BR112014015156A2 - análogos de insulina à base de ctp, seus métodos de produção e uso no tratamento de hiperglicemia, bem como sequência de ácido nucleico e célula hospedeira - Google Patents

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Abstract

análogos de insulina à base de ctp, seus método de produção e uso no tratamento de hiperglicemia, bem como sequência de ácido nucleico e célula hospedeira a presente invenção refere-se a análogo de insulina de cadeia única compreendendo cadeias a e b e uma porção de ligação, em que a dita porção de ligação covalentemente liga a terminação carbóxi da cadeia b à terminação amino da cadeia a para formar uma cadeia contígua de aminoácido, em que a dita porção de ligação compreende um peptídeo ctp, a sequência de ácido nucléico que codifica o análogo de insulina, a célula hospedeira, bem como a método para produzir um análogo de insulina hiperglicosilado e ao uso de um análogo de insulina no tratamento de hiperglicemia.

Description

“ANÁLOGOS DE INSULINA À BASE DE CTP, SEUS MÉTODO DE PRODUÇÃO E USO NO TRATAMENTO DE HIPERGLICEMIA, BEM COMO SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO E CÉLULA HOSPEDEIRA” REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS
[001]O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/578.052 depositado em 20 de dezembro de 2011, estando a revelação deste aqui expressamente incorporada em sua totalidade a título de referência.
FUNDAMENTOS
[002]A insulina é uma terapia comprovada para o tratamento de diabetes juvenil e diabetes adulta em estágio tardio. O peptídeo é biossintetizado como um precursor linear maior de baixa potência (aproximadamente 2% a 9% de insulina nativa), denominada como pró-insulina. A pró-insulina é proteoliticamente convertida em insulina pela remoção seletiva de um peptídeo de conexão com 35 resíduos (peptídeo C). O heteroduplex resultante formado por ligações de dissulfeto entre “cadeia A” (SEQ ID NO: 1) e “cadeia B” (SEQ ID NO: 2) de insulina, representando um total de 51 aminoácidos, tem alta potência para o receptor de insulina (faixa nM). A insulina nativa tem uma afinidade seletiva aproximadamente cem vezes maior pelo receptor de insulina em relação ao receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 relacionado, mas demonstra pouca seletividade para as duas isoformas de receptor de insulina diferentes, denominadas como A e B.
[003]Os fatores de crescimento semelhante à insulina 1 e 2 são hormônios de peptídeo linear de cadeia única altamente homólogos em suas sequências de cadeia A e B, compartilhando aproximadamente cinquenta por cento de homologia com a insulina nativa. As cadeias A e B de IGF são ligadas por um “peptídeo O”, em que os peptídeos C dos dois IGFs diferem em tamanho e sequência de aminoácido, sendo que o primeiro tem doze e o segundo oito aminoácidos de comprimento. IGF-1 humano é um peptídeo básico com 70 aa tendo a sequência de proteína mostrada em SEQ ID NO: 3, e tem uma homologia de 43% à pró-insulina (Rinderknecht et al. (1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776). IGF-2 humano é um peptídeo básico com 67 aminoácidos tendo a sequência de proteína mostrada em SEQ ID NO: 4. Os IGFs demonstram uma atividade consideravelmente menor na isoforma de receptor B de insulina do que na isoforma de receptor A.
[004]Os requerentes identificaram previamente análogos de peptídeos de insulina à base de IGF-1, (em que o dipeptídeo GIn-Phe nativo da cadeia B é substituído por Tyr-Leu) que exibem uma alta atividade no receptor de insulina (vide PCT/US2009/068713, estando a revelação deste aqui incorporada). Esses análogos (referidos no presente documento como peptídeos análogos IGF YL) são mais prontamente sintetizados do que a insulina e permitem o desenvolvimento de análogos co-agonistas para insulina e receptores IGF-1, e análogos específicos de receptor de insulina seletivos. Ademais, esses análogos de insulina também podem ser formulados como agonistas de insulina de cadeia única de acordo com a presente revelação.
[005]A insulina é uma terapia comprovada para o tratamento de diabetes juvenil e de diabetes adulta em estágio tardio, porém, consiste em um dos índices terapêuticos relativamente limitados. A terapia de insulina ideal é uma formulação de insulina capaz de fornecer uma ação de tempo de uma vez ao dia (qd). A natureza usa glicosilação para inibir a depuração renal de uma série de proteínas nativas, e, conforme revelado no presente documento, fica estabelecido que os análogos de insulina podem ser glicosilados durante a biossíntese. Mais particularmente, um aspecto da presente revelação descreve análogos de insulina que foram modificados para incluir uma sequência de peptídeo que seja propensa à hiperglicosilação ligada a O quando a proteína for expressa em um sistema de expressão celular eucariótica.
[0O6]Além disso, esses análogos de agonistas de insuliha podem ser adicionalmente modificados para produzir análogos tendo um índice terapêutico aperfeiçoado (por exemplo, através do uso de química de pró-fármacos); uma duração de ação estendida (por exemplo, pela ligação de proteínas de plasma, como albumina, ou outras modificações, incluindo peguilação e acilação); e orientação tecidual preferencial (por exemplo, através do uso de modificação química com colesterol ou substituintes tipo vitamina). A preparação de análogos de insulina de cadeia única usando uma sequência ligante peptídica, incluindo, por exemplo, uma sequência ligante peptídica que compreende sítios de glicosilação, também proporciona uma localização estrutural inovadora para onde muitas das modificações químicas podem ser implantadas com sucesso. O uso primário de tais agonistas de insulina otimizados seria no tratamento de diabetes dependente de insulina.
SUMÁRIO
[007]Conforme revelado no presente documento, proporcionam-se análogos de insulina que tenham sido modificados para compreender uma sequência peptídica que seja glicosilada por sistemas de expressão celular eucariótica. Em uma modalidade, os análogos de insulina são modificados para compreender uma sequência — peptídica — denominada como peptídeo Cterminall (CTP: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQR; SEQ ID NO: 64), que seja propensa à hiperglicosilação ligada a O quando a proteína for expressa em um sistema de expressão celular eucariótica. O peptídeo CTP pode ser covalentemente ligado à terminação N e/ou à terminação carbóxi da cadeia B de um análogo de insulina com duas cadeias sem objeção à atividade in vitro inerente do análogo de insulina. O fato mais surpreendente é que o peptídeo CTP também pode ser usado para conectar as cadeias B e A de insulina para formar um análogo de insulina de cadeia única enquanto ainda mantém uma alta potência in vitro em uma maneira na qual o peptídeo C pró-insulina nativo não pode manter.
[008]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina que compreende uma cadeia A e uma cadeia B e um peptídeo CTP. Em uma modalidade, a cadeia A compreende a sequência GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1) e a cadeia B compreende a sequência FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 96). Mais particularmente, as cadeias A e B são ligadas entre si através de ligações de dissulfeto e o peptídeo CTP é covalentemente ligado à terminação amino e/ou carbóxi da cadeia B. Em uma modalidade, o peptídeo CTP compreende a sequência SSSSXscAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs: (SEQ ID NO: 66), em que Xso e Xs1i são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina, Em uma modalidade, prepara-se um análogo de insulina de cadeia única em que a terminação carbóxi da cadeia B é ligada à terminação amino da cadeia A através de um peptídeo CTP, e em uma modalidade adicional, o análogo de insulina de cadeia única compreende opcionalmente um peptídeo CTP ligado à terminação amino da cadeia B. Em outra modalidade, proporciona-se um análogo de insulina como uma construção de duas cadeias com o peptídeo CTP covalentemente ligado à terminação C da cadeia B opcionalmente com um segundo CTP ligado à terminação amino da cadeia B. Quando duas ou mais sequências que compreendem um peptídeo CTP forem ligadas a um análogo de insulina revelado no presente documento, a sequência que compreende os peptídeos CTP pode ser igual ou diferente. A caracterização in vitro e in vivo mostra que os análogos de insulina modificados por CTP têm alta potência na ausência de glicosilação. Portanto, a modificação de análogo de insulina ligando-se um peptídeo CTP proporciona um mecanismo para estender a ação de insulina que se baseia em glicosilação, uma abordagem natural a proteínas de duração mais longa.
[009]De modo ainda mais surpreendente, os requerentes constataram que quando um análogo de insulina de cadeia única for preparado usando um peptídeo como a porção de ligação para unir as cadeias A e B, a sequência exata do peptídeo CTP não precisa ser mantida. De modo correspondente, em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende uma cadeia A, uma cadeia B e uma porção de ligação em que a porção de ligação compreende um peptídeo com pelo menos 18 aminoácidos, (incluindo, por exemplo, peptídeos de 18 a 158, 29 a 87 ou 29 a 58 aminoácidos) que liga covalentemente a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A para formar uma cadeia de aminoácido contígua, com a condição de que a porção de ligação não compreenda uma sequência de 18 aminoácidos que seja idêntica a um fragmento de sequência de 18 aminoácidos de SEQ ID NO: 53 diretamente ligado à terminação carbóxi da cadeia B. Em uma modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que pelo menos 58% dos aminoácidos que compreendem a dita sequência contígua com 29 aminoácidos são serina ou prolina, Em outra modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que a sequência contígua com 29 aminoácidos tem mais de 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 92, ou 95% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 64, com a condição de que a porção de ligação não compreenda uma sequência com 18 aminoácidos que seja idêntica a um fragmento de sequência com 18 aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Em outra modalidade, a porção de ligação compreende a sequência de SEQ ID NO:
66. Em uma modalidade, a cadeia A compreende a sequência GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1) e a cadeia B compreende a sequência FVYNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 96).
[010]Em uma modalidade adicional, abrangem-se, também, pela presente invenção, sequências de ácido nucléico que codificam os análogos de insulina revelados no presente documento, bem como células procarióticas e eucarióticas que compreendem tais sequências de ácido nucléico. De acordo com uma modalidade, utilizam-se células hospedeiras eucarióticas que compreendem sequências de ácido nucléico que codificam análogos de insulina modificados revelados no presente documento para produzir análogos de insulina hiperglicosilados.
[011]Os agonistas de insulina revelados no presente documento podem compreender as sequências de cadeia B e A de insulina ou qualquer um dos análogos conhecidos ou derivados destes que exibam uma atividade de agonista de insulina quando ligados entre si em um heteroduplex. Conforme revelado no presente documento, tais peptídeos de cadeia A e cadeia B podem ser ligados entre si pelo peptídeo CTP, ou um peptídeo derivado deste, para formar um agonista de insulina de cadeia única, ou o peptídeo CTP pode ser ligado à terminação amino ou à terminação carbóxi da cadeia A ou B de um heteroduplex de insulina de cadeia dupla. De acordo com uma modalidade, a cadeia B compreende a sequência R22- XasLCGX29X30L VX33X3al Xasl VOGX41Xa2GFXa5 (SEQ ID NO: 16), e a cadeia À compreende a sequência GIVXaXs CCO XaXaX1o0C X12LX1a4X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18), em que Xa É ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico Xz é histidina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X1o é isoleucina ou serina; Xi12 é serina ou ácido aspártico; X1a é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; Xi5 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; Xi7 é ácido glutâmico, ácido aspártico, asparagina, lisina, ornitina ou glutamina; X1is é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; Xa5 é histidina ou treonina; X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico e ácido glutâmico; X34 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; X36 é tirosina; Xa41 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ornitina, lisina e arginina; Xas é tirosina; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma amina N-terminal; e R13 é COOH ou CONHz2. Em uma modalidade, Xs, X25 e X3o são histidina.
[012] Abrangem-se derivados adicionais dos agonistas de insulina pela presente revelação incluindo modificações que aperfeiçoam a solubilidade do agonista de insulina subjacente. Em uma modalidade, a solubilidade do peptídeo de agonista de insulina é acentuada pela ligação covalente de uma porção hidrofílica ao peptídeo. Em uma modalidade, a porção hidrofílica é ligada ao aminoácido N-terminal da cadeia B ou à cadeia lateral de um aminoácido localizado na extremidade terminal da cadeia B (por exemplo, uma lisina presente em qualquer uma das posições B26- 30) ou à cadeia lateral de qualquer aminoácido que compreenda a porção de ligação que liga a cadeia B à cadeia A em um análogo de insulina de cadeia única. Em uma modalidade, a porção hidrofílica é albumina, incluindo, por exemplo, albuminas, como albumina sérica humana (HSA) e albumina humana recombinante (rHA). Em uma modalidade, a porção hidrofílica é uma cadeia de polietileno glicol (PEG), tendo um peso molecular selecionado a partir da faixa de cerca de 500 a cerca de 40.000 Daltons. Em uma modalidade, a cadeia de polietileno glicol tem um peso molecular selecionado a partir da faixa de cerca de 500 a 5.000 Daltons. Em outra modalidade, a cadeia de polietileno glicol tem um peso molecular de cerca de 10.000 a cerca de
20.000 Daltons.
[013]A acilação ou a alquilação podem aumentar a meia-vida de peptídeos de análogo de insulina, e dos derivados de pró-fármaco destes, em circulação. À acilação ou a alquilação podem retardar, vantajosamente, o princípio da ação e/ou estender a duração da ação nos receptores de insulina. Os análogos de insulina revelados no presente documento podem ser adicionalmente modificados por acilação ou alquilação na mesma posição de aminoácido onde uma porção hidrofílica é ligada, ou em uma posição de aminoácido diferente.
[014]Abrangem-se, também, pela presente revelação, composições farmacêuticas que compreendem o análogo de insulina, e um veículo farmaceuticamente aceitável. De acordo com uma modalidade, proporciona-se uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos análogos de insulina revelados no presente documento, ou derivados destes, de preferência, em um nível de pureza de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Essas composições podem conter um peptídeo de agonista de insulina conforme revelado no presente documento em uma concentração de pelo menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 ma/ml, 25 mg/ml ou maior. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas compreendem soluções aquosas que são esterilizadas e opcionalmente armazenadas em vários recipientes de embalagem. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um pó liofiizado. As composições farmacêuticas podem ser adicionalmente embaladas como parte de um kit que inclui um dispositivo descartável para administrar a composição a um paciente. Os recipientes ou kits podem ser etiquetados para armazenamento em temperatura ambiente ou em temperatura refrigerada.
[015]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um método para produzir um análogo de insulina hiperglicosilado. Em uma modalidade, o método compreende proporcionar uma célula hospedeira eucariótica (por exemplo, de levedura, de camundongo ou de ser humano), que compreende um gene que codifica um análogo de insulina que compreende um peptídeo CTP, e culturar a célula sob condições que permitam a expressão do gene de análogo de insulina. Em uma modalidade, a célula hospedeira expressa enzimas de glicosilação humana de modo que as proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas na célula hospedeira exibam uma glicosilação protéica idêntica àquela de células humanas (vide as Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 2004/0018590 e 2002/0137134, estando as revelações destas aqui incorporadas a título de referência).
[016]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um método aperfeiçoado para regular os níveis de glicose sanguínea em pacientes dependentes de insulina. O método compreende as etapas de administrar a um paciente um peptídeo de agonista de insulina revelado no presente documento, ou um sal farmacêutico ou outro derivado deste, em uma quantidade terapeuticamente eficaz para o controle da diabetes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[017]A Figura 1 é uma visão geral esquemática da estratégia sintética de duas etapas para preparar insulina humana. Os detalhes do procedimento são fornecidos no Exemplo 1.
[018]A Figura 2 é um gráfico que compara a ligação específica ao receptor de insulina de insulina humana sintética em relação à insulina nativa purificada. À insulina sintética foi produzida pela abordagem detalhada na Figura 1 onde a ligação A7-B7 é o primeiro dissulfeto formado. Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, as duas moléculas têm atividades de ligação similares.
[019]A Figura 3 é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o análogo de insulina A19 (Insulina(p-NH2-F)'9). Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, as duas moléculas têm atividades de ligação similares.
[020]A Figura 4 é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o análogo IGF1(Y8'8L8!7). Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, as duas moléculas têm atividades de ligação similares.
[021]A Figura 5 é um alinhamento da pró-insulina humana (cadeia A, SEQ ID NO: 1; cadeia B, SEQ ID NO: 2 e cadeia C, SEQ ID NO: 53) e sequências de aminoácidos de fatores de crescimento tipo insulina | e 1 (IGF |; SEQID NO: 3 e IGF Il; SEQ ID NO: 4). O alinhamento demonstra que esses três peptídeos compartilham um alto nível de identidade de sequência (* indica um espaço sem nenhum aminoácido correspondente e um travessão (-) indica o aminoácido idêntico conforme presente em insulina).
[022]A Figura 6 é um desenho esquemático do esquema sintético usado para preparar o derivado de pró-fármacos IGF1(Y8'8LB!7)(p-NH2-F)A'º9, O derivado específico é p-NH2-F onde a amina aromática é acilada com o dipeptídeo Aib-Ala, que serve como um controle negativo visto que esse dipeptídeo não cliva sob condições fisiológicas.
[023]A Figura 7 é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de IGF1(Y8'SLB!7)(p-NH2-F)A!º e a forma estendida de dipeptídeo de IGF1(Y8'!8LB!7)(p-NH2-F)A!º, A síntese deste pró-fármaco é mostrada na Figura 6 onde o dipeptídeo AiBAla é ligado na posição A19 (isto é, IGF1(Y8'SLB!7)(AIBAla). O dipeptídeo não cliva prontamente sob condições fisiológicas e, portanto, a atividade é extremamente baixa e demonstra a capacidade de acilação neste sítio com dipeptídeo para silenciar a bioatividade. Isto constitui um dos dois ingredientes centrais de um pró-fármaco, baixa atividade na forma de pró-fármaco.
[024]As Figuras 8A-8C proporcionam a atividade de um dímero preparado de acordo com a presente revelação. A Figura 8A mostra a estrutura de um dímero de cadeia única IGF-1 que compreende dois peptídeos análogos IGF8!68!7 de cadeia única (IGF-1 cadeia B [CºHSY'6L17022P28R?9]- cadeia A [0º!415N'1821]; SEQ ID NO: 54) ligados entre si por uma ligação de dissulfeto entre as cadeias laterais da terminação amino das cadeias B. Os dissulfetos de insulina nativa (Aº-A'!, A7-B/7, A?º-B'!º) não são mostrados, mas estão residente sob a forma de dímero. A forma de cadeia única do dímero de dissulfeto pode ser convertida em uma forma de cadeia dupla por digestão proteolítica seletiva das duas ligações Arg-Gly (B29 A1) conforme denotado pelas setas. A Figura 8B é um gráfico que demonstra a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina, um dímero de peptídeo análogo IGF8'68!7 de cadeia única e um dímero de peptídeo análogo IGF8!68!7 de cadeia dupla. A Figura 8C é um gráfico que demonstra a atividade relativa de insulina, e um dímero de peptídeo análogo IGF8'!68!7 de cadeia dupla para induzir a fosforilação de receptor de insulina.
[025]As Figuras 9A-9C mostram a degradação de uma forma de pró-fármaco de um peptídeo de cadeia A IGF: (Aib-Pro em (pNH2-F)'!* de IGF1A(Ala)$7112ºamida. O dipeptídeo foi incubado em PBS, pH 7,4 a 37ºC durante períodos predeterminados de tempo. Coletaram-se alíquotas em 20 minutos (Figura 9A), 81 minutos (Figura 9B) e 120 minutos (Figura 9C) após o início da incubação, foram arrefecidas com TFA a 0,1% e testadas por HPLC analítica. Picos a (IGF1A(Ala)$:711-20(pNH2- F)'amida) e b (IGF1A(Ala)6:7:112º(Aib-Pro-pbNH-F)'ºamida) foram identificados com LC-MS e quantificados por integração da área de pico. Os dados indicam a conversão não-enzimática espontânea de IGF1A(Ala)$-7:11-20(Aib-Pro-pbNH-F)!ºamida em IGF1A(Ala)$:/1120(DNH2-F)' amida com o passar do tempo.
[026]As Figura 10A e 10B são gráficos que descrevem a atividade in vitro do pró- fármaco Aib,dPro-IGFIYL (dipeptídeo ligado através de A19 4-aminoPhe). A Figura 10A é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa (medida em 1 hora a 4ºC) e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (Aib,dPro- IGFIYL) com o passar do tempo (0 horas, 2,5 horas e 10,6 horas) incubado em PBS. A Figura 10B é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (Aib,dPro-IGFIYL) com o passar do tempo (0 horas, 1,5 hora e 24,8 horas) incubado em 20% de plasma/PBS a 37ºC. Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, atividade aumentada é recuperada a partir da amostra de derivado de pró-fármaco A19 IGF à medida que a forma de pró-fármaco é convertida em peptídeo IGF1 YL ativo.
[027]As Figura 11A e 11B são gráficos que descrevem a atividade in vitro do pró- fármaco dK,(N-isobutilG)-IGF1YL (dipeptídeo ligado através de 4-aminoPhe A19). A Figura 11A é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (IGF1YL: dK,(N-isobutilG) com o passar do tempo (0 hora, 5 horas e 52 horas) incubado em PBS. A Figura 11B é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (IGF1IYL: dK,(N-isobutilG) com o passar do tempo (0 hora, 3,6 horas e 24,8 horas) incubado em 20% de plasma/PBS a 37ºC. Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, a atividade aumentada é recuperada a partir da amostra de derivado de pró-fármaco A19 IGF à medida que a forma de pró-fármaco é convertida em peptídeo IGF1YL ativo.
[028]As Figuras 12A e 12B são gráficos que descrevem a atividade in vitro do pró-fármaco dK(e-acetil),Sar)-IGFIYL (dipeptídeo ligado através do 4-aminoPhe A19). A Figura 12A é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa (medida em 1 hora a 4ºC) e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (IGF1IYL: dK(e-acetil), Sar) com o passar do tempo (0 horas, 7,2 horas e 91,6 horas) incubado em PBS. A Figura 12B é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (IGF1YL: dK(e-acetil), Sar) com o passar do tempo (0 hora, 9 horas e 95 horas) incubado em 20% de plasma/PBS a 37ºC. Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, a atividade aumentada é recuperada a partir da amostra de derivado de pró-fármaco A19 IGF à medida que a forma de pró-fármaco é convertida em peptídeo IGF1YL ativo.
[029]A Figura 13 é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de heteroduplex de insulina nativa e o heteroduplex de cadeia A e BIGF-1 e um análogo IGF-1 de cadeia única em que a terminação carbóxi da cadeia B é diretamente ligada à terminação N da cadeia A IGF-1.
[030]A Figura 14 é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de heteroduplex de insulina nativa, IGF-1, heteroduplex delta IGF-1 e um análogo de cadeia única delta IGF-1 em que a terminação carbóxi da cadeia B é ligada à terminação N da cadeia A IGF-1 através de um ligante peptídico que consiste na sequência GYGSSSOR (SEQ ID NO: 35), em que o análogo delta IGF-1 compreende a sequência IGF-1 nativa com as seguintes substituições de aminoácido: HA8, OA9, OA14, OA15, QA17, NA21, YB16, LB17, OB22.
[031]A Figura 15 é um gráfico de barras que descreve a atividade de ligação in vitro relativa de análogos de insulina de cadeia única no receptor IGF-1 ou os receptores de insulina de subtipo A ou B em que a terminação carbóxi da cadeia B de insulina nativa é ligada à terminação amino da cadeia A de insulina nativa através do peptídeo IGF-1 C ou vários derivados do peptídeo IGF-1 C. Na nomenclatura de análogo de insulina BºC'Aº, as designações Bº E Aº se referem a sequências de insulina das cadeias A e B, enquanto C'* designa o peptídeo IGF-1 C. Conforme mostrado pelos dados, um análogo de insulina de cadeia única que liga a cadeia B à cadeia A através do peptídeo IGF- 1 C é um agonista de insulina potente. Adicionalmente, as modificações de posição 2 (por exemplo, substituindo alanina por tirosina nativa), ou, alternativamente, excluindo os últimos quatro aminoácidos do peptídeo de ligação IGF-1 C, gera um análogo de insulina de cadeia única insulina- seletivo de alta potência.
[032]A Figura 16 é um gráfico de barras que descreve a atividade de ligação in vitro relativa de análogos de insulina de cadeia única da fórmula BºC'Aº no receptor IGF-1 ou nos receptores de insulina de subtipo A ou B em que a sequência nativa do peptídeo de ligação IGF-1 C foi modificada pelas substituições de aminoácido indicadas na posição 1, 2, 3, 4 ou 8. Na nomenclatura de análogo de insulina BºC'Aº, as designações Bº e Aº se referem às sequências de insulina das cadeias A e B, enquanto C'* designa o peptídeo IGF-1 C.
[033]A Figura 17 é uma visão geral esquemática da biossíntese de análogos de insulina de cadeia única em E. coli e purificação sob condições de desnaturação. Detalhes do procedimento são fornecidos no Exemplo 15.
[034]As Figuras 18A-18C são gráficos que demonstram a atividade de análogos de insulha de cadeia única DP20 (GEEEEEKGPEHLCGAHLVDALYLVCG DRGFYSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVDECCHRSCDLRRLENYCN; SEQ ID NO: 68) e DP19 (MGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGEEEEE
KGPEHLCGAHLVDALYLVCGDRGFYGYGSSSRRAPQTGIVDECCHRSCDLRRLEN YCN; SEQ ID NO: 67) nos receptores de subtipo A e B de insulina e no receptor IGF. As Figuras 18A e 18B são gráficos que demonstram a atividade de fosforilação in vitro de análogos de insulina de cadeia única no receptor de subtipo A de insulina (Figura 18A) e no receptor de subtipo B de insulina (Figura 18B). Os análogos de insulina de cadeia única testados compreendem um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação (DP20; e), um peptídeo CTP (SEQ ID NO: 64) é usado como o peptídeo de ligação, em que o análogo de cadeia única é clivado na lisina de CTP para produzir uma insulina de cadeia dupla (DP20 Lys C; à); um peptídeo CTP (SEQ ID NO: 64) localizado na terminação N e usado como o peptídeo de ligação (DP22; V), em que o análogo de cadeia única é clivado na lisina de CTP para produzir uma insulina de cadeia dupla (DP20 Lys C; 0); em relação a uma insulina nativa de cadeia dupla (=). As sequências de comprimento completo de DP 19 (CTP-GEsK- cadeia B-peptídeo C'!-cadeia A) e DP20 (GEsK-cadeia B-CTP(K)-cadeia A são fornecidas como SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68, respectivamente. A Figura 18C demonstra a atividade de fosforilação in vitro surpreendentemente baixa dos análogos de cadeia única no receptor IGF (menor que a insulina nativa), em que a clivagem dos análogos de cadeia única em análogos de cadeia dupla aumenta substancialmente sua atividade no receptor IGF. Portanto, o análogo de cadeia única (DP20) tem uma seletividade maior para o receptor de insulina comparado ao receptor IGF em relação à versão de cadeia dupla de DP20.
[035]As Figuras 19A-19C são gráficos que demonstram a titulação de dose de insulina comparativa em camundongos normais de DP19 (Figura 19B) e DP20
(Figura 19C) em relação à insulina nativa (Figura 19A). A insulina e análogos de insulina foram administrados em 27 ou 90 nmol/kg.
[036]As Figuras 20A e 20B são gráficos que demonstram a atividade de fosforilação in vitro de análogos de insulina de cadeia única que compreendem um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação (DP20; e); um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação em que as serinas foram substituídas por alanina (DP20 S2A (SEQ ID NO: 80); V); um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação em que o teor de aminoácido permanece igual, mas a sequência foi aleatorizadas (DP20R CTP; 0, em que, o peptídeo de ligação é PPRPPQSASPPDLSPLSGTPSRPSLS; SEQ ID NO: 69); e o peptídeo C de pró-insulina nativa como o peptídeo de ligação (DP20 Cº (SEQ ID NO: 76); à), em relação a um peptídeo de insulina nativa de cadeia dupla (m) e IGF nativo (O). A atividade de cada peptídeo foi testada no receptor de subtipo A de insulina e no receptor de subtipo B de insulina. Conforme indicado pelos dados, os análogos de insulina de cadeia única que usam o peptídeo CTP ou os derivados modificados de tal sequência produzem agonistas de insulina potentes em relação à pró-insulina nativa ou peptídeos IGF em ambos os subtipos de receptor de insulina.
[037]A Figura 21 é um gráfico que demonstra a atividade de fosforilação in vitro de análogos de insulina de cadeia única no receptor de subtipo A de insulina. A atividade dos análogos de cadeia única que compreendem um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação, em que as prolinas foram substituídas por alanina (DP20 P em A (SEQ ID NO: 70); e); o peptídeo C de pró-insulina nativa é usado como o peptídeo de ligação (DP20 Cº (SEQ ID NO: 71); à); o peptídeo IGF-1 C nativo é usado como o peptídeo de ligação (isto é, 010: (SEQ ID NO: 72); 0); um peptídeo CTP (SEQ ID NO: 64) é usado como o peptídeo de ligação, em que o análogo de cadeia única é clivado na lisina de CTP para produzir uma insulina de cadeia dupla (DP20 Lys C; O); em relação a uma insulina nativa de cadeia dupla (=) e IGF nativo (V). Conforme indicado pelos dados, os análogos de insulina de cadeia única que usam o peptídeo CTP em que os resíduos de prolina foram substituídos por alanina retêm atividade como agonistas de insulina em relação aos pró-peptídeos de insulina nativa no receptor de insulina. A clivagem do análogo de cadeia única DP20 com Lys C produz uma insulina de cadeia dupla portando um peptídeo CTP na terminação carbóxi de cadeia B que tem uma potência similar à insulina nativa.
[038]As Figuras 22A e 22B são gráficos que demonstram a atividade de fosforilação in vitro de análogos de insulina de cadeia única que compreendem um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação. A Figura 22A é um gráfico que compara a atividade de análogos de cadeia única que compreendem um peptídeo CTP ligado ao peptídeo C de pró-insulina nativa como o peptídeo de ligação (DP20 CTPCº (SEQ ID NO: 73); e); um peptídeo C de pró-insulina nativa ligado a um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação (DP20 CºCTP (SEQ ID NO: 74); V) em relação a um peptídeo de insulina nativa de cadeia dupla (m)e IGF nativo (O). A Figura 22B é um gráfico que compara os análogos de cadeia única que compreendem um peptídeo C de pró-insulina nativa ligado a um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação (DP20 CºCTP (SEQ ID NO: 74); e); dois peptídeos CTP ligados extremidade à extremidade como o peptídeo de ligação (DP20 2CTP (SEQ ID NO: 75); V) em relação a um peptídeo de insulina nativa de cadeia dupla (m)e IGF nativo (O).
[039]A Figura 23 é um gráfico que demonstra a atividade de fosforilação in vitro no receptor de subtipo A de insulina de análogos de insulina de cadeia única que compreendem um peptídeo C de pró-insulina nativa truncado como o peptídeo de ligação. Apresenta-se a atividade de análogos de insulina de cadeia única que compreendem o peptídeo C de pró-insulina nativa tendo os primeiros 6 aminoácidos removidos (DP20 Cº (desC1-6) (SEQ ID NO: 76); e), aminoácidos 15-21 removidos (DP20 Cº (desC15-21) (SEQ ID NO: 77); à), ou aminoácidos 27-33 removidos (DP20 Cº (desC27-33) (SEQ ID NO: 78); V) em relação a um peptídeo de insulina nativa de cadeia dupla (=) e um análogo de insulina tendo CTP como o peptídeo de ligação (0) (DP20).
[040]A Figura 24 é um gráfico que demonstra a atividade de fosforilação in vitro nos receptores de subtipo A e B de insulina (IRA e IRB) comparando a atividade de um derivado de DP20 (DP25M; modificado para que seja mais semelhante à insulina) à insulina e DP20.
[041]As Figuras 25A-25D são gráficos que mostram os resultados de testes de tolerância à insulina comparativos conduzidos em camundongos comparando a capacidade de insulina humana em reduzir e sustentar uma baixa concentração de glicose no sangue em relação a três análogos de insulina acilados diferentes. Os compostos foram testados em duas concentrações diferentes (27 nmol/kg e 90 nmol/kg). As insulinas aciladas incluem MIU-41, MIU-SB6 e MIU-37. MIU-41 [B'(H5,H10,Y16,L17)25a : A'(H8,rEC16-K14,N18,N21)], é um análogo de insulina de cadeia dupla tendo uma acilação C16 através de um ligante de ácido gama- glutâmico ligado a um resíduo de lisina localizado na posição A14. MIU-36 [B'(C16- Ko,H5,H10,Y16,L17)25a : A'(N18,N21)], é um análogo de insulina de cadeia dupla tendo uma acilação C16 ligada à terminação N da cadeia B). MIU-S7 [B'(H5,H10,Y16,L17,C16rE-K22)25a : A'(NI8,N21)], é um análogo de insulina de cadeia dupla tendo uma acilação C16 através de um ligante de ácido gama- glutâmico ligado a um resíduo de lisina localizado na posição B22.
