CH621558A5 - Process for the preparation of kanamycin derivatives with antibacterial activity - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Derivate des Kanamycin A und B, wobei diese Verbindungen als l-N-[L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl]-ó'-N-methylkanamycin A oder B, l-N-[L-(—)-v-Amino-a-hydroxybutyryl]-6'-N-methylkanamycin A oder B und 1-N-[L-(—)-ò-Amino-a-hydroxyvaleryl]-6'-N-methylkanamycin A oder B bezeichnet werden und der allgemeinen Formel IV

(IV)

621 558

entsprechen, worin R3 für —OH oder — NH2 steht und R die Bedeutungen L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl, L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl oder L-(—)-ò-Amino-a-hydroxy-valeryl besitzt; sowie von pharmazeutisch verträglichen, nichttoxischen Säureadditionssalzen davon.

Es ist bekannt, dass einige der durch den R-Faktor vermittelten Kanamycin-resistenten Organismen, beispielsweise E. coli K-12 R-5 und Ps. aeruginosa GN 315, die Kanamycine durch 6 -N-Acetylierung inaktivieren. Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Derivate des Kanamycin A und B herzustellen, die gegenüber diesem Typ von enzymati-scher Inaktivierung durch diese Kanamycin A oder B resistenten Organismen resistent sind, jedoch dennoch die Mehrzahl ihrer biologischen Aktivität und Spektren behalten.

Am meisten bevorzugt sind Ausführungsformen, die zu Verbindungen der Formel IV führen, worin:

1. R für L-(—)-7-Amino-a-hydroxybutyryl und R3 für OH (IVa) stehen;

2. R für L-(—)-Y-Amino-a-hydroxybutyryl und R3 für NH2 (IVb) stehen;

3. R für L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl und R3 für OH (IVc) stehen;

4. R für L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl und R3 für NH2 (IVd) stehen;

5. R für L-(—)-ò-Amino-a-hydroxyvaleryl und R3 für OH (IVe) stehen; und

6. R für L-(—)-ô-Amino-a-hydroxyvaleryl und R3 für NH2 (IVf) stehen; oder ein nicht-toxisches pharmazeutisch verträg-

s liches Säureadditionssalz davon.

Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung bedeutet der Begriff «nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz» ein Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasalz, das durch io Reaktion von 1 Mol Verbindung IV mit 1 bis 4 Mol einer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure gebildet ist. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Äpfelsäure und 15 Zitronensäure, und alle anderen Säuren, die üblicherweise zur Bildung von Amin-enthaltenden Pharmazeutika verwendet werden.

Andere, am meisten bevorzugte Ausführungsformen ergeben Sulfat-, Hydrochlorid-, Acetat-, Maleat-, Citrat-, Ascor-20 bat-, Nitrat- oder Phosphatsalze und insbesondere das Mono-sulfatsalz bzw. das Disulfatsalz der Verbindung IV.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch die erfindungsgemässe Schaffung des Verfahrens zur Herstellung der Verbindung der Formel IV

worin RfürL-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl, L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl oder L-(—)-ô-Amino-a-hydroxy- 45 valeryl steht und worin R3 die Bedeutung —OH oder — NH2

besitzt, gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man in aufeinanderfolgenden Stufen:

A) die Verbindung der Formel II

worin R3 für —OH oder — NH2 steht, mit einem Acylierungsmittel der Formel VII

621 558

OH O

I II

L-(—)-W-NH-(CH2)n-CH-C-M (VII)

worin W für einen Rest steht, der ausgewählt ist unter:

—

<rysn2-o-l-, ch3-c

2

M einen Rest darstellt, der ausgewählt ist unter

V

-o-n

, -O

,0. _N0? .

, loi o

und jedoch bevorzugt oder

-O-

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt in einem Verhält- thyläther, Dioxan, Dimethylacetamid, Dimethylformamid,

nis von 0,5 Mol bis 1,4 Mol der Verbindung VII pro Mol 6s Tetrahydrofuran und Propylenglykoldimethyläther, jedoch

Verbindung II, jedoch bevorzugt in einem Verhältnis von 0,8 vorzugsweise wässrigem Tetrahydrofuran, acyliert, wobei die bis 1,1 in einem Lösungsmittel, das vorzugsweise ausgewählt entsprechende Verbindung der Formel III ist unter einer Mischung aus Wasser und Äthylenglykoldime-

621558

8

entsteht, worin n, R3 und W die vorstehenden Bedeutungen besitzen; und

B) die Blockierungsgruppe W aus der Verbindung III vorzugsweise durch nach dem Stand der Technik bekannte Methoden, und vorzugsweise in dem Fall, in dem W einen Rest der Formel

20

qm=h2-o-'-

30

darstellt, durch Hydrieren der Verbindung III mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators, der vorzugsweise ausgewählt ist unter Palladium, Platin, Raney-Nickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, jedoch bevorzugt Palladium und am bevorzugtesten Palladium-auf-Aktivkohle, in einem aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bestehenden Lösungsmittelsystem, das vorzugsweise ausgewählt ist unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldi-methyläther, Propylenglykoldimethyläther oder dergleichen, jedoch vorzugsweise 1:1 Wasser-Dioxan und bevorzugt in Gegenwart einer katalytischen Menge Eisessig, entfernt, wobei die Verbindung der Formel IV gebildet wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der Verbindungen der Formel IV ist durch die nachfolgenden Stufen gekennzeichnet:

A) Acylieren der Verbindung der Formel II mit einem Acylierungsmittel der Formel oder

î î

fyV0-LH- (CH2 ) n-C—C — 0 —

(VII a)

? ?" fi fi\_jCH2-0-C-NH- (CH2^-C-C-0-

(VII b)

worin N eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt, in einem Lösungsmittelsystem aus wässrigem Tetrahydrofuran oder wässrigem Dimethylformamid-Aceton, bei ungefähr Raumtemperatur, wobei die Verbindung der Formel III

9

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gebildet wird, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt; und

B) Hydrieren der Verbindung III in wässrigem Tetrahydrofuran in Gegenwart von Palladium-auf-Aktivkohle bei ungefähr atmosphärischem Druck, wobei Verbindung IV gebildet wird.

Alternativ kann in Stufe A) das Acylierungsmittel VII in situ durch Vermischen der Verbindung der Formel

* ?H »

/' \yxii2-0-c-nh-(ch2)n-c—c—oh

mit äquimolaren Mengen an N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid und Dicyclohexylcarbodiimid in einer kleinen Menge wasserfreiem Tetrahydrofuran gebildet werden. Die erhaltene Mischung wird filtriert und das Filtrat wird zu einer wässrigen Tetrahydrofuranmischung des 6 -N-Kanamycin A oder B zugegeben, wobei die entsprechende Verbindung III gebildet wird.

Die Verbindungen IV sind wertvoll als antibakterielle Mittel, als Beifuttermittel bei Tierfutter, als therapeutische Mittel bei Geflügel und Tieren, einschliesslich des Menschen, und sie sind besonders wertvoll bei der Behandlung von infektiösen

30

45

50

(ch )

I 2 "

nh I

00

1

o

Ó

Erkrankungen, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht sind.

Bei oraler Verabreichung sind die Verbindungen IV brauchbar als Zusatzbehandlung zur präoperativen Sterilisation des Darms. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora, die gegenüber diesen Pharmazeutika empfindlich ist, werden im Dickdarm vermindert. In Verbindung mit geeignetem mechanischen Reinigen sind sie brauchbar bei der Vorbereitung von Dickdarmoperationen.

Die Verbindungen IV sind bei der Behandlung systemischer bakterieller Infektionen brauchbar, wenn sie parenteral im Dosisbereich von ungefähr 250 mg bis ungefähr 3000 mg pro Tag in aufgeteilten Dosen drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Im allgemeinen sind die Verbindungen wirksam, wenn sie in einer Dosis von ungefähr 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden verabreicht werden.

