbeitsweise wurde die Aminosäuresequenz am
N-Terminator des Polypeptids von G6PDH, welches durch die nachstehenden
Methoden kultiviert und gereinigt worden war, mittels
eines Proteinsequenzanalysators in flüssiger Phase
(BECKMAN System 890ME, hergestellt durch die Fa. Beckman Co.,
Ltd.) bestimmt. Anschließend wurde bestätigt, daß die Aminosäuresequenz
zumindest am N-Terminator des G6PDH-Enzyms derjenigen
Teil-Aminosäuresequenz entspricht, welche wie vorstehend angegeben
abgeschätzt wurde.
Das Verfahren zur Herstellung des G6PDH-Enzyms aus dem Transformanden
umfaßt das Kultivieren des Transformanden in einem
Nährmedium zwecks Erzeugung von G6PDH in einem Bakterium oder
in einer Nährbrühe, das Sammeln der Bakterienmasse durch Filtration
oder Zentrifugieren oder das Sammeln der Nährbrühe
nach Beendigung des Kulturverfahrens sowie das anschließende
mechanische oder enzymatische Aufbrechen des Bakteriums, beispielsweise
unter Verwendung von Lysozym, wobei gegebenenfalls
EDTA und/oder ein geeignetes grenzflächenaktives Mittel zugesetzt
werden, und schließlich das Isolieren und Sammeln des erzeugten
G6PDH in einer Pufferlösung. Die so erhaltene G6PDH-
Lösung kann aufkonzentriert oder wahlweise mittels einer Ammoniumsulfatfraktionierung,
einer Gelfiltration, einer Absorptionschromatographie,
einschließlich einer Affinitätschromatographie
und einer Ionenaustauschchromatographie behandelt
werden, um auf diese Weise G6PDH von großer Reinheit zu erhalten.
Falls als Wirtsbakterium beispielsweise ein Escherichia coli-
Bakterium ausgewählt wird, wird vorzugsweise dem vorstehend
beschriebenen Verfahren auch noch eine Erhitzungsbehandlung
angefügt. Beispielsweise ermöglicht eine Behandlung der Nährbrühe
und des aufgebrochenen solubilisierten Bakteriums während
16 Stunden bei 60°C eine außerordentlich einfache Reinigung
des G6PDH-Enzyms und darüber hinaus eine wirksame Entfernung
von möglicherweise kontaminierenden Enzymen, welche
zu Problemen bei der Anwendung des G6PDH-Enzyms für die klinische
Diagnose führen können. Auf diese Weise läßt sich ein
G6PDH-Enzym mit sehr guten Eigenschaften herstellen, welches
in nicht mehr nachweisbarer Weise durch kontaminierende Enzyme
in seiner Wirkung beeinträchtigt wird. Bei diesen kontaminierenden
Enzymen kann es sich um die folgenden Enzyme handeln:
NAD(P)H-Oxidase, Lactatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase,
Glucoseisomerase, ATPase, alkalische Phosphatase, Phosphoglucomutase,
Hexose-6-phosphatisomerase, NAD(P)-Nucleosidase,
Malatdehydrogenase und Succinatdehydrogenase. In bezug auf
die Enzyme NAD(P)H-Oxidase und Lactatdehydrogenase, welche nur
schwer zu entfernen sind und daher bei der Anwendung von G6PDH
für die klinische Diagnose zu Problemen führen, kann festgestellt
werden, daß es gemäß der Erfindung möglich ist, ein
G6PDH zu erhalten, in welchem die Aktivität von NAD(P)H-
Oxidase und Lactatdehydrogenase jeweils nur 0,0001 Einheiten
oder weniger je 100 Einheiten des Enzyms G6PDH entspricht.
Die Kultivierungsbedingungen für das als Transformand verwendete
Bakterium können entsprechend dessen physiologischen
Erfordernissen für Nährstoffe ausgewählt werden. In vielen
Fällen läßt sich die Kultivierung in einem flüssigen Medium
durchführen.
Vorzugsweise wird eine unter Bewegen durchgeführte Tiefbelüftungskultivierung
verwendet. Als Nährstoffe eignen sich
solche, welche üblicherweise für Bakterienkulturen in weitem
Umfang verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen können beliebige
Kohlehydrate verwendet werden, welche metabolisieren
können, beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose,
Fructose und Honig. Als Stickstoffquellen können beliebige
stickstoffhaltige Verbindungen eingesetzt werden, beispielsweise
Pepton, Fleischbrühe, Hefeextrakt oder Kaseinhydrolysat.