[042]As Figuras 26A-26D mostram os resultados de testes de tolerância à insulina comparativos conduzidos em camundongos comparando a atividade do análogo de insulina acilado comercialmente disponível (Detemir) em relação ao análogo de insulina de cadeia dupla acilado MIU-55. MIU-55 [B'(H5,10,Y16,L17,C16rE-K22)25a : A'(N18,N21)] tem os 5 aminoácidos C-terminais da cadeia B excluídos e termina como uma amida de cadeia B. É acilado com um ácido graxo C16 através de um ligante gama Glu no grupo e-amino de Lys B22. Os resultados indicam que MIU-55 é cerca de um terço tão potente quanto Detemir (vide as Figuras 26A e 26B). Os dados também indicam que as formas aciladas de insulina têm ação mais longa que as formas não-aciladas e que MIU-55, embora menos potente que Detemir, exibe um perfil similar como Detemir. As Figuras 26C e 26D fornecem dados em valores AUC de glicose no sangue após a administração dos análogos listados.
[043]As Figuras 27A-27D mostram os resultados de testes de tolerância à insulina comparativos conduzidos em camundongos comparando a atividade do análogo de insulina acilado comercialmente disponível (Detemir) em relação ao análogo de insulina acilado de cadeia dupla MIU-49. MIU-49 [B'(C16-rE,H5,Aib9,H10,E13- K17,Y16)25a : A'(N18,N21)] é um agonista de insulina de cadeia dupla tendo os 5 aminoácidos C-terminais da cadeia B excluídos e acilados com um ácido graxo C16 através de um ligante gama Glu no grupo a-amino de Gly B2). Os resultados indicam que MIU-49 é cerca de um terço tão potente quanto Detemir (vide as Figuras 27A e 27B). Os dados também indicam que as formas aciladas de insulina têm ação mais longa do que as formas não-aciladas e que MIU-49, embora menos potente que Detemir, exibe um perfil similar à Detemir. As Figuras 27C e 27D fornecem dados sobre os valores AUC de glicose no sangue após a administração dos análogos listados.
[044]As Figuras 28A-28D representam os resultados obtidos a partir de um teste de tolerância à insulina comparativo para Detemir e MIU-56 usando camundongos C57/BIk. MIU-56 é um análogo de insulina de cadeia única B'(H5,Y16,L17)25a- PEG8-K-PEGA4-A'(N18,21) que compreende um 20 kDa PEG ligado à cadeia lateral do resíduo de lisina única na porção de ligação (PEG8-K-PEGA4) que une a cadeia A e a cadeia B. As Figuras 28A e 28B são gráfico que mostram os resultados de testes de tolerância à insulina comparando a capacidade do análogo de insulina acilado Detemir em relação ao análogo de insulina de cadeia única peguilado MIU-56 para reduzir e manter os níveis de glicose no sangue baixos. As Figuras 28C e 28D mostram a glicose sanguínea AUC24rnoras em camundongos administrados com
Detemir e MIU-56, respectivamente.
[045]As Figuras 29A-29F representam os resultados obtidos a partir de um teste de tolerância à insulina comparativo para MIU-56 e MIU-57 usando camundongos C57/BIk. MIU-57 é um análogo de insulina de cadeia única (B'(H5,Y16,L17)25-C'- A'(N18,21) que compreende um 20 kDa PEG ligado à terminação N da cadeia B. As Figuras 29A e 29B são gráficos que mostram os resultados de testes de tolerância à insulina comparando MIU-5S6 e MIU-57. As Figuras 29C e 29D mostram a glicose sanguínea AUC24roras em camundongos administrados com MIU-56 e MIU-57, respectivamente. Os resultados das titulações de dose de insulina comparativas de MIU-56 e MIU-57 revelam que um perfil similar é obtido em camundongos para dosagens variando de 20 nmol/kg a 80 nmol/kg (vide as Figuras 29E e 29F). Um dímero (MIU 58) foi preparado compreendendo dois análogos de insulina de cadeia única (B'(H5,Y16,L17)25-C'-A'(N18,21) ligados cabeça à cabeça através de uma cadeia PEG 20 kDa. As Figuras 29G-29J representam os resultados obtidos a partir de um teste de tolerância à insulina comparativo para MIU-57 e MIU-58 usando camundongos C57/BIk. As Figuras 29G e 29H são gráficos que mostram os resultados de testes de tolerância à insulina comparando MIU-57 e MIU-58. As Figuras 29! e 29J mostram a glicose sanguínea AUC24noras em camundongos administrados com MIU-57 e MIU-58, respectivamente.
[046]As Figuras 30A e 30B fornecem dados de uma titulação de dose de insulina comparativa de dois derivados de insulina peguilados. Os derivados de insulina diferem com base na colocação de um PEG 20 kDa que é ligado à terminação N (Figura 30A) de MIU-59, ou à cadeia lateral de aminoácido B29, de um análogo de insulina MIU-60, em que s aminoácidos Al e BI foram carbamilados (Figura 30B).
[047]As Figuras 31A-31D fornecem dados de uma titulação de dose de insulina comparativa dos três análogos de insulina de cadeia única MIU-67, MIU-68 e MIU- 69, cada um compreendendo duas cadeias PEG de 10 kDa cada em relação ao derivado de insulina nativa peguilado único (20K PEG) (MIU-59). Mais particularmente, as atividades de análogos de insulina de cadeia única MIU-67 (B'(H5,Y16,L17)25-C'(K8)-A'(N18,21)) tendo duas cadeias PEG (10K cada) uma ligada na terminação N e a outra no aminoácido 8 da porção de ligação (posição C8), MIU-68 (B'(H5,Y16,L17, K22)25-C'(K8)-A'(N18,21)) tendo duas cadeias PEG (10K cada) uma ligada na terminação N e a outra no aminoácido B22 e MIU-69 (B'(H5,Y16,L17)25-C'(K8)-A'(K14, N18,21)) tendo duas cadeias PEG (10K cada) uma ligada na terminação e a outra no aminoácido A14 foram comparadas. Cada composto foi administrado em duas dosagens (20 e 80 nmol/kg).
[048]As Figuras 32A e 32B, camundongos diabéticos (camundongos db/db) foram administrados com análogos de insulina peguilados para comparar sua atividade relativa com os análogos de insulina comercialmente disponíveis. O eixo geométrico x indica a concentração do composto administrado (isto é, controle de veículo, 30 ou 90 nmol/kg ou 60 nmol/kg para Humulina e 30, 90 e 240 para Levemir). Em particular, os análogos de insulina Levemir e Humulin foram comparados aos análogos de insulina peguilados MIU-59 (análogo de insulina nativo tendo um PEG kDa único ligado a sua terminação N) e MIU-66 (análogo de insulina nativo tendo um PEG 20 kDa único ligado a sua terminação N e a terminação amino das cadeias A e B carbamiladas. Tanto MIU-59 como MIU-66 têm uma atividade aperfeiçoada em relação a Levemir e Humulina (vide as Figuras 32A em 12 horas e 32B em 24 horas).
[049]A Figura 33 é um gráfico que mostra os resultados de um teste de tolerância à insulina comparativo conduzido em camundongos normais para um análogo de insulina de cadeia dupla de pró-fármaco acilado no elemento de pró-fármaco de dipeptídeo (MIU-29: [B'(Y16,L17,Y25)29a :A'(aF19-dLys(Ac)NLeu)] em relação a seu análogo de insulina pai (MIU-27: [B'(Y16,L17,Y25)29a : A'(aF19-)]. O derivado de pró-fármaco MIU-29 compreende uma substituição de 4-amino-fenilalanina na posição A19 em que um dipeptídeo dLys(Ac),NLeu foi covalentemente ligado na posição 4-amino do resíduo A19 e a cadeia lateral da lisina do elemento de dipeptídeo foi acilada com um ácido graxo C14. Este dipeptídeo se autoclivará sob condições fisiológicas com uma meia-vida de aproximadamente 5 horas. Após incubar MIU-29 por 24 horas ex vivo, o composto resultante (designado “MIU-29c”) foi administrado aos camundongos e sua capacidade de reduzir glicose sanguínea foi comparada ao composto pai. Conforme mostrado na Figura 33, os dois compostos funcionam quase identicamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DEFINIÇÕES
[050]Para descrever e reivindicar a invenção, a terminologia a seguir será usada de acordo com as definições apresentadas abaixo.
[051]O termo “cerca de” conforme o uso em questão significa maior ou menor que o valor ou faixa de valores declarado por 10 por cento, mas não é destinado a designar qualquer valor ou faixa de valores somente a esta definição mais ampla. Cada valor ou faixa de valores precedidos pelo termo “cerca de” também é destinado a abranger a modalidade do valor absoluto declarado ou faixa de valores.
[052] Conforme o uso em questão, o termo “pró-fármaco” é definido como qualquer composto que seja submetido à modificação química antes de exibir efeitos farmacológicos.
[053]Conforme o uso em questão, o termo “aminoácido” abrange qualquer molécula contendo tanto grupos funcionais amino como grupos funcionais carboxila, em que os grupos amino e carboxilato são ligados ao mesmo carbono (o alfa carbono). Opcionalmente, o alfa carbono pode ter um ou mais substituintes orgânicos adicionais. Para os propósitos da presente revelação, a designação de um aminoácido sem especificar sua estereoquímica é destinada a abranger a forma L ou D do aminoácido, ou uma mistura racêmica. Entretanto, no caso onde um aminoácido for designado por seu código de três letras e incluir um número sobrescrito, a forma D do aminoácido é especificada por inclusão de uma letra d minúscula antes do código de três letras e do número sobrescrito (por exemplo, dLys'), em que a designação sem a letra d minúscula (por exemplo, Lys') é destinada para especificar a forma L nativa do aminoácido. Nesta nomenclatura, a inclusão do número sobrescrito designa a posição do aminoácido na sequência de análogo de insulina, em que os aminoácidos que ficam localizados na sequência de análogo de insulina são designados por números sobrescritos positivos numerados consecutivamente a partir da terminação N. Os aminoácidos adicionais ligados ao peptídeo de análogo de insulina seja na terminação N ou através de uma cadeia lateral são numerados começando em O e aumentando em valor inteiro negativo à medida que forem adicionalmente removidos da sequência de análogo de insulina. Por exemplo, a posição de um aminoácido em um pró-fármaco de dipeptídeo ligado à terminação N de um análogo de insulina é designada como aa'aa?-análogo de insulina, em que aaº representa o aminoácido carbóxi-terminal do dipeptídeo e aa” designa o aminoácido amino terminal do dipeptídeo.
[054]Conforme o uso em questão, o termo “ácido de hidroxila” se refere a aminoácidos que foram modificados para substituir o grupo amino alfa carbono por um grupo hidroxila.
[055] Conforme o uso em questão, o termo “aminoácido não-codificado” abrange qualquer aminoácido que não seja um L-isômero de qualquer um dos 20 aminoácidos a seguir: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr.
[056]Um “dipeptídeo” é um composto formado pela ligação aminoácido alfa ou um ácido de hidroxila alfa a outro aminoácido, através de uma ligação peptídica.
[057]Conforme o uso em questão, o termo “clivagem química” desprovido de qualquer designação adicional abrange uma reação não-enzimática que resulte na quebra de uma ligação química covalente.
[058]Um “polipeptídeo bioativo” se refere a polipeptídeos que sejam capazes de exercer um efeito biológico in vitro e/ou in vivo.
[059] Conforme o uso em questão, uma referência geral a um peptídeo é destinada a abranger peptídeos que tenham terminações amino e carbóxi modificadas. Por exemplo, uma sequência de aminoácido que designa os aminoácidos padrão é destinada a abranger aminoácidos padrão nas terminações N e C bem como um ácido de hidroxila correspondente na terminação N e/ou um aminoácido C-terminal correspondente modificado para compreender um grupo amida no lugar do ácido carboxílico terminal.
[060] Conforme o uso em questão, um aminoácido “acilado” é um aminoácido que compreende um grupo acila que seja não-nativo a um aminoácido de ocorrência natural, independentemente do meio através do qual este é produzido. Métodos exemplificadores de produzir aminoácidos acilados e peptídeos acilados são conhecidos na técnica e incluem acilar um aminoácido antes da inclusão no peptídeo ou síntese de peptídeo seguido por acilação química do peptídeo. Em algumas modalidades, o grupo acila faz com que o peptídeo tenha um ou mais entre (i) uma meia-vida prolongada em circulação, (ii) um princípio retardado de ação, (iii) uma duração estendida de ação, (iv) uma resistência aperfeiçoada a proteases, e (v) potência aumentada nos receptores de IGF e/ou peptídeo de insulina.
[061]Conforme o uso em questão, um aminoácido “alquilado” é um aminoácido que compreende um grupo alquila que seja não-nativo a um aminoácido de ocorrência natural, independentemente do meio através do qual este é produzido. Métodos exemplificadores de produção de aminoácidos alquilados e peptídeos alquilados são conhecidos na técnica e incluem alquilar um aminoácido antes da inclusão no peptídeo ou síntese de peptídeo seguido por alquilação química do peptídeo. Sem se ater a nenhuma teoria particular, acredita-se que a alquilação de peptídeos alcançará efeitos similares, senão idênticos, à acilação dos peptídeos, por exemplo, uma meia-vida prolongada em circulação, um princípio retardado de ação, uma duração estendida de ação, uma resistência aperfeiçoada a proteases e potência aumentada nos receptores de IGF e/ou insulina.
[062] Conforme o uso em questão, o termo “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer um dos veículoes farmacêuticos padrão, como uma solução salina tamponada de fosfato, água, emulsões, como uma emulsão óleo/água ou água/óleo, e vários tipos de agentes umectantes. O termo também abrange qualquer um dos agentes aprovados por uma agência reguladora do governo Federal dos Estados Unidos ou arrolados na Farmacopeia Norte-Americana para uso em animais, inclusive seres humanos.
[063] Conforme o uso em questão, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a sais de compostos que retenham a atividade biológica do composto pai, e que não sejam biologicamente ou, de outro modo, indesejáveis. Muitos dos compostos revelados no presente documento são capazes de formar sais ácidos e/ou básicos em virtude da presença de grupos amino e/ou carboxila ou grupos similares a esses.
[064]Sais de adição básica farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de bases inorgânicas e orgânicas. Os sais derivados a partir de bases inorgânicas incluem, a título de exemplo somente, sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio e magnésio. Os sais derivados a partir de bases orgânicas incluem, mas não se limitam a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias.
[065]Sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de sais inorgânicos e orgânicos. Sais derivados a partir de ácidos inorgânicos incluem ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e similares. Sais derivados a partir de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico,
ácido malônico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-tolueno-sulfônico, ácido salicílico, e similares.
[066]Conforme o uso em questão, o termo “porção hidrofílica” se refere a qualquer composto que seja prontamente solúvel em água ou absorva prontamente água, e que sejam tolerados in vivo por espécies de mamíferos sem efeitos tóxicos (isto é, sejam biocompatíveis). Exemplos de porções hidrofílicas incluem polietileno glicol (PEG), ácido polilático, ácido poliglicólico, um copolímero de ácido poliático- poliglicólico, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, poliidroxietil — metacrilato, — poliidroxipropil! — metacrilamida, — polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, e celuloses derivadas, como hidroximetilcelulose ou hidroxietilcelulose e copolímeros destas, bem como polímeros naturais incluindo, por exemplo, albumina, heparina e dextrano.
[067] Conforme o uso em questão, o termo “tratar” inclui a profilaxia do distúrbio ou condição específica, ou o alívio dos sintomas associados a um distúrbio ou condição específica e/ou evitar ou eliminar os ditos sintomas. Por exemplo, conforme o uso em questão, o termo “tratar diabetes” se refere, em geral, a manter os níveis de glicose no sangue próximos aos níveis normais e pode incluir aumentar ou diminuir os níveis de glicose no sangue dependendo de uma dada situação.
[068]Conforme o uso em questão, uma quantidade “eficaz” uma “quantidade terapeuticamente eficaz" de um análogo de insulina se refere a uma quantidade não- tóxica, mas suficiente, de um análogo de insulina para proporcionar o efeito desejado. Por exemplo, um efeito desejado seria a prevenção ou o tratamento de hiperglicemia. A quantidade que é “eficaz” variará de indivíduo para indivíduo, dependendo da idade e da condição geral do indivíduo, modo de administração, e similares. Portanto, nem sempre é possível especificar uma “quantidade eficaz” exata. No entanto, uma quantidade “eficaz” apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por um indivíduo com conhecimento comum na técnica usando uma experimentação de rotina.
[069]O termo, “parenteral” significa não através do canal alimentar, mas através de alguma outra rota, como intranasal, inalação, subcutânea, intramuscular, intra- espinhal, ou intravenosa.
[070]Ao longo do pedido, todas as referências a uma posição de aminoácido particular por letra e número (por exemplo, posição A5) se referem ao aminoácido na posição da cadeia A (por exemplo, posição A5) ou da cadeia B (por exemplo, posição B5) na respectiva cadeia A (SEQ ID NO: 1) ou cadeia B (SEQ ID NO: 2) de insulina humana nativa, ou a posição de aminoácido correspondente em quaisquer análogos destes. Por exemplo, uma referência no presente documento à “posição B28" desprovido de qualquer elaboração adicional significa a posição correspondente B27 da cadeia B de um análogo de insulina na qual o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 2 foi excluído. De modo similar, os aminoácidos adicionados à terminação N da cadeia B nativa são numerados começando com Bo, seguido por números de valor negativo crescente (por exemplo, B-1, B-2...) à medida que aminoácidos são adicionados à terminação N.
[071]Conforme o uso em questão, o termo “peptídeo de insulina nativo” é destinado a designar o heteroduplex de 51 aminoácidos que compreende a cadeia A de SEQ ID NO: 1 e a cadeia B de SEQ ID NO: 2, bem como análogos de insulina de cadeia única que compreendem SEQ ID NOS: 1 e 2. O termo “peptídeo de insulina” conforme o uso em questão, desprovido de uma linguagem descritiva adicional é destinado a abranger o heteroduplex de 51 aminoácidos que compreende a cadeia A de SEQ ID NO: 1 e a cadeia B de SEQ ID NO: 2, bem como análogos de insulina de cadeia única destes (incluindo, por exemplo, aqueles revelados no Pedido Internacional Publicado WO96/34882 e na Patente U.S. No. 6.630.348, estando as revelações desses aqui incorporadas a título de referência), incluindo heteroduplexes e análogos de cadeia única que compreendem análogos modificados da cadeia A e/ou cadeia B nativa e derivados destes. Esses análogos modificados incluem a modificação do aminoácido na posição A19, B16 ou B25 para uma 4-amino fenilalanina ou uma ou mais substituições de aminoácido nas posições selecionadas a partir de A5, A8, A9, A1O, A12, A14, A15, A17, A18, A21, B1, B2, B3, B4, B5, Ba, B1O0, B13, B14, B17, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29 e B30 ou exclusões de qualquer ou de todas as posições B1-4 e B26-30. Os peptídeos de insulina, conforme definido no presente documento, também podem ser análogos derivados a partir de uma insulina de ocorrência natural pela inserção ou substituição de uma porção não-peptídica, por exemplo, um fragmento retroinverso, ou incorporação de ligações não-peptídicas, como uma ligação de azapeptídeo (CO substituído por NH) ou ligação pseudo-peptídica (por exemplo, NH substituído por CH2) ou uma ligação éster (por exemplo, um depsipeptídeo, em que uma ou mais ligações de amida (-CONHR-) são substituídas por ligações éster (COOR)).
[072]Um “análogo de insulina A19” é um peptídeo de insulina que tem uma substituição de 4-amino fenilalanina ou 4-metóxi fenilalanina pelo resíduo de tirosina nativo na posição 19 da cadeia A de insulina nativa.
[073]Conforme o uso em questão, um “peptídeo análogo IGFB'68!?” é um termo genérico que compreende um heteroduplex de cadeia A e cadeia B, bem como análogos de insulina de cadeia única deste, em que a cadeia A compreende a sequência peptídica de SEQ ID NO: 15 e a cadeia B compreende a sequência de SEQ ID NO: 17, bem como análogos dessas sequências em que o análogo da cadeia A e/ou cadeia B compreende 1 a 3 substituições de aminoácido adicionais, com a condição de que a cadeia B não compreenda a sequência de SEQ ID NO: 2 e compreenda uma tirosina na posição B16 e uma leucina na posição B 17.
[074]Um “análogo IGF YL” é um peptídeo que compreende uma cadeia A de IGF de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia B de IGF de SEQ ID NO: 28.
[075]Conforme o uso em questão, o termo “análogo de insulina de cadeia única” abrange um grupo de proteínas estruturalmente relacionadas em que as cadeias A e B de insulina ou IGF, ou análogos ou derivados destas, são covalentemente ligadas entre si para formar uma cadeia polipeptídica linear. Conforme revelado no presente documento, o análogo de insulina de cadeia única compreende a ligação covalente da terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A através de uma porção de ligação.
[076]Conforme o uso em questão, o termo “cadeia A de insulina”, desprovido de uma linguagem descritiva adicional é destinado a abranger a sequência de 21 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, bem como os análogos funcionais e derivados desses que quando combinados com uma cadeia B de insulina têm uma atividade no receptor de insulina. Por exemplo, os análogos funcionais e derivados incluem a cadeia A de análogos de insulina A19, bem como outros análogos conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, que compreendem modificação da sequência de SEQ ID NO: 1 por uma ou mais inserções, exclusões ou substituições de aminoácido nas posições selecionadas a partir de A4, A5, A8, A9, A1O, A12, A14, A1S5, A17, A18, A21.
[077]Conforme o uso em questão, o termo “cadeia B de insulina”, desprovido de uma linguagem descritiva adicional é destinado a abranger a sequência de 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2, bem como análogos funcionais modificados da cadeia B nativa que quando combinados com uma cadeia A de insulina têm uma atividade no receptor de insulina. Por exemplo, análogos funcionais e derivados, incluindo a modificação do aminoácido na posição B16 ou B25 a uma 4-amino fenilalanina ou uma ou mais inserções, exclusões ou substituições de aminoácido nas posições selecionadas a partir de B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B17, B20, B21, B22, B23, B25, B26, B27, B28, B29 e B30 ou exclusões de qualquer ou de todas as posições B 1-4 e B26-30.
[078]Um “sítio de glicosilação” designa qualquer resíduo ou região de aminoácido em um polipeptídeo que seja submetido à glicosilação, isto é, à ligação de uma estrutura de carboidrato. Esses sítios são tipicamente sítios de N-glicosilação (isto é, qualquer resíduo ou região de aminoácido em um polipeptídeo que permita a ligação de uma estrutura de carboidrato através da ligação N) ou sítios de O-glicosilação (isto é, qualquer resíduo ou região de aminoácido em um polipeptídeo que permita a ligação de uma estrutura de carboidrato através da ligação O).
[079]Conforme o uso em questão, um “sítio de glicosilação não-nativo” é um sítio de glicosilação que não esteja presente no peptídeo nativo. De modo específico, a sequência nativa do peptídeo foi modificada para introduzir um sítio de glicosilação em uma posição onde anteriormente não havia esse sítio, ou aminoácido(s) adicional(is) é(são) adicionado(s) ao peptídeo nativo em que as sequências adicionadas juntas com a sequência nativa introduzem um sítio de glicosilação, ou o(s) aminoácido(s) adicionado(s) compreende(m) um sítio de glicosilação.
[080] Conforme o uso em questão, o termo “peptídeo hiperglicosilado” se refere a uma sequência de aminoácido que compreende dois ou mais sítios de glicosilação não-nativos que tenham sido glicosilados. Os sítios de glicosilação do peptídeo de hiperglicosilação podem incluir sítios de glicosilação N-ligados, e/ou sítios de glicosilação O-ligados.
[081]Conforme o uso em questão, um peptídeo CTP é uma sequência de aminoácido que compreende a sequência SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR (SEQ ID NO: 64), uma sequência que compreende 18 a 28 fragmentos de aminoácido de SEQ ID NO: 64, ou uma sequência que compreende uma sequência de 18 a 29 aminoácidos que compartilhe pelo menos 50% de identidade de sequência a uma sequência de 18 a 29 aminoácidos de (SEQ ID NO: 64), com a condição de que o peptídeo CTP não compreenda uma sequência de 18 aminoácidos que seja idêntica a uma sequência de 18 aminoácidos contida no peptídeo C de pró-insulina nativo (SEQ ID NO: 53).
[082] Conforme o uso em questão, o termo “derivado” é destinado a abranger uma modificação química a um composto (por exemplo, um aminoácido), incluindo uma modificação química in vitro, por exemplo, introduzindo-se um grupo em uma cadeia lateral em uma ou mais posições de um polipeptídeo, por exemplo, um grupo nitro em um resíduo de tirosina, ou iodo em um resíduo de tirosina, ou por conversão de um grupo carboxílico livre em um grupo éster ou em um grupo amida, ou convertendo-se um grupo amino em uma amida por acilação, ou acilando-se um grupo hidróxi produzindo um éster, ou por alquilação de uma amina primária produzindo uma amina secundária ou ligação de uma porção hidrofílica a uma cadeia lateral de aminoácido. Outros derivados são obtidos por oxidação ou redução das cadeias laterais dos resíduos de aminoácido no polipeptídeo.
[083] Conforme o uso em questão, o termo cadeia A de IGF, desprovido de uma linguagem descritiva adicional é destinado a abranger a sequência de 21 aminoácidos de IGF 1 ou IGF 2 nativo (SEQ ID NOs: 5 e 7 respectivamente), bem como análogos funcionais destes conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, incluindo a modificação da sequência de SEQ ID NO: 5 e 7 por uma ou mais substituições de aminoácido nas posições selecionadas a partir de A5, A8, A9, A1O, A12, A14, A15, A17, A18, A21.
[084]Conforme o uso em questão, o termo “cadeia B de IGF YL”, desprovido de uma linguagem descritiva adicional é destinado a abranger uma sequência de aminoácido que compreende SEQ ID NO: 17, incluindo, por exemplo, a sequência de SEQ ID NO: 6, bem como análogos da cadeia B de IGF YL e derivados dessa, incluindo uma a modificação do aminoácido na posição B16 ou B25 para uma 4- amino fenilalanina ou uma ou mais substituições de aminoácido nas posições selecionadas a partir de B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B17, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29 e B30 ou exclusões de qualquer ou de todas as posições
B1-4 e B26-30.
[085]O termo “identidade” conforme o uso em questão se refere à similaridade entre duas ou mais sequências. A identidade é medida dividindo-se o número de resíduos idênticos pelo número total de resíduos e multiplicando-se o produto por 100 para obter uma porcentagem. Portanto, duas cópias exatamente da mesma sequência têm 100% de identidade, enquanto duas sequências que tenham exclusões, adições ou substituições de aminoácido umas em relação às outras tenham um grau inferior de identidade. Os indivíduos versados na técnica reconhecerão que vários programas computacionais, como aqueles que empregam algoritmos, como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410) se encontram disponíveis para determinar a identidade de sequência.
[086] Conforme o uso em questão, o termo “seletividade” de uma molécula por um primeiro receptor em relação a um segundo receptor se refere à seguinte razão: EC5o da molécula no segundo dividido pelo EC5o da molécula no primeiro receptor. Por exemplo, uma molécula que tenha um EC5o de 1 nM em um primeiro receptor e um ECso de 100 nM em um segundo receptor tem uma seletividade de 100 vezes para o primeiro receptor em relação ao segundo receptor.
[087]Conforme o uso em questão, uma “modificação” de aminoácido se refere a uma substituição de um aminoácido, ou à derivação de um aminoácido pela adição e/ou remoção de grupos químicos a partir do aminoácido, e inclui a substituição por qualquer um dos 20 aminoácidos comumente encontrados em proteínas humanas, bem como aminoácidos atípicos ou de ocorrência não-natural. As fontes comerciais de aminoácidos atípicos incluem Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, EUA), ChemPep Inc. (Miami, FL, EUA), e Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA, EUA). Os aminoácidos atípicos podem ser adquiridos junto a fornecedores comerciais, sintetizados novamente, ou quimicamente modificados ou derivados a partir de aminoácidos de ocorrência natural.
[088]Conforme o uso em questão, uma “substituição” de aminoácido se refere à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente.
[089] Conforme o uso em questão, o termo “substituição de aminoácido conservativo” é definido no presente documento como trocas em um dos cinco grupos a seguir: |.Resíduos pequenos alifáticos, não-polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; Il. Resíduos polares negativamente carregados e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gin, ácido cistéico e ácido homocistéico; Ill. Resíduos polares positivamente carregados: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn) IV. Resíduos grandes alifáticos não-polares: Met, Leu, He, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína V. Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina
[090] Conforme o uso em questão, o termo geral “cadeia de polietileno glicol” ou “cadeia PEG” se refere a misturas de polímeros de condensação de óxido de etileno e água, em uma cadeia ramiíficada ou linear, representada pela fórmula geral H(OCH2CH2)nOH, em que n é pelo menos 2. O termo “cadeia de polietileno glicol" ou “cadeia PEG” é usado em combinação com um sufixo numérico para indicar o peso molecular médio aproximado da mesma. Por exemplo, PEG-5.000 se refere à cadeia de polietileno glicol tendo um peso molecular médio total de cerca de 5.000 Daltons.
[091]Conforme o uso em questão, o termo “peguilado” e similares se refere a um composto que tenha sido modificado a partir de seu estado nativo ligando-se uma cadeia de polietileno glicol ao composto. Um “polipeptídeo peguilado” é um polipeptídeo que tenha uma cadeia PEG covalentemente ligada ao polipeptídeo.
[092] Conforme o uso em questão, um “ligante” é uma ligação, molécula ou grupo de moléculas que liga duas entidades separadas entre si. Os ligantes podem proporcionar um espaçamento ótimo das duas entidades ou pode fornecer, ainda, uma ligação lábil que permita que as duas entidades sejam separadas uma da outra. As ligações lábeis incluem grupos fotocliváveis, porções lábeis ácidas, porções lábeis básicas e grupos cliváveis por enzima.
[093]Conforme o uso em questão, um “dímero IGF" é um complexo que compreende dois peptídeos análogos de IGF YL (cada um compreendendo uma cadeia A e a cadeia B) covalentemente ligados entre si através de um ligante. O termo dímero de IGF, quando usado desprovido de qualquer linguagem de qualificação, abrange tanto homodímeros de IGF como heterodímeros de IGF. Um homodímero de IGF compreende duas subunidades idênticas, enquanto um heterodímero de IGF compreende duas subunidades que diferem, embora as duas subunidades sejam substancialmente similares entre si.
[094]O termo “C1-Cn alquil"” em que n pode ser de 1 a 6, conforme o uso em questão, representa um grupo alquila ramificado ou linear tendo de um ao número específico de átomos de carbono. Grupos alquila C1-Cs típicos incluem, mas não se limitam a, metil, etil, n-propil, iso-propil, butil, iso-butil, sec-butil, terc-butil, pentil, hexil e similares.
[095]Os termos “C2-Cn alquenil” em que n pode ser de 2 a 6, conforme o uso em questão, representam um grupo ramificado ou linear olefinicamente insaturado tendo de 2 ao número específico de átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla. Exemplos desses grupos incluem, mas não se limitam a, 1-propenil, 2-propenil (- CH2-CH=CH2), 1,3-butadienil, (-CH=CHCH=CH2), 1-butenil. (-CH=CHCH2CHs), hexenil, pentenil, e similares.
[096]O termo “C2-Cn alquinil” em que n pode ser de 2 a 6 se refere a um grupo ramificado ou linear insaturado tendo de 2 a n átomos de carbono e pelo menos uma ligação tripla. Exemplos desses grupos incluem, mas não se limitam a, 1-propinil, 2- propinil, 1-butinil, 2-butinil, 1-pentinil, e similares.
