DE2512587C3 - 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6' -N-alkylkanamycine A, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel - Google Patents

Description

OH

ί- OH

CH.NHR

in der R Methyl oder Äthyl bedeutet, und deren pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze. 2. Verfahren zur Herstellung der 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryI)-6'-N-alkylkanamycine A nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jo jeweils in an sich bekannter Weise

A) nur die 6'-Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert,

B) das blockierte Kanamycinderivat mit einem ^ aktiven Ester der L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure. deren Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert ist, die von derjenigen verschieden ist, die an der 6'-Aminogruppe von Kanamycin A eingeführt wurde, acyliert,

C) die übrigen Aminogruppen des Acylierungsproduktcs mit der gleichen Aminoschutzgruppe, welche die eingesetzte 4-Amino-2-hydroxybuttersäure aufweist, blockiert,

D) die ö'-Aminoschutzgruppe aus dem Acylierungsprodukt abspaltet,

E) die freie 6'-Aminogruppe des dabei erhaltenen Produktes alkyliert

F) die restlichen Aminoschutzgruppen aus dem Alkylierungsprodukt abspaltet,

die jeweilige Verbindung gemäß Anspruch 1 aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch durch Säulenchromatographie isoliert und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.

3. Pharmazeutische Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der Verbindungen nach Anspruch I oder deren pharmakologisch verträgliche Salze in Kombination mit einem pharmakologisch verträglichen Träger enthalten.

Die Erfindung betrifft l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkyl-kanamycine A und ihre pharmakologisch verträglichen Säurcadditionssalze, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen ^ enthaltende pharmazeutische Mittel.

Kanamycin A ist ein bekanntes Aminoglycosid-Antibiotikum. In den letzten Jahren wurden jedoch einige gegen Kanamycin resistcnte Stämme gefunden und man ist seither bemüht, den Resistenzmechanismus bei ,,„ diesen gegen Kanamycin resistenten Stämmen zu untersuchen.

Es wurde festgestellt, daß einige Stämme von gramnegativen Bakterien, die den R-Faktor tragen, der Familien Staphylococcus aurcus und Psciiclomomis _h^ aeruginosa, die bei Patienten isoliert wurden, gegen Kanamycin resistent sind. Bei der genauen Untersuchung des Resistenzmechanismus wurde gefunden, daß diese resislenten Stämme Phosphotransferasen, welche die 3'-Hydroxylgruppc von Kanamycin phosphorylieren können, eine Nucleotidyltransfcrase, welche die 2"Hydroxylgruppe von Kanamycin nucleotidylieren kann, oder Acetyltransferascn, welche die 6'-Aminogruppen von Kanamycin acetylicren können, bilden, so daß diese Transferasen das Kanamycin inaktivieren. Daraufhin wurden die verschiedensten Kanamycinderivatc hergestellt und getestet, um die Beziehung zwischen ihren Strukturen und ihren antibakteriellen Wirksamkeiten zu untersuchen. Dabei ist es gelungen, neue Kanamycinderivate zu finden, die eine verbesserte antibakterielle Wirksamkeit (Aktivität) selbst gegenüber den verschiedenen Arten von gegen Kanamycin resistenten Stämmen aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-alkylkanamycinc A der allge-

meinen Formel

HO

f— OH

CH₁NHR

H₂NCH₂Ch₂CHCOHN-L OH

NH,

in der R Methyl oder Äthy! bedeutet, und deren pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze.

Beispiele für pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen der oben angegebenen Formel I sind das Hydrochlorid, Sulfat, Phosphat, Acetat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Oxalat, Citrat, Methansulfonat und Äthansulfonat.