Zusätzlich können, falls erforderlich, auch Salze mitverwendet
werden, wie Phosphate, Carbonate, Sulfate, Salze von Magnesium,
Kalzium, Kalium, Eisen, Mangan und Zink oder auch spezifische
Aminosäuren und spezifische Vitamine.
Die Kultivierungstemperatur wird in geeigneter Weise innerhalb
des Bereiches gewählt, in welchem das Bakterium unter
Erzeugung von G6PDH wachsen kann. Im Fall von Escherichia coli
liegt dieser Temperaturbereich vorzugsweise zwischen etwa 20
und 42°C. Die Kultivierungszeiten variieren mehr oder weniger
in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen. Üblicherweise
erfolgt die Kultivierung während 12 bis 48 Stunden, wonach
die Kultivierung zu einem geeigneten Zeitpunkt abgebrochen
wird, der sich danach richtet, daß eine maximale Ausbeute
an G6PDH erhalten wird. Auch der pH-Wert des Kulturmediums kann
innerhalb eines angemessenen Bereiches modifiziert werden, so
daß das Bakterium unter Erzeugung von G6PDH angemessen wächst,
und vorzugsweise liegt der pH-Wertbereich zwischen 6,0 und 8,0.
Die das Bakterium enthaltende Nährbrühe wird so genommen, wie
sie ist, um das darin enthaltene G6PDH-Enzym zu gewinnen. Wenn
die Brühe selbst das Enzym G6PDH enthält, wird sie mittels
Filtration oder Zentrifugieren in eine G6PDH-haltige Lösung
und die bakterielle Zellmasse aufgetrennt. Wenn sich das
Enzym G6PDH in den Zellen selbst befindet, wird die Bakterienmasse
beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren von
der Nährbrühe abgetrennt und dann werden die Zellen entweder
mechanisch oder enzymatisch unter Verwendung von Lysozym aufgebrochen.
Erforderlichenfalls werden ein chelatierendes Mittel,
wie EDTA, und/oder oberflächenaktive Stoffe zugesetzt, um
das G6PDH-Enzym zu solubilisieren und dann in einer Pufferlösung
zu isolieren und zu sammeln.
Die so erhaltene, das G6PDH enthaltende Lösung läßt man durch
Aufkonzentrierung unter vermindertem Druck, durch Membrankonzentration,
durch Aussalzverfahren unter Verwendung von Ammoniumsulfat
einen Niederschlag bilden. Man kann auch eine fraktionelle
Niederschlagsbildung unter Verwendung von hydrophilen
organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Methanol,
Äthanol und Aceton anwenden. Der Niederschlag wird anschließend
in Wasser gelöst und gegen eine semipermeable Membran
dialysiert, um so Verunreinigungen von niedrigem Molekulargewicht
abzutrennen. Diese G6PDH-haltige Lösung wird mittels
Gelfiltration unter Anwendung von absorbierenden Mitteln oder
Gelfiltrationsmitteln, durch Adsorptionschromatographie, wie
beispielsweise Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie,
weiter gereinigt. Schließlich wird sie unter
vermindertem Druck aufkonzentriert und lyophilisiert, bis ein
G6PDH-Enzym in gereinigter Form erhalten wird.
Auf diese Weise läßt sich beispielsweise ein G6PDH mit den
folgenden Eigenschaften herstellen:
Reaktionslösung | |
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)|0,2 ml | |
10% BSA (Rinderserumalbumin) | 0,05 ml |
1% Triton X-100 | 0,1 ml |
10 mM NADP | 0,1 ml |
100 U/ml Diaphorase | 0,05 ml |
0,25% NBT | 0,1 ml |
0,1 M Glucose-6-phosphat | 0,2 ml |
destilliertes Wasser | 0,2 ml |
1,0 ml der Reaktionslösung mit der vorstehend angegebenen
Zusammensetzung wird in ein Reagenzglas eingefüllt und 3
Minuten lang auf 37°C vorerwärmt. Anschließend setzt man
20 µl einer Enzymlösung zu, welche G6PDH enthält. Man läßt diese
Mischung 10 Minuten lang bei 37°C stehen, damit die enzymatische
Reaktion ablaufen kann. Die Reaktion wird durch Zusatz
von 2,0 ml einer 0,1 N-HCl abgebrochen, und dann wird die
Extinktion bei 550 nm gemessen. Die Aktivität von G6PDH, die
pro Minute 1 µMol Glucose-6-phosphat zu Gluconsäure-lacton-
6-phosphat oxydiert, wird als eine Einheit (U) definiert.