Die Verbindungen der Art der Verbindung IV, insbesondere BB-K28, 142, 148, 162 und 163 besitzen alle wesentlich verbesserte Aktivitäten gegen ein grösseres Spektrum von Mikroorganismen im Vergleich zu den Stammverbindungen, von denen sie abgeleitet sind, d. h. von Kanamycin A und B.

Nachfolgend ist die Tabelle I dargestellt, die die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von Kanamycin A und B und BB-K28, 142, 148, 162 und 163 gegen eine Vielzahl grampositiver und gram-negativer Bakterien zeigen, so wie sie durch die Steers-Agar-Verdünnungsmethode auf Mueller-Hinton-Agarmedium erhalten wurden.

Tabelle I (MIC y/ml)

Organismus

BB-K

BB-K

BB-K

BB-K

BB-K

Kanamycin

Kanamycin

28

142

148

162

163

A

B

Ec-LE. coli NIHJ

0,4

0,4

3,1

6,3

6,3

0,4

1,6

Ec-3 E. coli Juhl

A15 119

0,8

0,8

3,1

6,3

12,5

0,8

1,6

Ec-5 E. K-12 ML-1630

A20 363

0,8

1,6

3,1

12,5

12,5

>100

>100

Ec-7 E. (KM-R)

A20365

0,2

0,2

0,2

3,1

6,3

6,3

100

Ec-8 E. K-12

A 9 632

0,4

0,4

0,4

6,3

12,5

0,4

1,6

Ec-9 E. NR79/W677

A20 664

0,4

0,4

0,4

6,3

6,3

3,1

6,3

Ec-10 E. JR35/0600

A20 665

0,4

0,4

0,4

3,1

6,3

50

100

621 558

10

Tabelle I (Fortsetzung) (MIC y/ml)

Organismus

BB-K 28

BB-K 142

BB-K 148

BB-K 162

BB-K 163

Kanamycin A

Kanamycin B

Ec-52 E. W677

A20 684

0,4

0,8

0,4

3,1

6,3

0,8

1,6

Ec-53 E. JR66/W677

A20 683

0,8

6,3

12,5

50

100

100

>100

Ec-59 E.

A20 766

0,8

6,3

12,5

50

100

>100

>100

Ec-60 E. :

A20 898

6,3

50

>50

100

>100

>100

>100

Ec-55K-12CS2R-5

*

*

3,1

3,1

Kp-1 K. pneumoniae D-ll

0,4

0,2

0,8

0,8

1,6

0,2

1,6

Kp-8 K.Type 22

A20 680

1,6

12,5

25

12,5

50

>100

>100

Sm-1 Ser. marcescens

A20 019

0,8

1,6

1,6

6,3

6,3

1,6

3,1

Pa-1 Ps. aeruginosa D-15

3,1

3,1

3,1

6,3

12,5

12,5

25

Pa-3 Ps.

A 9 930

0,2

0,4

0,4

3,1

3,1

6,3

25

Pa-4 Ps.

H-9

25

100

>50

100

>100

>100

>100

Pa-5 Ps.

A15 150

6,3

12,5

6,3

12,5

12,5

12,5

50

Pa-15 Ps. (GM-R)

A20 717

6,3

25

12,5

25

25

100

100

Pa-16 Ps. (GM-R)

A20 718

3,1

12,5

6,3

25

50

25

50

Pa-20 Ps.

A20 325

3,1

12,5

12,5

6,3

12,5

25

50

Pa-21 Ps.

A20 601

12,5

12,5

12,5

25

50

50

100

Pa-23 Ps.

A20 741

25

50

50

50

100

>100

>100

Px-10 Ps.

A20621

100

100>

>50

>100

>100

Pv-L PR. vulgaris

A 9 436

0,2

0,4

0,8

0,4

3,1

Pm-1 Pr. mirabilis

A 9 554

0,8

1,6

1,6

3,1

3,1

0,8

3,1

Pg-1 Pr. morganii

A 9 553

0,8

0,8

1,6

6,3

6,3

0,8

3,1

Sa-2 S. aureus Smith

A15 167

0,2

0,4

0,1

1,6

1,6

0,2

0,4

Sa-4 S. FDA 209P

0,8

1,6

0,8

12,5

25

0,8

1,6

Sa-10S. (KM-R)

A20 239

1,6

1,6

1,6

12,5

12,5

50

50

Sa-49 S.

A20 240

3,1

6,3

12,5

50

50

>100

100

Bs-1 B Subtilis PC1-219

<

0,05

< 0,05

< 0,025

0,4

0,8

< 0,05

0,2

M6-1 Mycob. 607

0,8

0,8

0,8

3,1

3,1

0,4

3,1

M6-2 Mycob. 607 (KM-R)

>100

100

>50

>100

>100

>100

>100

M6-3 Mycob. 607 (KM, SM-R) >100

100

>50

>100

>100

>100

>100

Mp-1 Mycob. phlei

0,2

0,4

0,4

1,6

1,6

0,8

3,1

Mr-1 Mycob. ranae

0,8

0,8

0,8

3,1

3,1

0,8

1,6

Nach den umfassenden Erfahrungen mit Kanamycin A und B und seiner chemischen Reaktivität wurde erwartet, dass von den vier oder fünf primären Aminfunktionen, die in Kanamycin A bzw. B vorliegen, aus sterischen Gründen die ó'-Amino-funktion die reaktivste ist. Es wurde daher postuliert, dass, wenn man die 6-Aminofunktion in ein 6 -N-Methyl-sek.-Amin überführt, seine Reaktivität mit einem Acylierungsmittel wesentlich vermindert wäre, und dass die 1-N-primäre Amin-funktion aus sterischen Gründen bei den verbleibenden primären Aminen die reaktivste wäre. Daher wurde das 6'-N-Methylkanamycin A oder B direkt mit einem geeigneten, Seitenketten acylierenden Mittel acyliert, ohne zuerst die anderen Aminfunktionen des Moleküls zu blockieren. Die Kontrolle der molaren Mengen an verwendetem Acylierungsmittel bestimmt den Grad der Acylierung, die an anderen Positionen auftritt.

Ausgangsmaterialien Herstellung von L-(—)-7-BenzyIoxycarbonylamino-a-hydroxybuttersäure (VI) 1. L-( —)-7-Amino-a-hydroxybuttersäure (7,4 g, 0,062 Mol) wird zu einer Lösung von 5,2 g (0,13 Mol) Natriumhydroxyd in 50 ml Wasser zugegeben. Zur gerührten Lösung gibt man tropfenweise bei 0 bis 5°C im Verlauf von 0,5 Std. 11,7 g (0,068 Mol) Carbobenzoxychlorid und setzt das Rühren der Mischung während einer Stunde bei derselben Temperatur fort. Die Reaktionsmischung wird mit 50 ml Äther gewaschen,

mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH2 eingestellt und mit vier 80 ml-Portionen Äther extrahiert. Man vereinigt die Ätherextrakte, wäscht mit einer kleinen Menge gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet mit wasserfreiem Natriumsul-45 fat und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft und der erhaltene Rückstand wird aus Benzol kristallisiert, wobei man 11,6 g (74%) farblose Platten mit Schmelzpunkt 78,5 bis 79,5°C, [cc]d —4,5° (c = 2, CHîOH) erhält.

50 Infrarotspektrum (IR) [KBr]: IR (KBr) vc = o 1740,1690 cm-1. Kernmagnetische Resonanz (NMR) (Aceton-dö) ô (in ppm von TMS) 2,0 (2H, m), 3,29 (2H, d-d, J = 6,7 und 12 Hz). 4,16 (1H, d-d, J = 4,5 und 8 Hz), 4,99 (2H, s), 6,2 (2H, breit), 7,21 (5H, s).