Die bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybulyryl)-6'-N-mcthyl-kanamycin A (nachfolgend abgekürzt mit »l-AHB-6'-MKM«) und l-N-(L-4-Amino-2-hydroxvbutyryl)-6'-N-äthylkanamycin A (nachfolgend abgeküizt mit»I-AHB-6'-EKM«) weisen die folgenden Eigenschaften auf:

Die Verbindung l-AHB-6'-MKM liegt i.i Form eines weißen kristallinen Pulvers vor, das sich bei 169 bis 173°C zersetzt, [«];,+78° (c=l, in Wasser). Sie entspricht der empirischen Formel C^H^NiOu, wie ihre Elementaranalyse gezeigt hat. Diese Verbindung ergibt bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Silicagel unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform/Methanol/28%igcm wäßrigem Ammoniak/Wasser (1 :4 :2 : I, bezogen auf das Volumen) als Entwicklungslösungsmitlcl bei Rf = 0.13 einen einzelnen Fleck, der positiv gegenüber der Ninhydrin-Rcaklion ist.

Der Verbindung 1-AHB-6'-EKM liegt in Form eines weißen kristallinen Pulvers vor, das sich bei 184 bis !88⁰C zersetzt, [»] +80° (c=!, in Wasser). Sie entspricht der empirischen Formel C₂₄H₄₇N₅Ou, wie ihre Elementaranalyse zeigte. Diese Verbindung ergibt bei der TLC an Silicagel unter Verwendung der gleichen Lösungsmittelmischung wie oben bei Rf=0,20 einen einzelnen Fleck, der gegenüber der Ninhydrin-Reaktion positiv ist.

Die Strukturen dieser Verbindungen wurden durch NMR-Spektroskopie und durch Papierchromatogra-

jo phie für die Produkte bestätigt, die 40 Minuten lang bei 100⁰C einer Hydrolyse in 6 η HCI unterworfen wurden. Diese beiden Verbindungen sind beide wenig toxisch, ihr LDw-Wert beträgt mehr als 200 mg/kg bei intravenöser Verabreichung an Mäusen. Die Verbindungen

Ii können bei niedrigen Konzentrationen das Wachstum ' von verschiedenen grampositiven und gramnegativen Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin resistenten Stämme hemmen und sie können daher mit Erfolg zur Behandlung der durch diese Bakterkii hervorgerufenen Infektionserkrankungen verwendet werden.

Es wurden die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von 1-AHB-6-MKMund l-AHB-6'-EKM gegenüber verschiedenen Mikroorganismen nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung eines Agar-

4·ϊ Nährmediums bei 37°C bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle

Untersuchte Mikroorganismen	MIC (wg/ml)	I-All U-O-IiKM
	l-/\IIH-6'-MKM	1.56
Staphylococcus auicus !'ΌΛ209Ρ	0,78	3.12
Vlycobiietcrium smcgmatis ATCC6O7	0,39	1.56
l'schcrichiii coli K-12	0,39	1.56
[•schcrichiii coli K=I 2 R5	0,78	3,12
[•schcrichiii coli K-12 MLI629	0,78	6.25
!•schcrichiii coli K-12 MLI630	1,56	3.12
!•schcrichiii coli K-12 MLI4I0	1,56	3.12
[•schcrichiii coli LA29O R55	1,56	1,56
l-schcrichiii coli LA 290 R56	0,78	1.56
!•schcrichiii coli LA29O R64	0.78

Fortsetzung

Untersuchte Mikroorganismen

MiC (,-ig/ml)	I-AIIB-6'EKM
l-AIIB-6'-MKM	1,56
1,56	25
6,25	1,56
0,78	25
6,25	25
6,25	25
3,12	50
12,5	100
50	100
12,5

Escherichia coü W677
Escherichia coli JR66/W677
Klebsieila pneumoniae PCI 602
Klebsielia pneumoniae 22-3038
Pseudomonas aeruginosa A3
Pseudomonns aeruginosa No. 12
Pseudomonas aeruginosa TI-13
Ps:eudomonas aeruginosa GN315
Pseudomonas aeruginosa 99