Reaktionslösung | |
80 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)|0,5 ml | |
0,6 mM NAD(P)H | 0,5 ml |
1,0 ml der Reaktionslösung mit der vorstehend angegebenen
Zusammensetzung wird in eine Quarzzelle von 2,0 ml Fassungsvermögen
eingefüllt und 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Zu
dieser Lösung setzt man dann unter Rühren 0,2 ml der G6PDH-
Lösung zu, deren Konzentration auf 5000 U/ml eingestellt wurde.
Die Reduktion von A₃₄₀ (Δ A) wird in Zeitabständen bei 37°C
bestimmt. Die Aktivität der NAD(P)H-Oxidase, welche die Menge
an NAD(P)H mit einer Geschwindigkeit von 1 µMol/min vermindert,
wird als eine Einheit (U) definiert.
T; Reaktionszeit
6,22; millimolarer Extinktionskoeffizient von NAD(P)H bei 340 nm (cm²/µmol)
6,22; millimolarer Extinktionskoeffizient von NAD(P)H bei 340 nm (cm²/µmol)
Reaktionslösung | |
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)|0,2 ml | |
0,1 M Natriumpyruvat | 0,1 ml |
3 mM NAD(P)H | 0,1 ml |
destilliertes Wasser | 0,6 ml |
1,0 ml der Reaktionslösung mit der vorstehend angegebenen
Zusammensetzung wird in eine Quarzzelle von 2,0 ml Fassungsvermögen
eingefüllt und 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Zu
der so erhaltenen Lösung setzt man unter Rühren 0,2 ml der
G6PDH-Lösung zu, deren Konzentration auf 5000 U/ml eingestellt
wurde. Anschließend wird die Reduktion von A₃₄₀ (ΔA) in Zeitabständen
bei 37°C gemessen. Die Aktivität der Lactat-Dehydrogenase,
welche die Menge an NAD(P)H mit einer Geschwindigkeit
von 1 µMol/Minute verringert, wird als eine Einheit (U) definiert.
T; Reaktionszeit
6,22; millimolarer Extinktionskoeffizient von NAD(P)H bei 340 nm (cm²/µMol)
6,22; millimolarer Extinktionskoeffizient von NAD(P)H bei 340 nm (cm²/µMol)
- (a) Enzymatische Wirkung: katalysiert die enzymatische Reaktion der Bildung von Gluconsäurelacton-6-phosphat und NAD(P)H aus Glucose-6-phosphat und NAD(P).
- (b) Substratspezifität: wirkt mindestens auf Glucose-6-phosphat
als Substrat ein.
Substrat Relative Aktivität (%) Glucose-6-phosphat 100 Mannose-6-phosphat 38,5 Galactose-6-phosphat 19,3 Fructose-6-phosphat 0 Glucose-1-phosphat 0 Glucosamin-6-phosphat 0 6-Phosphogluconsäure 0 Coenzyme KM-Wert (mM) NADP ca. 8,3 × 10-3 NAD ca. 1,2 - (c) Optimaler pH-Wert: 8 bis 9
Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten werden zur Bestimmung des optimalen pH-Wertes gemäß der vorstehend erläuterten Enzymbestimmungsmethode verwendet. Die Ergebnisse bestätigen, daß der optimale pH-Wert im Bereich von 8 bis 9 liegt. - (d) Isoelektrischer Punkt: 6,1 ± 0,6
Es wird die Methode der isoelektrischen Punkt-Elektrophorese unter Verwendung von AMPHOLINE PAGPLATE®, hergestellt von LKB CO., LTD., ausgenutzt, um auf diese Weise den isoelektrischen Punkt zu bestimmen. Die Ergebnisse bestätigen, daß der isoelektrische Punkt pI einen Wert von 6,1 ± 0,6 hat. - (e) Thermische Stabilität: das Enzym ist während 15 Minuten
bei einer Behandlung von etwa 65°C stabil.