[097]Conforme o uso em questão, o termo “aril”" se refere a um sistema de anel carbocíclico mono- ou bicíclico tendo um ou dois anéis aromáticos que incluem, mas não se limitam a, fenil, naftil, tetraidro naftil, indanil, indenil, e similares. O tamanho do anel de aril e a presença de substituintes ou grupos de ligação são indicados designando-se o número de carbonos presentes. Por exemplo, o termo “(C1-C3 alquil) (C6s-Cio aril)” se refere a um aril com 5 a 10 membros que seja ligado a uma porção pai através de uma cadeia de alquil com um a três membros.
[098]O termo “heteroaril” conforme o uso em questão se refere a um sistema de anel mono- ou bicíclico contendo um ou dois anéis aromáticos e contendo pelo menos um átomo de nitrogênio, oxigênio, ou enxofre em um anel aromático. O tamanho do anel heteroaril e a presença de substituintes ou grupos de ligação são indicados designando-se o número de carbonos presentes. Por exemplo, o termo “(C1-Cn alquil)(C5-C6 heteroaril)” se refere a um heteroaril com 5 ou 6 membros que é ligado a uma porção pai através de uma cadeia de alquil com um a “nº membros.
[099] Conforme o uso em questão, o termo “halo” se refere a um ou mais membros do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo, e iodo.
[0100]Conforme o uso em questão, o termo “paciente” sem designação adicional é destinado a abranger qualquer animal domesticado vertebrado de sangue quente (incluindo, por exemplo, mas sem limitar-se a, gado, cavalos, gatos, cachorros e outros animais de estimação) e seres humanos.
[0101]O termo “isolado” conforme o uso em questão significa que foi removido a partir de seu ambiente natural. Em algumas modalidades, produz-se o análogo através de métodos recombinantes e o análogo é isolado a partir da célula hospedeira.
[0102]O termo “purificado,” conforme o uso em questão, se refere ao isolamento de uma molécula ou composto sob uma forma que seja substancialmente isenta de contaminantes normalmente associados à molécula ou composto em um ambiente nativo ou natural e meios tiveram sua pureza aumentada como resultado da separação a partir de outros componentes da composição original. O termo “polipeptídeo purificado” é usado para descrever um polipeptídeo que foi separado de outros compostos que incluem, mas não se limitam a, moléculas de ácido nucléico, lipídeos e carboidratos.
[0103]Uma “peptidomimética” se refere a um composto químico tendo uma estrutura que seja diferente da estrutura geral de um peptídeo existente, mas que funciona de maneira similar ao peptídeo existente, por exemplo, imitando-se a atividade biológica de tal peptídeo. Tipicamente, a peptidomimética compreende e aminoácidos de ocorrência natural e/ou aminoácidos não-naturais, mas também podem compreender modificações à cadeia principal de peptídeo. Por exemplo, uma peptidomimética pode incluir uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural com a inserção ou substituição de uma porção não-peptídica, por exemplo, um fragmento retroinverso, ou incorporação de ligações não-peptídicas, como uma ligação azapeptítica (CO substituído por NH) ou ligação pseudo-peptídica (por exemplo, NH substituído por CH2), ou uma ligação éster (por exemplo, depsipeptídeos, em que uma ou mais ligações de amida (-CONHR-) são substituídas por ligações éster (COOR)). Alternativamente, a peptidomimética pode ser desprovida de quaisquer aminoácidos de ocorrência natural.
[0104]Conforme o uso em questão, o termo “aminoácido carregado” ou “resíduo carreado” se refere a um aminoácido que compreende uma cadeia lateral que seja negativamente carregada (isto é, desprotonada) ou positivamente carregada (isto é, protonada) em solução aquosa em pH fisiológico. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido cistéico, ácido homocistéico, e ácido homoglutâmico, enquanto aminoácidos positivamente carregados incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados incluem os aminoácidos carregados dentre os 20 aminoácidos comumente encontrados em proteínas humanas, bem como aminoácidos atípicos ou aminoácidos de ocorrência não-natural.
[0105]Conforme o uso em questão, o termo “aminoácido acídico” se refere a um aminoácido que compreende uma segunda porção acídica (diferente do ácido alfa carboxílico do aminoácido), incluindo, por exemplo, um ácido carboxílico de cadeia lateral ou grupo de ácido sulfônico.
ABREVIAÇÕES:
[0106]Os análogos de insulina serão abreviados da seguinte forma:
[0107]As cadeias A e B de insulina serão designadas por uma letra A maiúscula para a cadeia A e por uma letra B maiúscula para a cadeia B em que um sobrescrito O (por exemplo, Aº ou Bº) designará que a sequência de base é uma sequência de insulina (cadeia A: SEQ ID NO: 1, cadeia B SEQ ID NO: 2) e um sobrescrito 1 (por exemplo, A' ou B'!) designará que a sequência de base é uma sequência IGF-1 (cadeia A: SEQ ID NO: 5, cadeia B SEQ ID NO: 62). As modificações que desviam da sequência de insulina nativa e IGF são indicadas entre parênteses após a designação da cadeia A ou B (por exemplo, [B'(H5,H10,Y16,L17) : A'(H8,N18,N21)]) com a abreviação de aminoácido com letra única indicando a substituição e o número indicando a posição da substituição nas respectiva cadeia A ou B, usando a numeração de insulina nativa. Dois pontos entre a cadeia A e B indica uma insulina de cadeia dupla, enquanto um travessão indicará uma ligação covalente e, portanto, um análogo de cadeia única. Em análogos de cadeia única, uma porção de ligação será incluída entre as cadeias A e B e a designação C' se refere ao peptídeo IGF 1 C nativo, SEQ ID NO: 13.
MODALIDADES
[0108]De acordo com uma modalidade, proporcionam-se análogos de insulina que foram modificados para introduzir um ou mais sítios de glicosilação. A glicosilação de produtos farmacêuticos à base de peptídeo pode conferir benefícios adicionais incluindo uma meia-vida sérica aumentada; uma meia-vida in vivo funcional aumentada; e uma degradação reduzida. Introduzir sítios de glicosilação nos análogos de insulina proporciona locais para ligação de uma porção de carboidrato no agonista de insulina, de modo que quando o agonista de insulina for produzido em uma célula eucariótica capaz de glicosilação, o agonista de insulina seja glicosilado. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina em que a sequência peptídica foi modificada, seja pela adição e/ou pela substituição de aminoácidos para adicionar novos sítios de glicosilação não presentes em insulina nativa. Em uma modalidade, o sítio de glicosilação é introduzido na terminação amino ou carbóxi da cadeia B, ou no caso de um análogo de cadeia única, o sítio de glicosilação pode ser introduzido ao peptídeo de ligação do análogo de cadeia única. Em uma modalidade adicional, proporciona-se um análogo de cadeia única em que pelo menos um sítio de glicosilação é introduzido tanto à terminação amino da cadeia B e como à porção de ligação do análogo de cadeia única.
[0109]Os requerentes constataram que análogos de insulina de cadeia única de alta potência podem ser preparados onde a porção de ligação que liga a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A possa ser maior que 18 aminoácidos, desde que a porção de ligação não tenha o peptídeo C de pró-insulina nativa diretamente ligado à terminação carbóxi de cadeia B. De acordo com esta constatação, proporcionam-se análogos de insuliha de cadeia única que compreendem uma cadeia A de insulina, uma cadeia B de insulina e uma porção de ligação, em que a porção de ligação compreende um peptídeo de pelo menos 18 aminoácidos, incluindo, por exemplo, 18 a 87, 29 a 87, ou 29 a 58 aminoácidos, em que a porção de ligação covalentemente liga a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A para formar uma cadeia contígua de aminoácido.
Mais particularmente, a porção de ligação não compreende a sequência do peptídeo C de pró-insulina nativa (SEQ ID NO: 53), ou um fragmento contíguo de 18, 20, 25 ou 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 53 diretamente ligado à terminação carbóxi da cadeia B. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única em que a porção de ligação compreende uma sequência de pelo menos 18 aminoácidos em que a porção de ligação compreende um fragmento contíguo de 4, 8, 16, 18, 20, 25 ou 30 aminoácidos do peptídeo C de pró-insulina nativa (SEQ ID NO: 53), com a condição de que a porção de ligação também compreenda um peptídeo não-Cº de pelo menos 8, 16, 18, 24 ou 29 aminoácidos que seja ligado à terminação carbóxi da cadeia B. Conforme o uso em questão, um peptídeo não-Cº é qualquer peptídeo que tenha menos de 90% de identidade de sequência com uma sequência contida no peptídeo C de pró-insulina nativa (SEQ ID NO: 53) e/ou não compreenda uma sequência de 15 aminoácidos idêntica a uma sequência de 15 aminoácidos contida em SEQ ID NO 53. Em uma modalidade, o peptídeo não-Cº compreende um ou mais sítios de glicosilação N-ligados e/ou O-ligados.
[0110]Em uma modalidade, a porção de ligação compreende um peptídeo de 18 a 145, 18 a 87, 29 a 87, ou 29 a 58 aminoácidos em que a dita porção de ligação é desprovida de uma sequência contígua de pelo menos 18 aminoácidos que tenha uma identidade de sequência superior a 80% com SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, a porção de ligação inclui outros materiais poliméricos além dos resíduos de aminoácido, ou em substituição dos mesmos, incluindo, por exemplo, polietileno glicol.
[0111]EmM uma modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que a dita sequência contígua com 29 aminoácidos tem uma identidade de sequência superior a 60, 80 ou 90% a (SEQ ID NO: 66), com a condição de que a sequência não compreenda uma sequência de 15 aminoácidos idêntica a uma sequência de 15 aminoácidos contida em SEQ ID NO 53. Em outra modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que pelo menos 58% dos aminoácidos que compreendem a sequência contígua com 29 aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em serina e prolina.
[0112]Em outra modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que a dita sequência contígua com 29 aminoácidos tem uma identidade de sequência superior a 70%, 80%, 90% a SSSSXscAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs: (SEQ ID NO: 66), em que Xso e Xs1i são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina, com a condição de que a sequência não compreenda uma sequência de 15 aminoácidos idêntica a uma sequência de 15 aminoácidos contida em SEQ ID NO 53. Em outra modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que a dita sequência contígua com 29 aminoácidos é um análogo de SEQ ID NO: 64, em que o dito análogo difere de SEQ ID NO: 64 somente por 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações de aminoácido (em que as ditas modificações são selecionadas a partir de substituições, exclusões ou inserções de aminoácido), e, em uma modalidade adicional, as modificações de aminoácido são substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi- terminal da cadeia B, em que a dita sequência contígua com 29 aminoácidos é um análogo de (SEQ ID NO: 64), em que o dito análogo difere de (SEQ ID NO: 64) somente por 1, 2 ou 3 substituições de aminoácido.
Glicosilação
[0113]Durante a produção de proteína in vivo nascente, os análogos de insulina que compreendem sítios de glicosilação podem ser submetidos a um processamento adicional, conhecido como modificação pós-translacional, em que resíduos de açúcar (glicosill podem ser adicionados enzimaticamente em um processo conhecido como glicosilação. As proteínas resultantes portando cadeias laterais de oligossacarídeos covalentemente ligadas são conhecidas como proteínas ou glicoproteínas glicosiladas. De modo correspondente, uma proteína que porta um sítio de glicosilação não é necessariamente glicosilada. De acordo com uma modalidade, proporcionam-se análogos de agonistas de insulina que foram modificados para compreender uma sequência peptídica que seja propensa à hiperglicosilação quando expressa em um sistema de expressão eucariótico.
[0114]A glicosilação de proteína depende da sequência de aminoácido da proteína de interesse, bem com da célula hospedeira na qual a proteína é expressa. Diferentes organismos podem produzir diferentes enzimas de glicosilação (por exemplo, glicosiltransferases e glicosidases), e ter diferentes substratos (açúcares de nucleotídeo) disponíveis. Devido a esses fatores, o padrão de glicosilação de proteína, e a composição de resíduos de glicosil, podem diferir dependendo do sistema hospedeiro no qual a proteína particular é expressa. Os resíduos de glicosil úteis na invenção podem incluir, mas não se limitam a, glicose, galactose, manose, fucose, n-acetilglucosamina e ácido siálico. Em uma modalidade, o análogo de insulina compreende resíduos de glicosil de modo que o padrão de glicosilação seja humano.
[0115]Os indivíduos versados na técnica sabem que glicosilações de proteína diferentes podem resultar em características de proteína diferentes. Por exemplo, a eficácia de uma proteína terapêutica produzida em um hospedeiro de microorganismo, como levedura, e glicosilada usando a trajetória endógena de levedura pode ser reduzida comparada àquela da mesma proteína expressa em uma célula de mamífero, como uma linhagem celular CHO ou células HEK293. Essas glicoproteínas também podem ser imunogênicas em seres humanos e apresentarem uma meia-vida reduzida in vivo após a administração. Receptores específicos em seres humanos e outros animais podem reconhecer resíduos glicosil-específicos e promover a rápida depuração da proteína a partir da corrente sanguínea. De modo correspondente, um médico pode preferir uma proteína terapêutica com uma composição e padrão de glicosilação específicos, por exemplo, composição e padrão de glicosilação idênticos, ou pelo menos similares, àqueles produzidos em células humanas ou nas células espécie-específicas do animal em questão.
[0116]A expressão de proteínas glicosiladas diferentes daquelas de uma célula hospedeira pode ser alcançada modificando-se geneticamente a célula hospedeira para expressar enzimas de glicosilação heterólogas. Por exemplo, cepas de levedura foram geneticamente modificadas para expressar enzimas de glicosilação de ocorrência não-natural de modo que as proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas nessas cepas de levedura exibam uma glicosilação de proteína idêntica àquela de células animais, especialmente células humanas (vide as Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 2004/0018590 e 2002/0137134, estando as revelações destas aqui incorporadas a título de referência).
[0117]As sequências de glicosilação não-nativas e nativas são conhecidas pelos indivíduos versados na técnica e incluem sítios de glicosilação N-ligados, e sítios de glicosilação O-ligados. Os sítios de glicosilação N-ligados são sequências de peptídeo que servem como sítios de reconhecimento para ligação enzimática de uma porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de glicosilação O-ligadas de tripeptídeo incluem asp aragina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina. Portanto, a presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação O-ligada consiste em sequências peptídicas que servem como sítios de reconhecimento para ligação enzimática de uma porção de carboidrato à cadeia lateral de um ácido de hidroxiamino, mais comumente, serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina também possam ser usados. Em uma modalidade, o açúcar de glicosilação O-ligado é N-aceilgalactosamina, galactose, ou xilose. Conhece-se uma série de sítios de glicosilação O-ligados na técnica e foram reportados na literatura. Vide, por exemplo, Ten Hagen et al. (11029) J. Biol. Chem. 274(39):27867-74; Hanisch et al. (2001) Glycobiology 11:731-740; e Ten Hagen et al. (2003) Glycobiology 13:1R-16R.
[0118]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um método para produzir um análogo de insulina hiperglicosilado. O método compreende proporcionar uma célula hospedeira eucariótica que compreende um gene que codifica um análogo de insulina que foi modificado para incluir um sítio de glicosilação não-nativo (por exemplo, uma sequência de peptídeo CTP) e culturar a célula sob condições que permitam a expressão do gene de análogo de insulina. Em uma modalidade, a célula hospedeira expressa as enzimas de glicosilação humana de modo que as proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas na célula hospedeira exibam uma glicosilação de proteína idêntica àquela de células humanas (vide as Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 2004/0018590 e 2002/0137134, estando as revelações destas aqui incorporadas a título de referência). De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira eucariótica é selecionada a partir de levedura (por exemplo, Pichia pastoris) ou células de mamíferos (CHO ou HEK293).
[0119]Outro meio para aumentar o número de porções de carboidrato no análogo de insulina ocorre por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao análogo de insulina. Esses procedimentos são vantajosos pelo fato de que não requerem a produção do análogo de insulina em uma célula hospedeira que tenha capacidades de glicosilação para glicosilação N- ou O-ligadas. Dependendo do modo de acoplamento usado,o(s) açúcar(es) pode(m) ser ligado(s) a (a) arginina e histidina;
(b) grupos carboxilas livres; (c) grupos sulfidrilas livres, como aqueles de cisteína; (d) grupos hidroxila livres, como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos, como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. Os métodos para acoplar glicosídeos a peptídeos são descritos no documento WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin and Wriston (1981) CRC Critt Rev. Biochem., pp. 259-306, ambos se encontram aqui incorporados a título de referência.
[0120]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina em que um sítio de glicosilação foi introduzido no peptídeo de insulina. Um ou mais sítios de glicosilação podem ser adicionados modificando-se a sequência de insulina nativa por substituições, exclusões ou adições de aminoácido. Em uma modalidade, o análogo de insulina compreende uma modificação de um ou mais aminoácidos B25-B30, ou a adição de uma sequência peptídica à terminação N ou à terminação C da cadeia A ou B para introduzir um ou mais sítios de glicosilação não-nativos no análogo de insulina. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina, seja um análogo de cadeia dupla ou um análogo de cadeia única, em que um peptídeo que compreende um sítio de glicosilação foi ligado à terminação carbóxi da cadeia B de insulina. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende uma porção de ligação que une covalentemente a terminação carbóxi de uma cadeia B de insulina à terminação amino de uma cadeia A de insulina, em que a porção de ligação compreende uma sequência de aminoácido com mais de 18 resíduos e compreende um ou mais sítios de glicosilação. Em uma modalidade adicional, proporciona-se um análogo de insulina que compreende duas sequências peptídicas que contêm pelo menos um sítio de glicosilação (igual ou diferente). Em uma modalidade, uma primeira sequência peptídica contendo um sítio de glicosilação é ligada à terminação N da cadeia Be a segunda sequência peptídica contendo um sítio de glicosilação é ligada à terminação C da cadeia A ou B. Em uma modalidade, o análogo de insulina é um análogo de cadeia única em que a porção de ligação que une as cadeias Be À compreende a segunda sequência peptídica.
Unidades de Oligossacarídeo
[0121]A estrutura e o número de unidades de oligossacarídeo ligadas a um sítio de glicosilação particular em um análogo de insulina hiperglicosilado podem ser variáveis. Por exemplo, estas podem ser N-acetil glucosamina, N-acetil galactosamina, manose, galactose, glicose, fucose, xilose, ácido glucurônico, ácido idurônico e/ou ácido siálico. Em uma modalidade, os análogos de insulina hiperglicosilados compreendem cadeias de carboidrato não-nativas N-ligadas e/ou O-ligadas selecionadas a partir de: a)uma cadeia de açúcar tipo mamífero do tipo expresso por células CHO; b)uma cadeia de açúcar que compreende uma cadeia complexa de N- carboidrato (por exemplo, uma estrutura triantenária ou biantenária), incluindo, por exemplo, carboidratos contendo muitas moléculas de manose e acetilglucosamina e muitos resíduos de ácido siálico terminal; Cc)juma cadeia de açúcar que compreende uma cadeia de O-carboidrato opcionalmente com um resíduo de ácido siálico terminal; djuma cadeia de açúcar sialilada por alfa-2,6-sialiltransferase ou alfa-2,3- sialiltransferase; e/ou e)uma cadeia de açúcar sialilada exibindo entre 3 e 30 ou 7 e 23 sialil-N- acetilgalactosamina. Em uma modalidade, o análogo de insulina hiperglicosilado é produzido por um mutante de glicosilação de mamífero que expressa estavelmente alfa 2,6 sialitransferase e apresenta uma deficiência em atividade de CMP-Neu5Ac hidrolase, e, em uma modalidade adicional, o mutante de glicosilação de mamífero é um mutante de glicosilação CHO. Tipicamente, essa glicosilação inclui N-acetil glucosamina, N-acetil galactosamina, manose, galactose, glicose, fucose, xilose,
ácido glucurônico, ácido idurônico e/ou ácido siálico.
[0122]Os análogos de insulina glicosilados conforme revelado no presente documento compreendem pelo menos uma porção de carboidrato covalentemente ligada a um sítio de glicosilação não-nativo e podem incluir uma ou mais porções de carboidrato covalentemente ligadas a um sítio de glicosilação nativo. Em algumas modalidades, o análogo de insulina hiperglicosilado compreende glicosilação O- ligada. Em outras modalidades, o análogo de insulina hiperglicosilado compreende glicosilação N-ligada. Em outras modalidades, o análogo de insulina hiperglicosilado compreende glicosilação O-ligada e N-ligada.
Peptídeo CTP
[0123]Em uma modalidade, um sítio de glicosilação é introduzido pela adição de sequências de aminoácidos ao análogo de insulina de base. Mais particularmente, os requerentes constataram que a sequência peptídica nomeada como peptídeo C- terminal (CTP: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQR; SEQ ID NO: 64), que é propensa à hiperglicosilação O-ligada quando a proteína for expressa em um sistema de expressão celular eucariótico pode ser covalentemente ligada a um análogo de insulina sem questionar a atividade in vitro inerente do análogo de insulina.
[0124]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia dupla em que a cadeia B e cadeia A de insulina são ligadas por ligações de dissulfeto, em que o análogo de insulina tem a estrutura geral de (peptídeo CTP 1)m- (cadeia B de insulina)-(peptídeo CTP 2)n:(cadeia A de insulina) em que m é um número inteiro selecionado a partir de O a 4, n é um número inteiro selecionado a partir de O a 4, e peptídeo CTP 1 e peptídeo CTP 2 representam sequências de aminoácidos que compreendem um peptídeo CTP em que o peptídeo CTP 1 e o peptídeo CTP2 podem ter sequências de aminoácidos iguais ou diferentes. O peptídeo CTP pode ser qualquer peptídeo CTP conforme revelado no presente documento e a cadeia B de insulina e a cadeia A de insulina podem ser qualquer sequência revelada no presente documento ou qualquer sequência conhecida por funcionar com um agonista de receptor de insulina. De modo correspondente, os peptídeos CTP podem ser ligados à terminação amino e/ou à terminação carbóxi da cadeia B de um análogo de insulina de cadeia dupla ou À terminação amino da cadeia B e/ou como o peptídeo de ligação em análogos de cadeia única. O peptídeo CTP também pode ser ligado à terminação amino ou à terminação carbóxi da cadeia A em um análogo de insulina de cadeia dupla ou à terminação carbóxi da cadeia A em um análogo de insulina de cadeia única.
[0125]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina que compreende uma cadeia A e uma cadeia B e um peptídeo CTP, em que o peptídeo CTP é um peptídeo tendo pelo menos 60, 70, 80, 85, 90, ou 95% de identidade de sequência com (SEQ ID NO: 64). Em uma modalidade, o peptídeo CTP é um peptídeo que compreende uma sequência de 18 a 29 aminoácidos que compartilha pelo menos 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96 ou 98% de identidade de sequência com uma região de 18 a 29 aminoácidos de (SEQ ID NO: 64). Em uma modalidade, o peptídeo CTP compreende um análogo de (SEQ ID NO: 64), em que o dito análogo difere de (SEQ ID NO: 64) por 1, 1a 2,3 a4,4a6 ou até 8 modificações de aminoácido em que a modificação é uma substituição, exclusão ou inserção de aminoácido. Em uma modalidade, o análogo difere de (SEQ ID NO: 64) por 1, 1 a 2, 3 a4,4a6 ou até 8 substituições de aminoácido em que as substituições de aminoácido se encontram em uma ou mais posições selecionadas a partir de 1 a 4, 7 a 15, 18, 20, 21, 24 e 27 de (SEQ ID NO: 64). Em uma modalidade, as substituições de aminoácido se encontram em uma ou mais posições selecionadas a partir de 1, 2, 3, 4, 10, 13, 15, e 21 de (SEQ ID NO: 64). Em uma modalidade, as substituições de aminoácido se encontram em uma ou mais posições selecionadas a partir de 7, 8, 9, 12, 14, 18, 20, 24 e 27 de (SEQ ID NO: 64). Em uma modalidade, o peptídeo CTP compreende uma sequência de 29 aminoácidos que difere da SEQ ID NO: 66 por 1 a 2 substituições de aminoácido. Em uma modalidade adicional, o peptídeo CTP compreende um fragmento de SEQ ID NO: 64 em que o fragmento representa uma sequência contígua de 18 a 28 aminoácidos idêntica a uma sequência de aminoácido contida em SEQ ID NO: 64. Em uma modalidade, o peptídeo CTP consiste em SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 79.
[0126]De acordo com uma modalidade, o peptídeo CTP compreende um peptídeo da sequência SSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOXs: (SEQ ID NO: 66), em que X5o e Xs: são independentemente arginina ou lisina, ou um peptídeo que difere de SSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs: (SEQ ID NO: 66) por uma ou duas modificações de aminoácido. Em uma modalidade, o peptídeo CTP é uma sequência de 29 aminoácidos que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK (SEQ ID NO: 79), SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQR (SEQ ID NO: 64) e SSSSRAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 65). Em uma modalidade, o peptídeo CTP compreende uma sequência (SSSSXscAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs:)n (SEQ ID NO: 66), em que n é um número inteiro selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2, 3 e 4, e, em uma modalidade adicional, n é 1 ou 2. Em uma modalidade adicional, um primeiro peptídeo CTP é ligado à terminação N da cadeia B e um segundo peptídeo CTP é ligado à terminação carbóxi da cadeia B, em que o primeiro e o segundo peptídeos CTP compreendem sequências independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 65.
[0127]De modo surpreendente, os requerentes constataram que o peptídeo CTP pode ser usado para conectar as cadeias B e A de insulina para formar um análogo de insulina de cadeia única enquanto ainda mantém uma alta potência in vitro em uma maneira na qual o peptídeo C de pró-insulina nativa não pode. Em uma modalidade, prepara-se um análogo de insulina de cadeia única em que a terminação carbóxi da cadeia B é ligada à terminação amino da cadeia A através de um peptídeo CTP. Em outra modalidade, proporciona-se um análogo de insulina como uma construção de cadeia dupla com o CTP covalentemente ligado à terminação C da cadeia B e/ou à terminação amino da cadeia B. A caracterização in vitro e in vivo revela que os análogos de insulina modificados por CTP têm alta potência na ausência de glicosilação, proporcionando, assim, um mecanismo para estender a ação de insulina que se baseia na glicosilação, uma abordagem natural a proteínas de duração mais longa.
[0128]De acordo com uma modalidade, proporcionam-se análogos de insulina de cadeia dupla em que as cadeias A e B são ligadas entre si através de ligações de dissulfeto e o peptídeo CTP é covalentemente ligado à terminação amino e/ou à terminação carbóxi da cadeia B.
Análogos de cadeia única
[0129]A pró-insulina é um polipeptídeo precursor de baixa potência que é proteoliticamente convertido em insulina pela remoção seletiva de um peptídeo de conexão de 35 resíduos (peptídeo C; SEQ ID NO: 53). Prepararam-se análogos de insulina de cadeia única em que a terminação carbóxi da cadeia B de insulina é ligada à terminação amino da cadeia A através de um ligante peptídico. O conhecimento convencional é que o peptídeo de ligação que une as cadeias A e B não deve ter mais de 11 a 12 aminoácidos para manter a potência. De modo surpreendente, os requerentes constataram que contanto que o peptídeo C de pró- insulina nativa não seja diretamente ligado à terminação carbóxi de cadeia B, os peptídeos de comprimentos muito maiores que 18 aminoácidos podem ser usados como peptídeos de ligação com perda mínima de potência no receptor de insulina.
[0130]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de agonista de insulina de cadeia única que compreende a estrutura geral B-LM-A em que B representa uma cadeia B de insulina, A representa uma cadeia A de insulina, e LM representa uma porção de ligação que liga a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A. As cadeias A e B de insulina podem ser qualquer sequência de insulina conhecida, incluindo aquelas reveladas no presente documento, que quando ligadas juntas como um heteroduplex formam uma insulina funcional (isto é, capaz de ligar e ativar um receptor de insulina).
[0131]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende uma cadeia A, uma cadeia B e uma porção de ligação, em que a porção de ligação compreende um peptídeo de 18 aminoácidos que liga covalentemente a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A para formar uma cadeia contígua de aminoácido, com a condição de que a porção de ligação não compreenda a sequência de SEQ ID NO: 53, ou qualquer fragmento desta, diretamente ligada à terminação carbóxi da cadeia B. Os requerentes constataram que o peptídeo C de pró-insulina nativa aparenta ter um impacto negativo sobre a potência de análogos de insulina de cadeia única quando o peptídeo for ligado à terminação carbóxi da cadeia B. Inserir um peptídeo CTP entre a cadeia B e a o peptídeo C de pró-insulina nativa produz um análogo de insulina de cadeia única mais potente em relação à própria pró-insulina (vide a Figura 22).
[0132]De modo correspondente, podem-se preparar análogos de insulina de cadeia única tendo peptídeos de ligação surpreendentemente longos enquanto retêm a potência do análogo de insulina subjacente. Mais particularmente, em uma modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência peptídica de pelo menos 18 aminoácidos que não compreende a sequência do peptídeo C de pró- insulina nativa (SEQ ID NO: 53), ou um fragmento contíguo de 18, 20, 25 ou 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 53 diretamente ligado à terminação carbóxi da cadeia B. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a sequência do peptídeo C de pró-insulina nativa (SEQ ID NO: 53), ou uma fragmento contíguo de 18, 20, 25 ou 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 53 com a condição de que a porção de ligação também compreende um peptídeo não-Cº de pelo menos 4, 8, 16, 20, 24 ou 28 aminoácidos diretamente ligado à terminação carbóxi da cadeia B. Nesse contexto, a referência a um análogo de insulina que compreende um peptídeo não-Cº sendo “diretamente ligado” é destinada a significar que o aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B é covalentemente ligado ao aminoácido amino terminal do peptídeo não-Cº. Conforme o uso em questão, um peptídeo não-Cº é qualquer peptídeo que tenha uma identidade de sequência inferior a 90% com uma sequência contida no peptídeo C de pró-insulina nativa (SEQ ID NO: 53) e/ou não compreende uma sequência de 15 aminoácidos idêntica a uma sequência de 15 aminoácidos contida em SEQ ID NO 53. Em uma modalidade, o peptídeo não-Cº compreende um ou mais sítios de glicosilação N-ligados e/ou O- ligados. Em uma modalidade, o peptídeo não-Cº compreende um peptídeo CTP, e, em uma modalidade adicional, o peptídeo não-Cº é CTP (SEQ ID NO: 64). Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única em que o peptídeo de ligação compreende um primeiro peptídeo CTP (por exemplo, uma sequência que compreende SEQ ID NO: 66) diretamente ligado à terminação carbóxi da cadeia B e um segundo peptídeo que liga o primeiro peptídeo CTP à terminação amino da cadeia A. O segundo peptídeo pode ser qualquer sequência de aminoácido variando de 1 a 58 aminoácidos, e, em uma modalidade, o segundo peptídeo tem aproximadamente de 1 a 29 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o segundo peptídeo compreende um ou mais sítios de glicosilação N- ligados e/ou O-ligados. Em outra modalidade, o segundo peptídeo compreende um segundo peptídeo CTP ou compreende o peptídeo C de pró-insulina nativa, IGF-1 ou IFG-2. Em qualquer uma dessas modalidades, pode-se ligar uma sequência adicional que compreende um peptídeo CTP à terminação amino da cadeia B.
[0133]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única em que a porção de ligação é um peptídeo de 18 a 174, 18 a 145, 18 a 116, 18 a 97, 29 a 145, 29 a 145,29 a 116, 29 a 97, 29 a 58 resíduos de aminoácidos, e, em uma modalidade adicional, a porção de ligação compreende um total de 29 a 58 aminoácidos. Em uma modalidade, a porção de ligação é um peptídeo de 18 a 174, 18 a 145, 18 a 116, 18 a 97, 29 a 145, 29 a 145,29 a 116, 29 a 97, 29 a 58 resíduos de aminoácidos, em que a porção de ligação compreende uma sequência (SSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs:)n (SEQ ID NO: 66) em que n é 1,2 ou 3 e X5o e X5s1 são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina. Em algumas modalidades, a porção de ligação inclui outros polímeros (por exemplo, polietileno glicol) além dos resíduos de aminoácido, ou em substituição pelos mesmos, da porção de ligação.