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gegenüber den ö'-N-Acetyltransferase bildenden Stämmen, wie z.B. Escherichia coli K-12 R5 und Pseudomonas aeruginosa GN315, aktiver (wirksamer) als die in der US-Patentschrift 37 81268 beschriebene verwandte Verbindung 1 -N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryI)kanamycin. Es wurde auch gefunden, daß diese Verbindungen durch eine durch Pseudomonas aeruginosa GN 315 gebildete ö'-N-Acetyltransferase im wesentlichen nicht acetyliert werden. Eine andere verwandte Verbindung, das in der britischen Patentschrift 13 84 221 beschriebene ö'-N-Methylkanamycin, ist nicht in der Lage, das Wachstum der gegen Kanamycin resistenten Stämme, wie z.B. Escherichia coli K-12 ML 1629, K-12 ML 1630 und JR66/W677, Klebsielia pneumoniae 22-3038, Pseudomonas aeruginosa TI-13 und GN315, die 3'-Phosphotransferasen und 2"-NucleotidyItransferasen bilden, zu hemmen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können für die Behandlung von verschiedenen Infektionen, die durch Bakterien einschließlich der gegen Kanamycin resistenten Stämme hervorgerufen werden, oral oder parenteral, beispielsweise durch intraperitoneale, intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden.

Die eiiindungsgemäßen Verbindungen sind höchst wirksam bei der Behandlung von systemischen bakteriellen Infektionen bei Tieren und Menschen, wenn sie parenteral verabreicht werden. Sie eignen sich auch für die Sterilisierung des ivörperinnern (der Eingeweide) durch orale Verabreichung und für die chirurgische Sterilisation durch mechanische Reinigung.

Es wurde gefunden, daß sie bei subkutaner Verabreichung in eimer Dosis von mehr als 2 mg/kg gegenüber bei Mäusen durch Styphylococcus aureus Smith und Klebsielia pneumoniae S-1802 künstlich hervorgerufenen Infektionen wirksam sind.

Für die parenteral Verabreichung können sie in üblichen Dosierungsformen, beispielsweise in Form sterilisierter wäßriger Lösungen und physiologischer Kochsalzlösungen, verwendet werden. Bei der parenteralen Verabreichung an Menschen liegt die tägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 200 bis 2000 mg, die in 2 bis 4 Teildosen pro Tag verabreicht werden kann.

Für die orale Verabreichung können sie in konventionellen, bekannten Dosierungsformen verwendet werden, beispielsweise in Form von Pulvern, Kapseln,

Tabletten, Suppositorien und Sirupen Bei der oralen Verabreichung an Menschen liegt die tägliche Gesamtdosis innerhalb des Bereiches von 500 bis 2500 mg.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen der oben angegebenen Formel I können nach einem einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildenden Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

A) nur die 6'-Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert,

B) das blockierte Kanamycinderivat mit einem aktiven Elster der L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure, deren Aminogruppe mit einer Aminoschutzgruppe blockiert ist, die von derjenigen verschieden ist die an der 6'-Aminogruppe von Kanamycin A eingeführt wurde, acyliert,

C) die übrigen Aminogruppen des Acylierungsproduktes mil der gleichen Aminoschutzgruppe, welche die eingesetzte 4-Amino-2-hydroxy-buttersäure aufweist, blockiert,

O) die ö'-Aminoschutzgruppe aus dem Acylierungs-

produkt abspaltet
E) die freie 6'-Aminogruppe des dabei erhaltenen Produktes alkyliert

F) die restlichen Aminogruppen aus dem Alkylierungsprodukt abspaltet

die jeweilige Verbindung der oben angegebenen Formel I aus dem so erhaltenen Reaktionsgemisch durch Säulenchromatographie isoliert und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.

Geeignete Beispiele für Aminoschutzgruppen, ihre Einführung und Entfernung sind in dem Artikel von Y. Wolman »The Chemistry of Amino Group«, Seiten 669 bis 700 in der Interscience Publishers, 1968, und von Y. W. Barton »Protective Group in Organic Chemistry^, Seiten 43 bis 9i, Plenum Press, 1973, beschrieben.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah.ens wird nur die 6'-Aminogruppe des

bo Kanamycins, die unter den vier vorhandenen Aminogruppen die reaktionsfähigste ist, mit einer bekannten Aminoschutzgruppe blockiert und das a if diese Weise gebildete blockierte Derivat wird dann mit einem Derivat der L-4-Amino-2-hydroxy-buttersäure mit geschützter Aminofc'rjppe oder einem funktionellen Äquivalent davon acyliert unter Bildung des gewünschten 1-N-monoacylierten Derivats und der beiden monoacylierten Derivate als Nebenprodukt. Ohne diese drei