Wenn eine Probe von G6PDH in 40 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 15 Minuten lang bei unterschiedlichen Temperaturen behandelt wird, dann beträgt die Restaktivität bei 65°C oder darunter etwa 100% und bei 70°C etwa 70%. - (f) pH-Stabilität: das Enzym ist während 15 Minuten bei einer
Temperatur von 70°C im pH-Wertbereich von 6 bis 8 stabil.
Für diesen pH-Test werden verschiedene Pufferlösungen verwendet, nämlich 40 mM Dimethylglutarsäure für den pH-Wertbereich von 4,5 bis 6,5, 40 mM Phosphatpuffer für den pH-Wertbereich von 6,0 bis 8,0 und 40 mM Tris-HCl-Puffer für den pH-Wertbereich von 7,0 bis 9,0. - (g) Molekulargewicht: dieses liegt bei etwa 270 000.
Das Molekulargewicht wird bestimmt durch Säulenchromatographie
an einem TSK-Gel des Typs G3000 SW. Die folgenden Proteine
werden als Referenzproteine verwendet:
Ovalbumin 45 000 Rinderserumalbumin 67 000 Aldorase (aus Kaninchenmuskel) 150 000 Catalase (Kalbsleber) 210 000 - (h) Inhibitorwirkung: die Enzymaktivität wird durch die Anwesenheit von Mn2+, Cu2+, Al3+ inhibiert.
In der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen für Aminosäuren,
Peptide, Nucleinsäuren und andere Bausteine verwendet,
wobei diese Abkürzungen auch sonst üblicherweise im
Stand der Technik verwendet werden. Alle Aminosäuren entsprechen
der L-Form.
DNA: Deoxyribonucleinsäure
RNA: Ribonucleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
Ala: Alanin
Arg: Arginin
Asn: Asparagin
Asp: Asparaginsäure
Cys: Cystein
Gln: Glutamin
Glu: Glutaminsäure
Gly: Glycin
His: Histidin
Ile: Isoleucin
Leu: Leucin
Lys: Lysin
Met: Methionin
Phe: Phenylalanin
Pro: Prolin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosin
Val: Valin
RNA: Ribonucleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
Ala: Alanin
Arg: Arginin
Asn: Asparagin
Asp: Asparaginsäure
Cys: Cystein
Gln: Glutamin
Glu: Glutaminsäure
Gly: Glycin
His: Histidin
Ile: Isoleucin
Leu: Leucin
Lys: Lysin
Met: Methionin
Phe: Phenylalanin
Pro: Prolin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosin
Val: Valin
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Chromosomale DNA wird durch die nachstehende Methode aus dem
Stamm Bacillus sp.HT-3 isoliert, welcher unter der Nr. FERM
BP-2172 hinterlegt worden ist. Dieser Bakterienstamm wird
über Nacht bei 50°C in 150 ml einer normalen Nährbouillon
unter Schütteln kultiviert, dann 10 Minuten lang bei 3000 UpM
zentrifugiert und die Zellmasse abgetrennt. Zu dieser Zellmasse
setzt man 10 mg/ml Lysozymlösung in 5 ml einer Lösung
hinzu, die 10% Saccharose enthält. Außerdem setzt man 50 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 50 mM EDTA hinzu und hält diese
Mischung 15 Minuten lang auf 37°C. Anschließend setzt man
1 ml einer 10prozentigen Lösung von Natriumdodecylsulfat hinzu.
Zu der sich bildenden Suspension wird eine gleiche Volumenmenge
einer gemischen Lösung von Chloroform und Phenol
(Mischungsverhältnis 1 : 1) hinzugesetzt und dann unter Bewegung
gut vermischt. Schließlich zentrifugiert man 3 Minuten lang
bei 10 000 UpM, um so eine wäßrige Phase von einer Lösungsmittelphase
abzutrennen. Die abgetrennte wäßrige Phase wird
mit der zweifachen Volumenmenge an Äthanol überschichtet und
DNA wird daraus in Form eines Bandes isoliert, welches sich um
einen Glasstab windet, während man mit dem Glasstab allmählich
rührt. Die so isolierte DNA wird in 10 ml einer Lösung gelöst,
die 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 1 mM EDTA enthält. Diese
Lösung wird nachstehend als TE abgekürzt. Schließlich setzt man
die identische Volumenmenge einer gemischten Lösung von Chloroform/
Phenol (Mischungsverhältnis 1 : 1) hinzu und zentrifugiert
zwecks Abtrennung einer wäßrigen Phase. Zu der so abgetrennten
wäßrigen Phase setzt man die zweifache Volumenmenge an Äthanol
hinzu und wiederholt die vorstehend erläuterte Maßnahme, um
wiederum DNA abzutrennen, welche in 2 ml TE-Lösung solubilisiert
wird.