55

Analyse für C12H15NO5:

C H N

60 Berechnet: 56,91% 5,97% 5,53%

Gefunden: 56,66% 5,97% 5,47%

2. N-Hydroxysuccinimidester vonL-(—)-y~Benzyloxycarbo-65 nyl-amino-a-hydroxybuttersäure (VII).

Eine Lösung von 10,6 g (0,042 Mol) Verbindung VI und 4,8 g (0,042 Mol) N-Hydroxysuccinimid* in 200 ml Äthylace-tat wird auf 0°C gekühlt und dann werden 8,6 g (0,042 Mol)

11

621 558

Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Die Mischung wird über Nacht in einem Kühlschrank gehalten. Der Dicyclohexylharn-stoff, der sich abgeschieden hat, wird abfiltriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf ungefähr 50 ml konzentriert, wobei man farblose Kristalle von Verbindung VII erhält, die durch Filtrieren gesammelt werden; 6,4 g, Schmelzpunkt 121 bis 122,5°C. Man dampft das Filtrat im Vakuum zur Trok-kene ein und wäscht den kristallinen Rückstand mit 20 ml einer Mischung aus Benzol/n-Hexan, wobei man eine zusätzliche Menge an Verbindung VII erhält. Die Gesamtausbeute beträgt 13,4 g (92%).

[cc]d 1,5° (c = 2, CHCb).

IR (KBr) vc=o 1810,1755,1740,1680 cm"1.

NMR (Aceton-dö) ò (in ppm von TMS) 2,0 (2H, m), 2,83

(4H, s), 3,37 (2H, d-d, J = 6,5 und 12,5 Hz), 4,56 (1H, m),

4,99 (2H, s), 6,3 (2H, breit), 7,23 (4H, s).

Analyse für CióHisNzO?:

C H N

Berechnet: 54,85% 5,18% 8,00%

Gefunden: 54,79% 5,21% 8,14%

54,70% 5,20% 8,12%

3. Herstellung von N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid

N-Hydroxysuccinimid** (23 g, 0,2 Mol) wird in einer

Lösung von 9 g (0,22 Mol) Natriumhydroxyd in 200 ml Wasser gelöst. Zur gerührten Lösung gibt man tropfenweise unter Wasserkühlung 34 g (0,2 Mol) Carbobenzoxychlorid und rührt dann die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur, um das Carbobenzoxyderivat abzuscheiden, das durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 41,1 g (82%). Umkristallisation aus Benzol/n-Hexan (10:1) ergibt farblose Prismen, die bei 78 bis 79°C schmelzen.

4. Herstellung von 6-Carbobenzoxykanamycin A.

Eine Lösung von 42,5 g (90 mMol) Kanamycin A in Form der freien Base in 450 ml Wasser und 500 ml Dimethylform-amid (DMF) wird unterhalb 0°C abgekühlt und heftig gerührt. Zur Lösung gibt man tropfenweise im Verlauf von ungefähr 2 Std. eine Lösung von 22,4 g (90 mMol) N-(Benzyloxycarbo-nyloxy)-succinimid in 500 ml DMF. Die Mischung wird bei —10 bis 0°C über Nacht und dann einen Tag bei Raumtemperatur gerührt.

Die Reaktionsmischung wird unter vermindertem Druck unterhalb ungefähr 50°C eingedampft. Den öligen Rückstand löst man in einer Mischung aus 500 ml Wasser und 500 ml Butanol, wobei die Mischung filtriert wird, um unlösliches Material zu entfernen und in zwei Schichten aufgetrennt wird. Das Butanol und die wässrigen Schichten werden mit Butanol-gesättigtem Wasser (500 ml X 2) bzw. Wasser-gesättigtem Butanol (500 mlx2) behandelt, wobei man eine Technik anwendet, die der Gegenstromverteilung entspricht. Die drei wässrigen Schichten werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei man einen öligen Rückstand erhält, von dem ein Teil beim Stehen bei Raumtemperatur kristallisiert. Zu dem Rückstand einschliesslich der Kristalle gibt man ungefähr 100 ml Methanol, das das Öl löst und trennt es von den Kristallen ab. Nachdem man ungefähr 300 ml Äthanol zugegeben hat, wird die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gehalten, wobei man eine kristalline Masse erhält, die durch Filtrieren gesammelt wird. Sie wiegt 44 g. Das Produkt enthält eine kleine Menge Kanamycin A, wie dies durch Dünnschichtchromatographie unter Verwen-

** G.W. Anderson et al., J. Am. Chem. Soc., 86, 1839 (1964).

dung von n-Propanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (15:10:3:12) als Lösungsmittelsystem und Ninhydrin als Spray-Reagens, angezeigt wird.

Das Rohprodukt wird in 300 ml Wasser gelöst und auf einer Säule (30 mm Durchmesser) mit CG-50 Ionenaustauscherharz (NH4+ Typ, 500 ml) chromatographiert. Die Säule wird mit 0,1 n Ammoniumhydroxydlösung bespült und das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen gesammelt. Das gewünschte Produkt ist in den Röhren Nr. 10-100 enthalten, während das Kanamycin A aus den sich langsamer bewegenden Fraktionen gewonnen und das (die) Positionsisomere (n) des Produkts offensichtlich in den sich schneller bewegenden Fraktionen enthalten sind. Die Fraktionen 10-110 werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei man 24,6 g (45 %) eines farblosen Produkts, 6-Carbobenzoxy-kanamycin A(II) [6'-Cbz-Kanamycin A] erhält, das bei 204°C unter Verfärbung zu schmelzen beginnt und sich bei 212°C unter Gasentwicklung zersetzt.

[<x]D+106° (c = 2, H2O).

TLC (Dünnschichtchromatographie) Rf-Wert (Silikagel F254; Ninhydrin)

Lösungsmittelsystem 6'-Cbz-Kanamycin A Kanamycin A

n-PrOH-Pyridin-AcOH-HzO 0,42* 0,33** 0,15** 0,04

(15:10:3:12)

Aceton-AcOH-H20

(20:6:74) 0,24 0,14

CHCb-MeOH-c •

NH4OH-H2O

(1:4:2:1) 0,76 0,50

AcOMe-n—PrOH-c • NHtOH

(45:105:60) 0,22*** 0,04***

* hauptsächlich

** weniger

*** entdeckt durch Anthron-Schwefelsäure

Durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit einem der untersuchten Lösungsmittelsysteme stellt man fest, dass das Endprodukt von zwei geringeren Komponenten begleitet ist. Jedoch wird das Endprodukt zur Herstellung von Verbindung II ohne weitere Reinigung verwendet.

5. Herstellung von L-(—)-7-Amino-a-hydroxybuttersäure aus Ambutyrosin A oder B oder Mischungen davon.

Ambutyrosin A (5,0 g) [US-PS 3 541 078, erteilt am 17. November 1970] wird mit 160 ml 0,5 n Natriumhydroxyd 1 Std. am Rückfluss gehalten. Man neutralisiert das Hydrolysat mit 6n HCl und chromatographiert auf einer Säule mit CG-50 (NH4+ Typ). Man isoliert die gewünschte L-(—)-7-Amino-a-hydroxybuttersäure, indem man die Säule mit Wasser entwik-kelt und das Wasser durch Gefriertrocknen entfernt. Die L-(-)-Y-Amino-a-hydroxybuttersäure ist als kristallines Material mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 214,5°C [Spalte 2, Zeilen 31-38, US-PS 3 541 078] charakterisiert.

6. Herstellung von 6-Carbobenzoxykanamycin B.

Zu einer gekühlten Lösung von 8,1 g (0,0168 Mol) Kanamycin B in 120 ml Wasser und 80 ml 1,2-Dimethoxyäthan gibt man tropfenweise unter Rühren eine Lösung von 4,2 g (0,0168 Mol) N-(Benzyloxycarbonyloxy)-succinimid in 40 ml 1,2-Dimethoxäthan zu. Man rührt die Reaktionsmischung über Nacht und dampft unter vermindertem Druck ein. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und zweimal mit 50 ml Wasser-gesättigtem N-Butanol geschüttelt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und auf einer Säule mit 100 ml CG-50 (NH4+ Typ) adsorbiert. Man wäscht die Säule mit 200 ml Wasser, eluiert mit 0,05 n NH4OH. Das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 121 bis 180 werden gesammelt, eingedampft und gefriergetrocknet, wobei man 1,58 g (15%) des gewünschten Produkts erhält. Die Fraktio-

-5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

621558

12

nen 1 bis 120 werden eingedampft und nochmals auf CG-50 (NH4+) chromatographiert, wobei man 1,21 g (12%) des Produkts erhält. Schmelzpunkt = 151 bis 152°C (Zersetzung).