monoacylierten Derivate (Positionsisomere) voneinander zu trennen, werden die restlichen freien Aminogruppen jedes dieser Derivate mit üblichen, bekannten Aminoschutzgruppen blockiert, die jedoch von der zum Blockieren der ö'-Aminogruppe verwendeten verschieden sind. Anschließend wird nur die 6'-Aminoschutzgruppe selektiv aus den Derivaten entfernt, danach wird alkyliert unter Bildung des 6'-N-Alkylierungsproduktes, aus dem die restlichen Aminoschutzgruppen dann entfernt werden. Aus der Reaktionsmischung, welche die so gebildeten Positionsisomeren enthält, können die erfindungsgemäßen l-N-(L-4-Amino-2-hydroxy-butyryl)-6'-N-alkylkanamycine A bequem isoliert werden, beispielsweise unter Anwendung eines chromatographischen Verfahrens, wie es nachfolgend näher beschrieben wird.

Bei den oben in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erwähnten AminoschutzgruDpen kann es sich um solche handeln, wie sie üblicherweise bei der Synthese von Peptidcn verwendet werden, und sie können auf übliche Weise eingeführt werden, obgleich es bevorzugt ist, solche Aminoschutzgruppen zu verwenden, die mit einer guten Reaktionsausbeute gegebenenfalls leicht entfernt werden können.

Beispiele für Aminoschutzgruppen die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind eine Alkyloxycarbonylgruppe, wie Äthoxycarbonyl, tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl; eine Cycloalkyloxycarbonylgruppe. wie Cyclopentyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; und eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie Benzyloxycarbonyl und p-Nitrobenzyloxycarbonyl. Zur Herstellung von blockierten Derivaten in Form einer Schiffschen Base kann eine divalente Aminoschutzgruppe, z. B. Salicylidengruppe, verwendet werden. Vorzugsweise werden 2 oder mehr verschiedene Aminoschutzgruppen verwendet, die selektiv und unabhängig voneinander im Verlaufe von verschiedenen Reaktionen entfernt werden können.

In bezug auf die Schutzgruppe die zum Blockieren der 6'-Aminogruppe von Kanamycin verwendet wird, ist es höchst zweckmäßig, eine tert.-Butoxycarbonylgruppe

Z.U TVi WbttuCll, UlC VUIZ-UgSWCISCgCgCIIUUCl UCI U-rtIIII-

nogruppe reaktiv ist und gegebenenfalls leicht entfernt werden kann. Wenn die 6'-Aminogruppe beispielsweise mit der tert.-Butoxycarbonylgruppe blockiert werden soll, wird das Kanamycin in einer Mischung aus Pyridin, Wasser und Triäthylamin gelöst, dann werden 1 bis 3 Mol tert.-Butoxycarbonylazid unter Rühren zugetropft. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Rückstand wird durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines üblichen Kationenaustauscherharzes gereinigt, wobei man das ö'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin in einer guten Ausbeute erhält, wenn das nicht-umgesetzte Kanamycin für die erneute Verwendung zurückgewonnen werden kann.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die zum Acylieren der l-Aminogruppe des Kanamycins verwendete L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder ein funktionelles Derivat davon zweckmäßig in einer solchen Form vorliegen, daß die 4-Aminogruppe des Acylierungsmittels mit einer geeigneten Schutzgruppe blockiert ist, bei der es sich um irgendeine der oben erwähnten Aminoschutzgruppen handeln kann. Wenn die Hydroxyaminosäure mit o'-N-tert-Butoxycarbonylkanamycin umgesetzt werden soll, wird die Aminoschutzgruppe der Hydroxyaminosäure vorzugsweise mit einer Schutzgruppe, beispielsweise einer Benzyloxycarbonylgruppe, blockiert, die bei der Entfernung der o'-N-tert-Butoxycarbonylgruppe aus dem Butoxycarbonylkanamycin nicht freigesetzt wird. Die Acylierung der I-Aminogruppe von Kanamycin mit dem L-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Rest kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie es üblicherweise bei der Synthese von Amiden angewendet wird. Bei einer bevorzugten Aus-

H) führungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der zuerst das 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin hergestellt wird, kann das Acylierungsmittel vorzugsweise in einer solchen Form verwendet werden, die mit der l-Aminogruppe des ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamy-

i) ein mit hoher Selektivität reagiert, z.B. in Form eines aktiven Esters der L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure. Der aktive Ester kann nach irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Umsetzung der L-4-Amino-hydroxybuttersäure, in welcher die Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbonylgruppe blockiert worden ist, mit N-Hydroxysuccinimid in einem wasserfreien Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran, in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbo-

j) diimid. 0,5 bis 3 Mol des so hergestellten aktiven Esters können mit ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel, wie Dimethoxyäthan, umgesetzt werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren

in erhaltene Acylierungsprodukt besteht überwiegend aus der gewünschten l-N-acylierten Verbindung und zu einem geringeren Anteil aus den 3-N-acylierten und 3"-N-acylierten Verbindungen als Nebenprodukt. Diese Verbindungen brauchen für die Verwendung in der

r. nachfolgenden Stufe nicht voneinander getrennt zu werden, in der alle in dem Acylierungsprodukt vorhandenen restlichen freien Aminogruppen mit geeigneten Aminoschutzgruppen, die bei der Entfernung der 6'-N-tert.-Butoxycarbonylgruppe nicht freigesetzt wer-

iii den, und vorzugsweise mit den gleichen Aminoschutzgruppen, wie sie zum Blockieren der L-4-Amino-2-iiyui uxyuuiici säui c vciwciiuci wutucii siiiu, /.. u. uci Benzyloxycarbonylgruppe, blockiert werden. Die Blokkierung der Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbo-

>> nylgruppe kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden und im allgemeinen wird sie durch Umsetzung mit Benzyloxycarbonylchlorid unter basischen Bedingungen in Wasser oder in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel durchgeführt

in Das auf diese Weise erhaltene Benzyloxycarbonylierungsprodukt kann mit einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure, Essigsäure oder verdünnter Chlorwasserstoffsäure behandelt werden, am nur die 6'-N-tert-ButoxycarbonyIgruppe aus dem Produkt

")) selektiv zu entfernen. Das dabei erhaltene Produkt, in dem die 6'-Aminogruppe nicht mehr blockiert ist, wird einer 6'-Alkylierung unterworfen, wobei das gewünschte aminoblockierte Derivat erhalten wird. Die Alkylierung kann auf irgendeine bekannte, übliche Art

wi und Weise durchgeführt werden. Sie wird vorzugsweise durchgeführt durch Umsetzung der 6'-Aminogruppe mit einem Aldehyd mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen wie die Alkylgruppe, die eingeführt werden soll, d. h. mit Formaldehyd oder Acetaldehyd, um die

"i Aminogruppe in die Form der Schiffschen Base umzuwandeln, woran sich die normale katalytische Reduktion oder die Reduktion mit Natriumborhydrid anschließt um sie in die 6'-N-Alkylaminogruppe zu überführen.

Die Aminoschutzgruppen in dem die 1-N-Acyl-6'-N-alkylgruppe aufweisenden Produkt, welches das letzte Zwischenprodukt in dem erfindungsgemäßen Verfahren darstellt, können auf übliche Weise daraus entfernt werden. Wenn beispielsweise die Aminoschutzgruppe eine Benzyloxycarbonylgruppe ist, kann sie nach einem üblichen Verfahren, beispielsweise durch katal/t.sche Reduktion oder durch Behandlung mit Bromwasserstoff/Essigsäure, leicht entfernt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der die 6'-Aminogruppe mit einem Aldehyd umgesetzt wird unier Bildung einer Schiffschen Base, die dann reduziert wird, um die Alkylierung (unier Bildung einer entsprechenden Alkylaminogruppe) wie oben erwähnt zu bewirken, kann diese Reduktion auf katalytische Weise unter Verwendung von Pd-C oder Pt-C durchgeführt werden, wodurch gleichzeitig die Einführung der Alkylgruppe und die Entfernung der Benzyioxycarbonyigruppe erzielt werden kann.