Escherichia coli pM191, welcher das Plasmid pACYC184 enthält,
(vgl. "J. Bacteriol." 134, 1441(981); ATCC 37033) wird unter
Schütteln in 1 Liter BHI-Medium (Produkt der Firma Difco Laboratories)
kultiviert. Wenn der Trübungsgrad des Mediums einen
Wert OD₆₆₀ = 1,0 erreicht hat, wird Spectinomycin bis zu einer
Endkonzentration von 300 µg/ml hinzugesetzt und es wird weitere
16 Stunden bei 37°C kultiviert. Die Bakterienzellmasse wird
durch 10minütiges Zentrifugieren bei 3000 UpM abgetrennt und
dann zwecks Herstellung der Plasmid-DNA mittels der Lysozym-
Natriumdodecylsulfatmethode und der Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid-
Methode behandelt (vgl. Maniatis: "Molecular Cloning",
Seiten 86-94, Cold Spring Harbor (1982)).
(i) 2 µl (etwa 0,5 g) der chromosomalen DNA des Stammes Bacillus
sp. HT-3, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden vermischt mit
1 µl eines Spaltpuffers mit der 10fachen Konzentration, bezogen
auf die üblicherweise für eine enzymatische Reaktion verwendete
Konzentration. [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM MgCl₂,
1,0 M kCl, 70 mM Mercaptoäthanol]; ferner setzt man 1 µl von
3 Einheiten/ml Restriktionsenzym MboI (hergestellt von der Firma
Takara, Co.) und 6 µl Wasser hinzu und führt die Spaltungsreaktion
eine Stunde lang bei 37°C durch. Etwa 0,3 g Plasmid
pACYC184-DNA wurden gemäß einer anderen Ausführungsform unter
Anwendung der gleichen Technik mittels BamHI gespalten, und
dann wurden 0,6 Einheiten alkalische Phosphatase zugesetzt,
und es wurde eine Stunde lang bei 65°C inkubiert. Diese beiden
Lösungen, welche jeweils gespaltene DNA enthielten, wurden miteinander
vermischt, und dann setzte man ¹/₁₀ Volumen einer
3 M Natriumacetatlösung hinzu. Die so erhaltene gemischte Lösung
wurde mit einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform/Phenol in
einer Volumenmenge, welche dem Gesamtvolumen der resultierenden
Lösung entsprach, behandelt, und dann zentrifugierte man zur
Abtrennung einer wäßrigen Phase. Zu dieser wäßrigen Phase
setzte man die zweifache Volumenmenge an Äthanol hinzu und zentrifugierte
die ausgefallene DNA ab. Diese DNA wurde gesammelt
und unter vermindertem Druck getrocknet und dann in 89 µl
Wasser aufgelöst, worauf man 10 µl eines Verknüpfungspuffers
zusetzte, dessen Konzentration dem 10fachen der sonst üblichen
Konzentration entsprach und der die folgenden Bestandteile
enthielt: 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 M MgCl₂, 1,0 M Dithiothreitol,
10 mM Spermidin und 10 mM ATP. Außerdem setzte man
1 µl (175 Einheiten) der T4 DNA-Ligase zu (Produkt der Firma
Takara, Co.). Die so erhaltene DNA-Lösung ließ man über Nacht
bei 4°C stehen. Diese DNA-Lösung wurde mit Chloroform und
Phenol behandelt und dann unter Zusatz von Äthanol ausgefällt.
Der Niederschlag wurde abgetrennt, unter vermindertem
Druck getrocknet und wiederum in 10 µl einer TE-Lösung
aufgelöst.