[oc]d24 + 104° (c= 2,5, H20)-vc=o 1710 cm-1.

Analyse für C26H43N5O12:

C H N

Berechnet: 50,56% 7,02% 11,34%

Gefunden: 50,71% 7,38% 11,48%

TLC (Dünnschichtchromatographie) (Silikagel F254), Rf 0,03 in n-PrOH-Pyridin-AcOH-HaO (15:10:3:12). Rf 0,16 in Aceton-AcOH-mO (20:6:74).

7. Herstellung von L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure aus Dl- a-Hydroxy-y-phthalimidobuttersäure

A) Dehydroabietylammonium-L- cx-hydroxy-Y-phthalimido-butyrat: Zu einer Lösung von 25 g (0,1 Mol) a-Hydroxy-Y-phthalimidobuttersäure*** in 200 ml Äthanol gibt man eine Lösung von 29 g (0,1 Mol) Dehydroabietylamin in 130 ml Äthanol. Man schüttelt die Lösung 1 Min. heftig und lässt

5 Std. bei Raumtemperatur stehen; während dieser Zeit kristallisieren feine Nadeln aus. Man sammelt die Kristalle durch Filtrieren, wäscht mit 50 ml Äthanol und trocknet an der Luft, wobei man 30,1 g (56%) eines Diastereomeren des Dehydro-abiethylaminsalzes erhält. Schmelzpunkt = 93 bis 94°C.

[c]d +15° (c = 2,5; MeOH).

Umkristallisation aus 300 ml Äthanol ergibt 23,2 g (43%) reines Produkt mit Schmelzpunkt 94 bis 95°C.

[a]£ +10,8° (c = 2,5; MeOH).

Weitere Umkristallisation ändert weder den Schmelzpunkt noch die spezifische Drehung.

Analyse für C32H42N2O5 • H2O:

C H N

Berechnet: 69,54% 8,02% 5,07%

Gefunden: 69,58% 8,08% 5,07%

B) L-(—)-Y-Amino-a-hydroxybuttersäure: Zu einer Lösung von 1,5 g (0,014 Mol) Natriumcarbonat in 40 ml Wasser gibt man 5,3 g (0,01 Mol) Dehydroabiethylammonium-L-a-hydroxy-Y-phthalimidobutyrat und 60 ml Äther. Man schüttelt die Mischung heftig, bis sich der gesamte Feststoff gelöst hat. Die Ätherschicht wird abgetrennt. Die wässrige Lösung wird zweimal mit 20-ml-Portionen Äther gewaschen und unter vermindertem Druck auf 15 ml eingedampft. Zum Konzentrat gibt man 10 ml konz. Chlorwasserstoffsäure und hält die Mischung 10 Std. am Rückfluss. Nach dem Kühlen wird abgeschiedene Phthalsäure durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung wird zur Trockene eingedampft. Diese Operation wird zweimal wiederholt, um überschüssige Chlorwasserstoffsäure zu entfernen. Den verbliebenen Sirup löst man in 10 ml Wasser und filtriert um eine kleine Menge unlösliche Phthalsäure zu entfernen. Das Filtrat wird auf einer Säule mit IR-120 (H+, 1 cmX35 cm) adsorbiert, die Säule wird mit 300 ml Wasser gewaschen und mit In Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Man vereinigt die Ninhy-drin-positiven Fraktionen 10 bis 16 und dampft unter vermindertem Druck ein, wobei man einen Sirup erhält, der allmählich kristallisiert. Die Kristalle werden mit Äthanol verrieben, filtriert und in einem Vakuumexsiccator getrocknet, wobei man 0,78 g (66%) L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure mit Schmelzpunkt 206 bis 207°C erhält.

[a]g> -29° (c = 2,5; H2O).

Das IR-Spektrum ist identisch mit dem der authentischen Probe, die aus Ambutyrosin erhalten wurde.

8. Herstellung von L- ß-Benzyloxycarbonylamino- a-hydroxy-propionsäure XX

L-ß-Amino-a-hydroxypropionsäure* (8,2 g; 0,078 Mol) wird in einer Lösung von 6,56 g (0,0164 Mol) Natriumhydroxyd und in 60 ml Wasser gelöst. Zur gerührten Lösung gibt man tropfenweise 14,7 g (0,086 Mol) Carbobenzoxychlorid unterhalb 5°C zu. Die Mischung wird 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt, mit 60 ml Äther gewaschen und mit verdünnter HCl auf pH 2 eingestellt. Man sammelt den Niederschlag durch Filtrieren, wäscht mit Wasser und trocknet an der Luft, wobei man 9,65 g (52%) Verbindung XX erhält. Das Filtrat wird mit fünf 100-ml-Portionen Äther extrahiert. Die Ätherlösung wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockene eingedampft, wobei man zusätzliche 2,0 g (11%) Verbindung XX erhält. Insgesamt 11,65 g Verbindimg VI werden aus 500 ml Benzol/Äthylacetat (4:1) kristallisiert, wobei man 9,36 g (50%) reine Verbindung XX mit Schmelzpunkt 128,5 bis 129,5°C erhält.

Infrarot (IR) (KBr): vc=o 1745,1690 cm-1.

[a]«0 +2,9° (c 5,0; MeOH).

Kernmagnetische Resonanzspektren [NMR (DMSO-d6)]:ô (inppm) 3,05-3,45 (2H, m, CH2N), 4,05 (1H, d-d, -O-CH-CO-), 5,03 (2H, s, ŒfeAr), 7,18 (IH, breit, NH), 7,36 (5H, s, RingH).

Analyse für C11H13NO5:

C H N

Berechnet: 55,23% 5,48% 5,86%

Gefunden: 55,34% 5,49% 5,87%

9. N-Hydroxysuccinimidester von L-ß-Benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxypropionsäure XX3

Zu einer gekühlten und gerührten Lösung von 478 mg (2 mMol) Verbindung XX und 230 mg (2 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 10 ml Tetrahydrofuran (THF) gibt man 412 mg (2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Die Mischung wird 1 Std. bei 0 bis 5°C und 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert, um den N,N'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat, welches das Titelprodukt enthält, wird ohne Isolierung für die nachfolgende Reaktion verwendet.

10. Herstellung von L-ö-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxy-valeriansäure XXII

Zu einer gerührten Lösung von 400 mg (3,0 mMol) L-ô-Amino-a-hydroxyvaleriansäure* * und 250 mg (6,5 mMol) Natriumhydroxyd in 25 ml Wasser gibt man tropfenweise 580 mg (3,3 mMol) Carbobenzoxychlorid im Verlauf von 30 Min. bei 0 bis 5°C zu. Die Mischung wird 1 Std. bei 5 bis 15°C gerührt, mit 25 ml Äther gewaschen, mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt und mit drei 30-ml-Portionen Äther extrahiert. Man schüttelt die vereinigte Ätherlösung mit 10 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung, trocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein, wobei man Kristalle erhält, die aus Benzol umkristallisiert werden, wobei man 631 mg (78%) Verbindung XXII mit Schmelzpunkt 110 bis 111°C erhält;

Infrarotspektrum [IR (KBr)]: 3460,3350,1725,1685, 1535,1280,730, 690 cm-i.

* K. Freudenberg, Ber., 47, 2027 (1914).