Das nach der Entfernung der restlichen Aminoschutzgruppen erhaltene Reaktionsprodukt besteht aus der erfindungsgemäßen 6'-N-Alkyl-I -N-acyl-Verbindung und ihren Positionsisomeren einschließlich der 3-N-Acyl- und 3'-N-Acyl-Verbindungen. Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus dem die Isomeren enthaltenden Reaktionsprodukt durch Säulenchromatographie, beispielsweise unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauschharzes, isoliert werden. Das Eluat aus der chromatographischen Säule mit wäßrigem Amr.njniak wird in Fraktionen mit jeweils einem geringen Voluem gesammelt und jede der Fraktionen wird auf ihre antibakterielle Aktivität hin untersucht. Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus den vereinigten Fraktionen gewonnen werden, die gegenüber einem resistenten Stamm eine höhere antibakterielle Aktivität (Wirksamkeit) aufweisen als üblich.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel I

I I .-Il

6'-N-methylkanamycin A
(a) ö'-N-tert.-Butoxycarbonyl-kanamycin A

20 g (41,3 mMol) Kanamycin A wurden in 1600 ml einer Mischung aus Pyridin, Wasser und Triethylamin (Volumenverhältnis 10:10:1) gelöst, der Lösung wurden dann 5,9 g (41,3 mMol) tert.-Butoxycarbonylazid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der dabei erhaltene Feststoff wurde in Wasser gelöst und die wäßrige Lösung wurde durch eine mit einem Kationenaustauscherharz gefüllte 1000-ml-Säule geleitet, das im wesentlichen aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol-Mischpolymerisat bestand, um die Butoxycarbonylierungsprodukte an dem Harz zu adsorbieren. Die Säule wurde dann mit 5000 ml Wasser und 5000 ml 0,05 η wäßrigem Ammoniak gewaschen, dann mit 3000 ml 0,1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die gegenüber der Ninhydrinreaktion und der Rydon-Smith-Reaktion positiven Fraktionen des Eluats und diejenigen Fraktionen, die bei einer Hochspannungs-Papier-Elektrophorese einen einzelnen Reck ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man 103 g 6'-N-tert--Butoxycarbonylkanamycin in Form eines weißen Pulvers mit einem Zersetzungspunkt von 202 bis 203°C in einer Ausbeute von 45,3% erhielt. Durch weiteres Eluieren mit 0,3 η wäßrigem Ammoniak erhielt man 7,3 g nicht-umgesetztes Kanamycin A (Rückgewinnung 36,6%).

(b) 3-N, 3"-N-Di-Benzyloxycarbonyl-

l-N-(L-4-benzyloxycarbonylamido-

2-hydroxybutyryl)kanamycin A

1,754 g (3 mMol) ö'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin A wurden in einer Mischung aus 12,5 ml Wasser und 12,5 ml Dimethoxyäthan gelöst, dann wurde eine Lösung von 1,156 g (3,3 mMol) des N-HydOxysuccinimidesters der L-4-Benzyloxycarbonylamido-2-hydroxybtittersätire in 25 ml Dimethoxyäthan zugegeben.

ι". Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Das dabei erhaltene Kondensationsprodukt wurde ohne weitere Reinigung in einer Mischung aus i 2,5 mi Wasser und i 2,5 mi Aceton gelöst, dazu wurde 1 g (11,9 mMol) Natriumbicarbonat zugegeben. Die Mischung wurde unter Eiskühlung gerührt, während 1,68 g (9,9 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid zugetropft wurden. Danach wurde die Mischung I Stunde lang unter Eiskühlurig und weitere

r, 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der dabei erhaltene weiße Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen unter Bildung von 3,0 g des Benzyloxycarbonylierungsproduktes in Form eines weißen Pulvers. Dieses Produkt wurde in 75 ml 90%iger

üi Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wurde I Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen, um die tert.-Butoxycarbonylgruppe aus dem Produkt zu entfernen. Die Lösung wurde dann eingeengt, dann wurden 50 ml Diäthyläther zugegeben, um die Ausfällung

ι, zu bewirken. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Diäthyläther gewaschen, Ausbeute 2,87 g, in Form eines weißen Pulvers.