(ii) Der Stamm Escherichia coli DH1 (zur Verfügung gestellt
durch The National Institute of Genetics in Japan, dort geführt
unter der Nr. ME8569; Hinterlegungs-Nr. ATCC 33849) wurde in
100 ml des BHI-Mediums kultiviert und in der logarithmischen
Wachstumsphase durch 2minütiges Zentrifugieren bei 10 000 UpM
gesammelt. Die abgetrennte Zellmasse wurde in einer eiskalten
Lösung suspendiert, welche die folgenden Bestandteile enthielt:
30 mM Kaliumacetat (pH 5,8), 100 mM RbCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM
MnCl₂ und 15% Glycerin. Dann ließ man die Lösung 5 Minuten
bei 0° stehen und zentrifugierte sie schließlich, wobei der
flüssige Überstand verworfen wurde. Der gesammelte Niederschlag
wurde wiederum in 4 ml einer Lösung suspendiert, welche 10 mM
MOPS-Puffer (hergestellt durch die Firma Dohtite Co.) mit einem
pH-Wert von 6,5 sowie 75 mM CaCl₂, 10 mM RbCl und 15% Glycerin
enthielt. Man ließ das Ganze 15 Minuten lang bei 0°C stehen und
die dabei gebildeten Zellen wurden als kompetente Zellen verwendet.
(iii) Zu 200 µl der Zellsuspension setzte man 10 µl der gemäß
Abschnitt (i) hergestellten DNA-Lösung hinzu und ließ das Ganze
30 Minuten bei 0°C stehen. Anschließend setzte man 1 ml des
BHI-Mediums hinzu. 100 µl der so erhaltenen Lösung breitete man
auf einer BHI-Agarplatte aus, welche 25 µg/ml Chloramphenicol
enthielt, und kultivierte über Nacht bei 37°C, um so Transformanden
zu erzeugen. Diese Transformanden wurden auf einer Platte
von Versuchsagar (bestehend aus 4 ml 1 M Phosphatpuffer (pH 6,5),
1 ml 10% Triton X-100, 1 ml 100 mM NADP, 1 ml 500 U/ml Diaphorase,
2,5 ml 1% NBT, 2 ml 1 M Glucose-6-phosphat, 1,5 g Agar
und 88,5 ml destilliertem Wasser) repliziert, und anschließend
wurde die Farbänderung bei Zimmertemperatur beobachtet.
Der Transformand bildete etwa 4500 Kolonien. Es zeigte sich,
daß nur eine Kolonie unter den 4500 Transformanden eine stärkere
Blaufärbung aufwies als die anderen Kolonien, und dieser Bakterienstamm
wurde als Escherichia coli DH1 · pG6PDH1, FERM 2174
definiert. Nach der Isolation und Reinigung wurde dieses Bakterium
in dem BHI-Medium bei 37°C über Nacht kultiviert, um seine
Fähigkeit zur Erzeugung von G6PDH zu prüfen. Es zeigte sich,
daß die Aktivität von G6PDH 18 U/ml entsprach.
Das in diesen Bakterienstamm eingebaute Plasmid wurde gemäß der
Arbeitsweise von Beispiel 2 isoliert und wurde definiert als
pG6PDH1, welches das G6PDH-Gen und das pACYC184-Gen enthielt.
Unter Verwendung des Stammes Escherichia coli DH1 · pG6PDH1
wurde gemäß der gleichen Arbeitsweise wie für pACYC 184 beschrieben
die pG6PDH1-Plasmid-DNA hergestellt.
Mittels der nachstehenden Restriktionsenzyme EcoRI, ClaI, EcoRV,
HindIII, BglII, BamHI, SphI, NruI, HpaI, MluI, NcoI, ApaLI und
XbaI (die Restriktionsenzyme waren alle Produkte der Firma
Takara, Co.) wurde die Schnittstellenkartierung für die pG6PDH1-
Plasmid-DNA erstellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 wiedergegeben.
Die Nucelotidsequenz für die DNA, welche das G6PDH-Gen enthält,
wurde mittels der Di-deoxy-Methode unter Verwendung einer M13-
Phage bestimmt (vgl. "Science" 214, Seiten 1205-1210 (1981)).
Die Aminosäuresequenz und die Nucleotidsequenz des G6PDH-Strukturgens
sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt.
Der Stamm Escherichia coli DH1.pG6PDH1 wurde in 4 l des BHI-
Mediums (Difco Laboratories) kultiviert, welches 30 µg/ml Chloramphenicol
(Sankyo Pharmaceuticals Co.) enthielt, und zwar
in einem Kulturgefäß bei 37°C während 18 Stunden. Die Zellmasse
wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei 5000 UpM abgetrennt.