[0134]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única tendo a estrutura geral de (peptídeo CTP 1)m-(cadeia de B de insulina)- (peptídeo CTP 2)n-(cadeia A de insulina) em que m é um número inteiro selecionado a partir de 0 a 4, n é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 4, e o peptídeo CTP 1 e o peptídeo CTP2 representam sequências de aminoácidos que compreendem um peptídeo CTP em que o peptídeo CTP 1 e o peptídeo CTP 2 podem ter sequências de aminoácidos iguais ou diferentes. O peptídeo CTP pode ser qualquer peptídeo CTP conforme revelado no presente documento e a cadeia B de insulina e a cadeia A de insulina podem ser qualquer sequência revelada no presente documento ou qualquer sequência conhecida por funcionar como um agonista de receptor de insulina. Em uma modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que a dita sequência contígua de 28 aminoácidos tem uma identidade de sequência superior a 95% a SEQ ID NO: 66. Em uma modalidade, o peptídio CTP compreende a sequência SSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs5s2 (SEQ ID NO: 66), em que Xs5so e Xs1i são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina. Em outra modalidade, o peptídeo CTP compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQK (SEQ ID NO: 75), SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOR (SEQ ID NO: 64) ou SSSSRAPPPSLPSP SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 65), e, em uma modalidade adicional, o peptídeo CTP compreende a sequência SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQK (SEQ ID NO: 75).
[0135]Alternativamente, os requerentes constataram que a sequência primária do peptídeo CTP não aparenta ser fundamental (vide os dados apresentados na Figura 20). De modo correspondente, em uma modalidade, a porção de ligação compreende um peptídeo tendo um comprimento de pelo menos 18 aminoácidos que compartilha um teor de aminoácido similar. Por exemplo, em uma modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que pelo menos 58% dos aminoácidos que compreendem a dita sequência contígua com 29 aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em serina e prolina. Em uma modalidade adicional, a porção de ligação compreende pelo menos um sítio de glicosilação. Em uma modalidade, a porção de ligação compreende um análogo de (SEQ ID NO: 66), em que o dito análogo difere de (SEQ ID NO: 66) por 1,2,3,4, ou 6 substituições de aminoácido. Em uma modalidade, o peptídeo de ligação compreende um peptídeo CTP em que as substituições de aminoácido são feitas em uma ou mais posições selecionadas a partir das posições 1, 2, 3, 4, 10, 13, 15, e 21 de (SEQ ID NO: 66).
[0136]Os requerentes também constataram que múltiplas cópias do peptídeo CTP podem ser usadas como o peptídeo de ligação em análogos de cadeia única e/ou ligadas à terminação amino da cadeia B em análogos de insulina de cadeia única ou dupla. As múltiplas cópias do peptídeo CTP podem ser idênticas ou podem diferir em sequência e podem ser dispostas em uma orientação cabeça à cauda ou cabeça à cabeça. De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina que compreende um peptídeo CTP tendo a sequência (SSSSXscAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPOQXs:)n (SEQ ID NO: 66), em que n é um número inteiro selecionado a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3 e 4 e X5s0o e Xsi são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina como um análogo de cadeia dupla ou como um análogo de cadeia única em que a sequência (SSSSXsoAPPPSLP SPSRLPGPSDTPILPOQXs:)n (SEQ ID NO: 66), em que n é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3 e 4, e Xso e Xsi são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina, é ligada tanto à terminação amino como à terminação carbóxi da cadeia B, com n sendo igual ou diferente para o peptídeo CTP localizado na terminação amino e na terminação carbóxi da cadeia B.
[0137]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de agonista de insulina de cadeia única que compreende a estrutura geral B-LM-A, em que B representa uma cadeia B de insulina, A representa uma cadeia A de insulina, e LM representa uma porção de ligação ao peptídeo de pelo menos 18 aminoácidos que ligam a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A. As cadeias Ae B de insulina podem ser qualquer sequência de insulina conhecida, incluindo aquelas reveladas no presente documento, que quando ligadas entre si como um heteroduplex formam uma insulina funcional. Em uma modalidade, a cadeia B compreende a sequência R22-X25LCGX29X30oL VX3a3X34aL YLVCGX41X4a2GFXas (SEQ ID NO: 17), e a cadeia A compreende a sequência GIVXaXsCCXaXaX10CX12 LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18), em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico
X:s é histidina, treonina ou fenilalanina;
Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X10 é isoleucina ou serina;
Xi12 é serina ou ácido aspártico
X11 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina;
X17 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, ácido aspártico, ornitina ou lisina;
X18 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina;
X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina;
X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina;
Xas é histidina ou treonina;
X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina;
Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico;
Xs3 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico;
X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina;
Xa41 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina;
Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina;
Xas é tirosina ou fenilalanina;
R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-
prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; e Ri3 é COOH ou CONH2. Em uma modalidade, a cadeia B compreende, ainda, uma extensão amino-terminal que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados.
[0138]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a fórmula geral de cadeia B-LM-cadeia A, em que a cadeia B compreende a sequência Ra25-HLCGSX3oL VEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 56), LM é uma porção de ligação que compreende a sequência de SSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs: (SEQ ID NO 66) e a cadeia A compreende a sequência de GIVEQCCX:SICSLYQLENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 26), em que X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Xe é histidina, treonina ou fenilalanina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X21 é alanina, glicina ou asparagina; Xz2 É selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e desamino- fenilalanina; Xso e Xs1 são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina; e R25 é selecionado a partir do grupo que consiste em X22VNQ (SEQ ID NO: 50), um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de asparagina- glutamina, glutamina, AYRPSE (SEQ ID NO: 11), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, ácido glutâmico. Em uma modalidade, X8 e X3o são histidina, X21 é asparagina e R25 é selecionado a partir do grupo que consiste em X22VNQ (SEQ ID
NO: 50), e um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico. Em uma modalidade adicional, o análogo de insulina de cadeia única também compreende um peptídeo CTP ligado à terminação N da cadeia B. Em uma modalidade, a porção de ligação consiste em um peptídeo (SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQR)n, em que n é 1 ou 2. Em uma modalidade, proporciona-se um agonista de insulina de cadeia única que compreende a fórmula geral de cadeia B-LM-cadeia A em que a cadeia B compreende a sequência FYNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 104) ou um aminoácido que difere de SEQ ID NO: 104 por 1 a três aminoácidos selecionados independentemente a partir das posições B1, B2, B3, B4, B5, B9, B1O, B13, B14, B17, B20, B21, B22, e B23, a cadeia A compreende a sequência GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1) ou um aminoácido que difere de SEQ ID NO: 1 por 1 a três aminoácidos selecionados independentemente a partir das posições, A5, A8, A9, A1O, A12, A14, A15, A17, A18, A21, e a porção de ligação (LM) compreende a sequência (SSSSXscAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXSs:)n (SEQ ID NO: 66), em que Xso e X5s1 são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina; e n é | ou 2, com a condição de que Ba seja ligado diretamente à primeira serina de SEQ ID NO: 66 sem quaisquer aminoácidos intervenientes.
[0139]Em uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende a sequência de EEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP30; SEQ ID NO: 83),
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSD TPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP31; SEQ ID NO: 84), GEEEEEK
GPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVE QCCTSICSLYQLENYCN (DP33; SEQ ID NO: 85), FYNQHLCGSHLVEALYLVC
GERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP30; SEQ ID NO: 88), FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPP
PSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP31; SEQ ID NO: 89) ou GPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL PQOKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (DP33; SEQ ID NO: 90). Em uma modalidade, proporciona-se um dímero do análogo de insulina de cadeia única, incluindo, por exemplo, um homodímero ou heterodímeros que compreendem SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 90.
Cadeias A e B de insulina
[0140]Os agonistas de insulina de cadeia única da presente invenção podem compreender as sequências de cadeia B e A nativas de insulina humana (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente) ou qualquer um dos análogos conhecidos ou derivados destes que exibam atividade de agonista de insulina quando ligados entre si em um heteroduplex. Esses análogos incluem, por exemplo, proteínas tendo uma cadeia A e uma cadeia B que sejam diferentes da cadeia A e da cadeia B de insulina humana tendo uma ou mais exclusões de aminoácido, uma ou mais substituições de aminoácido, e/ou uma ou mais inserções de aminoácido que não destruam a atividade de insulina do análogo de insulina.
[0141]Um tipo de análogo de insulina, “análogo de insulina monomérico,” é bem conhecido na técnica. Esses análogos de rápida ação de insulina humana, incluindo, por exemplo, análogos de insulina em que: (a)o resíduo de amino acil na posição B28 é substituído por Asp, Lys, Leu, Val, ou Ala, e o resíduo de amino acil na posição B29 é Lys ou Pro; (b)os resíduos de amino acil em qualquer uma das posições B27, B28, B29, e B30 são excluídos ou substituídos por um aminoácido não-nativo. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina que compreende um Asp substituído na posição B28 ou um Lys substituído na posição 28 e uma prolina substituída na posição B29. Análogos de insulina monoméricos adicionais são revelados em Chance, et al., Patente U.S. No. 5.514.646; Chance, et al., Pedido de
Patente U.S. com número de série 08/255.297; Brems, et al., Protein Engineering, 5:527-533 (1992); Brange, et al., Publicação EPO No. 214.826 (publicada em 18 de março de 1987); e Brange, et al., Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991). Essas revelações se encontram expressamente aqui incorporadas a título de referência para descrever análogos de insulina monoméricos.
[0142]Os análogos de insulina também podem ter substituições dos aminoácidos amidados por formas acídicas. Por exemplo, Asn pode ser substituído por Asp ou Glu. De modo similar, Glh pode ser substituído por Asp ou Glu. Em particular, Asn(A18), Asn(A21), ou Asp(B3), ou qualquer combinação desses resíduos, podem ser substituídos por Asp ou Glu. Da mesma forma, GIN(A15) ou GIn(B4), ou ambos, podem ser substituídos por Asp ou Glu.
[0143]Conforme revelado no presente documento, proporcionam-se agonistas de insulina de cadeia única que compreendem uma cadeia B e uma cadeia A de insulina humana, ou análogos ou derivados destas, em que a terminação carbóxi da cadeia B é ligada à terminação amino da cadeia A através de uma porção de ligação. Em uma modalidade, a cadeia A é uma n sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1), GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5) ou GIVEECCFRSCD LALLETYCA (SEQ ID NO: 7) e a cadeia B compreende a sequência FVYNQHLCGS HLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2), GPETLCGAELVDALYLVCGDRGF YFNKPT (SEQ ID NO: 6) ou AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA (SEQ ID NO: 8), ou uma sequência carbóxi encurtada deste tendo um a cinco aminoácidos correspondentes a B26, B27, B28, B29 e B30 excluídos, e análogos dessas sequências em que cada sequência é modificada para compreender uma a cinco substituições de aminoácido nas posições correspondentes às posições de insulina nativa (vide o alinhamento peptídico mostrado na Figura 5) selecionadas a partir de A5, A8, A9, A10, A14, A15, A17, A18, A21, Bl, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14,
B20, B22, B23, B26, B27, B28, B29 e B30. Em uma modalidade, as substituições de aminoácido são substituições de aminoácido conservativas. As substituições de aminoácido adequadas nessas posições que não influenciam adversamente as atividades desejadas da insulina são conhecidas pelos indivíduos versados na técnica, conforme demonstrado, por exemplo, em Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolimers. 2007;88(5):687-713, estando a revelação deste aqui incorporada a título de referência.
[0144]De acordo com uma modalidade, os peptídeos de análogo de insulina de cadeia única podem compreender uma cadeia A de insulina e uma cadeia B de insulina ou análogos destas, em que a cadeia A compreende uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 70% de identidade de sequência (por exemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) ao longo do comprimento do peptídeo nativo, com pelo menos uma entre GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1), GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5) ou GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7) e a cadeia B compreende uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) ao longo do comprimento do peptídeo nativo, com pelo menos uma entre FVYNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2), GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 6) ou AYRPSETL CGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA (SEQ ID NO: 8) ou uma sequência carbóxi encurtada desta tendo um a quatro aminoácidos correspondentes a B27, B28, B29 e B30 excluídos.
[0145]Sequências de aminoácido adicionais podem ser adicionadas à terminação amino da cadeia B ou à terminação carbóxi da cadeia A dos agonistas de insulina de cadeia única da presente invenção. Por exemplo, pode-se adicionar uma série de aminoácidos negativamente carregados à terminação amino da cadeia B, incluindo, por exemplo, um peptídeo de 1 a 12, 1 a 10, 1 a 8 ou 1 a 6 aminoácidos de comprimento e compreendendo um ou mais aminoácidos negativamente carregados incluindo, por exemplo, ácido glutâmico e ácido aspártico. Em uma modalidade, a extensão amino terminal de cadeia B compreende 1 a 6 aminoácidos carregados. Em uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende uma extensão amino terminal de cadeia B que compreende a sequência XsoX61 Xe2X63Xe4X65K (SEQ ID NO: 19), em que Xeo é selecionado a partir do grupo que consiste em glicina, ácido glutâmico e ácido aspártico, e X61, X62, X63, X64 e X6s5 são independentemente ácido glutâmico ou ácido aspártico. Em uma modalidade, a extensão amino terminal de cadeia B compreende a sequência GX61Xe2X63X64aXesK (SEQ ID NO: 20) ou X61X62X63X64X65K (SEQ ID NO: 21), em que Xe1, Xe62, X63, Xe4 E Xss são independentemente ácido glutâmico ou ácido aspártico. Em uma modalidade, a cadeia B compreende a sequência GEEEEEKGPEHLCGAHLVDAL YLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 22), em que Xa42 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina lisina, ornitina e arginina. De acordo com uma modalidade, os análogos de insulina de cadeia única revelados compreendem uma amida C-terminal ou éster no lugar de um carboxilato C-terminal na cadeia A.
[0146]Os análogos de insulina de cadeia única de alta potência também podem ser preparados com base em sequências IGF | e IGF Il modificadas, conforme descrito no Pedido Internacional PCT/2009/068713, estando a revelação deste aqui expressamente incorporada a título de referência. Mais particularmente, os análogos de IGF | e IGF Il que compreendem uma substituição de um dipeptídeo de tirosina leucina pelos aminoácidos IGF nativos nas posições correspondentes a B16 e B17 de insulina nativa têm um aumento de dez vezes em potência no receptor de insulina. De modo correspondente, os análogos de insulina de cadeia única revelados no presente documento podem incluir uma cadeia A de IGF | (SEQ ID NO: 5) ou IGF Il (SEQ ID NO: 7) e uma cadeia B modificada de IGF | (SEQ ID NO: 6) ou IGF 11 (SEQ ID NO: 8) ou a cadeia B de insulina nativa (SEQ ID NO: 2). Além disso,
os análogos de insulina de cadeia única revelados no presente documento podem incluir uma cadeia A de insulina nativa, ou análogo desta, e uma cadeia B modificada de IGF | (SEQ ID NO: 6) ou IGF 11 (SEQ ID NO: 8), bem como análogos das ditas cadeias B. Em uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende uma cadeia A de IGF | (SEQ ID NO: 5), ou análogo ou derivado desta e uma cadeia B modificada de IGF | (SEQ ID NO: 6), IGF 11 (SEQ ID NO: 8) ou insulina nativa (SEQ ID NO: 2), ou análogos ou derivados desta.
[0147]Modificações adicionais ao IGF de cadeia única ou às cadeias A e B de insulina incluem, por exemplo, modificação dos aminoácidos em uma ou mais das posições A19, B16 ou B25 (em relação às cadeias A e B de insulina nativa) a uma 4- amino fenilalanina ou uma ou mais substituições de aminoácido nas posições selecionadas a partir de A5, A8, A9, A1O, A14, A15, A17, A18, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29 e B30 (em relação às cadeias A e B de insulina nativa) ou exclusões de qualquer ou de todas as posições B1-4 e B26-30. Em uma modalidade, as substituições nas posições selecionadas a partir de A5, A8, A9, A1O, A14, A15, A17, A18, A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B20, B21, B22, B23, B26, B27, B28, B29 e B30 são substituições de aminoácido conservativas em relação à sequência de insulina nativa.
[0148]De acordo com uma modalidade, a cadeia B compreende a sequência R22- XasL CGX29X30L VX33X34al YLVOGX41Xa2GFXas (SEQ ID NO: 17), e a cadeia À compreende a sequência GIVXaXsCCXsaXaX1oCX12aLX1aX15sLX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18), em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico Xs é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X10o é isoleucina ou serina;
Xi12 é serina ou ácido aspártico
X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina;
Xi7 é ácido glutâmico, ácido aspártico, asparagina, lisina, ornitina ou glutamina;
Xig é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina;
X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina;
X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina;
X2as é histidina ou treonina;
X29 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina;
Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico;
Xs3 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico;
X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina;
Xa41 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina;
Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina;
Xas é tirosina ou fenilalanina;
R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma amina N-terminal; e R13 é COOH ou CONH2. Em uma modalidade, Xs8, X25 e X3o são histidina. Em uma modalidade adicional, o peptídeo de análogo de insulina de cadeia única compreende um análogo da sequência peptídica de cadeia A de SEQ ID NO: 15 e/ou uma sequência peptídica de cadeia B de SEQ ID NO: 16, em que o análogo da cadeia A e da cadeia B compreende de 1 a 3 substituições de aminoácido adicionais.
[0149]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende uma sequência R22- XasLCGX29X30LVX33X3al YLVCOGX41X42GFXa5 (SEQ ID NO: 17), LM é uma porção de ligação conforme revelado no presente documento e tendo pelo menos 18 aminoácidos que liga covalentemente IB a IA, e IA compreende uma sequência GIVXaXsCOXaXaX10CX12LX1aX15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18), em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico; Xs é histidina ou fenilalanina; Xs e X14 são independentemente selecionados a partir de arginina, lisina, ornitina ou alanina; X1o é isoleucina ou serina; Xi12 é serina ou ácido aspártico; X1a é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é arginina, lisina, ornitina ou leucina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X18 é metionina, asparagina ou treonina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X21 é alanina, glicina ou asparagina;
Xas é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X2a9 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Xs33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico e ácido glutâmico; X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; Xai É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; Xa2 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma amina N-terminal; e Ria é COOH ou CONH>?, em que o aminoácido na designação Xa5 é diretamente ligado à porção de ligação, LM (isto é, a designação IB-LM-IA conforme o uso em questão é destinada a representar que a terminação carboxila de cadeia B e a terminação amino de cadeia A são diretamente ligados à porção de ligação LM em quaisquer aminoácidos intervenientes adicionais). A porção de ligação pode ser qualquer uma das estruturas descritas no presente documento.
[0150]De acordo com uma modalidade, proporciona-se uma análogo de insulina em que a cadeia A do peptídeo de insulihta compreende a sequência GIVEQCCXsSICSLYQLX1i7NX19C0X23 (SEQ ID NO: 23) e a cadeia B compreende a sequência X2aLCGX29X3oL VEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 24) em que Xz é selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e histidina;
X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; Xa3 é asparagina ou glicina; X2a4 É selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X2a9 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico. Em uma modalidade adicional, a cadeia B compreende a sequência X22VNQX25LCGX29X30L VEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 25) em que X22 é selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e desamino- fenilalanina; X2a5 É selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X29 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Z1 é um dipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em aspartato- lisina, lisina-prolina, e prolina-lisina; e B1: é selecionado a partir do grupo que consiste em treonina, alanina ou um tripeptídeo de treonina-arginina-arginina.
[0151]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência Xa2sLCGX29X3olL VEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 24), LM é uma porção de ligação conforme revelado no presente documento que liga covalentemente |B a IA, e IA compreende a sequência GIVEQCCXaSICSLYQLENX19CX21 (SEQ ID NO: 26). De acordo com uma modalidade, a cadeia A compreende a sequência GIVEQCCXsSICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 23) ou GIVDECCXsXsSCDLX1aX15LX17X18X19CX21-Ria (SEQ ID NO: 27), e a cadeia B compreende a sequência XasLCGX29X3oL VX3aaXs3alL YLVCGDX42GFXa5 (SEQ ID NO: 28) em que Xs é histidina ou fenilalanina; Xs e X11 são independentemente selecionados a partir de arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é arginina, lisina, ornitina ou leucina; Xi7 é ácido glutâmico ou glutamina; X18 é metionina, asparagina ou treonina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X21 é alanina, glicina ou asparagina; X23 é asparagina ou glicina; X2a5 É selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X29 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Xs33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico e ácido glutâmico; Xs34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas é tirosina; e R13 é COOH ou CONH2. Em uma modalidade, pelo menos um entre ne k é
1.
[0152]JEM uma modalidade adicional, a cadeia A compreende a sequência GIVDECCHXsSCDLX1aX15sLX17X18X19C0X21-Ria (SEQ ID NO: 27), e a cadeia B compreende a sequência X2sLCGX29X3oL VX3a3X3aL YLVCGDXa2GFXas (SEQ ID NO: 28) em que
Xa e Xi são independentemente selecionados a partir de arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X15 é arginina, lisina, ornitina ou leucina;
Xi7 é ácido glutâmico, ácido aspártico, asparagina, lisina, ornitina ou glutamina;
Xi18 é metionina, asparagina ou treonina;
X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina;
X21 é alanina, glicina ou asparagina;
X23 é asparagina ou glicina;
X25 é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina;
X29 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina;
X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico;
X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico e ácido glutâmico;
X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina;
Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina;
Xas é tirosina ou fenilalanina e
Rig é COOH ou CONH2. Em uma modalidade adicional, a cadeia A compreende a sequência GIVDECCHXsaSCDLX14X15LX17MX19CX21-Ri3 (SEQ ID NO: 29), e a cadeia B compreende a sequência X2sLCGAX3oLVDALYLVCGDXa2GFXas (SEQ ID NO: 30) em que
Xa, X14 E X15 são independentemente ornitina, lisina ou arginina;
X17 é ácido glutâmico ou glutamina;
X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina;
X21 é alanina, glicina ou asparagina;
Xas é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico e ácido glutâmico; Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas é tirosina ou fenilalanina e R13 é COOH ou CONH2. Em uma modalidade, a cadeia B é selecionada a partir do grupo que consiste em HLCGAELVDALYLVCGDXa2GFY (SEQ ID NO: 31), GPEHLCGAELVDALYLVCGDXsGFY (SEQ ID NO: 32) GPEHLCGAELV DALYLVCGDX4s2GFYFNPKT (SEQ ID NO: 33) e GPEHLCGAELVDALYL VCGDX4s2GFYFNKPT (SEQ ID NO: 34), em que Xa42 é selecionado a partir do grupo que consiste em ornitina, lisina e arginina. Em uma modalidade adicional, a cadeia A compreende a sequência GIVDECCHXsSCDLX14X15sLQMYCN-R13 (SEQ ID NO: 36), em que Xs, X1a e X15 são independentemente ornitina, lisina ou arginina.
[0153]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a fórmula geral de IB-LM-IA, em que IB é uma sequência de aminoácido — selecionada a partir do grupo que consiste em HLCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 31), GPEHLCGAELVDALYLVCGD X42GFY (SEQ ID NO: 32), GPEHLCGAELVDALYLVCGDXa2GFYFNPKT (SEQ ID NO: 33) e GPEHLCGAELVDALYLVCGDXa2GFYFNKPT (SEQ ID NO: 34), LM é uma porção de ligação conforme revelado no presente documento.
[0154]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência X2sLCGX29X3oLVX33X34aL YLVCGDXa2GFXas (SEQ ID NO: 28), LM é uma porção de ligação conforme revelado no presente documento que liga covalentemente IB a IA, e IA compreende a sequência GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21-Ria (SEQ ID NO: 37) ou
GIVDECCXsaXaSCDLX1aX15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 38), em que o resíduo de fenilalanina C-terminal de SEQ ID NO: 58 é direta e covalentemente ligado à porção de ligação, LM, na ausência de quaisquer aminoácidos intervenientes.
De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a sequência X2s5LCGX29X3oLVX33X3al YLVCGDX4a2GFXa5 (SEQ ID NO: 28)- (SSSSXs5oAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQXSs1)n (SEQ ID NO: 66)- GIVDECCXsXsSCDLX1aX15LX17X18X19CX21-Ria (SEQ ID NO: 27) ou X2sLCG XasX3o0LVX33X3al YLVOCGDXa2GFXas(Y1)< (SEQ ID NO: 28)- (SSSSXsoAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPOQXs:)n (SEQ ID NO: 66)- GIVEQCCHSICSLYQLENX19CX21- R13 (SEQ ID NO: 37), em que
Xs é histidina, treonina ou fenilalanina;
Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina;
Xi7 é ácido glutâmico, ácido aspártico, asparagina, lisina, ornitina ou glutamina;
Xig é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina;
X19 é tirosina, 4-metóxi fenilalanina ou 4-amino-fenilalanina;
X21 é alanina, glicina ou asparagina;
Xas é histidina ou treonina;
X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina;
X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico;
X33 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico;
X341 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina;
Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas é tirosina ou fenilalanina; e Xso e Xs1 são independentemente arginina ou lisina e né 1 ou 2.
[0155]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que |B compreende a sequência X25sLCGX29X30oL VX33X34aL YLVCGDXa2GFXas (SEQ ID NO: 28), LM é uma porção de ligação conforme revelado no presente documento e a cadeia À compreende a sequência GIVDECCHXsSCDLX14X15sLQMYCN-R13 (SEQ ID NO: 36), em que Xs, Xi e Xi5 são independentemente ornitina, lisina ou arginina e Ri3 é COOH ou CONH>.
[0156]EmM uma modalidade, a cadeia B é selecionada a partir do grupo que consiste em FVYNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 104), HLCGAELV DALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 39), GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFY (SEQ ID NO: 40), GPEHLCGAELVDALYLVCGDOGFYFNPKT (SEQ ID NO: 41) e GPEHLCG AELVDALYLVCGDOGFYFNKPT (SEQ |D NO: 42) e a cadeia A é GIVDECCHOSCDLOOLQMX1sCN-Ri3 (SEQ ID NO: 43) ou SEQ ID NO: 1, em que X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina.
[0157]EmM uma modalidade, a insulina de cadeia única compreende, ainda, uma cadeia de polietileno glicol covalentemente ligada à cadeia lateral de um aminoácido da porção de ligação e/ou em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em A9, A14 e A15 da cadeia A ou posições BO, B1, B10, B22, B28 ou B29 da cadeia B. Em uma modalidade, a cadeia de polietileno glicol é covalentemente ligada ao aminoácido amino-terminal da cadeia B.
Síntese de análogos de insulina
[0158]A presente revelação também se refere à sequência de ácido nucléico que codifica qualquer um dos análogos de insulina revelados no presente documento,
bem como células hospedeiras que compreendem tais sequências de ácido nucléico. Os análogos de insulina de cadeia única revelados no presente documento podem ser expressos usando técnicas padrão e vetores de expressão conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Os análogos de insulina revelados no presente documento podem ser expressos em células hospedeiras procarióticas (por exemplo, E coli) ou eucarióticas (células de levedura, células de mamíferos). De acordo com uma modalidade, os análogos de insulina hiperglicosilados são sintetizados usando células hospedeiras eucarióticas recombinantes que compreendem uma sequência de ácido nucléico que codifica um análogo de insulina revelado no presente documento que compreende um peptídeo CTP. Em uma modalidade, a célula hospedeira eucariótica é uma célula de levedura, mais tipicamente, uma célula de levedura (por exemplo, P. pastoris) que foi modificada para expressar genes de glicosilação humana. Alternativamente, a célula hospedeira em uma modalidade é uma célula hospedeira de mamífero (por exemplo, células CHO), opcionalmente modificada para expressar genes de glicosilação humana.
[0159]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um método para produzir um análogo de insulina hiperglicosilado, em que o método compreende culturar uma célula hospedeira que compreende um gene de codificação de análogo de insulina modificado por CTP sob condições em que a proteína de análogo de insulina modificado por CTP é produzida. A proteína expressa pode, então, ser recuperada a partir da cultura. Em uma modalidade, a célula hospedeira expressa uma cadeia B de insulina da fórmula geral (peptídeo CTP 1)m-(cadeia B de insulina)-(peptídeo CTP 2)n em que m é um número inteiro selecionado a partir de O a 4, n é um número inteiro selecionado a partir de O a 4, e peptídeo CTP 1 e peptídeo CTP 2 representam sequências de aminoácidos que compreendem um peptídeo CTP em que o peptídeo CTP 1 e o peptídeo CTP 2 podem ter sequências de aminoácidos iguais ou diferentes. A mesma célula também pode expressar a cadeia A de insulina em que a cadeia B e cadeia A são recuperadas a partir da célula e reconstituídas como uma insulina de cadeia dupla. Alternativamente, a cadeia A pode ser expressa em uma célula hospedeira separada que seja co-culturada com a primeira célula recombinante ou culturada separadamente.
[0160]EmM uma modalidade, proporciona-se uma célula hospedeira que compreende um gene que codifica um análogo de insulina de cadeia única em que a porção de ligação que liga a terminação carbóxi da cadeia B de insulina à terminação amino da cadeia A compreende um peptídeo CTP. Em uma modalidade alternativa, o gene codifica um análogo de insulina de cadeia única que compreende um peptídeo CTP ligado à terminação N da cadeia B. Em uma modalidade, o gene codifica um análogo de cadeia única que compreende um primeiro peptídeo CTP ligado à terminação N da cadeia B e a porção de ligação que compreende um segundo peptídeo CTP, em que o primeiro e o segundo peptídeos CTP são iguais ou diferentes. Em uma modalidade, o peptídeo CTP compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 64 ou SEQ ID NO: 75.
[0161]Em uma modalidade, a célula hospedeira expressa um análogo de insulina de cadeia única da fórmula geral (peptídeo CTP 1)m-(cadeia B de insulina)-(peptídeo CTP 2)n-(cadeia A de insulina) em que m é um número inteiro selecionado a partir de 0 a 4, n é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 4, e o peptídeo CTP 1 e o peptídeo CTP2 representam sequências de aminoácidos que compreendem um peptídeo CTP em que o peptídeo CTP 1 e o peptídeo CTP2 podem ter sequências de aminoácidos iguais ou diferentes. O método compreende as etapas de culturar as células hospedeiras que compreendem o gene que codifica um análogo de insulina CTP sob condições em que a dita proteína é produzida e recupera a proteína a partir da cultura.
[0162]Em uma modalidade, o análogo de insulina é expresso como um análogo de cadeia única em que a porção de ligação compreende um sítio de clivagem de peptídeo exclusivo na junção da porção de ligação e da cadeia A de insulina, e o método compreende, ainda, a etapa de clivar a proteína recuperada para produzir um análogo de insulina de cadeia dupla. Qualquer enzima de clivagem de peptídeo pode ser usada, desde eu o peptídeo de reconhecimento não esteja localizado nas sequências de cadeia B ou A de insulina. Em uma modalidade, a porção de ligação compreende a sequência SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQK (SEQ ID NO: 79) e o análogo de insulina de cadeia única expresso é clivado com Lys C para produzir um análogo de insulina de cadeia dupla. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de levedura que foi modificada para expressar somente enzimas de glicosilação humana. Em uma modalidade alternativa, a célula hospedeira é uma linhagem celular de mamífero que inclui, por exemplo, células CHO. Peguilação de análogos de insulina
[0163]A ligação covalente de uma porção hidrofílica aos análogos de insulina revelados no presente documento pode acentuar adicionalmente as propriedades dos análogos de insulina contendo CTP para proporcionar análogos tendo um princípio mais lento, duração estendida e exibindo um perfil basal de atividade. Em uma modalidade, os análogos de insulina revelados no presente documento (isto é, modificados para conter um sítio de glicosilação) são adicionalmente modificados para compreender uma porção hidrofílica covalentemente ligada à cadeia lateral de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em A9, A1l4 e A15 da cadeia A ou posições BO, B1, B10, B22, B28 ou B29 da cadeia B ou em qualquer posição da porção de ligação que ligue a cadeia A e a cadeia B. Em modalidades exemplificadoras, esta porção hidrofílica é covalentemente ligada a um resíduo de Lys, Cys, Orn, homocisteína, ou acetil-fenilalanina em qualquer uma dessas posições. Em uma modalidade, a porção hidrofílica é covalentemente ligada à cadeia lateral de um aminoácido da porção de ligação.