** S. Ohshiro et al., Yakugaku Zasshi, 87,1184 (1967).

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

621558

Kernmagnetisches Resonanzspektrum [NMR (Aceton-dö]: Ô (in ppm) 1,70 (4H, m), 4,14 (2H, q, J = 4,5 Hz), 4,19 (1H, m), 4,82 (2H, s), 6,2 (3H, breit), 725 (5H, s).

[aß5 +1,6 (c 10; MeOH).

Analyse für C13H ivNOs:

C H N

Berechnet: 58,42% 6,41% 5,24%

Gefunden: 58,36% 6,50% 5,27%

11. N-Hydroxysuccinimidester von L-ò-Benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxyvaleriansäure XXIII

Zu einer gerührten und gekühlten Lösung von 535 mg (2,0 mMol) Verbindung XXII und 230 mg (2,0 mMol) N-Hydroxy-succinimid in 55 ml Äthylacetat gibt man 412 mg (2,0 mMol) N,N -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Die Mischung wird

3 Std. bei Raumtemperatur gerührt und filtriert, um ausgefallenen N,N'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, wobei man 780 mg (100%) viskosen Sirup XXIII erhält.

IR (gut): vc=o 1810,1785,1725 cm"1.

6'-N-Methylkanamycin A (BB-K 25) nach Methode A 1. Zu einer Suspension von 610 mg LÌAIH4 in 10 ml trockenem Dioxan gibt man tropfenweise bei 70°C eine Suspension von 618 mg 6-N-Carbobenzoxykanamycin A (6-N-Cbz-Kanamycin A) in 30 ml trockenem Dioxan. Die Mischung wird 20 Std. bei 70°C gerührt und dann auf —5 bis 0°C gekühlt. Zur Reaktionsmischung gibt man vorsichtig ungefähr 20 ml kaltes Wasser. Nach beendeter Zugabe neutralisiert man die Mischung mit 2n HCl und dampft unter vermindertem Druck zur Trockene ein. Der Rückstand wird mit einer grossen Menge EtOH gewaschen, wobei man 536 mg des Rohprodukts erhält, das in einer kleinen Menge Wasser gelöst und auf einer Säule mit CG-50 Ionenaustauscherharz (NHt+ Typ; 20 ml) chromatographiert wird. Die Säule wird mit Wasser, 1 Ltr. 0,1 n NH4OH, 600 ml 0,2 n NH4OH und schliesslich 500 ml 0,5 n NH4OH bespült. Man sammelt 10 ml-Fraktionen und unterwirft sie dem Ninhydrinspottest, dem Scheibentest (B. subtilis PCI 219) und TLC (Dünnschichtchromatographie) auf einer Silikagelplatte; Lösungsmittelsystem, S-110 (CHCL3-MeOH-28% NH4OH-H2O = 1:4:2:1). Die Fraktionen,

welche nach TLC einen Ninhydrin-positiven und bioaktiven Spot bei RF 0,50 ergeben, werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei man 137 mg (27 %) BB-K 25, mit Schmelzpunkt 183 bis 187°C (Zersetzung) erhält.

NMR(D20): ô (ppm), 2,51 (3 H, s, 6'-N-CH3), 4,95 (1H, d,

4 Hz, 1"—H), 5,01 (1H, d, 3 Hz, l'-H).

Analyse für C19H38N4O11 • H2CO3:

C H N

Berechnet: 42,85% 7,19% 9,99%

Gefunden: 42,97% 7,27% 9,63%

2. Zu einer Suspension von 8,8 g LÌAIH4 in 100 ml trockenem Dioxan gibt man eine Suspension von 9,0 g 6'-N-Cbz-Kanamycin A in 200 ml trockenem Dioxan und rührt die Reaktionsmischung 4 Tage bei 80°C. Man kühlt die Reaktionsmischung auf 10°C, behandelt vorsichtig mit 200 ml Wasser und filtriert, um unlösliches Material zu entfernen. Das Filtrat wird mit n HCl neutralisiert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mehrmals mit EtOH gewaschen und in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird auf einer Säule mit CG-50 (NH4+ ; 200 ml) chromatographiert, die mit 100 ml Wasser gewaschen und nacheinander mit 2,0 Ltr. 0,1 n NH4OH und 1,5 Ltr. 0,2 n NH4OH eluiert wird. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 119 bis 144 zeigen beim Dünnschichtchroma-togramm (Silikagelplatte; CHCb-MeOH-28% NH4OH-H2O = 1:4:2:1) einen bioaktiven und Ninhydrin-positiven Spot bei Rf 0,45. Sie werden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und schliesslich lyophilisiert, wobei man 1,139 g (16%) BB-K 25 erhält, das mit dem gemäss Methode A-(l) hergestellten Produkt identisch ist.

6'-N-Methylkanamycin A (BB-K 25) nach Methode B Zu einer gerührten Suspension von 618 mg (1 mMol) 6-N-Cbz-Kanamycin in 30 ml trockenem Pyridin gibt man 7 ml Trimethylchlorsilan und 14 ml Hexamethyldisilazan bei 70°C zu. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei derselben Temperatur gerührt und im Vakuum eingedampft. Den Rückstand behandelt man mit trockenem Tetrahydrofuran (THF). Das unlösliche Material wird filtriert und mit trockenem THF gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei man 1,567 g des trimethylsilylierten Produkts erhält, das in 30 ml trockenem THF gelöst wird. Man gibt die Lösung zu einer Suspension von 758 mg Lithiumaluminiumhydrid in 70 ml trockenem THF. Die Mischung wird 22 Std. unter Rühren am Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen auf ungefähr 0°C behandelt man die Reaktionsmischung vorsichtig mit 20 ml Eiswasser und filtriert, um unlösliches Material zu entfernen. Das Filtrat wird mit 6n HCl neutralisiert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Den Rückstand wäscht man mehrmals mit Äthanol, löst in einer kleinen Menge Wasser und chromatographiert auf einer Säule mit CG-50 (NH4+; 50 ml). Die Säule wird mit 50 ml Wasser gewaschen und hintereinander mit 1 Ltr. 0,1 n NH4OH und 600 ml 0,2 n NH4OH eluiert. Das Eluat wird in 20 ml-Fraktionen gesammelt und wie in Methode A(l) beschrieben überwacht. Die Fraktionen 47 bis 72, die einen Ninhydrin-positiven und bioaktiven Spot bei Rf 0,50 gemäss TLC ergeben, werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert, wobei man 258 mg (52% aus 6'-Cbz-Kanamycin A) BB-K 25 mit Schmelzpunkt 183 bis 187°C erhält.

Beispiel 1

l-N-(L-(—)-Y-Amino-a-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-kanamycin A (BB-K 28)

Zu einer Lösung von 750 mg 6'-N-Methyl-kanamycin A (BB-K 25) in 30 ml 60%igem wässrigem THF gibt man 525 mg N-Hydroxy-succinimidester von N-Cbz-L-7-Amino-a-hydroxybuttersäure. Man hydriert die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur über Nacht unter atmosphärischem Druck in Gegenwart von 500 mg 10%igem Palladium-auf-Aktivkohle. Die Reaktionsmischung wird filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Den Rückstand löst man in einer kleinen Menge Wasser und adsorbiert an einer Säule mit CG-50 (NH4+; 70 ml). Die Säule wird mit Wasser gewaschen und nacheinander mit 850 ml 0,1 n Ammoniak (Röhren Nr. 1 bis 43 wurden in 20 ml-Fraktionen gesammelt), 1450 ml 0,2 n Ammoniak (Röhren Nr. 44 bis 115 in 20 ml-Fraktion) und schliesslich 100 ml 0,5 n Ammoniak (Röhren Nr. 116 bis 215 in 10 ml-Fraktion) bespült. Die Fraktionen 152 bis 161, die einen bioaktiven und Ninhydrin-positiven Spot bei Rf 0,17 gemäss TLC (Silikagel; CHCb-CH30H-28% NH4OH-H2O = 1:4:2:1) zeigen, werden vereinigt, unter vermindertem Druck s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

621 558

eingedampft und lyophilisiert, wobei man 149 mg (16%) BB-K28 mit Schmelzpunkt 187 bis 189°C (Zersetzung) erhält.