Die abgetrennte Bakterienzellmasse wurde mit 1 l einer 20 mM
Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen und dann in 500 ml einer
20 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Zu dieser
Suspension setzte man Lysozym, EDTA-2Na und Triton X-100 entsprechend
Endkonzentrationen von 1 mg/ml, 2 mM und 0,1% hinzu
und ließ dann 30 Minuten bei 37°C stehen. Der pH-Wert wurde
dann auf 7,0 eingestellt und man erhitzte 6 Stunden lang auf
60°C, worauf man 15 Minuten lang bei 5000 UpM zentrifugierte
und auf diese Weise 420 ml eines flüssigen Überstandes abtrennte,
dessen Aktivität in bezug auf G6PDH 162 U/ml entsprach. Zu diesem
flüssigen Überstand setzte man 840 ml Aceton hinzu und
zentrifugierte dann 15 Minuten lang bei 5000 UpM, um einen
Niederschlag abzutrennen, der in 500 ml eines 20 mM Phosphatpuffers
(pH 7,0) resuspendiert wurde. Man zentrifugierte wiederum
15 Minuten bei 5000 UpM und trennte auf diese Weise 480 ml
eines flüssigen Überstandes ab, dessen Aktivität in bezug auf
G6PDH 114 U/ml entsprach. Durch Ionenaustauschchromatographie
an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (Hersteller; Pharmacia
Fine Chemicals Co.), welche mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0)
abgepuffert war, wurden aktive Fraktionen aus dem Überstand
fraktioniert, welche vereinigt und unter Verwendung eines nahtlosen
Celluloseschlauches entsalzt wurden. Man erhielt so
300 ml eines Enzymproduktes, dessen Aktivität in bezug auf
G6PDH 148 U/ml entsprach.
Der Stamm Bacillus sp. HT-3 (FERM BP-2172) wurde in 4 l des
BHI-Mediums (Difco Laboratories) in einem Fermentierkolben
18 Stunden bei 55°C kultiviert und dann wurde die Zellmasse
durch 15minütiges Zentrifugieren bei 5000 UpM abgetrennt.
Die abgetrennte Bakterienmasse wurde mit 1 l eines 20 mM
Phosphatpuffers (pH 7,0) gewaschen und dann in 500 ml des
20-mM-Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert. Zu dieser Suspension
setzte man Lysozym, EDTA-2Na und Triton X-100 bis zu
Endkonzentrationen von 1 mg/ml, 2 mM bzw. 0,1% hinzu und ließ
das Ganze 30 Minuten lang bei 37°C stehen. Anschließend wurde
der pH-Wert auf 7,0 eingestellt und dann behandelte man 6
Stunden lang bei einer Temperatur von 60°C. Es erfolgte
wiederum eine Zentrifugierung während 15 Minuten bei 5000 UpM
und auf diese Weise wurden 420 ml eines flüssigen Überstandes
abgetrennt. Zu diesem flüssigen Überstand setzte man 840 ml
Aceton hinzu, zentrifugierte wiederum 15 Minuten bei 5000
UpM und trennte auf diese Weise einen Niederschlag ab. Dieser
Niederschlag wurde in 500 ml des 20 mM-Phosphatpuffers (pH
7,0) resuspendiert und dann erfolgte nochmals während 15 Minuten
eine Zentrifugierung bei 5000 UpM, wodurch 480 ml eines
flüssigen Überstandes abgetrennt wurden. Man führte dann eine
Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Sepharose CL-6B-
Säule durch, welche mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) abgepuffert
war und gewann so aktive Fraktionen, welche vereinigt
und unter Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt
wurden. Die Chromatographie an einer Octyl-Sepharose-
CL-4B-Säule (Pharmacia Fine Chemicals Co.), die mit 30% gesättigter
Ammoniumsulfatlösung abgepuffert war, ergab aktive
Fraktionen, welche vereinigt und unter Verwendung eines nahtlosen
Celluloseschlauches entsalzt wurden. Anschließend führte
man eine Chromatographie an Hydroxylapatit (KOKEN Co.) durch
und erhielt so wiederum aktive Fraktionen, welche vereinigt
und unter Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt
wurden. An einer blauen Sepharose-Säule (Pharmacia Fine
Chemicals Co.) wurde eine Chromatographie unter Gewinnung
aktiver Fraktionen durchgeführt, welche vereinigt und unter
Verwendung eines nahtlosen Celluloseschlauches entsalzt wurden.
Auf diese Weise erhielt man ein Enzymprodukt.