[0164]As porções hidrofílicas exemplificadoras incluem polietileno glicol (PEG), por exemplo, com um peso molecular de cerca de 1.000 Daltons a cerca de 40.000 Daltons, ou cerca de 20.000 Daltons a cerca de 40.000 Daltons. Porções hidrofílicas adequadas adicionais incluem polipropileno glicol, polióis polioxietilados (por exemplo, POG), sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), polioxialquilenos, polietileno glicol propionaldeído, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, monometóxi-polietileno glicol, mono-(C1-Ci1o) alcóxi- ou arilóxi- polietileno glicol, carboximetilcelulose, poliacetais, álcool polivinílico (PVA), pirrolidona polivinílica, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maléico, poli (beta-aminoácidos) (sejam homopolímeros ou copolímeros aleatórios), poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol (PPG) e outros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, ácidos colônicos ou outros políneros de polissacarídeo, Ficoll ou dextrano e misturas destes.
[0165]A porção hidrofílica, por exemplo, cadeia de polietileno glicol de acordo com algumas modalidades tem um peso molecular selecionado a partir da faixa de cerca de 500 a cerca de 40.000 Daltons. Em uma modalidade, a porção hidrofílica, por exemplo, PEG, tem um peso molecular selecionado a partir da faixa de cerca de 500 a cerca de 5.000 Daltons, ou cerca de 1.000 a cerca de 5.000 Daltons. Em outra modalidade, a porção hidrofílica, por exemplo, PEG, tem um peso molecular de cerca de 10.000 a cerca de 20.000 Daltons. Ainda em outra modalidade exemplificadora, a porção hidrofílica, por exemplo, PEG, tem um peso molecular de cerca de 20.000 a cerca de 40.000 Daltons. Em uma modalidade, a porção hidrofílica, por exemplo, PEG, tem um peso molecular de cerca de 20.000 Daltons. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única em que um ou mais aminoácidos do análogo são peguilados, e o peso molecular combinado das cadeias PEG covalentemente ligadas é cerca de 20.000 Daltons.
[0166]Em uma modalidade, dextranos são usados como a porção hidrofílica. Os dextranos são polímeros de polissacarídeco de subunidades de glicose, predominantemente ligadas por ligações a1-6. Dextrano se encontra disponível em muitas faixas de peso molecular, por exemplo, cerca de 1 kD a cerca de 100 kD, ou de cerca de 5, 10, 15 ou 20 KkD a cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 kD.
[0167]Contemplam-se polímeros lineares ou ramificados. As preparações resultantes de conjugados podem ser essencialmente monodispersas ou polidispersas, e podem ter cerca de 0,5, 0,7, 1, 1,2, 1,5 ou 2 porções poliméricas por peptídeo.
[0168]Em uma modalidade, a porção hidrofílica é uma cadeia de polietileno glicol (PEG), opcionalmente ligada à cadeia lateral de um aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em A9, A14 e A15 da cadeia A, no aminoácido amino terminal da cadeia B, nas posições B10, B22, B28 ou B29 da cadeia B ou em qualquer posição da porção de ligação que ligue a cadeia Ae a cadeia B. Em uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende uma porção de ligação de peptídeo, em que um dos aminoácidos da porção de ligação tem uma cadeia de polietileno covalentemente ligada a sua cadeia lateral. Em uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende uma porção de ligação de peptídeo, em que um aminoácido da porção de ligação é peguilado, e um ou mais aminoácido em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em A9, A14 e A15 da cadeia A, no aminoácido amino terminal da cadeia B e nas posições B10, B22, B28 ou B29 da cadeia B também são peguilados. Em uma modalidade, o peso molecular total da(s) cadeia(s) PEG covalentemente ligada(s) é cerca de 20.000 Daltons.
[0169]EmM uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única, em que um dos aminoácidos da porção de ligação tem uma cadeia de polietileno de 20.000 Daltons covalentemente ligada a sua cadeia lateral. Em outra modalidade, um análogo de insulina de cadeia única compreende uma cadeia de polietileno covalentemente ligada a um dos aminoácidos da porção de ligação e uma segunda cadeia PEG ligada a um aminoácido amino terminal em B29 da cadeia B. Em uma modalidade, quando duas cadeias PEG forem ligadas ao análogo de insulina de cadeia única, cada cadeia PEG tem um peso molecular de cerca de
10.000 Daltons.
[0170]As porções hidrofílicas, como polietileno glicol, podem ser ligadas ao análogo de insulina sob quaisquer condições adequadas usadas para reagir uma proteína com uma molécula de polímero ativada. Pode-se usar qualquer meio conhecido na técnica, incluindo através de acilação, alquilação redutiva, adição de Michael, alquilação de tiol ou outros métodos de conjugação/ligação quimiosseletivos através de um grupo reativo na porção PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, a-haloacetil, maleimido ou hidrazino) a um grupo reativo no composto alvo (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, a- haloacetil, maleimido ou hidrazino). Os grupos de ativação que podem ser usados para ligar o polímero solúvel em água a uma ou mais proteínas incluem, sem caráter limitativo, sulfona, maleimida, sulfidril, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano e 5- piridil. Caso seja ligado ao peptídeo por alquilação redutiva, o polímero selecionado deve ter um único aldeído reativo de modo que o grau de polimerização seja controlado. Vide, por exemplo, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); e Zalipsky et al, Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995).
[0171]EmM um aspecto específico da invenção, um resíduo de aminoácido no análogo de insulina tendo um tiol é modificado com uma porção hidrofílica, como PEG. Em algumas modalidades, o tiol é modificado com PEG ativado por maleimida em uma reação de adição de Michael para resultar em um peptídeo PEGuilado que compreende a ligação de tioéter mostrada abaixo:
Ns o
H Lito, O O :
[0172]EmM algumas modalidades, o tiol é modificado com um PEG ativado por haloacetil em uma reação de substituição nucleofílica para resultar em um peptídeo PEGuilado que compreende a ligação de tioéter mostrada abaixo: Peptídeo Lana
O É Acilação de análogos de insulina
[0173]EM algumas modalidades, o análogo de insulina é modificado para compreender um grupo acila. O grupo acila pode ser covalentemente ligado diretamente a um aminoácido do análogo de insulina, ou indiretamente a um aminoácido do análogo de insulina através de um espaçador, em que o espaçador é posicionado entre o aminoácido do análogo de insulina e o grupo acila. O análogo de insulina pode ser acilado na mesma posição de aminoácido onde uma porção hidrofílica é ligada, ou em uma posição de aminoácido diferente. Por exemplo, a acilação pode ocorrer em qualquer posição incluindo qualquer aminoácido das cadeias A ou B, bem como uma posição na porção de ligação, desde que a atividade exibida pelo análogo de insulina não-acilado seja retida mediante a acilação. Exemplos não-limitantes incluem acilação nas posições A14 e A15 da cadeia A, nas posições de aminoácido amino terminal (B1 para cadeias B à base de insulina ou B2 para cadeias B à base de IGF), B10, B22, B28 ou B29 da cadeia B ou em qualquer posição da porção de ligação.
[0174]Em um aspecto específico da invenção, o análogo de insulina (ou derivado ou conjugado deste) é modificado para compreender um grupo acila por acilação direta de uma amina, hidroxila, ou tiol de uma cadeia lateral de um aminoácido do análogo de insulina. Em algumas modalidades, o análogo de insulina é diretamente acilado através da amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol de um aminoácido. Em algumas modalidades, a acilação se encontra na posição B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido das sequências de cadeia A e B de insulina nativa). Neste sentido, pode-se proporcionar um análogo de insulina que tenha sido modificado por uma ou mais substituições de aminoácido na sequência de cadeia À ou B, incluindo, por exemplo, nas posições A14, A15, B1/B2, B10, B22, B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido das sequências de cadeia A e B de insulina nativa) ou em qualquer posição da porção de ligação com um aminoácido que compreende uma amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol. Em algumas modalidades específicas da invenção, a acilação direta do análogo de insulina ocorre através da amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol do aminoácido na posição B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido das sequências de cadeia A e B de insulina nativa).
[0175]Em uma modalidade, o análogo de insulina compreende um aminoácido de Fórmula |:
H HAN—=C—COOH oa, he em que n= 1 a4 [Fórmula |]
[0176]Em algumas modalidades exemplificadoras, o aminoácido de Fórmula |, é o aminoácido em que n é 4 (Lys) ou n é 3 (Orn).
[0177]Em outra modalidade, o análogo de insulina compreende um aminoácido de
Fórmula |l:
H HAN—C— CcooH to, em quen=1a4 [Fórmula 1]
[0178]Em algumas modalidades exemplificadoras, o aminoácido de Fórmula Il é o aminoácido em que n é 1 (Ser).
[0179]Ainda em outra modalidade, o análogo de insulina que compreende um tiol de cadeia lateral é um aminoácido de Fórmula Ill:
H HaN—C— COooH o kh em que n=1a4 [Fórmula Il]
[0180]Em algumas modalidades exemplificadoras, o aminoácido de Fórmula Ill é o aminoácido em que n é 1 (Cys).
[0181]Ainda em outra modalidade, o análogo de insulina compreende um aminoácido bi-substituído que compreende a mesma estrutura de Fórmula |, Fórmula 1l, ou Fórmula Ill, exceto pelo fato de que o hidrogênio ligado ao alfa carbono do aminoácido de Fórmula |, Fórmula Il, ou Fórmula Ill é substituído por uma segunda cadeia lateral.
[0182]De acordo com uma modalidade, os análogos de insulina acilados compreendem um espaçador entre o peptídeo e o grupo acila. Em algumas modalidades, o análogo de insulina é covalentemente ligado ao espaçador, que é covalentemente ligado ao grupo acila. Em algumas modalidades exemplificadoras, o análogo de insulina é modificado para compreender um grupo acila por acilação de uma amina, hidroxila, ou tiol de um espaçador, sendo que tal espaçador é ligado a uma cadeia lateral de um aminoácido na posição B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido da cadeia A ou B de insulina nativa), ou em qualquer posição da porção de espaçador. O aminoácido do análogo de insulina ao qual o espaçador é ligado pode ser qualquer aminoácido que compreenda uma porção que permita uma ligação ao espaçador. Por exemplo, um aminoácido que compreende uma cadeia lateral -NH2, -OH, ou -COOH (por exemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, ou Glu) é adequado.
[0183]EmM algumas modalidades, o espaçador entre o análogo de insulina e o grupo acila é um aminoácido que compreende uma amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol (ou um dipeptídeo ou tripeptídeo que compreende um aminoácido compreendendo uma amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol). Em algumas modalidades, o espaçador compreende um espaçador bifuncional hidrofílico. Em uma modalidade específica o espaçador compreende um amino poli(alquilóxi)carboxilato. Neste sentido, o espaçador pode compreender, por exemplo, NH2(CH2CH2O0)n(CH2)mCOOH, em que m é qualquer número inteiro de 1 a 6 e n é qualquer número inteiro de 2 a 12, como, por exemplo, ácido 8-amino-3,6- dioxaoctanóico, que se encontra comercialmente disponível junto a Peptides International, Inc. (Louisville, KY, EUA). Em uma modalidade, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende dois ou mais grupos reativos, por exemplo, um grupo amina, hidroxila, tiol, e carboxila ou quaisquer combinações destes. Em determinadas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo hidroxila e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo amina e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo tiol e um carboxilato.
[0184]Em algumas modalidades, o espaçador entre o peptídeo de análogo de insulina e o grupo acila é um espaçador bifuncional hidrofóbico. Os espaçadores bifuncionais hidrofóbicos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, EUA, 1996), que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência. Em determinadas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende dois ou mais grupos reativos, por exemplo, um grupo amina, hidroxila, tiol, e carboxila ou quaisquer combinações destes. Em determinadas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo hidroxila e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo amina e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo tiol e um carboxilato. Os espaçadores bifuncionais hidrofóbicos adequados que compreendem um carboxilato e um grupo hidroxila ou um grupo tiol são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ácido 8- hidroxioctanóico e ácido 8-mercaptooctanóico.
[0185]De acordo com determinadas modalidades, o espaçador bifuncional pode ser um aminoácido sintético ou um aminoácido de ocorrência natural que compreende uma cadeia principal de aminoácido que tenha 3 a 10 átomos de comprimento (por exemplo, ácido 6-amino hexanóico, ácido 5-amino valérico, ácido 7- aminoeptanóico, e ácido 8-aminooctanóico). Alternativamente, o espaçador pode ser um espaçador de dipeptídeo ou tripeptídeo tendo uma cadeia principal de peptídeo que tenha 3 a 10 átomos (por exemplo, 6 a 10 átomos) de comprimento. Cada aminoácido do espaçador de dipeptídeo ou tripeptídeo ligado ao análogo de insulina pode ser independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em: aminoácidos de ocorrência natural e/ou aminoácidos de ocorrência não-natural, incluindo, por exemplo, qualquer um dos isômeros D ou L dos aminoácidos de ocorrência natural (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), ou qualquer um dos isômeros D ou L dos aminoácidos de ocorrência não-natural selecionados a partir do grupo que consiste em: B-alanina (B-Ala), N-a-metil-alanina (Me-Ala), ácido aminobutírico (Abu), ácido a-aminobutírico (y-Abu), ácido aminoexanóico (e-Ahx), ácido aminoisobutírico (Aib), ácido aminometilpirrola carboxílico, ácido aminopiperidina carboxílico, aminoserina (Ams), ácido aminotetraidropiran-4-carboxílico, arginina N-metóxi-N-metil amida, ácido B- aspártico (B-Asp), ácido azetidina carboxílico, 3-(2-benzotiazolil)alanina, a-terc- butilglicina, ácido 2-amino-5-ureido-n-valérico (citrulina, Cit), B-cicloexilalanina (Cha), acetamidometil-cisteína, ácido diaminobutanóico (Dab), ácido diaminopropiônico (Dpr), diidroxifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), ácido y-glutâmico (y- Glu), homosserina (Hse), hidroxiprolina (Hyp), isoleucina N-metóxi-N-metil amida, metil-isoleucina (Melle), ácido isonipecótico (Isn), metil-leucina (MeLeu), metil-lisina, dimetil-lisina, trimetil-lisina, metanoprolina, metionina-sulfóxido (Met(O)), metionina- sulfona (Met(O>2)), norleucina (Nle), metil-norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina — (Orn), ácido para-aminobenzóico (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4- F)), 4-nitrofenilalanina (Phe(4-NO2)), 4-cianofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-deidroprolina, pirrolidinilalanina, sarcosina (Sar), selenocisteína (Sec), U-benzil-fosfoserina, 4-ácido amino-3-hidróxi- 6-metileptanóico (Sta), ácido 4-amino-S-cicloexil-3-hidroxipentanócio (ACHPA), ácido 4-amino-3-hidróxi-5-fenilpentanóico (AHPPA), ácido 1,2,3,4,-tetraidro-isoquinolina-3- carboxílico (Tic), tetraidropiranglicina, tienilalanina (Thi), U-benzil-fosfotirosina, O- fosfotirosina, “metoxitirosina, etoxitirosina, “O-(bis-dimetilamino-fosfono)-tirosina, tirosina sulfato de tetrabutilamina, metil-valina (MeVal), ácido 1-amino-1-cicloexano carboxílico (Acx), ácido aminovalérico, beta-ciclopropil-alanina (Cpa), propargilglicina (Prg), alilglicina (Alg), ácido 2-amino-2-cicloexil-propanóico (2-Cha), terc-butilglicina
(Tbg), vinilglicina (Vg), ácido 1-amino-1-ciclopropano carboxílico (Acp), ácido 1- amino-1-ciclopentano carboxílico (Acpe), ácido 3-mercaptopropiônico alquilado, ácido 1-amino-1-ciclobutano carboxílico (Acb). Em algumas modalidades, o espaçador de dipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ala-Ala, B-Ala-B-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, ácido y-aminobutírico-ácido y-aminobutírico, e y-Glu- y-Glu.
[0186]O peptídeo de análogo de insulina pode ser modificado para compreender um grupo acila por acilação de um alcano de cadeia longa. Em aspectos específicos, o alcano de cadeia longa compreende um grupo amina, hidroxila, ou tiol (por exemplo octadecilamina, tetradecanol, e hexadecanotiol) que reage com um grupo carboxila, ou forma ativada deste, do análogo de insulina. O grupo carboxila, ou forma ativada deste, do análogo de insulina pode ser parte de uma cadeia lateral de um aminoácido (por exemplo, ácido glutâmico, ácido aspártico) do análogo de insulina ou pode ser parte da cadeia principal de peptídeo.
[0187]Em determinadas modalidades, o análogo de insulina é modificado para compreender um grupo acila por acilação do alcano de cadeia longa por um espaçador que é ligado ao análogo de insulina. Em aspectos específicos, o alcano de cadeia longa compreende um grupo amina, hidroxila, ou tiol que reage com um grupo carboxila, ou forma ativada deste, do espaçador. Espaçadores adequados que compreende um grupo carboxila, ou forma ativada deste, são descritos no presente documento e incluem, por exemplo, espaçadores bifuncionais, por exemplo, aminoácidos, dipeptídeos, tripeptídeos, espaçados bifuncionais hidrofílicos e espaçadores bifuncionais hidrofóbicos. Conforme o uso em questão, o termo “forma ativada de um grupo carboxila” se refere a um grupo carboxila com a fórmula geral R(C=O)X, em que X é um grupo de partida e R é o análogo de insulina ou o espaçador. Por exemplo, as formas ativadas de grupos carboxila podem incluir, mas não se limitam a, cloretos de acila, anidridos, e ésteres. Em algumas modalidades, o grupo carboxila ativado é um éster com um grupo de partida de N- hidroxisuccinimida (NHS).
[0188]Em relação a esses aspectos da invenção, em que um alcano de cadeia longa é acilado pelo peptídeo de análogo de insulina ou pelo espaçador, o alcano de cadeia longa pode ter qualquer tamanho e pode compreender qualquer comprimento de cadeia de carbono. O alcano de cadeia longa pode ser linear ou ramificado. Em determinados aspectos, o alcano de cadeia longa é um Ca a Cão alcano. Por exemplo, o alcano de cadeia longa pode ser qualquer um entre Ca alcano, Cs alcano, Cs alcano, Cio alcano, Ci2 alcano, Cia alcano, Ci6 alcano, Ci8 alcano, Co alcano, C22 alcano, C2a alcano, Ca6 alcano, Ca8 alcano, ou C3o alcano. Em algumas modalidades, o alcano de cadeia longa compreende Cs a C2o alcano, por exemplo, C14 alcano, C16 alcano, ou Ci3 alcano.
[0189]Em algumas modalidades, um grupo amina, hidroxila, ou tiol do análogo de insulina é acilado com um ácido de colesterol. Em uma modalidade específica, o peptídeo é ligado ao ácido de colesterol através de um espaçador Cys des-amino alquilado, isto é, um espaçador de ácido 3-mercaptopropiônico alquilado. Métodos adequados de acilação peptídica através de aminas, hidroxilas, e tióis são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); e Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (para métodos de acilação através de uma hidroxila); e San and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (para métodos de acilação através de um tiol); Bioconjugate Chem. “Chemical Modifications of Proteins: History and Applications” páginas 1, 2 a 12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. “Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity” Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989).
[0190]O grupo acila do peptídeo de análogo de insulina acilado pode ter qualquer tamanho, por exemplo, qualquer comprimento de cadeia de carbono, pode ser linear ou ramiíficado. Em algumas modalidades específicas da invenção, o grupo acila é um Ca à C3o ácido graxo. Por exemplo, o grupo acila pode ser qualquer Ca ácido graxo, Cs ácido graxo, Cs ácido graxo, Cio ácido graxo, C12 ácido graxo, Cia ácido graxo, C16 ácido graxo, C18 ácido graxo, Cao ácido graxo, C22 ácido graxo, Ca4 ácido graxo, Ca6 ácido graxo, Ca8 ácido graxo, ou C3o ácido graxo. Em algumas modalidades, o grupo acila é Cs a C2o ácido graxo, por exemplo, Ci14 ácido graxo ou C16 ácido graxo.
[0191]Em uma modalidade alternativa, o grupo acila é um ácido biliar. O ácido biliar pode ser qualquer ácido biliar adequado incluindo, mas sem limitar-se a, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocólico, e ácido de colesterol.
[0192]O análogo de insulina acilado descrito no presente documento pode ser adicionalmente modificado para compreender uma porção hidrofílica. Em algumas modalidades específicas, a porção hidrofílica pode compreender uma cadeia de polietileno glicol (PEG). A incorporação de uma porção hidrofílica pode ser cumprida através de qualquer meio adequado, tal como qualquer um dos métodos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o análogo acilado compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Cys, Lys, Orn, homo- Cys, ou Ac-Phe, e a cadeia lateral do aminoácido é covalentemente ligada a uma porção hidrofílica (por exemplo, PEG). Em uma modalidade, o grupo acila é ligado à posição A14, A15, BO, B1, B1O, B22, B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido das cadeias A e B de insulina nativa), opcionalmente através de um espaçador que compreende Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ou Ac- Phe.
[0193] Alternativamente, o análogo de insulina acilado compreende um espaçador, em que o espaçador é tanto acilado como modificado para compreender a porção hidrofílica. Exemplos não-limitantes de espaçadores adequados incluem um espaçador que compreende um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em Cys, Lys, Orn, homo-Cys, e Ac-Phe.
Alquilação do análogo de insulina
[0194]EM algumas modalidades, o análogo de insulina modificado para compreender um sítio de glcosilação é adicionalmente modificado para compreender um grupo alquila. O grupo alquila pode ser covalentemente ligado diretamente a um aminoácido do análogo de insulina, ou indiretamente a um aminoácido do análogo de insulina através de um espaçador, em que o espaçador é posicionado entre o aminoácido do análogo de insulina e o grupo alquila. O grupo alquila pode ser ligado ao análogo de insulina através de uma ligação de éter, tioéter, ou amino. Por exemplo, o análogo de insulina pode ser alqguilado na mesma posição de aminoácido onde uma porção hidrofílica é ligada, ou em uma posição de aminoácido diferente.
[0195]A alquilação pode ser realizada em qualquer posição no análogo de insulina, incluindo, por exemplo, na região C-terminal da cadeia B ou em uma posição na porção de ligação, desde que a atividade de insulina seja retida. Em um aspecto específico da invenção, o análogo de insulina é modificado para compreender um grupo alquila por alquilação direta de uma amina, hidroxila, ou tiol de uma cadeia lateral de um aminoácido do análogo de insulina. Em algumas modalidades, o análogo de insulina é diretamente alquilado através da amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol de um aminoácido. Em algumas modalidades específicas da invenção, a alquilação direta do análogo de insulina ocorre através da amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol do aminoácido na posição A14, A15, BO, B1, B1O, B22, B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido da cadeia A e B de insulina nativa).
[0196]Em algumas modalidades, o aminoácido do análogo de insulina compreende um aminoácido selecionado a partir da Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill, e o grupo alquila é ligado através do grupo amino, hidroxila ou tiol contido na Fórmula |, Fórmula |l, e Fórmula ll, respectivamente. Em algumas modalidades exemplificadoras, o aminoácido de Fórmula | é o aminoácido em que n é 4 (Lys) oun é 3 (Orn). Em algumas modalidades exemplificadoras, o aminoácido de Fórmula |l é o aminoácido em que n é 1 (Ser). Em algumas modalidades exemplificadoras, o aminoácido de Fórmula |l é o aminoácido em que n é 1 (Cys). Ainda em outras modalidades, o aminoácido do peptídeo de análogo de insulina que compreende uma amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol é um aminoácido distribuído que compreende a mesma estrutura de Fórmula |, Fórmula Il, ou Fórmula Ill, exceto pelo fato de que o hidrogênio ligado ao alfa-carbono do aminoácido de Fórmula |, Fórmula Il, ou Fórmula Ill é substituído por uma segunda cadeia lateral.
[0197]Em algumas modalidades da invenção, o análogo de insulina compreende um espaçador entre o peptídeo e o grupo alquila. Em algumas modalidades, o análogo de insulina é covalentemente ligado ao espaçador, que é covalentemente ligado ao grupo alquila. Em algumas modalidades exemplificadoras, o análogo de insulina é modificado para compreender um grupo alquila por alguilação de uma amina, hidroxila, ou tiol de um espaçador, em que o espaçador é ligado a uma cadeia lateral de um aminoácido na posição A14, A15, BO, B1, B10, B22, B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido das cadeias A e B de insulina nativa). O aminoácido do análogo de insulina ao qual o espaçador é ligado pode ser qualquer aminoácido (por exemplo, um aminoácido unicamente a-substituído ou um aminoácido a- a-bi-substituído) que compreende uma porção que permite ligação ao espaçador. Um aminoácido do análogo de insulina que compreende uma cadeia lateral -NH2, -OH, ou -COOH (por exemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, ou Glu) é adequado. Em algumas modalidades, o espaçador entre o peptídeo de análogo de insulina e o grupo alquila é um aminoácido que compreende uma amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol ou um dipeptídeo ou tripeptídeo que compreende um aminoácido compreendendo uma amina de cadeia lateral, hidroxila, ou tiol.
[0198]No caso em que a alfa-amina é alquilada, o espaçador aminoácido pode ser qualquer aminoácido. Por exemplo, o aminoácido espaçador pode ser um aminoácido hidrofóbico, por exemplo, Gly, Ala, Val, Leu, He, Trp, Met, Phe, Tyr. Alternativamente, o aminoácido espaçador pode ser um resíduo acídico, por exemplo, Asp e Glu. Em modalidades exemplificadoras, o aminoácido espaçador pode ser um aminoácido hidrofóbico, por exemplo, Gily, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, ácido 6-amino hexanóico, ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanóico, ácido 8-amino octanóico. Alternativamente, o aminoácido espaçador pode ser um resíduo acídico, por exemplo, Asp e Glu, desde que a alquilação ocorra na alfa-amina do resíduo acídico. No caso onde a amina de cadeia lateral do aminoácido espaçador é alquilada, o aminoácido espaçador é um aminoácido que compreende uma amina de cadeia lateral, por exemplo, um aminoácido de Fórmula | (por exemplo, Lys ou Orn). Neste caso, é possível que tanto a alfa-amina como a amina de cadeia lateral do aminoácido espaçador sejam alquiladas, de modo que o peptídeo seja dialquilado. As modalidades da invenção incluem tais moléculas dialquiladas.
[0199] Quando ocorre alquilação através de um grupo hidroxila do aminoácido do espaçador, o aminoácido ou um dos aminoácidos do espaçador podem ser um aminoácido de Fórmula Il. Em uma modalidade exemplificadora específica, o aminoácido é Ser. Quando ocorre alquilação através de um grupo tiol do aminoácido do espaçador, o aminoácido ou um dos aminoácidos do espaçador podem ser um aminoácido de Fórmula Ill. Em uma modalidade exemplificadora específica, o aminoácido é Cys.
[0200]EM algumas modalidades, o espaçador compreende um espaçador bifuncional hidrofílico. Em uma modalidade específica, o espaçador compreende um amino poli(alquilóxi)carboxilato. Neste sentido, o espaçador pode compreender, por exemplo, NH2(CH2CH2O0)n(CH2)mCOOH, em que m é qualquer número inteiro de 1 a 6 e n é qualquer número inteiro de 2 a 12, como, por exemplo, ácido 8-amino-3,6-
dioxaoctanóico, que se encontra comercialmente disponível junto a Peptides International, Inc. (Louisville, KY, EUA). Em algumas modalidades, o espaçador entre o peptídeo de análogo de insulina e o grupo alquila é um espaçador bifuncional hidrofílico. Em determinadas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende dois ou mais grupos reativos, por exemplo, um grupo amina, hidroxila, tiol, e carboxila ou quaisquer combinações destes. Em determinadas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo hidroxila e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo amina e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofílico compreende um grupo tiol e um carboxilato.
[0201]Em algumas modalidades, o espaçador entre o peptídeo de análogo de insulina e o grupo alquila é um espaçador bifuncional hidrofóbico. Em determinadas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende dois ou mais grupos reativos, por exemplo, um grupo amina, hidroxila, tiol, e carboxila ou quaisquer combinações destes. Em determinadas modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo hidroxila e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo amina e um carboxilato. Em outras modalidades, o espaçador bifuncional hidrofóbico compreende um grupo tiol e um carboxilato. Espaçadores bifuncionais hidrofóbicos adequados que compreendem um carboxilato e um grupo hidroxila ou um grupo tiol são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ácido 8-hidroxioctanóico e ácido 8-mercaptooctanóico.
[0202]O espaçador (por exemplo, aminoácido, dipeptídeo, tripeptídeo, espaçador bifuncional hidrofílico, ou espaçador bifuncional hidrofóbico) tem de 3 a 10 átomos (por exemplo, 6 a 10 átomos, (por exemplo, 6, 7, 8, 9, ou 10 átomos)) de comprimento. Em modalidades mais específicas, o espaçador tem cerca de 3 a 10 átomos (por exemplo, 6 a 10 átomos) de comprimento e o alquil é um grupo alquila
Ci2 a Cis, por exemplo, grupo alquila Cia, grupo alqguila Cie, de modo que o comprimento total do espaçador e do grupo alquila seja 14 a 28 átomos, por exemplo, cerca de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28 átomos. Em algumas modalidades, o comprimento do espaçador e do alquil é de 17 a 28 (por exemplo, 19 a 26, 19 a 21) átomos.
[0203]De acordo com uma modalidade, o espaçador bifuncional é um aminoácido de ocorrência não-natural ou sintético que compreende uma cadeia principal de aminoácido tendo de 3 a 10 átomos de comprimento (por exemplo, ácido 6-amino hexanóico, ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanóico, e ácido 8-amino octanóico). Alternativamente, o espaçador pode ser um espaçador de dipeptídeo ou tripeptídeo tendo uma cadeia principal de peptídeo com 3 a 10 átomos (por exemplo, 6 a 10 átomos) de comprimento. O espaçador de dipeptídeo ou tripeptídeo ligado ao análogo de insulina pode ser composto por aminoácidos de ocorrência natural e/ou aminoácidos de ocorrência não-natural, incluindo, por exemplo, qualquer um dos aminoácidos ensinados no presente documento. Em algumas modalidades, o espaçador compreende uma carga negativa geral, por exemplo, compreende um ou dois aminoácidos negativamente carregados. Em algumas modalidades, o espaçador de dipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: Ala-Ala, B-Ala-B-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, ácido y-aminobutírico-ácido y-aminobutírico, e y-Glu- y-Glu. Em uma modalidade, o espaçador de dipeptídeo é y-Glu-y-Glu.
[0204]Os métodos adequados de alquilação de peptídeo através de aminas, hidroxilas, e tióis são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma síntese de éter de Williamson pode ser usada para formar uma ligação de éter entre o peptídeo de insulina e o grupo alquila. Da mesma forma, uma reação de substituição nucleofílica do peptídeo com um haleto de alquila pode resultar em qualquer uma entre ligação de éter, tioéter, ou amino. O grupo alquila do peptídeo de análogo de insulina alquilado pode ter qualquer tamanho, por exemplo, qualquer comprimento de cadeia de carbono, e pode ser linear ou ramificado. Em algumas modalidades da invenção, o grupo alquila é um Ca à Cao alquil. Por exemplo, o grupo alquila pode ser qualquer entre Ca alquil, Cs alquil, Ca alquil, Cio alquil, Ci2 alquil, Cia alquil, Ci6 alquil, Cia alquil, Cao alquil, C22 alquil, C24 alquil, Ca6 alquil, Ca8 alquil, ou Cao alquil. Em algumas modalidades, o grupo alquila é um Cs a C2o alquil, por exemplo, um C14 alquil ou C16 alquil.
[0205]EmM algumas modalidades específicas, o grupo alquila compreende uma porção esteróide de um ácido biliar, por exemplo, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocólico, e ácido de colesterol.
[0206]EmM algumas modalidades, o análogo de insulina é modificado para compreender um grupo alquila reagindo-se um alcano nucleofílico de cadeia longa com o análogo de insulina, em que o análogo de insulina compreende um grupo de partida adequado para substituição nucleofílica. Em aspectos específicos, o grupo nucleofílico do alcano de cadeia longa compreende um grupo amina, hidroxila, ou tiol (por exemplo, octadecilamina, tetradecanol, e hexadecanotiol). O grupo de partida do análogo de insulina pode ser parte de uma cadeia lateral de um aminoácido ou pode ser parte da cadeia principal de peptídeo. Grupos de partida adequados incluem, por exemplo, N-hidroxisuccinimida, halogênios, e ésteres de sulfonato.