Infrarot [IR(KBr)]: vc=o 1650 cm-1.

NMR (D2O): 2,70 ppm (3H, s, N-CHs).

Analyse für: C23H45N5O13 • 2H2CO3 • 2H2O:

C H N

Berechnet: 39,52% 7,03% 9,23%

Gefunden: 39,26% 6,69% 9,69%

39,00% 6,54% 9,20%

Um eine Spur Isomeres des Typs BB-K 11 (3"-N-acyliertes Isomeres) zu entfernen, unterwirft man das BB-K 28 einer Säulenchromatographie mit einem Tetraminkupfer (TACu)-Typ von Amberlite CG-50 Ionenaustauscherharz. Man löst BB-K 28 (73 mg) in einer kleinen Menge Wasser und chromatographiert auf einer Säule mit CG-50 (TACu-Typ; 3 ml). Die Säule wird mit 20 ml Wasser gewaschen und dann mit 100 ml 0,2 n NH4OH und schliesslich mit 100 ml 1,0 n NH4OH eluiert. Man sammelt das Eluat in 7 ml-Fraktionen und überwacht mit dem Ninhydrin-Spottest, dem Scheibentest (B. subtilis PCI 219 und Pseudomonas aeruginosa) und TLC auf Silikagel (S-110; Ninhydrin). Die Fraktionen 21 bis 24 zeigen einen Ninhydrin-positiven und bioaktiven (gegen den Ps. aeru-ginosa-Stamm) Spot bei Rf 0,2. Sie werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei man 30 mg blaues Pulver erhält. Der blaugefärbte Rückstand (30 mg) wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst und auf einer Säule mit CG-50 (NÜ4+; 3 ml) adsorbiert, die mit 20 ml 0,2 n NH4OH und 200 ml 0,5n NH4OH bespült wird. Man sammelt das Eluat in 7 ml-Fraktio-nen. Die Fraktionen 19 bis 23, die einen positiven Ninhydrin-test zeigen, werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet, wobei man 20 mg reines BB-K 28 mit Schmelzpunkt 187 bis 189°C (Zersetzung) erhält.

Beispiel 2

l-N-[L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl]-6'-N-methyl-kanamycin A (BB-K 162).

Eine Mischung von 218 mg (0,912 mMol) N-Cbz-L-Iso-serin, 163 mg (0,912 mMol) N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (HONB) und 188 mg (0,912 mMol) DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) in 10 ml THF wird bei 5°C über Nacht stehen gelassen und dann filtriert. Nachdem das Filtrat zu einer Lösung von 441 mg (0,892 mMol) ó'-N-Methyl-kanamy-cin A in 20 ml 50%igem wässrigem THF zugegeben ist, rührt man die Mischung 5 Std. bei Raumtemperatur und konzentriert unter vermindertem Druck auf ungefähr 2 ml. Das Konzentrat wird auf einer Säule mit Amberlite CG-50 (NH4+; 26 ml) adsorbiert, die mit 40 ml Wasser gewaschen und mit 500 ml 0,ln NH4OH eluiert wird. Man sammelt das Eluat in 10 ml-Fraktionen. Die Fraktionen 11 bis 16 werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei man 231 mg des N-acylierten Produkts erhält. Aus den 0,3 n NHUOH-Eluat sammelt man 175 mg (40%) des Ausgangsmaterials, BB-K 25.

Zu einer Lösung des Acylderivats in 20 ml 50%igem wässrigem EtOH gibt man 130 mg 10% Pd-auf-Aktivkohle und hydriert die Mischung unter Normaldruck bei Raumtemperatur. Man filtriert den Katalysator ab und dampft das Filtrat ein, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die erhaltene wässrige Lösung wird einer Säulenchromatographie auf CG-50 (NH4+; 25 ml) unterworfen. Man eluiert die Säule nacheinander mit 40 ml Wasser, 240 ml 0,1 n NH4OH, 500 ml 0,2 n NH4OH, 300 ml 0,4 n NH4OH und sammelt das Eluat in 10 ml-Fraktionen. Die bioaktiven Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei man 127 mg des Rohprodukts erhält, das auf einer Säule mit CG-50 (Tetraminkupfer-Typ; 4 ml) nochmals chromatographiert und mit 200 ml 0,3 n NH4OH, 300 ml 0,5 n NH4OH und schliesslich mit 300 ml In NH4OH eluiert wird. Man sammelt das Eluat in 10 ml-Fraktionen.

14

s

10

15

20

25

30

Röhre Nr. Eluiermittel Menge Rf Bemerkungen

4 0,3n NH4OH 27 mg 0,33 inaktiv

19_24 0,5nNH40H 38 mg 0,33 inaktiv, wahrscheinlich ein Positionsisomeres

50-54 l,QnNH40H 35 mg 0,37 das gewünschte Produkt, BB-K162

Die Röhren Nr. 50 bis 54 werden vereinigt und zur Trok-kene eingedampft, wobei man 35 mg (6,8%) des gewünschten bioaktiven Produkts BB-K 162 mit Schmelzpunkt 178 bis 185°C (Zersetzung) erhält.

KBr

Vç_Ql630cm 1.

Beispiel 3

l-N-[L-(—)-ô-Amino-a-hydroxy valeryl]-6 -N-methyl-kanamycin A (BB-K 163)

Eine Mischung von 94 mg (0,353 mMol) N-Cbz-L-y-Amino-a-hydroxyvaleriansäure, 64,5 mg (0,353 mMol)

HONB und 74,5 mg (0,353 mMol) DCC in 5 ml trockenem THF wird über Nacht bei 4°C stehen gelassen und filtriert. Das Filtrat gibt man zu einer Lösung von 175 mg (0,351 mMol) 6'-

N-Methyl-kanamycin A in 10 ml 50%igem wässrigem THF und rührt die Mischung bei Raumtemperatur 5 Std. lang. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur in Gegenwart von 70 mg 10%igem Palladium-auf-Aktivkohle hydriert. Man filtriert den Katalysator ab und dampft das Filtrat ein, um das THF zu entfernen. Das erhaltene wässrige Konzentrat wird auf einer Säule mit Amberlite CG-50 (NH4+-Typ; 20 ml) chromatographiert und nacheinander mit Wasser (50 ml), 0,1 n ss NH4OH (250 ml), 0,2 n NHtOH (450 ml) und 0,5 n NH4OH (400 ml) eluiert. Das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen gesammelt. Die bioaktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Trockene eingedampft, wobei man 40 mg Rohprodukt erhält, das auf einer Säule mit CG-50 (Tetraminkupfer-Typ; 1,5 ml) «o nochmals chromatographiert und mit 10 ml Wasser und 100 ml 0,5 n NH4OH eluiert wird. Man sammelt das Eluat in 5 ml-Fraktionen.

50

Röhre Nr. Eluiermittel Menge Rf Bemerkungen

7-8 0,5n NHtOH 5 mg 0,21 inaktiv

9 0,5n NH4OH 9 mg 0,21,0,29 eine Mischung aus zwei Komponenten

10-14 0,5n NHtOH 24 mg 0,29 das gewünschte Produkt BB-K 163

15

621558

Die Röhren Nr. 10 bis 14 werden vereinigt und zur Trok-kene eingedampft, wobei man 24 mg (11 %) des gewünschten bioaktiven Produkts, BB-K 163 mit Schmelzpunkt 167 bis 174°C (Zersetzung) erhält.

KBr v^_Ql620cm 1.