(c) l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-_(|| 6'-N-methylkanamycin A

575 mg der in Stufe (b) hergestellten Verbindung

1 ml einer 1 η wäßrigen Natriumhydroxidlösung und 0,25 ml einer 37%igen wäßrigen Formaldehydlösung

ι. zugegeben. 10 Minuten später wurden 222g Natriumborhydrid zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und dann zur Trockne eingeengt. Zu dem Rückstand wurden 7 ml Wasser zugegeben, und der dabei erhaltene weiße Nie-

•ι derschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen, wobei 675 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Letzteres wurde in einer Mischung aus 5 ml Essigsäure, 4 m! Methanol und 1 ml Wasser gelöst. In die Lösung wurde bei Raumtemperatur 4,5 Stunden lang in Gegen-

v. wart eines aus 300 mg 5% Pd auf Kohle bestehenden Katalysators Wasserstoffgas eingeleitet, um die katalytische Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden miteinander vereinigt und

ι" zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wurde in 7 ml Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak auf pH 8,8 bis 9,0 eingestellt und dann durch eine Säule mit 30 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers (in der Ammo-

■>> niumform) laufen gelassen. Die Säule wurde mit 200 ml Wasser und 150 ml OJn wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 150 ml 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 3-ml-Fraktionen gesammelt.

Il

und jede der Fraktionen wurde nach einem üblichen Plattenversuchsverfahren auf ihre antibakterielle Aktivität gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten Stamm Bacillus subtilis PCI 219 und gegenüber dem gegen Kanamycin resistenten Stamm Excherichia coli JR66/W677 getestet. Die Fraktionen (39 ml), die eine höhere antibakterielle Aktivität gegenüber diesen Stämmen aufwiesen, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei man 53 mg l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methylkanamycin in Form eines weißen Pulvers erhielt, Zersetzungspunkt 169 bis 173° C, Ausbeute 15% (bezogen auf 6'-N-tert.-Bu toxycarbony !kanamycin).

Beispiel 2

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N äthylkanamycin A

I₁Ug aer in Beispiel ι nergesienien veromuung wurden in 16 ml Methanol gelöst, dann wurden 1,8 ml einer 2 η wäßrigen Acetaldehydlösung zugegeben. IO Minuten später wurden 444 mg Natriumborhydrid zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingeengt, danach wurden 25 ml Wasser zugegeben. Der dabei erhaltene weiße Niederschlag wurde «!-«filtriert und mit Wasser gewaschen, wobei man 804 mg eines weißen Pulvers erhielt. Das so erhaltene Pulver wurde in einer Mischung aus 6 ml Essigsäure, 4,8 ml Methanol und 1,2 ml Wasser ge löst. In die Lösung wurde 6,5 Stunden lang bei Raum temperatur in Gegenwart von 400 mg 5% Pd auf Kohle als Katalysator Wasserstoffgas eingeleitet, um die katalytische Reduktion zu bewirken. Der Katalysator wurde dann abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat

ίο und das Waschwasser wurden miteinander vereinigt, zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in 12 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak auf pH 9,2 eingestellt und durch eine Säule mit 80 ml eines schwach sauren Kationenaustauschers

r> (Ammonium-Form) laufen gelassen. Das Harz in der Säule wurde mit 435 ml Wasser und 384 ml 0,3 η wäßrigem Ammoniak gewaschen und dann mit 384 ml 03 ti wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 8-ml-Fraktionen gesammelt und auf die gleiche Weise

-'<> wie in Beispiel I (c) getestet. Die aktiven Fraktionen (56 ml) wurden miteinander vereinigt und /ur Trockne eingedampft, wobei man 92mg l-N(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-äthylkanamycin A in Form eines weißen Pulvers erhielt, Zersetzungspunkt 184 bis

2S I88°C, Ausbeute 13% (bezogen auf 6'-N-tert.-Butoxycarbonylkanamycin).

Claims (1)

Patentansprüche:

1. l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-aIkyIkanamycine A, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

HO

H,N

HiNCH₁CH₁CHCOHN