[0207]Em determinadas modalidades, o análogo de insulina é modificado para compreender um grupo alquila reagindo-se o alcano nucleofílico de cadeia longa com um espaçador, que é ligado ao análogo de insulina, em que o espaçador compreende o grupo de partida. Em aspectos específicos, o alcano de cadeia longa compreende um grupo amina, hidroxila, ou tiol. Em determinadas modalidades, o espaçador que compreende o grupo de partida pode ser qualquer um discutido no presente documento, por exemplo, aminoácidos, dipeptídeos, tripeptídeos,
espaçadores bifuncionais hidrofílicos e espaçadores bifuncionais hidrofóbicos compreendendo, ainda, um grupo de partida adequado.
[0208] Quando um alcano de cadeia longa for alquilado pelo análogo de insulina ou pelo espaçador, o alcano de cadeia longa pode ter qualquer tamanho e pode compreender qualquer comprimento de cadeia de carbono. O alcano de cadeia longa pode ser linear ou ramificado. Em determinados aspectos, o alcano de cadeia longa é um Ca a Cao alcano. Por exemplo, o alcano de cadeia longa pode ser qualquer um entre Ca alcano, Ce alcano, Cs alcano, Cio alcano, Ci12 alcano, Cia alcano, Ci6 alcano, Cia alcano, C2o alcano, C22 alcano, Ca alcano, Cas alcano, Cas alcano, ou C3o alcano. Em algumas modalidades o alcano de cadeia longa compreende um Cs a C2o alcano, por exemplo, um Cia alcano, C16 alcano, ou Cis alcano.
[0209]Da mesma forma, em algumas modalidades, a alquilação pode ocorrer entre o análogo de insulina e uma porção de colesterol. Por exemplo, o grupo hidroxila de colesterol pode deslocar um grupo de partida no alcano de cadeia longa para formar um produto de colesterol-peptídeo de insulina. Os análogos de insulina alquilados descritos no presente documento podem ser adicionalmente modificados para compreender uma porção hidrofílica. Em algumas modalidades específicas, a porção hidrofílica pode compreender uma cadeia de polietileno glicol (PEG). A incorporação de uma porção hidrofílica pode ser cumprida através de qualquer meio adequado, como qualquer um dos métodos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o análogo de insulina pode compreender um aminoácido selecionado a partir de Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ou Ac-Phe, em que a cadeia lateral do aminoácido é covalentemente ligada a uma porção hidrofílica (por exemplo, PEG). Em algumas modalidades, o grupo alquila é ligado à posição A14, A15, BO, B1, B1O, B22, B28 ou B29 (de acordo com a numeração de aminoácido da cadeia A ou B de insulina nativa), opcionalmente através de um espaçador que compreende Cys, Lys,
Orn, homo-Cys, ou Ac-Phe, e, opcionalmente, compreendendo, ainda, uma porção hidrofílica ligada à cadeia lateral de outro aminoácido. Alternativamente, o análogo de insulina alquilado pode compreender um espaçador, em que o espaçador é tanto alquilado como modificado para compreender a porção hidrofílica. Exemplos não- limitantes de espaçadores adequados incluem um espaçador que compreende um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em Cys, Lys, Orn, homo-Cys, e Ac-Phe. Conjugados
[0210]Em algumas modalidades, os análogos de insulina revelados no presente documento como sendo modificados para compreender um sítio de glicosilação são adicionalmente amidados, carboxilados, fosforilados, esterificados, N-acilados, ciclizados através de, por exemplo, uma ponte de dissulfeto, ou convertidos em um sal (por exemplo, um sal de adição ácida, um sal de adição básica), e/ou opcionalmente dimerizados, multimerizados, ou polimerizados, ou conjugados. A presente revelação também abrange conjugados nos quais o análogo de insulina é ligado a uma porção heteróloga. A conjugação entre o análogo de insulina e a porção heteróloga pode ser através de uma ligação covalente, ligação não-covalente (por exemplo, interações eletrostáticas, ligações e hidrogênio, interações de van der Waals, pontes de sal, interações hidrofóbicas, e similares), ou ambos os tipos de ligação. Pode-se usar uma variedade de sistemas de acoplamento não-covalente, incluindo biotina-avidina, ligante/receptor, enzima/substrato, proteína de ligação de ácido nucléico/ácido nucléico, proteína de ligação lipídeo/lipídeo, parceiros moleculares de adesão celular; ou quaisquer parceiros de ligação ou fragmentos destes que tenham afinidade entre si. Em alguns aspectos, as ligações covalentes são ligações peptídicas. A conjugação do análogo de insulina à porção heteróloga pode ser uma conjugação indireta ou direta, sendo que a primeira pode envolver um ligante ou um espaçador. Ligantes e espaçadores adequados são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, qualquer um dos ligantes ou espaçadores descritos.
[021 1] Conforme o uso em questão, o termo “porção heteróloga” é sinônimo ao termo “porção conjugada” e se refere a qualquer molécula (química ou bioquímica, de ocorrência natural ou não-codificada) que seja diferente do análogo de insulina ao qual é ligada. Porções conjugadas exemplificadoras que podem ser ligadas ao análogo de insulina incluem, mas não se limitam a, um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo (incluindo, por exemplo, uma proteína de plasma), um agente de direcionamento, uma imunoglobulina ou porção desta (por exemplo, região variável, CDR, ou região Fc), um marcador de diagnóstico, como um radioisótopo, fluoróforo ou marcador enzimático, um polímero incluindo polímeros solúveis em água, ou outros agentes terapêuticos ou agentes de diagnóstico. Em algumas modalidades, proporciona-se um conjugado que compreende o análogo de insulina e uma proteína de plasma, em que a proteína de plasma é selecionada a partir do grupo que consiste em albumina, transferina, fibrinogênio e globulihnas. Em algumas modalidades, a porção de proteína de plasma do conjugado é albumina ou transferina. Em uma modalidade, a porção heteróloga é albumina, incluindo, por exemplo, albuminas, como albumina sérica humana (HSA) e albumina humana recombinante (rHA). O conjugado, em algumas modalidades, compreende o análogo de insulina e um ou mais entre um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucléico, um anticorpo ou fragmento deste, um polímero, um ponto de análogo de insulina, uma molécula pequena, uma toxina, um agente de diagnóstico, um carboidrato, um aminoácido.
Porção Heteróloga de Polímero
[0212]EmM algumas modalidades, a porção heteróloga conjugada ao análogo de insulina é um polímero. Em algumas modalidades, o polímero é selecionado a partir do grupo que consiste em: poliamidas, policarbonatos, polialguilenos e derivados destes incluindo, polialguileno glicóis, óxidos de polialguileno, tereftalatos de polialquileno, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, incluindo poli(metil metacrilato), poli(etil metacrilato), poli(butilmetacrilato), poli(fisobutil metacrilato), poli(hexilmetacrilato), polifisodecil metacrilato), poli(lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poliímetil acrilato), polifisopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), e poli(octadecil acrilato), polímeros de polivinila incluindo alcoóis polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, haletos polivinílicos, polifacetato de vinila), e polivinilpirrolidona, poliglicolidas, polisiloxanos, poliuretanos e copolímeros destes, celuloses incluindo alquil celulose, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitro celuloses, metil celulose, etil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxi-propil metil celulose, hidroxibutil metil celulose, acetato de celulose, propionato de celulose, celulose acetato butirato, celulose acetato ftalato, carboxiletil celulose, triacetato de celulose, e sal sódico de celulose sulfato, polipropileno, polietilenos incluindo poli(etileno glicol), polifóxido de etileno), e poli(tereftalato de etileno), e poliestireno.
[0213]Em alguns aspectos, o polímero é um polímero biodegradável, incluindo um polímero biodegradável sintético (por exemplo, polímeros de ácido lático e ácido glicólicos, polianidridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), e poli(lactida-cocaprolactona)), e um polímero biodegradável natural (por exemplo, alginato e outros polissacarídeos incluindo dextrano e celulose, colágeno, derivados químicos destes (substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquil, alquileno, hidroxilações, oxidações, e outras modificações rotineiramente feitas por indivíduos versados na técnica), albumina e outras proteínas hidrofílicas (por exemplo, zeína e outras prolaminas e proteínas hidrofóbicas)), bem como qualquer copolímero ou mistura deste. Em geral, esses materiais se degradam seja por hidrólise enzimática ou exposição à água in vivo, por erosão superficial ou em massa.
[0214]Em alguns aspectos, o polímero é um polímero bioadesivo, como hidrogel bioerosível descrito por H. S. Sawhney, C. P. Pathak e J. A. Hubbell em Macromolecules, 1993, 26, 581-587, estando os ensinamentos deste aqui incorporados, ácidos poliialurônicos, caseína, gelatina, glutina, polianidridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosana, poli(metil metacrilatos), poli(etil metacrilatos), poli(butil metacrilato), poli(fisobutil metacrilato), polifhexil metacrilato), poli(fisodecil metacrilato), poli(lauril metacrilato), poli(fenil metacrilato), poliímetil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(fisobutil acrilato), e polifoctadecil acrilato).
[0215]Em algumas modalidades, o polímero é um polímero solúvel em água ou um polímero hidrofílico. Os polímeros hidrofílicos são descritos no presente documento em “Porções Heterólogas Hidrofílicas.” Os polímeros solúveis em água adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, polivinilpirrolidona, hidroxipropil celulose (HPC; Klucel), hidroxipropil metilcelulose (HPMC; Methocel), nitrocelulose, hidroxipropil etilcelulose, hidroxipropil butilcelulose, hidroxipropil pentilcelulose, metil celulose, etilcelulose (Ethocel), hidroxietil celulose, várias algquil celuloses e hidroxialquil celuloses, vários éteres de celulose, acetato de celulose, carboximetil celulose, sódio carboximetil celulose, cálcio carboximetil celulose, copolímeros de acetato de vinila/ácido crotônico, poli-hidroxialguil metacrilato, hidroximetil metacrilato, — copolímeros de ácido —metacrílico, ácido —polimetacrílico, polimetilmetacrilato, copolímeros de anidrido maléico/metil vinil éter, álcool polivinílico, ácido poliacrílico de sódio e cálcio, ácido poliacrílico, polímeros carbóxi acídicos, carboxipolimetileno, polímeros de carboxivinil, copolímero de polioxietileno polioxipropileno, anidrido co-maléico polimetilviniléter, carboximetilamida, copolímero de potássio metacrilato divinilbenzeno, polioxietileno glicóis, polietileno glicol, e derivados, sais, e combinações destes.
[0216]EmM uma modalidade, o polímero é um polialquileno glicol, incluindo, por exemplo, polietileno glicol (PEG). Em algumas modalidades, a porção heteróloga é um carboidrato. Em algumas modalidades, o carboidrato é um monossacarídeo (por exemplo, glicose, galactose, frutose), a dissacarídeo (por exemplo, sacarose, lactose, maltose), um oligossacarídeo (por exemplo, rafinose, estaquiose), um polissacarídeo (amido, amilase, amilopectina, celulose, quitina, calose, laminarina, xilana, manana, fucoidana, galactomanana).
[0217]Em algumas modalidades, a porção heteróloga é um lipídeo. O lipídeo, em algumas modalidades, é um ácido graxo, eicosanóide, prostaglandina, leucotrieno, tromboxano, N-acil etanolamina, glicerolipídeo (por exemplo, gliceróis mono-, di-, tri- substituídos), glicerofosfolipídeo (por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina), esfingolipídeo (por exemplo, estfingosina, ceramida), lipídeo de esterol (por exemplo, esteróide, colesterol), lipídeo de prenol, sacarolipídeo, ou a policetida, óleo, cera, colesterol, esterol, vitamina solúvel em gordura, monoglicerida, diglicerida, triglicerida, um fosfolipídeo.
Porção Heteróloga de Fusão Fc
[0218]Conforme notado anteriormente, em algumas modalidades, o análogo de insulina é conjugado, por exemplo, fundido a uma imunoglobulina ou porção desta (por exemplo, região variável, CDR, ou região Fc). Tipos conhecidos de imunoglobulinas (Ig) incluem IgG, IgA, IgE, 1gD ou IgM. A região Fc é uma região C- terminal de um lg de cadeia pesada, que é responsável pela ligação aos receptores Fc que realizam atividades, como reciclagem (que resulta em uma meia-vida prolongada), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), e citotoxicidade dependente complementar (CDC).
[0219]Por exemplo, de acordo com algumas definições, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano se estende a partir de Cys226 até a terminação C da cadeia pesada. A “região de articulação” geralmente se estende a partir de Glu216 a Pro230 de IgGI humano (regiões de articulação de outros isotipos IgG podem ser alinhadas à sequência IgGl alinhando-se as cisteínas envolvidas na ligação de cisteína). A região Fc de um IgG inclui dois domínios constantes, CH2 e CH3. O domínio CH2 de uma região fc de IgG humano geralmente se estende a partir do aminoácido 231 ao aminoácido 341. O domínio CH3 de uma região Fc de IgG humano Fc geralmente se estende a partir dos aminoácidos 342 a 447. As referências feitas à numeração de aminoácido de imunoglobulinas ou fragmentos, ou regiões, de imunoglobulina, são todos baseados em Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento Norte-Americano de Saúde Pública, Bethesda, Md, EUA. Em uma modalidade relacionada, a região Fc pode compreender uma ou mais regiões constantes nativas ou modificadas a partir de uma cadeia pesada de imunoglobulina, diferente de CH1, por exemplo, as regiões CH2 e CHs3 de IgG e IgA, ou as regiões CH3 e CHa de IgE.
[0220]As porções conjugadas adequadas incluem porções de sequência de imunoglobulina que incluem o sítio de ligação FcRn. FcRn, um receptor de salvação, é responsável pela reciclagem de imunoglobulinas e pelo retorno destas à circulação no sangue. A região da porção Fc de IgG que se liga ao receptor FcRn foi descrita com base na cristalografia de raios X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). A área de contato principal do Fc com FcRn é próxima à junção dos domínios CH2 e CH3. Os contatos Fc-FcRn se encontram todos em uma cadeia pesada de Ig único. Os sítios de contato principais incluem resíduos de aminoácido 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, e 314 do domínio CH2 e resíduos de aminoácido 385- 387, 428, e 433-436 do domínio CHs.
[0221]Algumas porções conjugadas podem incluir ou não sítio(s) de ligação FcyR. FcyR são responsáveis por ADCC e CDC. Exemplos de posições na região Fc que fazem um contato direto com FcyR são aminoácidos 234-239 (região de articulação inferior), aminoácidos 265-269 (B/C loop), aminoácidos 297-299 (C/E loop), e aminoácidos 327-332 (F/G) loop (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000). À região de articulação inferior de IgE também implicou na ligação FCcRI (Henry, et al.,
Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). Os resíduos envolvidos na ligação de receptor IgA são descritos em Lewis et al., (J Inmunol. 175:6694-701, 2005). Os resíduos de aminoácido envolvidos na ligação de receptor IgE são descritos em Sayers et al. (J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004). As modificações de aminoácido podem ser feitas à região Fc de uma imunoglobulina. Essas regiões Fc variantes compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio CH3 da região Fc (resíduos 342-447) e/ou pelo menos uma modificação de aminoácido no domínio CH2 da região Fc (resíduos 231-341). Mutações que se acreditam conferir uma afinidade aumentada por FcRn incluem T256A, T307A, ES80A, e N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591). Outras mutações podem reduzir a ligação da região Fc a FecyRI, FCyRIIA, FcyRIIB, e/ou FCyRIIIA sem reduzir significativamente a afinidade por FcRn. Por exemplo, a substituição do Asn na posição 297 da região Fc por Ala ou outro aminoácido remove um sítio de N- glicosilação altamente conservado e pode resultar em imunogenicidade reduzida com meia-vida prolongada concomitante da região Fc, bem como uma ligação reduzida a FcyRs (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Realizaram- se modificações de aminoácido nas posições 233-236 de IgGIl que reduzem a ligação a FcyRs (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 e Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). Algumas substituições de aminoácido exemplificadoras são descritas nas Patentes U.S. 7.355.008 e 7.381.408, estando incorporadas em sua totalidade a título de referência. Porção Heteróloga Hidrofílica
[0222]EmM algumas modalidades, o análogo de insulina descrito no presente documento é covalentemente ligado a uma porção hidrofílica. As porções hidrofílicas podem ser ligadas ao análogo de insulina sob quaisquer condições adequadas usadas para reagir uma proteína com uma molécula de polímero ativado. Qualquer meio conhecido na técnica pode ser usado, incluindo através de acilação, alquilação redutiva, adição de Michael, alquilação de tiol ou outros métodos de conjugaçâão/ligação quimiosseletivos através de um grupo reativo na porção hidrofílica (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, a-haloacetil, maleimido ou hidrazino) a um grupo reativo no composto alvo (por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, a-haloacetil, maleimido ou hidrazino). Os grupos de ativação que podem ser usados para ligar o polímero solúvel em água a uma ou mais proteínas incluem, sem caráter limitativo, sulfona, maleimida, sulfidril, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano, 5-piridil, e grupo acila alfa-halogenada (por exemplo, ácido alfa- iodo acético, ácido alfa-bromoacético, ácido alfa-cloroacético). Caso seja ligado ao peptídeo por alquilação redutiva, o polímero selecionado deve ter um único aldeído reativo de modo que o grau de polimerização seja controlado.
Vide, por exemplo, Kinstler et al., Adv.
Drug.
Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv.
Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); e Zalipsky et al, Adv.
Drug Delivery Rev. 16: 157- 182 (1995). A porção hidrofílica, por exemplo, cadeia de polietileno glicol, de acordo com algumas modalidades, tem um peso molecular selecionado a partir da faixa de cerca de 500 a cerca de 40.000 Daltons.
Em algumas modalidades, a cadeia de polietileno glicol tem um peso molecular selecionado a partir da faixa de cerca de 500 a cerca de 5,000 Daltons, ou cerca de 1.000 a cerca de 5.000 Daltons.
Em outra modalidade, a porção hidrofílica, por exemplo, cadeia de polietileno glicol, tem um peso molecular de cerca de 10.000 a cerca de 20.000 Daltons.
Ainda em outras modalidades exemplificadoras, a porção hidrofílica, por exemplo, cadeia de polietileno glicol, tem um peso molecular de cerca de 20.000 a cerca de 40.000 Daltons.
Contemplam-se polímeros hidrofílicos lineares ou ramiíficados.
As preparações resultantes de conjugados podem ser essencialmente monodispersas ou polidispersas, e podem ter cerca de 0,5, 0,7, 1, 1,2, 1,5 ou 2 porções poliméricas por peptídeo.
[0223]Em algumas modalidades, o aminoácido nativo do peptídeo é substituído por um aminoácido tendo uma cadeia lateral adequada para reticulação com porções hidrofílicas, para facilitar a ligação da porção hidrofílica ao peptídeo. Aminoácidos exemplificadores incluem Cys, Lys, Orn, homo-Cys, ou acetil fenilalanina (Ac-Phe). Em outras modalidades, um aminoácido modificado para compreender um grupo hidrofílico é adicionado ao peptídeo na terminação N ou na terminação C. Em algumas modalidades, o peptídeo do conjugado é conjugada a uma porção hidrofílica, por exemplo, PEG, através de uma ligação covalente entre a cadeia lateral de um aminoácido do peptídeo e a porção hidrofílica.
Porção Heteróloga r»PEG
[0224]Em algumas modalidades, o conjugado compreende um análogo de insulina fundido a um peptídeo acessório que seja capaz de formar uma conformação estendida similar ao PEG químico (por exemplo, um molécula de PEG recombinante (rPEG)), como aquela descrita na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WOZ2009/023270 e na Publicação de Pedido de Patente U.S. No. US2008/0286808. A molécula rPEG não é polietileno glicol. A molécula r;PEG, em alguns aspectos, é um polipeptídeo que compreende um ou mais entre glicina, serina, ácido glutâmico, ácido aspártico, alanina, ou prolinaz Em alguns aspectos, o rPEG é um homopolímero, por exemplo, poli-glicina, poli-serina, ácido poli-glutâmico, ácido poli- aspártico, poli-alanina, ou poli-prolina. Em outras modalidades, o rPEG compreende dois tipos de aminoácidos repetidos, por exemplo, poli(Gly-Ser), poli(Gly-Glu), poli(Gly-Ala), poli(GIy-Asp), poli(Gly-Pro), poli(Ser-Glu), etc. Em alguns aspectos, o rPEG compreende três tipos diferentes de aminoácidos, por exemplo, poli(Gly-Ser- Glu). Em aspectos específicos, o rPEG aumenta a meia-vida do análogo de insulina. Em alguns aspectos, o r;PEG compreende uma carga positiva líquida ou uma carga negativa líquida. Em alguns aspectos, o r;PEG é desprovido de uma estrutura secundária. Em algumas modalidades, o rPEG é maior ou igual a 10 aminoácidos de comprimento e, em algumas modalidades, tem cerca de 40 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento. Em alguns aspectos, o peptídeo acessório é fundido à terminação N ou C do peptídeo da invenção através de uma ligação peptídica ou de um sítio de clivagem de proteinase. Em alguns aspectos, o r;PEG compreende um tag de afinidade ou é ligado a um PEG que seja maior que 5 kDa. Em algumas modalidades, o rPEG confere ao conjugado da invenção um raio hidrodinâmico, meia-vida sérica, resistência à protease, ou solubilidade aumentados e, em alguns aspectos, confere ao conjugado uma imunogenicidade reduzida.
[0225]As porções de conjugado podem ser ligadas ao análogo de insulina através de uma ligação covalente direta reagindo-se os resíduos de aminoácido direcionados do peptídeo com um agente de derivatização orgânica que seja capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com resíduos N- ou C-terminais desses aminoácidos direcionados. Os grupos reativos no peptídeo ou porção de conjugado incluem, por exemplo, um grupo aldeído, amino, éster, tiol, a-haloacetil, maleimido ou hidrazino. Os agentes de derivatização incluem, por exemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anídrico succínico ou outros agentes conhecidos na técnica. Alternativamente, as porções de conjugado podem ser ligadas ao peptídeo indiretamente através de veículoes intermediários, como veículoes de polissacarídeo ou polipeptídeo. Exemplos de veículoes de polissacarídeo incluem aminodextrano. Exemplos de veículoes de polipeptídeo adequados incluem polilisina, ácido poli-glutâmico, ácido poli-aspártico, copolímeros destes, e polímeros misturados desses aminoácidos e outros, por exemplo, serinas, para conferir propriedades de solubilidade desejáveis no veículo carregado resultante.
Multímeros
[0226]O análogo de insulina pode ser parte de um dímero, trímero ou multímero de ordem superior que compreende pelo menos dois, três, ou mais peptídeos ligados através de um ligante, em que pelo menos um ou ambos os peptídeos consistem em um análogo de insulina. Em uma modalidade, um análogo de insulina de cadeia é ligado à cadeia A ou à cadeia B de um segundo polipeptídeo de insulina que seja um heteroduplex que compreende as cadeias A e B ou um segundo análogo de insulina de cadeia única. O dímero pode ser um homodímero ou um heterodímero. Em algumas modalidades, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em um reticulador de tiol bifuncional e em um reticulador de amina bi-funcional. Em determinadas modalidades, o ligante é PEG, por exemplo, um PEG 5 kDa, PEG 20 kDa. Em algumas modalidades, o ligante é uma ligação de dissulfeto. Por exemplo, cada monômero do dímero pode compreender um resíduo Cys (por exemplo, um Cys terminal ou internamente posicionado) e o átomo de enxofre de cada resíduo Cys participa da formação da ligação de dissulfeto. Em alguns aspectos da invenção, os monômeros são conectados através de aminoácidos terminais (por exemplo, N-terminal ou C-terminal), através de aminoácidos internos, ou através de um aminoácido terminal de pelo menos um monômero e um aminoácido interno pelo menos do outro monômero. Em aspectos específicos, os monômeros não são conectados através de um aminoácido N-terminal. Em alguns aspectos, os monômeros do multímero são ligados juntos em uma orientação “cauda-à-cauda” na qual os aminoácidos C-terminais de cada monômero são ligados entre si. Em uma modalidade, o dímero compreende dois análogos de insulina de cadeia única em que os dois análogos de insulina são ligados entre si através da cadeia lateral de aminoácidos de um aminoácido presente na porção de ligação de cada análogo de insulina de cadeia única. Uma porção de conjugado pode ser covalentemente ligada a qualquer um dos análogos de insulina de cadeia única descritos no presente documento, incluindo um dímero, trímero ou multímero de ordem superior.
[0227]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um multímero que compreende um análogo IGF YL de cadeia B revelado no presente documento (incluindo derivados de pró-fármaco e depósito deste). O multímero (por exemplo, um dímero) pode ser um homodímero ou heterodímero, que compreende peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em insulina nativa, IGF-1 nativo, IGF-II nativo, um peptídeo análogo de insulina e peptídeos análogos IGF. Em algumas modalidades, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em um reticulador de tiol bifuncional e um reticulador de amina bifuncional. Em determinadas modalidades, o ligante é PEG, por exemplo, um PEG 5 kDa, PEG 20 kDa. Em algumas modalidades, o ligante é uma ligação de dissulfeto. Formulações de Liberação Controlada
[0228]Alternativamente, os análogos de insulina descritos no presente documento podem ser modificados em uma forma de depósito, de modo que a maneira na qual o análogo de insulina da presente revelação é liberado no corpo ao qual este é administrado seja controlada em relação ao tempo e ao local no corpo (vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.450.150). As formas de depósito dos análogos de insulina das presentes revelações podem ser, por exemplo, uma composição implantável que compreende o análogo de insulina da presente revelação e um material poroso ou não-poroso, como um polímero, em que o análogo de insulina das presentes revelações é encapsulado ou espalhado pelo material e/ou uma degradação do material não-poroso. Então, o depósito é implantado no local desejado no corpo e o análogo de insulina das presentes revelações é liberado a partir do implante em uma taxa predeterminada.
[0229] Alternativamente, um polímero de depósito grande pode ser ligado a um elemento de dipeptídeo de auto-clivagem que seja covalentemente ligado ao análogo de insulina conforme descrito no presente documento. Nesta modalidade, o polímero de depósito segquestra efetivamente o análogo de insulina em seu sítio de administração até que seja subsequentemente clivado a partir do análogo através de uma reação não-enzimática em uma taxa predeterminada. As formulações de depósito de análogos de insulina usando um dipeptídeo de auto-clivagem foram descritas no documento PCT/US2009/068713, estando a revelação deste aqui incorporada. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina que compreende um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco em que o elemento de pró- fármaco de dipeptídeo é ligado a um polímero grande, como PEG ou dextrano.
[0230]Podem-se preparar composições farmacêuticas que compreendem os análogos e são formuladas de modo que tenham um perfil de liberação in vivo desejado. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é uma formulação de liberação imediata, controlada, sustentada, estendida, retardada, ou bifásica. Os métodos de formulação de peptídeos ou conjugados para liberação controlada são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, J Pharm 374: 46-52 (2009) e as Publicações de Pedido de Patente Internacionall Nos. WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; e WO 1999/040942. As composições instantâneas podem compreender, ainda, por exemplo, micelas ou lipossomos, ou alguma outra forma encapsulada, ou podem ser administradas em uma forma de liberação estendida para proporcionar um efeito de armazenamento e/ou distribuição prolongado. As formulações farmacêuticas reveladas podem ser administradas de acordo com qualquer regime incluindo, por exemplo, diariamente (1 vezes ao dia, 2 vezes ao dia, 3 vezes ao dia, 4 vezes ao dia, 5 vezes ao dia, 6 vezes ao dia), a cada dois dias, a cada três, a cada quatro, a cada cinco dias, a cada seis dias, semanalmente, duas vezes por semana, a cada três semanas, mensalmente, ou duas vezes ao mês.
Derivados de Pró-Fármaco de Análogos de Insulina
[0231]A presente revelação também abrange análogos de pró-fármaco dos peptídeos análogo de insulina revelados no presente documento. De modo vantajoso, as formulações de pró-fármaco aperfeiçoam o índice terapêutico do peptídeo subjacente e retardam o princípio de ação e aumentam a meia-vida do análogo de insulina peptídeo. A química de pró-fármaco revelada pode ser quimicamente conjugada a aminas de sítio ativo para formar amidas que se transformem em amina pai mediante a formação de dicetopiperazina e a liberação do elemento de pró-fármaco (vide o Pedido de Patente Internacional PCT/US2009/068713, estando a revelação deste aqui expressamente incorporada). Esta química de pró-fármaco biologicamente amigável inovadora se degrada sob condições fisiológicas (por exemplo, pH de cerca de 7, a 37ºC em um ambiente aquoso) e não depende da degradação enzimática. A duração do análogo de pró- fármaco é determinada pela seleção da sequência de pró-fármaco de dipeptídeo, e, portanto, permite flexibilidade na formulação de pró-fármaco.
[0232]Em uma modalidade, proporciona-se um pró-fármaco tendo um meio tempo de ativação não-enzimática (ti2) entre 1-100 horas sob condições fisiológicas. As condições fisiológicas, conforme revelado no presente documento, são destinadas a incluir uma temperatura de cerca de 35 a 40ºC e um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4 e, mais tipicamente, incluir um pH de 7,2 a 7,4 e uma temperatura de 36 a 38ºC em um ambiente aquoso. Em uma modalidade, um dipeptídeo, capaz de ser submetido à formação de dicetopiperazihna sob condições fisiológicas, é covalentemente ligado através de uma ligação de amida ou éster ao análogo de insulina (vide os Pedidos Internacionais WO 2009/099763 e WO 2010/080607, estando as revelações deste aqui incorporadas).
[0233]Vantajosamente, a taxa de clivagem, e, logo, a ativação do pró-fármaco, dependem da estrutura e da estereoquímica da pró-porção de dipeptídeo e também da resistência do nucleófilo. Em última análise, os pró-fármacos revelados no presente documento serão quimicamente convertidos em estruturas que possam ser reconhecidas pelo receptor de insulina/IGF, em que a velocidade desta conversão química determinará o tempo de princípio e a duração da ação biológica in vivo. À química de pró-fármaco revelada neste pedido depende de uma reação química intramolecular que não dependa de aditivos químicos adicionais, ou enzimas. A velocidade de conversão é controlada pela natureza química do substituinte de dipeptídeo e sua clivagem sob condições fisiológicas. Visto que o pH fisiológico e a temperatura são estritamente regulados em uma faixa altamente definida, a velocidade de conversão de pró-fámaco em fármaco exibirá uma alta reprodutibilidade intra- e inter-pacientes. Em uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de um análogo de insulina de cadeia única em que o análogo de insulina de cadeia única compreende uma porção de ligação de pelo menos 18 aminoácidos, compreendendo opcionalmente um sítio de glicosilação, e/ou opcionalmente em que um dos aminoácidos da porção de ligação é peguilado. Em uma modalidade, a porção de ligação compreende uma sequência de SEQ ID NO: 66. Alternativamente, ou além da peguilação do aminoácido da porção de ligação, um dos dois aminoácidos do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo pode ser peguilado. Alternativamente, ou em qualquer combinação com os sítios peguilados supramencionados, o derivado de pró-fármaco de insulina de cadeia única pode ser peguilado em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em A9, A14 e A15 da cadeia A, no aminoácido amino terminal da cadeia B ou em qualquer uma das posições B10, B22, B28 ou B29 da cadeia B ou em qualquer posição da porção de ligação.
[0234]Conforme revelado no presente documento, proporcionam-se pró-fármacos em que os peptídeos análogo de insulina têm meias-vidas estendidas de pelo menos 1 hora, e, mais tipicamente, maiores que 20 horas, porém, menores que 100 horas, e são convertidos em uma forma ativa nas condições fisiológicas através de uma reação não-enzimática conduzida por instabilidade química inerente. Em uma modalidade, um tempo t1/2 de ativação não-enzimática do pró-fármaco está entre 1 e 100 h, e, mais tipicamente, entre 12 e 72 horas, e, em uma modalidade, ti2 está entre 24 e 48 h conforme medido incubando-se o pró-fármaco em uma solução de tampão de fosfato (por exemplo, PBS) a 37ºC e pH de 7,2. Em uma modalidade, a meia-vida dos pró-fármacos é cerca de 1, 8, 12, 20, 24, 48 ou 72 horas. Em uma modalidade, a meia-vida dos pró-fármacos é cerca de 100 horas ou maior incluindo as meias-vidas de até cerca de 168, 336, 504, 672 ou 720 horas, e são convertidos em forma ativa em condições fisiológicas através de uma reação não-enzimática conduzida por instabilidade química inerente. As meias-vidas dos vários pró- fármacos são calculadas usando-se a fórmula t = 0,693/k, onde 'k' é a constante de taxa de primeira ordem para a degradação do pró-fármaco. Em uma modalidade, a ativação do pró-fármaco ocorre após a clivagem de um dipeptídeo ligado por ligação de amida, e a formação de uma dicetopiperazina ou dicetomorfolina, e o peptídeo de análogo de insulina ativa.