6'-N-Methyl-kanamycin B, BB-K 140 Zu einer Suspension von 2,0 g (3,25 mMol) 6-N-Cbz-Kanamycin B in 100 ml trockenem Pyridin gibt man 20 ml Trimethylsilylchlorid und 50 ml Hexamethyldisilazan bei 70°C unter Rühren zu und rührt die Mischung bei derselben Temperatur über Nacht. Der Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt und mit trockenem THF gewaschen. Das Filtrat wird mit den Waschflüssigkeiten vereinigt und zur Trockene eingedampft. Den öligen Rückstand löst man in 80 ml trockenem THF. Die Lösung wird tropfenweise zu einer gerührten Suspension von 4,4 g Lithiumaluminiumhydrid in 200 ml trockenem THF zugegeben und die Mischung wird über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Kühlen behandelt man die Reaktionsmischung vorsichtig mit Eiswasser, stellt mit 2n HCl auf pH 7 ein und dampft unter vermindertem Druck zur Trockene ein. Nach dem gründlichen Waschen mit Äthanol löst man den Rückstand (2,7 g) in 5 ml Wasser und chromatographiert auf einer Säule mit Amberlite CG-50 (NHt+ ; 40 ml). Die Säule wird mit 300 ml Wasser gewaschen und mit 0,1 n Ammoniak eluiert. Das Eluat sammelt man mit 10 ml-Fraktionen und überwacht mit Ninhydrinspottest, Scheibentest (B. subtilis PCI 219) und TLC (Silikagelplatte, CHCl3-CHsOH-28 % NH4OH-H2O = 1:4:2:1). Die Fraktionen 70 bis 134, die einen Ninhydrin-positiven und bioaktiven Spot bei Rf 0,47 nach TLC zeigen, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 889 mg (55 %) BB-K 140 mit Schmelzpunkt 177 bis 181°C (Zersetzung) erhält.

NMR (D2O): 2,74 ppm (3H, s, N-CHs).

Analyse für CiyH.wNsOio • H2CO3:

C H N

Berechnet: 42,93% 7,39% 12,52%.

Gefunden: 42,93% 7,13% 11,86%

Beispiel 4

l-N-[L-( — )-Y-Amino-a-hydroxybutyryl]-6 -N-methyl-kanamycin B (BB-K 142)

Eine Mischung von 253 mg (1 mMol) N-Cbz-L-7-Amino-a-hydroxy-buttersäure, 115 mg (1 mMol) N-Hydroxysuccini-mid (HOSu) und 206 mg (1 mMol) DCC wird 3 Std. bei 5°C gerührt und filtriert, um den Niederschlag zu entfernen, der sich während der Reaktion abgeschieden hat. Die erhaltene aktive Esterlösung wird zu einer Lösung von 497 mg (1 mMol) 6 -N-Methyl-kanamycin B (BB-K 140) in 10 ml Wasser zugegeben und die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert die Reaktionsmischung und dampft im Vakuum ein. Den Rückstand löst man in 5 ml Wasser und adsorbiert an einer Säule mit CG-50 Ionenaustauscherharz (NHt+-Typ; 45 ml), die nacheinander mit 200 ml Wasser, 1500 ml 0,05 n Ammoniak und 500 ml 0,3 n Ammoniak eluiert wird. Das Eluat sammelt man in 10 ml-Fraktionen. Das gewünschte Zwischenprodukt-Derivat ist in den Fraktionen 58 bis 72 enthalten, die mit 0,05 n Ammoniak eluiert werden, während 163 mg (33%) BB-K 140 aus den mit 0,3 n Ammoniak eluierten Fraktionen gewonnen werden.

Eine Lösung des Zwischenprodukt-Derivats in 20 ml

50%igem THF wird über Nacht unter Normaldruck in Gegenwart von 30 mg 10% Palladium-auf-Aktivkohle hydriert. Die Reaktionsmischung wird filtriert und auf ungefähr 4 ml konzentriert. Man adsorbiert das Konzentrat auf einer Säule mit Amberlite CG-50 (NHt+-Typ; 10 ml), die mit 150 ml Wasser gewaschen und hintereinander mit 350 ml 0,05 n NH4OH, 300 ml 0,1 n NHtOH, 150 ml 0,3 n NH4OH und 300 ml 0,5 n NHtOH eluiert wird. Man sammelt das Eluat in 15 ml-Fraktionen. Die Fraktionen 67 und 68, die einen bioaktiven Spot bei Rf 0,22 gemäss TLC (Silikagelplatte; CHCb-CH30H-28% NH4OH-H2O = 1:4:2:1) aufweisen, werden vereinigt und auf einer Säule mit CG-50 (unterer Teil NH4+-Typ 1 ml; oberer Teil Tetraminkupfer-Typ 2 ml) nochmals chromatographiert. Man eluiert die Säule mit 100 ml 0,5 n NHtOH und dann mit 50 ml 1,0 n NH4OH und sammelt das Eluat in 5 ml-Fraktionen. Die Fraktionen 15 bis 33 werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei man 29,4 mg (5%) des gewünschten bioaktiven Produkts, BB-K 142 mit Schmelzpunkt 188 bis 192°C (Zersetzung) erhält.

IR(KBr):vc=o 1640 cm"1.

Analyse für C23H46N6O12 • 2H2CO3 :

C H N

Berechnet: 41,55% 6,97% 11,63%

Gefunden: 41,52% 6,72% 10,95%

Man erhitzt eine kleine Probe BB-K 142 auf 100°C 1 Std. lang in 0,5 n NaOH, wobei man 6 -N-Methyl-kanamycin B und L-HABA erhält; dies wird durch TLC (Dünnschichtchromatographie) bestätigt.

Beispiel 5

l-N-[L-( — )-ß-Amino-a-hydroxypropionyl]-6 -N-methyl-kanamycin B (BB-K 148)

Eine gerührte Mischung von 120 mg (0,5 mMol) N-Cbz-L-Isoserin, 58 mg (0,5 mMol) HOSu und 103 mg (0,5 mMol) DCC in 5 ml THF wird bei 5°C über Nacht stehen gelassen. Nachdem die Mischung filtriert wurde, gibt man das Filtrat zu einer Lösung von 248 mg (0,5 mMol) BB-K 140 in 5 ml Wasser und rührt über Nacht. Nach dem Entfernen des THF wird die wässrige Lösung auf einer Säule mit Amberlite (CG-50 (NH4+-Typ; 10 ml) adsorbiert. Das Eluieren wird mit 300 ml 0,5 n NHtOH, gefolgt von 300 ml 0,1 n NHtOH durchgeführt, und man sammelt 10 ml-Fraktionen. Das gewünschte Zwischenprodukt-Derivat (68 mg) wird durch Eindampfen der Fraktionen 18 bis 31 erhalten, die mit 0,05 n NHtOH erhalten werden, während man 69 mg (28%) BB-K 140 aus den mit 0,1 n Ammoniak eluierten Fraktionen gewinnt.

Eine Lösung des Zwischenprodukt-Derivats in 10 ml Wasser wird über Nacht in Gegenwart von 20 mg 10% Pd-C hydriert und die Reaktionsmischung wird filtriert und auf ungefähr 5 ml konzentriert. Man chromatographiert das Konzentrat auf einer Säule mit Amberlite CG-50 (NH4+; 8 ml) und eluiert nacheinander mit 280 ml 0,05 n NHtOH, 340 ml 0,1 n NH4OH und 200 ml 0,2 n NH4OH. Die gewünschte bioaktive Komponente (35 mg) erhält man aus den mit 0,2 n NHtOH eluierten Fraktionen. Das Produkt zeigt noch immer 2 bis 3 Ninhydrin-positive Spots und wird durch nochmaliges Chromatographieren auf einer Säule mit CG-50 (unterer Teil NH4+-Typ 1 ml; oberer Teil Tetraminkupfer-Typ 2 ml) gereinigt, die nacheinander mit 60 ml 0,3 n NH4OH, 110 ml 0,5 n NHtOH und 100 ml 1,0 n NHtOH eluiert wird. Das gewünschte Produkt, BB-K 148, wird aus den Fraktionen 40

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

621558

16

bis 50 erhalten, die mit 0,1 n NH4OH eluiert wurden.