Zu jedem der beiden Enzymprodukte, welche gemäß Beispiel 5
und Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurden, setzte man eine
geringe Menge BSA von RIA-Qualität hinzu (Produkt der Firma
Sigma Co.) und lyophilisierte gemäß üblicher Methode. Die
spezifische Aktivität der folgenden Enzyme G6PDH, NAD(P)H-
Oxidase, (NAD(P)Hox) und Lactatdehydrogenase (LHD) in den
lyophilisierten Produkten wurde bestimmt, und es wurden dabei
die folgenden Ergebnisse erhalten:
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine DNA, welche die
in Fig. 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz codiert bzw. die
in Fig. 2 dargestellte DNA und der Transformand, welcher
diese DNA enthält, für ein Verfahren zur stabilen Erzeugung
von G6PDH in großem Maßstab durch Kultivieren des Transformanden
verwendet. Auf diese Weise läßt sich ein G6PDH-Enzym
mit ausgezeichneter und überraschender Langzeitstabilität und
thermischer Stabilität erhalten, welches keine kontaminierenden
Enzyme enthält, die Probleme bei der Verwendung als diagnostisches
Mittel ergeben könnten.
Claims (10)
1. Die DNA, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz,
beginnend mit dem N-Terminator, codiert, wobei Fig. 1
Bestandteil dieses Anspruchs ist.
2. Die DNA gemäß Anspruch 1, deren Nucleotidsequenz in
Fig. 2 dargestellt ist, beginnend mit dem 5′-Terminator, wobei
Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
3. Ein Plasmid, gekennzeichnet durch die DNA, welche die
in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem
N-Terminator - codiert, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
4. Ein Transformand, dadurch gekennzeichnet, daß er ein
Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte
Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator
- codiert, und welcher einer Wirtszelle fremd ist, wobei Fig. 1
Bestandteil dieses Anspruchs ist.
5. Der Transformand gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Bakterium zur Gattung Escherichia gehört
und ein Bakterium ist, welches zu Escherichia coli gehört.
6. Der Transformand gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß er definiert ist als Escherichia coli DHl.pG6PDH,
hinterlegt unter der Nr. FERM BP-2174 bei der Agency of
Industrial Science and Technology, the Fermentation Research
Institute.
7. Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase
nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Maßnahmen:
Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert und welcher einer Wirtszelle fremd ist, um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, welche die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz - beginnend mit dem N-Terminator - codiert und welcher einer Wirtszelle fremd ist, um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
8. Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase
nach Anspruch 2, umfassend die folgenden Maßnahmen:
Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, deren Nucleotidsequenz in Fig. 2 dargestellt ist - beginnend mit dem 5′-Terminator - um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
Kultivieren eines Transformanden, welcher ein Plasmid mit der DNA aufweist, deren Nucleotidsequenz in Fig. 2 dargestellt ist - beginnend mit dem 5′-Terminator - um so die genetische Information der DNA zu exprimieren, und Gewinnen der Glucose- 6-phosphat-dehydrogenase aus dem Nährmedium, wobei Fig. 2 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
9. Verfahren zur Herstellung von Glucose-6-phosphat-
dehydrogenase gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die Aktivität der kontaminierenden Enzyme NAD(P)H-Oxidase und
Lactase-dehydrogenase in der erzeugten Glucose-6-phosphat-
dehydrogenase jeweils 0,0001 Einheiten oder weniger je 100
Einheiten der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase-Aktivität beträgt
und daß die Glucose-6-phosphat-dehydrogenase die folgenden
physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:
- (a) Enzymatische Wirkung: sie katalysiert eine enzymatische Reaktion, durch welche Gluconsäure-lacton-6-phosphat und NAD(P)H aus Glucose-6-phosphat und NAD(P) gebildet wird;
- (b) Substratspezifität: sie weist mindestens Substratspezifität in bezug auf Glucose-6-phosphat auf;
- (c) der optimale pH-Wert liegt im Bereich von 8 bis 9;
- (d) der optimale isoelektrische Punkt hat einen Wert von 6,1 ±0,6;
- (e) Thermische Stabilität: sie ist 15 Minuten lang bei etwa 65°C stabil;
- (f) pH-Stabilität: sie ist 15 Minuten lang bei 70°C bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 stabil.
10. Ein Polypeptid, bestehend aus der in Fig. 1 dargestellten
Aminosäuresequenz, beginnend mit dem N-Terminator, wobei
Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
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