[0235]EM outra modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é covalentemente ligado ao peptídeo de análogo de insulina através de uma ligação amida, e o dipeptídeo compreende, ainda, um polímero de depósito ligado ao dipeptídeo. Em uma modalidade, dois ou mais polímeros de depósito são ligados a um único elemento de dipeptídeo. Em uma modalidade, o polímero de depósito é ligado à cadeia lateral de um dos aminoácidos que compreendem o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo. O polímero de depósito é selecionado de modo que seja biocompatível e tenha um tamanho suficiente para que o análogo de insulina, modificado por ligação covalente do dipeptídeo, permaneça sequestrado em um sítio de injeção e/ou incapaz de interagir com seu receptor correspondente mediante administração a um paciente. A clivagem subsequente do dipeptídeo libera o análogo de insulina para interagir com seu alto destinado. O elemento de dipeptídeo portando depósito pode ser ligado ao análogo de insulina através de uma ligação amida por qualquer grupo amina conveniente do análogo de insulina, incluindo uma amina N-terminal ou uma cadeia lateral portando amina de um aminoácido interno natural ou sintético do análogo de insulina. Em uma modalidade, o elemento de dipeptídeo portando depósito é ligado ao grupo amino de uma 4-amino fenilalanina presente na posição A19 do análogo.
[0236]De acordo com uma modalidade, o polímero de depósito é selecionado a partir de polímeros biocompatíveis conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Tipicamente, os polímeros de depósito têm um tamanho selecionado a partir de uma faixa de cerca de 20.000 a 120.000 Daltons. Em uma modalidade, o polímero de depósito tem um tamanho selecionado a partir de uma faixa de cerca de 40.000 a
100.000 ou cerca de 40.000 a 80.000 Daltons. Em uma modalidade, o polímero de depósito tem um tamanho de cerca de 40.000, 50.000, 60.000, 70.000 ou 80.000 Daltons. Os polímeros de depósito adequados incluem, mas não se limitam a, dextranos, —polilactidas, poliglicolidas, polímeros à base decaprolactona, poli(caprolactona), — polianidridos, poliaminas, poliesteramidas, poliortoésteres, polidioxanonas, poliacetais, policetais, policarbonatos, polifosfoésteres, poliésteres, tereftalato de polibutileno, poliortocarbonatos, polifosfazenos, succinatos, ácido poli(mélico), poli(aminoácidos), polivinilpirrolidona, polietileno glicol, poliidroxicelulose, —polissacarídeos, quitina,y quitosana, ácido hialurônico, e copolímeros, terpolímeros e misturas destes, e polímeros biodegradáveis e seus copolímeros incluindo polímeros à base de caprolactona, policaprolactonas e copolímeros que incluem tereftalato de polibutileno. Em uma modalidade, o polímero de depósito é selecionado a partir do grupo que consiste em polietileno glicol, dextrano, ácido polilático, ácido poliglicólico e um copolímero de ácido lático e ácido glicólico, e, em uma modalidade específica, o polímero de depósito é polietileno glicol. Em uma modalidade, o polímero de depósito é polietileno glicol e o peso molecular combinado do(s) polímero(s) de depósito ligado(s) ao elemento de dipeptídeo é cerca de 40.000 a 80.000 Daltons.
[0237]|dentificaram-se — dipeptídeos — específicos compostos por aminoácidos naturais ou sintéticos que facilitam a decomposição intramolecular sob condições fisiológicas para liberar o análogo de insulina ativa. O dipeptídeo pode ser ligado (através de uma ligação de amida) a um grupo amino presente no análogo de insulina, ou um grupo amino introduzido no análogo de insulina pela modificação da sequência peptídica. Em uma modalidade, a estrutura de dipeptídeo é selecionada para resistir à clivagem por peptidases presentes em soros de mamíferos. De modo correspondente, em uma modalidade, a taxa de clivagem do elemento de pró- fármaco de dipeptídeo a partir do peptídeo bioativo não é substancialmente acentuada (por exemplo, maior que 2X) quando a reação for conduzida usando condições fisiológicas na presença de proteases de soro em relação à condução da reação na ausência das proteases. Portanto, a meia-vida de clivagem do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo a partir do análogo de insulina (em PBS sob condições fisiológicas) não é maior que duas, três, quatro ou cinco vezes a meia-vida de clivagem do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo a partir do análogo de insulina em uma solução que compreende uma protease de degradação de insulina. Em uma modalidade, a solução que compreende a protease de degradação de insulina é soro, mais particularmente, soro de mamífero, incluindo soro humano.
[0238]De acordo com uma modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo compreende a estrutura U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N-alquilado. Seleciona-se a estrutura de U-B, em uma modalidade, em que a clivagem química de U-B a partir do análogo de insulina é pelo menos cerca de 90% completo dentro de cerca de | a cerca de 720 horas em PBS sob condições fisiológicas. Em uma modalidade, a meia-vida de clivagem química (t12) de U-B a partir do análogo de insulina peptídeo é pelo menos cerca de 1 hora a cerca de | semana em PBS sob condições fisiológicas. Em uma modalidade, U, B, ou o aminoácido do análogo de insulina ao qual U-B é ligado é um aminoácido não-codificado. Em algumas modalidades U e/ou B é um aminoácido na configuração de estereoisômero D. Em algumas modalidades exemplificadoras, U é um aminoácido na configuração de estereoisômero D e B é um aminoácido na configuração de estereoisômero L. Em algumas modalidades exemplificadoras, U é um aminoácido na configuração de estereoisômero L e B é um aminoácido na configuração de estereoisômero D. Em algumas modalidades exemplificadoras, U é um aminoácido na configuração de estereoisômero D e B é um aminoácido na configuração de estereoisômero D. Em uma modalidade, B é um aminoácido N- alquilado, mas não é prolina, Em uma modalidade, o grupo N-alguilado de aminoácido B é um C1-C18 alquil, e, em uma modalidade, o grupo N-alquilado é C1- Cs alquil. Em uma modalidade, U é um aminoácido tendo uma substituição Supla no carbono alfa.
[0239]Em uma modalidade, um ou mais elementos de dipeptídeo são ligados ao análogo de insulina através de uma ligação amida formada através de um ou mais grupos amino selecionados a partir do grupo amino N-terminal da cadeia B, ou do grupo amino de cadeia lateral de um aminoácido presente no análogo de insulina. Em uma modalidade, o análogo de insulina compreende dois elementos de dipeptídeo, em que os elementos de dipeptídeo são opcionalmente peguilados, alquilados, acilados ou ligados a um polímero de depósito. De acordo com uma modalidade, a extensão de dipeptídeo é covalentemente ligada a um análogo de insulina através da amina de cadeia lateral de um resíduo de lisina que reside em ou próximo ao sítio ativo. Em uma modalidade, a extensão de dipeptídeo é ligada através de um aminoácido sintético ou de um aminoácido modificado, em que o aminoácido sintético ou aminoácido modificado exibe um grupo funcional adequado para ligação covalente da extensão de dipeptídeo (por exemplo, a amina aromática de uma amino-fenilalanina). De acordo com uma modalidade, um ou mais elementos de dipeptídeo são ligados ao análogo de insulina em um grupo amino selecionado a partir do grupo amino N-terminal da cadeia B, ou do grupo amino de cadeia lateral de uma amina aromática de um resíduo de 4-amino-fenilalanina presente em uma posição correspondente à posição A19, B16 ou B25 de insulina nativa.
[0240]O elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é designado para clivar espontaneamente sua ligação de amida ao análogo de insulina sob condições fisiológicas e na ausência de atividade enzimática. Em uma modalidade, o aminoácido N-terminal do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo compreende um aminoácido C-alquilado (por exemplo, ácido amino isobutírico). Em uma modalidade, o aminoácido C-terminal do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo compreende um aminoácido N-alquilado (por exemplo, prolina ou N-metil glicina)à= Em uma modalidade, o dipeptídeo compreende uma sequência de um aminoácido C- alquilado N-terminal seguido por um aminoácido N-alquilado.
[0241]Os requerentes constataram que a inserção seletiva de uma porção de aminoácido de 4-amino fenilalanina para a tirosina nativa na posição 19 da cadeia A pode ser acomodada sem perda de potência do peptídeo de insulina (vide a Figura 3). A amidação química subsequente deste grupo amino de sítio ativo com o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo revelado no presente documento reduz dramaticamente a atividade de ligação ao receptor de insulina e, portanto, proporciona um pró-fármaco adequado de insulina (vide as Figuras 7-12, dados fornecidos para o análogo IGF1Y'6L'!7 (p-NH2-F)A!º que foi demonstrado tendo uma atividade comparável ao (p-NH2-F)A!º de insulina, vide a Figura 4). Os requerentes constataram que uma modificação similar pode ser feita aos peptídeos análogos IGF8'6B17 para fornecer um sítio de ligação adequado para química de pró-fármaco. De modo correspondente, em uma modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é ligado ao anel aromático de uma 4-aminofenilalanina A19 de um (p- NH2-F)A'º de insulina ou peptídeo análogo de insulina IGF8'98!7 através de uma ligação amida, em que o aminoácido C-terminal do dipeptídeo compreende um aminoácido N-alguilado e o aminoácido N-terminal do dipeptídeo é qualquer aminoácido.
[0242]A porção de pró-fármaco de dipeptídeo também pode ser ligada a sítios adicionais de um (p-NH2-F)A!º de insulina ou peptídeo análogo de insulina IGFB!6B17 para preparar (p-NH2-F)A!º de insulina ou derivados de pró-fármaco de análogo de insulina IGF8'68!7, De acordo com uma modalidade, proporciona um derivado de pró- fármaco de análogo de insulina IGF8!68!7 que compreende uma cadeia B IGFB16B17 com um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco ligado através de uma ligação amida e ao grupo amino N-terminal da cadeia B, ou ao grupo amino de cadeia lateral de uma amina aromática de um resíduo de 4-amino-fenilalanina presente em uma posição correspondente a A19, B16 ou B25 de insulina nativa ou presente na porção de ligação. O derivado de pró-fármaco de análogo de insulina IGF8'98!7 pode compreender uma cadeia A de insulina nativa ou uma cadeia A IGF-1 nativa ou quaisquer análogos destas revelados no presente documento. Em uma modalidade, o dipeptídeo compreende um aminoácido C-alquilado N-terminal seguido por um aminoácido N-alquilado. De acordo com uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única derivado de pró-fármaco em que a cadeia Ae a cadeia B que compreendem o análogo compreendem uma sequência de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, ou podem compreender um análogo de SEQ ID NO: 1 e/ou SEQ ID NO: 2 em que os análogos incluem a substituição do aminoácido na posição A19, B16 ou B25 por uma 4-amino fenilalanina e/ou uma ou mais substituições de aminoácido em posições correspondentes a posições A5, A8, A9, A1O, A14, A15, A17, A18, A19 e A21, B1, B2, B3, B4, B5, B9, B10, B13, B14, B20, B22, B23, B26, B27, B28, B29 e B30 de insulina nativa, ou exclusões de qualquer ou de todas as posições correspondentes B1-4 e B26-30, em relação à insulina nativa. Em uma modalidade, o dipeptídeo é ligado a um grupo amino N- terminal da cadeia B do análogo de insulina, em que o aminoácido C-terminal do dipeptídeo compreende um aminoácido N-alguilado e o aminoácido N-terminal do dipeptídeo é qualquer aminoácido, com a condição de que quando o aminoácido C- terminal do dipeptídeo for prolina, o aminoácido N-terminal do dipeptídeo compreende um aminoácido C-alquilado.
[0243]Em uma modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo compreende a estrutura geral de Fórmula X: RR, R; R3 O PK XxX Rs o R, R em que R1, R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci18 alquil, C2-C18 alquenil, (C:-Ci18 alguil)OH, (C1-Ci8 alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil)| CONH;>, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH>, (C1- Ca alquil)NHC(NH2*+)NH2, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, (C1-Ca alquil)(C3-Coa heteroaril), e C1-Ci2 alquil(W)C1-C12 alquil, em que W é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou R: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil ou aril; ou Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Cs cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-Ci8 alquil, (C1-Cis alquil)OH, (C1-Ci8 alquil)NHz, (C1-Ci18 alquil)SH, (Co-Ca alquil)(C3-Cse)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-C5s heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, e (C1-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; Re é H, C1-Cs alquil ou Re e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e
R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e OH. Em uma modalidade, quando o elemento de pró-fármaco for ligado à amina N-terminal do análogo de insulina e Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formarem um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros, então, pelo menos um entre Ri: e R2 é diferente de H. Em uma modalidade, uma cadeia lateral de aminoácido do elemento de dipeptídeo é acilada com um grupo acila com tamanho suficiente para aglutinar albumina sérica. O grupo acila pode ser linear ou ramificado, e, em uma modalidade, é um ácido graxo C16 e C30. Por exemplo, o grupo acila pode ser qualquer um entre ácido graxo C16, ácido graxo C18, ácido graxo C20, ácido graxo C22, ácido graxo C24, ácido graxo C26, ácido graxo C28, ou um ácido graxo C30. Em algumas modalidades, o grupo acila é um ácido graxo C16 a C20, por exemplo, um ácido graxo C18 ou um ácido graxo C20.
[0244]Em uma modalidade, proporciona-se o elemento de pró-fármaco de Fórmula X em que Ri é selecionado a partir do grupo que consiste em H e C1-Cs alquil; e R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Cs alquil, C2-Cs alquenil, (C1-Ca alquil)OH, (C1-Ca alquil)SH, (C2- C3 alquil)SCH3, (C1-Ca alquil)|CONH>2, (C1-Ca alguil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH>2, (C1-Ca alquil)|NHC(NH2*) NH>, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7, e CH2(C5-Cs9 heteroaril), ou Ri: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-C; anel de cicloalquila; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-Ca alquil, (C1-Ca alquil)OH, (C1-Ca alquil)SH, (C1-Ca alquil)NH2, (C3-Cse)cicloalquil ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; Rs é H, ou Re e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; e
R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e OH e Rs é H. Em uma modalidade, R3 é C1-Cs alquil e Ra é selecionado a partir do grupo que consiste em H, C1-Cs alquil, CH2OH, (Co-Ca alquil)(C6-C1o aril)R7, e CH2(C5-Cs9 heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros. Em uma modalidade adicional, Rs é NHR« e Ra é H.
[0245]De acordo com uma modalidade, o elemento de dipeptídeo compreende um composto tendo a estrutura geral de Fórmula : R, Ro Y O
EE o RR em que R1, R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, Ci-Cis alquil, C2-C18 alquenil, (C:-Ci18 alguil)OH, (C1-Cia alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil)| CONH;>2, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH>, (C1- Ca alquil)NHC(NH2*+)NH2, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-C1o aril)R7, (C1-Ca alquil)(C3-Cs9 heteroaril), e C1-Ci2 alquil(Wi1)C1-C12 alquil, em que Wi é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou R: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil; ou Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Cs cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-Ci18 alquil, (C1-Cis alquil)OH, (C1-Ci8 alquil)NHz, (C1-Ci18 alquil)SH, (Co-Ca alquil)(C3-Cs)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(Cs-Cio aril)R7, e (C1i-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; R6 é H, C1-Cs alquil ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, C1-C136 alquil, Ca- Cia alquenil, (Co-Ca alquil)|CONH>2, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0246]Em outra modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo compreende a estrutura geral: R, Ro * O
TE o R Rg em que R1 e Rg são independentemente H ou C1-Cs alquil; R2 e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Cs alquil, C2-Cs alquenil, (C1-Ca alquilJOH, (C1-Ca alguil'SH, (C2-C3 alquil)|SCHs3, (C1-Ca alquil)CONH>2, (C1-Ca alquil)COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1-Ca alquil|NHC(NH2+) NH2, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7, e CH2(C3-Cs heteroaril), ou R: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci12 cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-Cs alquil, (C1-Ca alquil)OH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1-Ca alquil)SH, (Ca-Ce)ciclo alquil ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; Rs é H, C1-C3 alguil, ou Re e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, C1-C138 alquil, C2- Cia alquenil, (Co-Ca alquil)|CONH>2, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil)OH e halo, desde que quando Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formarem um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros, tanto Ri como R2 não sejam H. Em uma modalidade, R; é H ou OH. Em uma modalidade, o primeiro aminoácido e/ou o segundo aminoácido do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é um aminoácido na configuração de estereoisômero D.
[0247]EmM uma modalidade adicional, proporciona-se p elemento de pró-fármaco de Fórmula X em que Ri é selecionado a partir do grupo que consiste em H e C1-Cs alquil; e R2 e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Cs alquil, C2-Ca alquenil, (C:-Ca alquil))OH, (C1-Ca alguil'SH, (C2-C3 alquil)|SCH3, (C1-Ca alquil)CONH>2, (C1-Ca alquil)COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1-Ca alquil)|NHC(NH2*) NH>2, (Co-Ca alquil)(C3a-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, e CH2(C5-Cg heteroaril), ou Ri e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-C;g anel de cicloalquila; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-Csa alquil, (C1-Ca alquil)OH, (C1-Ca alquil)SH, (C1-Ca alquil)NH2, (C3a-Cse)cicloalquil ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; Re: é H, ou R6 e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil)OH e halo, e Ra é H, desde que quando o elemento de dipeptídeo for ligado a uma amina N terminal e Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formarem um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros, tanto Ri: como R2 não são H. Em uma modalidade, o primeiro aminoácido e/ou o segundo aminoácido do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é um aminoácido na configuração de estereoisômero D.
[0248]Em outras modalidades, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura de Fórmula X, em que R1 e Rg são independentemente H ou C1-Cs alquil; R2 e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Cg alquil, C2>-Cs alquenil, (Ci-Ca alquilJOH, (C1-Ca algquil/!SH, (C2-C3 alquil)|SCHs3, (C1-Ca alquil)CONH>2, (C1-Ca alquil)COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1-Ca alquil)NHC(NH2+) NH2, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-C1o aril)R7, e CH2(C3-Co heteroaril), ou R: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-C12 cicloalquil; R3 é C1-C18 alquil; R5 é NHRs; R6 é H ou C1-Cs alquil; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C138 alquil, C2-Ci18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alguil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0249]Em uma modalidade adicional, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura de Fórmula X, em que R1 e R2 são independentemente C1-Ci18 alquil ou (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; ou R: e R2 são ligados através de -(CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-C18 alquil; Ra e Rg são hidrogênio; Rs é NHo; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0250]Em uma modalidade adicional, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura de Fórmula X, em que Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Ci18 alquil, (C1-Ci138 alquil)OH, (C1-Ca alquil) NH, e (Co-Ca alquil)(Ce- Cio aril)R7, ou Ri e R2 são ligados através de (CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-Ci18 alquil ou R e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cg alquil e (Co-Ca alquil)(C6-C1o aril)R7; Rs é NHo; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, C1-C18 alquil, C2-Cis alquenil, (Co-Ca alqui))CONH2, (Co-Ca alqui))COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo, com a condição de que tanto Ri como R2 não são hidrogênio e desde que pelo menos um entre Ra ou R3 é hidrogênio.
[0251]EmM outra modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura de Fórmula X, em que Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e (C1-Ca alquil)NH2, ou Ri: e R2 são ligados através de (CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-Cs alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-Cs alquil; R3 é hidrogênio; e R5 é NH2, com a condição de que tanto R: como R2 não são hidrogênio.
[0252]Em uma modalidade adicional, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura de Fórmula X, em que Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cg alquil e (C1-Ca alquil) NHa;
R3 é C1-Cs alquil; Ra e Ra são hidrogênio; e Rs é NH2, com a condição de que tanto R: como R2 não são hidrogênio.
[0253]Em outra modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura de Fórmula X, em que Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-Cs alquil, (C1-Ca alquil)NH2, ou Ri: e R2 são ligados através de (CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-Cs alquil; Ra é (Co-Ca alquil)(C6-Ci10o aril)R7; R5 é NH>; R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e (Co-Ca alquil)OH; e R3 é hidrogênio, com a condição de que tanto R: e R2 não são hidrogênio.
[0254]Em outra modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura de Fórmula X, em que Ri é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; R>2 é hidrogênio; R3 é C1-C18 alquil; Ra e Rg são hidrogênio; Rs é NHRs ou OH; Re é H, C1-Csa alguil, ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Ci18 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo, com a condição de que, se R: for alquil ou (Co-Ca alquil)(Ces-Ci1o aril)R7, então, R: e Re juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-11 anel heterocíclico.
[0255]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende uma cadeia A e uma cadeia B em que a terminação carbóxi da cadeia B é ligada à terminação amino da dita cadeia A através de uma porção de ligação que compreende um peptídeo CTP. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência R22-X2sLCGX29X3oLVX33X3al YLVCGXa41 Xa2GFXa5 (SEQ ID NO: 17), LM é uma porção de ligação que compreende um peptídeo de SEQ ID NO: 66 ou uma sequência contígua de 29 de aminoácidos tendo pelo menos 58% dos aminoácidos sendo serina ou prolinay, em que a porção de ligação covalentemente liga |B a IA e IA compreende a sequência GIVXaXsCOXaXaX10CX12LX1aX15LX17X18X19CX21-Ri3 (SEQ ID NO: 18), em que o aminoácido na designação Xas é fenilalanina ou tirosina que é diretamente ligada à porção de ligação, LM. Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência J-Ra23-R22-X25LCGX29X30L VX33X34aL Xa6lL VCGX41 Xa2GFXa5 (SEQ ID NO: 16) ou uma sequência que difere da SEQ ID NO: 16 por 1 a 3 modificações de aminoácido selecionadas a partir das posições 5, 6, 9, 10, 16, 18, 19 e 21 de SEQ ID NO: 16, LM é uma porção de ligação que compreende um peptídeo de SEQ ID NO: 66 ou uma sequência contígua de 29 aminoácidos tendo pelo menos 58% dos aminoácidos sendo serina ou prolina, em que a porção de ligação covalentemente liga IB a IA e IA compreende a sequência GIVXaXsCCXs8X9aX1oCX12 LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18) ou uma sequência que difere da SEQ ID NO: 15 por 1 a 3 modificações de aminoácido selecionadas a partir das posições 5, 8, 9, 10, 14, 15, 17, 18 e 21 de SEQ ID NO: 16, em que J é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral de U-
B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado ligado através de uma ligação de amida; Xa É ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico Xe é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, ornitina, lisina ou alanina; X1o é isoleucina ou serina; X12 é serina ou ácido aspártico X14 É tirosina, arginina, ornitina, lisina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, ornitina, lisina ou leucina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; Xi8 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é um aminoácido da estrutura geral:
O Santanna ka 2
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHR10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina;
Xas é histidina ou treonina; X2a9 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; X36 é um aminoácido da estrutura geral Oo dmesentos- à L 2
Q Xp em que X12 é selecionado a partir do grupo que consiste em OH e NHRi11, em que R:1 é um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B; Xa41 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ornitina, lisina e arginina; Xas É um aminoácido da estrutura geral
O deimeça— dd, ds )
Q X13 em que X13 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH e NHRi2, em que R12 é H ou elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma amina N-terminal; R23 é uma ligação ou uma sequência de aminoácido que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados; e R13 é COOH ou CONH>2. Em uma modalidade, somente um entre J, Rio, Ri e Ri2 é U-B. Em uma modalidade, X:12 é OH e X13 é H ou OH e J e/ou X é U-B. Em uma modalidade, X12 é OH e X13 é OH, R23 é uma ligação, Jé He X é U-B. Em uma modalidade adicional, Xs, X25s e X3o são histidina. Em uma modalidade, a porção de ligação compreende a sequência SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK (SEQ ID NO: 79) ou SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQR (SEQ ID NO: 64). Em outra modalidade, o peptídeo de análogo de insulina de cadeia única compreende uma sequência peptídica de cadeia A de SEQ ID NO: 15 e uma sequência peptídica de cadeia B de SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade, R2 é uma ligação ou compreende uma sequência amino XeoX6:iXs2Xe3XeaXesK (SEQ ID NO: 19), em que Xeso é selecionado a partir do grupo que consiste em glicina, ácido glutâmico e ácido aspártico, e X61, X62, X63, Xea E Xes5 são independentemente ácido glutâmico ou ácido aspártico. Em uma modalidade, U é um aminoácido a C-alquilado ou um ácido de hidroxila C-alquilado e B é um aminoácido N-alquilado.
[0256]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência J- Ra3R22-X25LCGX29X30L VEALYLVCOG ERGFF (SEQ ID NO: 24), LM é uma porção de ligação que compreende um peptídeo CTP conforme revelado no presente documento e IA compreende a sequência GIVEQCCXaSICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 23) em que Xs é selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e histidina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é um aminoácido da estrutura geral:
O Eme de 2
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHR10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado; X23 é asparagina ou glicina; Xas É selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X2a9 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em FVNQ (SEQ ID NO: 10), um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de asparagina-
glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma amina N-terminal; e R23 é uma ligação ou uma sequência de aminoácido que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados. Em uma modalidade adicional, a cadeia B compreende a sequência X22VNQX25LCGX29X3oL VEALYLVCGERGFFYT-Z1-B: (SEQ ID NO: 25) em que Xz2 é selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e desamino- fenilalanina; X2a5 É selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X29 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Z1 é um dipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em aspartato- lisina, lisina-prolina, e prolina-lisina; e Bi: é selecionado a partir do grupo que consiste em treonina, alanina ou um tripeptídeo de treonina-arginina-arginina.
[0257]De acordo com uma modalidade proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência X2sLCGX29X3oL VEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 24), LM é uma porção de ligação conforme revelado no presente documento que liga covalentemente |B a IA, e IA compreende a sequência GIVEQCCOX:SICSLYQLENX:19CX21 (SEQ ID NO: 26), em que o resíduo de fenilalanina C-terminal de SEQ ID NO: 24 é direta e covalentemente ligado à porção de ligação, LM, na ausência de quaisquer aminoácidos intervenientes.
[0258]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura: IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência J-R23- R22-X25LCGX29X30oL VX33X3aL YLVCGDXa2GFXas (SEQ ID NO: 28), LM é uma porção de ligação conforme revelado no presente documento e IA compreende a sequência
GIVXa4ECCX8XaSCDLX14aX15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 15) em que J é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral de U- B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado ligado através de uma ligação de amida; Xa É ácido aspártico ou ácido glutâmico; Xs é histidina ou fenilalanina; Xs e Xi são independentemente selecionados a partir de arginina, ornitina, lisina ou alanina; X15 é arginina, lisina, ornitina ou leucina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; X18 é metionina, asparagina ou treonina; X19 é um aminoácido da estrutura geral:
O Reme—c—do | H,
É
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHR10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado; X21 é alanina, glicina ou asparagina; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação covalente, AYRPSE (SEQ ID NO: 11), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico e ácido glutâmico; R23 é uma ligação ou uma sequência de aminoácido que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados; Xas É selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X2a9 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Xs33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico e ácido glutâmico; X34 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; Xa2 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina ornitina e arginina; Xas É um aminoácido da estrutura geral Oo B-HN—CI ls. là, 2
Q X13 em que X13 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH e NHRi2, em que Ri2 é um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B; e R13 é COOH ou CONH>2, com a condição de que um e somente um entre J, X, e X13 compreende U-B. Em uma modalidade, J é H, e X13 é OH, e X é NH-U-B.
[0259]Em uma modalidade, U e B do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo U-B são selecionados para inibir a clivagem enzimática do dipeptídeo U-B a partir de um peptídeo de insulina por enzimas encontradas em soro de mamíferos. Em uma modalidade, U e/ou B são selecionados de modo que a meia-vida de clivagem de U- B do peptídeo de insulina, em PBS sob condições fisiológicas, não seja maior que duas vezes a meia-vida de clivagem de U-B do peptídeo de insulina em uma solução que compreende uma protease de degradação de insulina (isto é, a clivagem de U-B do pró-fármaco de insulina não ocorre em uma taxa maior que 2x mais rápido na presença da protease e condições fisiológicas relativas a condições idênticas na ausência da enzima). Em uma modalidade, U, B, ou o aminoácido do peptídeo de insulina ao qual U-B é ligado consiste em um aminoácido não-codificado. Em uma modalidade, U e/ou B é um aminoácido na configuração de estereoisômero D. em algumas modalidades exemplificadoras, U é um aminoácido na configuração de estereoisômero D e B é um aminoácido na configuração de estereoisômero L. Em algumas modalidades exemplificadoras, U é um aminoácido na configuração de estereoisômero L e B é um aminoácido na configuração de estereoisômero D. Em algumas modalidades exemplificadoras, U é um aminoácido na configuração de estereoisômero D e B é um aminoácido na configuração de estereoisômero D. Em uma modalidade, U-B é um dipeptídeo que compreende a estrutura de Fórmula X conforme definido no presente documento. Em uma modalidade, B é um aminoácido N-alquilado, mas não prolina.
[0260]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um polipeptídeo de agonista de insulina de cadeia única que compreende uma cadeia B e uma cadeia A de insulina humana, ou análogos ou derivados deste, em que a terminação carbóxi da cadeia B é ligada à terminação amino da cadeia A através de uma porção de ligação. Em uma modalidade, a porção de ligação compreende um polietileno glicol de 6 a 16 unidades monoméricas, e um peptídeo CTP.
[0261]Em uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende a estrutura IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência J-Ra3R22- XasLCGX29X30oL VX33X34L X361L VCGX41X4a2GFXas SEQ ID NO: 16); LM é uma porção de ligação que compreende um peptídeo CTP conforme revelado no presente documento, e IA compreende a sequência GIVXaXsCCXaXaX1oCX12aLX1aX15LX17X18
X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18) em que J é H ou um dipeptídeo que compreende a estrutura geral de U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N-alquilado ligado através de uma ligação de amida; Xa É ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico Xs é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X1o é isoleucina ou serina; X12 é serina ou ácido aspártico X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; Xi8 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é um aminoácido da estrutura geral: Oo Smmonts dos 2
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH, OCHs3 ou NHRi10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N-alquilado; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina,
valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; Xas é histidina ou treonina; X2a9 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; X36 é um aminoácido da estrutura geral
O S-HN—CI le. ” 2
Q Xp em que Xi2 é selecionado a partir do grupo que consiste em OH e NHR, em que Ri1 é um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B; Xa É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas É UM aminoácido da estrutura geral
Oo St cu—nAde " L
À
Q Xi3 em que X13 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH e NHRi2, em que Ri2 é H ou elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; R23 é uma ligação ou uma sequência de aminoácido que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados; e R13 é COOH ou CONH>z, com a condição de que U, B, ou o aminoácido do agonista de insulina de cadeia única ao qual U-B é ligado consiste em um aminoácido não-codificado.
[0262]Em uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência R23R22- XasLCGX29X30L VX33X3aL YLVCGX41 Xa2GFXas (SEQ ID NO: 17); LM é uma porção de ligação que compreende a peptídeo CTP conforme revelado no presente documento; e IA compreende a sequência GIVXaXsCCXaXaX1oCX12LX1aX15LX17X18X19CX21- R13 (SEQ ID NO: 18) em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico Xe é histidina, treonina ou fenilalanina;
Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X10 é isoleucina ou serina; Xi12 é serina ou ácido aspártico X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; Xi7 é ácido glutâmico ou glutamina; Xig é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é um aminoácido da estrutura geral: " Since CH, 2
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHR10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; Xas é histidina ou treonina; X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico,
glutamina e ácido glutâmico; X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; Xas é tirosina ou fenilalanina; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; R23 é H ou uma sequência amino que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados; e R13 é COOH ou CONH2. Em uma modalidade, pelo menos um entre n ou k é
1. Em uma modalidade, tanto n como k são 1. Em uma modalidade adicional, a terminação carbóxi da cadeia B compreende uma extensão de aminoácido adicional selecionada a partir do grupo que consiste em F, Y, FN, YT, FNK, YTP, FNPK (SEQ ID NO: 47), FNKP (SEQ ID NO: 45), YTPK (SEQ ID NO: 46), YTPKT (SEQ ID NO: 12), YTKPT (SEQ ID NO: 48), FNKPT (SEQ ID NO: 44) e FNPKT (SEQ ID NO: 49). Em uma modalidade, R23 é uma ligação e R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina- ácido glutâmico, glutamina, ácido glutâmico e H.