Ausbeute 8,1 mg (3%); Schmelzpunkt 190 bis 198°C (Zersetzung).

s

IR(KBr): vc=o 1630 cm-1.

Beispiel 6

l-N-[L-(—)-ó-Amino-a-hydroxyvaleryl]-

6'-N-methyl-kanamycin B 10

Ersetzt man in der Arbeitsweise des Beispiels 5 das dort verwendete 6-N-Methyl-kanamycin A durch eine äquimolare Menge an 6 -N-Methyl-kanamycin B, so erhält man das Titelprodukt.

Amberlite CG-50 ist die Handelsbezeichnung für die chro- 15 matographische Qualität eines schwach-sauren Kationenaustauscherharzes eines Carbonsäure-polymethacryltyps.

Die Cupra-ammoniumform von Amberlite CG-50 wird auf die folgende Weise hergestellt: Zu einer gerührten Suspension von CG-50 (NH4+) in Wasser gibt man 10%ige Kupfer-II- 20 sulfatlösung, um das Kupfersalz von CG-50 zu erhalten, das filtriert wird. Man wäscht das Harz mehrmals mit Wasser und behandelt dann unter Rühren mit IN NH4OH, filtriert und wäscht mehrmals mit Wasser, wobei man die tief-blaue Cupra-ammoniumform von CG-50 erhält. 25

Beispiel 7

Herstellung des Monosulfatsalzes von l-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-6 -N-methyl-kanamycin A oder B

Ein Mol l-[L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-6'-N- 30 methyl-kanamycin A oder B werden in 1 bis 3 Ltr. Wasser gelöst. Die Lösung wird filtriert, um irgendwelche ungelöste Feststoffe zu entfernen. Zur gekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser. Die Mischung wird 30 Min. rührengelassen, worauf man kaltes 35 Äthanol zur Mischung zugibt, bis ein Niederschlag auftritt. Die

Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und man stellt fest, dass es sich um das gewünschte Monosulfatsalz handelt.

Beispiel 8

Herstellung des Disulfatsalzes von l-[L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionylJ-ó-N-methyl-kanamycin A oder B 35 g l-[L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl]-6'-N-methyl-kanamycin A oder B werden in 125 ml entionisiertem Wasser gelöst. Man senkt den pH mit 50% V/V Schwefelsäure auf 7 bis 7,5 ab.

8,5 g Darco G-60 (Aktivkohle) werden zugesetzt und die Mischung wird bei Umgebungstemperatur 0,5 Std. aufgeschlämmt. Man entfernt die Kohle durch geeignetes Filtrieren und wäscht mit 40 ml Wasser. Die Wasserwäsche wird zum Filtrat zugesetzt.

Das obige vereinigte Filtrat/Waschflüssigkeit wird mit 50% V/V Schwefelsäure auf pH 2 bis 2,6 eingestellt. Es entwickelt sich eine grosse Menge Kohlendioxid. Man lässt die Lösung unter Rühren 20 Min. am Laborvakuum, um zusätzliches Kohlendioxid auszutreiben.

Zur entgasten Lösung gibt man 8,5 g Darco G-60. Die Mischimg wird 0,5 Std. bei Umgebungstemperatur aufgeschlämmt. Man entfernt die Kohle durch geeignetes Filtrieren und wäscht mit 35 ml entionisiertem Wasser. Die Waschflüssigkeit wird zum Filtrat zugesetzt.

Das vereinigte Filtrat/Waschflüssiglceit wird mit 50% V/V Schwefelsäure auf pH 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung gibt man unter schnellem Rühren im Verlauf von 10 Min zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumina Methanol). Die Mischung wird 5 Min. bei pH 1 bis 1,3 gerührt, durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,148 mm (100 mesh) gegeben, 2 Min. gerührt und 5 Min absitzen gelassen. Die Hauptmenge der überstehenden Flüssigkeit wird dekantiert. Die verbleibende Aufschlämmimg wird auf geeignete Weise filtriert, mit 200 ml Methanol gewaschen und 24 Std. bei 50°C im Vakuum getrocknet, wobei man das Titel-Disulfatsalz erhält.

B

Claims (4)

00 621 558 PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel :h„nhcr NH-R sowie pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzen besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass man in aufeinanderfol- davon, worin R für L-(—) -7-Amino-a-hydroxybutyryl, L-(—)- genden Stufen: ß-Amino-a-hydroxypropionyl oder L-(—)-ô-Amino-a-hydro- A) die Verbindung der Formel II xyvaleryl steht und R3 die Bedeutungen —OH oder -NH2 worin R3 für -OH oder -NH2 steht, mit einem Acylierungsmittel der Formel VII OH O I II L-(-)-W-NH-(CH2)„-CH-C-M j(VII) worin W einen Rest darstellt, der ausgewählt ist unter:

1

CH-

Ô

gebildet wird, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt; und

B) die Verbindung der Formel III in wässrigem Tetrahydrofuran in Gegenwart von Palladium-auf-Aktivkohle bei ungefähr atmosphärischem Druck hydriert, wobei die Verbindung der Formel IV gebildet wird.

8. Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 7 auf Acylierungsmittel der Formel Vlla, die in der Stufe A) in situ durch Vermischen einer Verbindung der Formel dem Mittel erhalten werden.

35

o o

11

1

0

2-0-C-NH-<CH2)

Tl n f— H

H

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man die Stufe A) mit einem Acylierungsmittel der Formel ss

OH O

I II

L-(_)—W-NH—(CH2)n-CH-C-M

darstellt und M für worin W einen Rest der Formel

/~\_ch2-O

X

oder steht, in einem Molverhältnis von 0,8 bis 1,1 des Acylierungs-mittels der Formel VII zur Verbindung der Formel II in wäss-65 rigem Tetrahydrofuran, durchführt.

3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schutzgruppe W einen Rest der Formel

621 558

4

4-

wählt und diesen in Stufe B) durch Hydrieren entfernt.

4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hydrieren mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators in einem aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bestehenden Lösungsmittelsystem durchführt.

5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hydrieren mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium, Platin, Raney-Nickel, Rhodium, Ruthenium oder Nickel in einer Mischung aus Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther oder Propylenglykoldimethyläther, durchführt.

6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hydrieren mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium-auf-Aktivkohle in einem Wasser/ Dioxan-Lösungsmittelsystem vom Volumenverhältnis 1:1 und in Gegenwart einer katalytischen Menge Eisessig durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Verbindung der Formel IV

.nhcr

(IV)

worin R für L-(—)-y-Amino-a-hydroxybutyryl, L-(—)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl oder L-(—)-ó-Amino-a-hydroxy-valeryl steht und R3 die Bedeutungen —OH oder — NH2 besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass man in aufeinanderfolgenden 35

Stufen:

A) die Verbindung der Formel II mit einem entsprechenden Acylierungsmittel der Formel

? OH O

^"~^-ch2-O-C-HH- (CH2 ) n-c—c—0—

(VII a)

oder

^ A-jCH2-0-C-NH- (CH2 ) n-C - c- o -

(VII b)

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt, in einem wässri-gen Tetrahydrofuran- oder wässrigen Dimethylformamid-

Aceton-Lösungsmittelsystem bei ungefähr Raumtemperatur acyliert, wobei die entsprechende Verbindung der Formel HI

621558

HC-OH

i 2n

NH I

3

M einen Rest bedeutet, der ausgewählt ist unter

621 558

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 darstellt, in einem Mol ver- Formel II von 0,5 bis 1,4 in einem Lösungsmittel acyliert, hältnis der Verbindung der Formel VII zur Verbindung der 30 wobei man die entsprechende Verbindung der Formel III

;h2NH-CH3

erhält; und

B) die Schutzgruppe W aus der Verbindung der Formel III entfernt, wobei eine Verbindung der Formel IV gebildet wird.

3 t ch.

iba o

o il oder

QJ

«

4«

mit äquimolaren Mengen N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid und Dicyclohexylcarbodiimid als wasserentziehen-45