[0263]EM uma modalidade, Ra23 é H ou uma sequência amino de 4 a 7 aminoácidos em que o aminoácido N-terminal é selecionado a partir do grupo que consiste em glicina, ácido glutâmico e ácido aspártico, o aminoácido C-terminal é uma lisina e os outros aminoácidos da sequência são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico e ácido aspártico e R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina- ácido glutâmico, glutamina, ácido glutâmico e H.
[0264]Em uma modalidade, U-B compreende a estrutura de Fórmula X: R, Ro Pr o há o R, Re x em que R1, R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci8 alquil, C2-C18 alquenil, (C1-Ci18 alquilJOH, (C1-Ci18 alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil)|CONH2, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1- Ca alquil)NHC(NH2*)NH2, (Co-Ca alquil)(Ca-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-C1o aril)R7, (C1-Ca alguil)(C3-Ca heteroaril), e C1-Ci2 alquil(W1)C1-C12 alquil, em que W1 é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou Ri: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil ou aril; ou Ra1 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Cs6s cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C18 alquil, (C1-Ci1s alquil)OH, (C1-Ci8 alquil)NH>2, (C1-Ci8 alquil)'SH, (Co-Ca alquil)(C3a-Ce)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6s-Ci1o aril)JR7, e (C1-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; Rs é NHRs ou OH; Re é H, C1-Cs alquil ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, C1-C18 alquil, C2-
Cia alquenil, (Co-Ca alquil)|CONH>2, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo. Em uma modalidade, R: ou R2 é diferente de H.
[0265]Em outra modalidade, proporciona-se um análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência J- R23-R22-X25L CGX29X30olL VX3a3X34lL YLVCOGX41X42GFXa5 (SEQ ID NO: 17); LM compreende uma porção de ligação que compreende um peptídeo CTP conforme revelado no presente documento; e IA compreende a sequência GIVXaXsCCXaXaX1oCX12LX1aX15LX17X18 X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18) em que J é H ou um dipeptídeo que compreende a estrutura geral de U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N-alquilado ligado através de uma ligação de amida; Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico Xe é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X10 é isoleucina ou serina; Xi12 é serina ou ácido aspártico X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; X17 é ácido glutâmico ou glutamina; Xi8 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é um aminoácido da estrutura geral:
O Sina. ds 2
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHRi10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; Xas é histidina ou treonina; X2a9 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Xs3 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; Xa41 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; Xa2 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas É um aminoácido da estrutura geral
Oo Sina. | Ho “x Xi3 em que X13 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH e NHRi2, em que Ri2 é H ou elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; R23 é uma ligação ou uma sequência de aminoácido que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados; e R:i3 é COOH ou CONH2. Em uma modalidade adicional, a terminação carbóxi da cadeia B compreende uma extensão de aminoácido adicional selecionada a partir do grupo que consiste em F, Y, FN, YT, FNK, YTP, FNPK (SEQ ID NO: 47), FNKP (SEQ ID NO: 45), YTPK (SEQ ID NO: 46), YTPKT (SEQ ID NO: 12), YTKPT (SEQ ID NO: 48), FNKPT (SEQ ID NO: 44) e FNPKT (SEQ ID NO: 49).
[0266]Em uma modalidade, R23 é uma ligação ou XesoX6:iXe2X63X6aXesK (SEQ ID NO: 19), em que Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em glicina, ácido glutâmico e ácido aspártico, e X61, X62, Xe3 Xe6a e Xe65 são independentemente ácido glutâmico ou ácido aspártico; e R13 é COOH ou CONH2
[0267]EmM uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende a estrutura IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência J-Ra3-R22- XasL CGX29X30L VX33X34L X36l VCGX41 X42GFXa5 SEQ ID NO: 16);
LM é uma porção de ligação que compreende um peptídeo CTP conforme revelado no presente documento; e IA compreende a sequência GIVXaXsCCOXaXsX1ioCX12alX1aX15LX17X18 X19CX21-Ri3 (SEQ ID NO: 18). Em uma modalidade, a terminação carbóxi da cadeia B tem uma extensão de aminoácido terminal que consiste em F, Y, FN, YT, FNK, YTP, FNPK (SEQ ID NO: 47), FNKP (SEQ ID NO: 45), YTPK (SEQ ID NO: 46), YTPKT (SEQ ID NO: 12), YTKPT (SEQ ID NO: 48), FNKPT (SEQ |D NO: 44) e FNPKT (SEQ ID NO: 49).
[0268]Em uma modalidade, R23 é uma amina N-terminal ou XeoX6:Xe2X63X6aXesK (SEQ ID NO: 19), em que Xeo é selecionado a partir do grupo que consiste em glicina, ácido glutâmico e ácido aspártico, e X6s1, X62, X6s3, Xsa e Xs5 São independentemente ácido glutâmico ou ácido aspártico.. De acordo com uma modalidade, o elemento de dipeptídeo U-B compreende a estrutura de Fórmula X: R, Ro O PK: o RB x em que (a)R1, Ra, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Cig alguil, C2-Cig alquenil, (C:-Ci8 alguil)OH, (C1-Cis alquil)SH, (C2-C3 alquil!SCHs3, (C1-Ca alquil)CONH>2, (C1-Ca alqguil)COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1-Ca alqui)NHC(NH2*)NH>2, (Co-Ca alquil)(C3-C6 cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs — heterocíclico), (Co-Ca alquil)(Ce-Cio aril)R7, (Ci-Ca alquil)(Ca-Co heteroaril), e C1i-Ci2 alquil((Wi)C1-C12 alquil, em que Wi é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou (ii) R1 e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil ou aril; ou
(iii) Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam a C3-Cs cicloalquil; (b) Ra é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C13 alquil, (C1- Cisalquil)OH, (C1-Cis alquil)NH2, (C1-Ci8 alquil)SH, (Co-Ca alquil)(C3-Ce)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-C5 heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-C1o aril)R7, e (C1-Ca alquil)(C3- Cs heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; (c) Rs é NHR6s ou OH; (d) Re é H, C1-Cg alquil ou Re e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e (e) R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e OH. Em uma modalidade, R: ou R2 é diferente de H.
[0269]De acordo com uma modalidade, o elemento de dipeptídeo U-B compreende a estrutura RR, Ro " O LX: o R, R x em que R1, R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci8 alquil, C2-C18 alquenil, (C1-Ci18 alquilJOH, (C1-Ci18 alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil)|CONH2, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1- Ca alquil)|NHC(NH2*)NH2, (Co-Ca alquil)(Ca-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, (C1-Ca alguil)(C3-Csa heteroaril), e C1-Ci2 alquil(W1)C1-C12 alquil, em que W1 é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou Ri: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil; ou Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Cs cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-Ci18 alquil, (C1-Cis alquil)OH, (C1-Ci8 alquil)NH2, (C1-Ci8 alquil)SH, (Co-Ca alquil)(C3a-Ce)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-C5s heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Cio aril)R7, e (C1-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; Re é H, C1-Cs alquil ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo. Em uma modalidade, R: ou R2 é diferente de H.
[0270]Em uma modalidade específica, o elemento de dipeptídeo compreende a estrutura de Fórmula X em que R1 e R2 são independentemente C1-C138 alquil ou aril; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; e Rs é uma amina ou uma hidroxila.
[0271]Em outra modalidade específica, o elemento de dipeptídeo compreende a estrutura de Fórmula X em que Ri: é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril, ou R: e R2 são ligados através de -(CH2)p-, em que pé 2a 9; R3 é C1-Ci18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; e Rs é uma amina ou uma amina N-substituída.
[0272]Em outra modalidade específica, o elemento de dipeptídeo compreende a estrutura de Fórmula X em que Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e aril; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra e Rg são hidrogênio; e Rs é selecionado a partir do grupo que consiste em amina, amina N- substituída e hidroxila.
[0273]De acordo com uma modalidade, uma forma de pró-fármaco de um análogo de insulina de cadeia única compreende a estrutura IB-LM-IA, em que |B compreende a sequência R22HLCGSX3oL VEALYLVCG ERGFF (SEQ ID NO: 56) ou X22aVNQX25sLCGX29X3oL VEALYLVCGERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 25);
[0274]LM é uma porção de ligação que compreende um peptídeo CTP conforme revelado no presente documento e (IA compreende a sequência GIVEQCCXsáSICSLYQLENX:9CX21-R13 (SEQ ID NO: 26) ou GIVXaCCOXaX9SCDLX1aX15sLX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 15), em que Xa É ácido glutâmico ou ácido aspártico; X: é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é arginina, lisina, ornitina ou alanina; X14 é arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; Xi17 é ácido glutâmico ou glutamina; Xi8 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina;
X19 é um aminoácido da estrutura geral
O Litqu—nAs- ido 2 RR R O > IV
AS R$ H o R Bs ; em que m: é um número inteiro variando de 1 a 3; R1, R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci8 alquil, C2-C18 alquenil, (C1-Ci18 alguilJOH, (C1-Ci18 alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil) CONH>, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1- Ca alquilNHC(NH2*)NH2, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, (C1-Ca alquil)(C3-Cs9 heteroaril), e C1-Ci2 alquil(Wi1)C1-C12 alquil, em que Wi é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou Ri: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil; ou Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam a C3-Cs cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C13 alquil, (C1-Cis alquil)OH, (C1-C18 alquil)NH2, (C1-Ci18 alquil)'SH, (Co-Ca alquil)(C3- Ce)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(Cs-Cio aril)R7, e (Ci-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e R juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; R6 é H, C1-Cs alquil ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C'138 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alquil)|CONH>, (Co-Ca alquil)|COOH, (Co- Ca alquil) NH, (Co-Ca alquil) OH, e halo; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; X22 é selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e desamino- fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; Xas é histidina ou treonina; X29 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Z1 é um dipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em aspartato- lisina, lisina-prolina, e prolina-lisina; e B1: é selecionado a partir do grupo que consiste em treonina, alanina ou um tripeptídeo de treonina- arginina-arginina.
R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em X22VNQ (SEQ ID NO: 50), um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de asparagina- glutamina, glutamina, e uma amina N-terminal; e R13 é COOH ou CONH2. Em uma modalidade, mi: é 1. De acordo com uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende a estrutura IB-LM- IA, em que IB compreende a sequência X2aVNQX25LCGX29X3oL VEALYLVC GERGFFYT-Z1-B1 (SEQ ID NO: 25), LM é uma porção de ligação que compreende um peptídeo CTP conforme revelado no presente documento e IA compreende a sequência GIVXa4ECCXaXsSCDLX14aX15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 15).
[0275]Em uma modalidade, o análogo de insulina de cadeia única compreende um composto de fórmula: IB-LM-IA, em que IB representa um IGF YL de cadeia B que compreende a sequência GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 6) ou GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNPKT (SEQ ID NO: 52), LM representa uma porção de ligação que compreende SEQ ID NO: 66 e IA representa um IGF de cadeia A que compreende a sequência GIVDECCHRSCDLRRLEMX:8CA-Ri13 (SEQ ID NO: 61) ou GIVDECCHOSCDLOOLQMX:sCN-Ri3 (SEQ ID NO: 43) ou à sequência de insulina nativa GIVEQCCTSICSLYQLENX:sCN-Ri3 (SEQ ID NO: 61) em que Xz é histidina ou fenilalanina; X19 é um aminoácido da estrutura geral
O ii ds “x x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHRi10, em que Rio é um dipeptídeo que compreende a estrutura geral: Ri Ro Ra O
PE Rs o R Rs, Ri é selecionado a partir do grupo que consiste em H e C1-Cs alquil; R2 e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Cs alquil, C2-Cs alquenil, (C1-Ca alquilJOH, (C1-Ca alquil'SH, (C2-C3 alquil)|SCHs3, (C1-Ca alquil)CONH>2, (C1-Ca alquil)COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1-Ca alquil|NHC(NH2*) NH>, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7, e CH2(C5-Cs9 heteroaril), ou Ri e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Cs cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-Ca alquil, (C1-Ca alquil)OH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1-Ca alquil)SH, e (C3-Cs)cicloalquil ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; Rs é NHR: ou OH; Re é H, ou Re e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 5 ou 6 membros; R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H e OH; e Re éHie R13 e Ria são independentemente COOH ou CONH2. Em uma modalidade, Ri: ou R2 é diferente de H. A presente invenção também abrange qualquer combinação de peptídeos de análogo de insulina cadeia A e cadeia B, conforme revelado no presente documento, ligados entre si através de uma porção de ligação conforme revelado no presente documento como um análogo de insulina de cadeia única da fórmula IB- LM-IA.
Elemento de pró-fármaco de dipeptídeo
[0276]Os substituintes do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo, e seu sítio de ligação ao análogo de insulina, podem ser selecionados para proporcionar a meia- vida desejada de um análogo de pró-fármaco dos análogos de insulina revelados no presente documento. Por exemplo, quando um elemento de dipeptídeo de pró- fármaco que compreende a estrutura:
R, R, r O eY e o RR x for ligado ao grupo alfa amino do aminoácido N-terminal do análogo de insulina cadeia B, os compostos tendo um ti2 de cerca de 1 hora em PBS sob condições fisiológicas são proporcionados quando R1: e R2 forem independentemente C1-C'i8 alquil ou aril; ou R e R2 forem ligados através de -(CH2))-, em que pé 2a 9; R3 for C1-Ci18 alquil; Ra e R8 forem hidrogênio; e Rs for uma amina.
[0277]Em outras modalidades, os pró-fármacos ligados na terminação N e tendo um ti/2 de, por exemplo, cerca de 1 hora compreendem um elemento de pró-fármaco de dipeptídeo com a estrutura: Ri Ro ” O Y e o R, Rs em que R1 e R2 são independentemente C1-C138 alquil ou (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; ou Ri: e R2 são ligados através de -(CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-Ci18 alquil; Ra e Rg são hidrogênio; Rs é NH>; R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C138 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alqguil)|CONH>2, (Co-Ca alguil))COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo; e Ra é H..
[0278]Alternativamente, em uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró- fármaco de análogo de insulina em que o pró-fármaco de dipeptídeo é ligado ao grupo alfa amino do aminoácido N-terminal do análogo de insulina cadeia B, e o pró- fármaco tem um ti12 entre cerca de 6 a cerca de 24 horas em PBS sob condições fisiológicas. Em uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de análogo de insulina tendo um t1/2 entre cerca de 6 a cerca de 24 horas em PBS sob condições fisiológicas em que o elemento de pró-fármaco tem a estrutura de Fórmula X e R1 e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Ci18 alquil e aril, ou R: e R2 são ligados através de -(CH2),-, em quepé2as; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e aril; e Rs é uma amina, com a condição de que tanto R: e R2 não sejam hidrogênio e desde que um entre Ra ou Ra seja hidrogênio.
[0279]Em uma modalidade adicional, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de análogo de insulina em que o pró-fármaco de dipeptídeo é ligado ao grupo alfa amino do aminoácido N-terminal do análogo de insulina cadeia B, e o pró-fármaco tem um ti2 entre cerca de 72 a cerca de 168 horas em PBS sob condições fisiológicas. Em uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de análogo de insulina tendo um ti2 entre cerca de 72 a cerca de 168 horas em PBS sob condições fisiológicas em que o elemento de pró-fármaco tem a estrutura de Fórmula X e R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e aril;
R2 é H; R3 é C1-C18 alquil; Ra e Ra são hidrogênio; e Rs é uma amina ou uma amina N-substituída ou uma hidroxila; com a condição de que, se Ri for alquil ou aril, então, R: e Rs juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-11 anel heterocíclico.
[0280]Em algumas modalidades, pró-fármacos tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado ao aminoácido alfa N-terminal do peptídeo de cadeia B de análogo de insulina e tendo um ti2 por exemplo, entre cerca de 12 a cerca de 72 horas, ou, em algumas modalidades, entre cerca de 12 a cerca de 48 horas, compreendem um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco com a estrutura: R, Ro à o
CX o RR x em que R: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Ci138 alquil, (C1-Ci18 alquil)OH, (C1-Ca alquil)NH2, e (Co-Ca alquil)(Ces-C1o aril)R7, ou R1 e R2 são ligados através de (CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cg alquil e (Co-Ca alquil)(C6-C1o aril)R7; Rs é NHa; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci8 alquil, C2-Cis alquenil, (Co-Ca alqui))!CONH2, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquillNH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo; com a condição de que tanto R: e R2 não sejam hidrogênio e desde que pelo menos um entre Ra ou Ra seja hidrogênio.
[0281]Em algumas modalidades, pró-fármacos tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado ao aminoácido N-terminal do peptídeo de cadeia B de análogo de insulina e tendo um t1,2, por exemplo, entre cerca de 12 a cerca de 72 horas, ou, em algumas modalidades, entre cerca de 12 a cerca de 48 horas, compreendem um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco com a estrutura: RIR; R; O ão. Rs Oo RH x em que R: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e (C1-Ca alquil)|NH2, ou Ri: e R2 são ligados através de (CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-Csg alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-Cs alquil; e Rs é NH>; com a condição de que tanto R: e R2 não sejam hidrogênio.
[0282]Em outras modalidades, pró-fármacos tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado ao aminoácido N-terminal do peptídeo de cadeia B de análogo de insulina e tendo um t12, por exemplo, entre cerca de 12 a cerca de 72 horas, ou, em algumas modalidades, entre cerca de 12 a cerca de 48 horas, compreendem um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco com a estrutura: RiRo Rs O ST “o + O R, H x em que Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e (C1-Ca alquil) NH>; R3 é C1-Cs alquil; Ra é hidrogênio; e Rs é NH>; com a condição de que tanto R: e R2 não sejam hidrogênio.
[0283]Em algumas modalidades, pró-fármacos tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado ao aminoácido N-terminal do peptídeo de cadeia B de análogo de insulina e tendo um t12, por exemplo, entre cerca de 12 a cerca de 72 horas, ou, em algumas modalidades, entre cerca de 12 a cerca de 48 horas, compreendem um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco com a estrutura: RR R; O St Rs O RH x em que R: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-Cs alquil, (C1-Ca alquil)NH2, ou Ri: e R2 são ligados através de (CH2),, em que pé 2a 9; R3 é C1-Cs alquil; Ra é (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; R5 é NHa; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e (Co-Ca alquil)OH; com a condição de que tanto R: e R2 não sejam hidrogênio.
[0284]Além disso, proporciona-se um pró-fármaco tendo o elemento de pró- fármaco de dipeptídeo ligado ao aminoácido alfa N-terminal do análogo de insulina e tendo um ti/2, por exemplo, de cerca de 72 a cerca de 168 horas em que o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura:
RH É O
TX O R Rg x em que R: é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1- Cs alquil e (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; R3 é C1-C18 alquil; Ra e Rg são hidrogênio; R5 é NHRs ou OH; Re: é H, C1-Cs alguil, ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C'138 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alguil)|CONH>2, (Co-Ca alguil))COOH, (Co-Ca alquil) NH, (Co-Ca alquil) OH, e halo; com a condição de que, se Ri: for alquil ou (Co-Ca alquil)(Cs-C10 aril)R7, então, R: e R5 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-11 anel heterocíclico.
[0285]Em algumas modalidades, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é ligado a uma amina de cadeia lateral de um aminoácido interno do análogo de insulina. Nesta modalidade, os pró-fármacos tendo um ti2, por exemplo, de cerca de 1 hora têm a estrutura: Ri Ro e o
VE o RR em que
Ri: e R2 são independentemente C1-Cs alquil ou (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; ou R: e R2 são ligados através de -(CH2),-, em que pé 2a 9; R3 é C1-Ci18 alquil; Ra e Rg são hidrogênio; R5 é NHa; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C138 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alguil)CONH>2, (Co-Ca alguil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0286] Adicionalmente, proporcionam-se pró-fármacos tendo um ti2, por exemplo, entre cerca de 6 a cerca de 24 horas e tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado a uma cadeia lateral de aminoácido interno em que o pró-fármaco compreende um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco com a estrutura: Ri Ro " Oo Pa Sã o R, Re em que R: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil, e (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, ou R: e R2 são ligados através de - (CH2))-, em que pé 2a 9; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; R1« e Rs são independentemente hidrogênio, C1-Cia alquil ou (Co-Ca alquil)(Ce6-C1o aril)R7; Rs é NHRs; R: é H ou C1-Cs alquil, ou Re e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil,
C2-Ci18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alguil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo; com a condição de que tanto R: e R2 não sejam hidrogênio e desde que pelo menos um entre Ra ou Ra seja hidrogênio.
[0287]Além disso, proporciona-se um pró-fármaco tendo um ti2, por exemplo, de cerca de 72 a cerca de 168 horas e tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado a uma cadeia lateral de aminoácido interno do análogo de insulina em que o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo tem a estrutura: Ri H É [2 Tv Sã O R Rg em que R: é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1- C18 alquil e (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; R3 é C1-Ci16 alquil; Ra e Rg são hidrogênio; R5 é NHRs ou OH; R: é H ou C1-Cs alquil, ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C138 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alguil)|CONH>2, (Co-Ca alguil))COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo; com a condição de que, se R: e R2 forem independentemente um alquil ou (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7, Ri ou R2 seja ligado através de (CH2), a Rs, emquepéz2aso,
[0288]Em algumas modalidades, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é ligado a uma amina de cadeia lateral de um aminoácido interno do análogo de insulina em que o aminoácido interno compreende a estrutura de Fórmula V h es e +- (CH)n
N H>e, em que n é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 4. Em algumas modalidades n é 3 ou 4 e, em algumas modalidades, o aminoácido interno é lisina. Em algumas modalidades, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é ligado a uma amina primária em uma cadeia lateral de um aminoácido localizado na posição 28, ou 29 da cadeia B do análogo de insulina.
[0289]Em modalidades onde o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo de fórmula X é ligado a um substituinte amino de um grupo arila de um aminoácido aromático, pró-fármaco, sendo que os substituintes do elemento de pró-fármaco podem ser selecionados para proporcionar o tempo desejado de ativação. Por exemplo, a meia- vida de um análogo de pró-fármaco de qualquer um dos análogos de insulina revelados no presente documento que um aminoácido da estrutura de Fórmula |V: h eos o Fr R, R ” O SS ) IV N —N R$ H o RR em que m: é um número inteiro de O a 3, pode ser selecionada alterando-se os substituintes de R1, R2, Ra, Ra, R5, e Ra. Em uma modalidade, o aminoácido de fórmula V está presente em um aminoácido correspondente à posição A19, B16 ou B25 de insulina nativa, e, em um exemplo específico, o aminoácido de fórmula V fica localizado na posição A19 do análogo de insulina, e m: é 1. Em uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de análogo de insulina que compreende a estrutura de Fórmula IV e tem um ti2 de cerca de 1 hora em PBS sob condições fisiológicas. Em uma modalidade, o derivado de pró-fármaco de análogo de insulina tendo um ti2 de cerca de 1 hora em PBS sob condições fisiológicas compreende a estrutura de fórmula IV em que, R1 e R2 são independentemente C1-C18 alquil ou aril; R3 é C1-Ci18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; e R5 é uma amina ou uma hidroxila. Em uma modalidade, m: é 1.
[0290]Em uma modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é ligado ao análogo de insulina através de uma amina presente em um grupo arila de um aminoácido aromático do análogo de insulina, em que o pró-fármaco tem um t1,2, por exemplo, de cerca de 1 hora tem um dipeptídeo de estrutura: R; Ro É o
E o R ER em que R: e R2 são independentemente C1-Ci8 alquil ou (Co-Ca alquil)(Cs- C10 aril)R7; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C138 alquil e (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7; R5 é NH2 ou OH; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C138 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alguil)|CONH>2, (Co-Ca alguil))COOH, (Co-Ca alquil) NH, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0291]Em outra modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de análogo de insulina que compreende a estrutura de Fórmula IV, em que mi: é um número inteiro d O a 3 e tendo um t1/2 de cerca de 6 a cerca de 24 horas em PBS sob condições fisiológicas. Em uma modalidade, onde o pró-fármaco de análogo de insulina tendo um ti2 de cerca de 6 a cerca de 24 horas em PBS sob condições fisiológicas compreende a estrutura de fórmula IV em que, R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril, ou R: e R2 são ligados através de -(CH2),-, em que pé 2a 9; R3 é C1-Ci18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; e Rs é uma amina ou amina N-substituída. Em uma modalidade, mi: é 1. Em uma modalidade, proporcionam-se pró-fármacos tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado através de um aminoácido aromático e tendo um ti2, por exemplo, de cerca de 6 a cerca de 24 horas, em que o dipeptídeo compreende a estrutura de:
RH É O Y e O R Rs em que
Ri: é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C'18 alquil, (C1-C18 alquil)OH, (C1-Ca alquil) NH>, e (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C13 alquil e (Co-Ca alquil)(C6-C10 aril)R7; Rs é NHRs; Re é H, C1-Csa alquil, ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0292]EmM outra modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de análogo de insulina que compreende a estrutura de Fórmula IV, em que mi: é um número inteiro de O a 3 e tendo um t1/2 de cerca de 72 a cerca de 168 horas em PBS sob condições fisiológicas. Em uma modalidade, onde o derivado de pró-fármaco de análogo de insulina tendo um ti1/2 de cerca de 72 a cerca de 168 horas em PBS sob condições fisiológicas compreende a estrutura de fórmula IV em que, Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e aril; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra e Rg são hidrogênio; e Rs é selecionado a partir do grupo que consiste em amina, amina N- substituída e hidroxila. Em uma modalidade, m: é 1.
[0293]Em uma modalidade, proporcionam-se pró-fármacos tendo o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado através de um aminoácido aromático e tendo um ti2, por exemplo, de cerca de 72 a cerca de 168 horas, em que o dipeptídeo compreende uma estrutura de: RH 5 O
EE o RR em que R e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil, (C1-Ca alquil)COOH, e (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, ou R: e Rs juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-11 anel heterocíclico; R3 é C1-Ci8 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra é hidrogênio ou forma um 4-6 anel heterocíclico com R3; R3 é hidrogênio; R5 é NHRs ou OH; R: é H ou C1-Cs alquil, ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil, C2-C18 alquenil, (Co-Ca alquil)CONH>, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0294]De acordo com uma modalidade, o dipeptídeo de Fórmula X é adicionalmente modificado para compreender um polímero grande que interfere a capacidade do análogo de insulina para interagir com a insulina ou receptor IGF-1. À clivagem subsequente do dipeptídeo libera o análogo de insulina a partir do complexo de dipeptídeo em que o análogo de insulina liberado é completamente ativo. De acordo com uma modalidade, o dipeptídeo de Fórmula X é adicionalmente modificado para compreender um polímero grande que interfere na capacidade do análogo de insulina ligado para interagir com a insulina ou receptor IGF-1. De acordo com uma modalidade, o análogo de insulina compreende um dipeptídeo da estrutura geral de Fórmula X: Ri R> S o TE * o R, BR em que uma das cadeias laterais de aminoácido do dipeptídeo de Fórmula X é peguilada ou acilada.
[0295JEM uma modalidade, proporciona-se um análogo de insulina que compreende a estrutura IB-LM-IA, em que IB compreende a sequência J-R23-R22- XasL CGX29X30L VX33X34L Xa6l VCGX41X4a2GFXa5 (SEQ ID NO: 16); LM é uma porção de ligação que compreende a peptídeo CTP conforme descrito no presente documento, incluindo, por exemplo, um peptídeo de ligação que compreende a sequência de SEQ ID NO: 66; e IA compreende a sequência GIVXaXsCCXaXaX10CX12LX1aX15LEX18X190X21 — R13 (SEQ ID NO: 55), em que J é H ou um elemento de dipeptídeo of fórmula X; Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico X: é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X10 é isoleucina ou serina; Xi12 é serina ou ácido aspártico X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; Xis é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina;
Xio é um aminoácido da estrutura geral:
O Sina du
É
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHR10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral de Fórmula X; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; Xas é histidina ou treonina; X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X34 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; Xa É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; Xa2 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas É UM aminoácido da estrutura geral
O
PO da
À
Q Xi3 em que X1:3 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH e NHR12, em que Ri2 é H ou elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral de Fórmula X; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina- prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma amina N-terminal; R23 é uma ligação XeoX6:Xe62X63XsaX65K (SEQ ID NO: 19), em que Xeo é selecionado a partir do grupo que consiste em glicina, ácido glutâmico e ácido aspártico, e X61, X62, X63, X64 E X65 são independentemente ácido glutâmico ou ácido aspártico; e R:3 é COOH ou CONH, em que o dipeptídeo de Fórmula X é acilado ou peguilado. Em uma modalidade, J compreende um dipeptídeo acilado ou peguilado de Fórmula X.
[0296]Os análogos de insulina e derivado de pró-fármaco destes aqui revelados podem ser adicionalmente modificados para aperfeiçoar a solubilidade do peptídeo em soluções aquosas em pH fisiológico, enquanto acentua a duração efetiva do peptídeo evitando-se depuração renal do peptídeo. Os peptídeos são facilmente depurados por causa de seu tamanho molecular relativamente pequeno quando comparado às proteínas de plasma. Aumentar o peso molecular de um peptídeo acima de 40 kDa excede o limiar renal e estende significativamente a duração no plasma. De modo correspondente, em uma modalidade, os pró-fármacos de peptídeo são adicionalmente modificados para compreender uma porção hidrofílica covalentemente ligada.
[0297]Em uma modalidade, a porção hidrofílica é uma proteína de plasma, cadeia de polietileno glicol ou a porção Fc de uma imunoglobina. Portanto, em uma modalidade, os análogos de insulina presentemente revelados são adicionalmente modificados para compreender um ou mais grupos hidrofílicos covalentemente ligados às cadeias laterais de aminoácidos.
[0298]De acordo com uma modalidade, os pró-fármacos de insulina revelados no presente documento são adicionalmente modificados ligando-se uma porção hidrofílica ao aminoácido N-terminal da cadeia B ou à cadeia lateral de um aminoácido de lisina (ou outro aminoácido adequado) localizado na terminação carbóxi da cadeia B, incluindo, por exemplo, na posição 28 de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco de insulina de cadeia única em que um dos aminoácidos da porção de ligação é modificado ligando-se uma porção hidrofílica à cadeia lateral do ligante peptídico. Em uma modalidade, o aminoácido modificado é cisteína, lisina ou acetil fenilalanina.
[0299]De acordo com uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró- fármaco do análogo de insulina em que o elemento de dipeptídeo de Fórmula X compreende, ainda, um grupo de polietileno glicol, alguila ou acila. Em uma modalidade, uma ou mais cadeias de polietileno glicol são ligadas ao dipeptídeo de Fórmula X em que o peso molecular combinado das cadeias de polietileno glicol varia de cerca de 20.000 a cerca de 80.000 Daltons, ou 40.000 a 80.000 Daltons ou
40.000 a 60.000 Daltons. Em uma modalidade, pelo menos uma cadeia de polietileno tendo um peso molecular de cerca de 40.000 Daltons é ligada ao dipeptídeo de Fórmula X. Em outra modalidade, o dipeptídeo de Fórmula X é acilado com um grupo acila de tamanho suficiente para ligar albumina sérica e, portanto,
inativar o peptídeo de análogo IGF8!68!7 mediante administração. O grupo acila pode ser linear ou ramificado, e, em uma modalidade, é um ácido graxo C16 a C30. Por exemplo, o grupo acila pode ser qualquer um entre ácido graxo C16, ácido graxo C18, ácido graxo C20, ácido graxo C22, ácido graxo C24, ácido graxo C26, ácido graxo C28, ou um ácido graxo C30. Em algumas modalidades, o grupo acila é um ácido graxo C16 a C20, por exemplo, um ácido graxo C18 ou um ácido graxo C20.
[0300]Em outra modalidade, os peptídeos de análogo de insulina, e seus análogos de pró-fármaco, revelados no presente documento são adicionalmente modificados pela adição de um aminoácido modificado à terminação carbóxi ou amino da cadeia A ou à terminação amino da cadeia B do peptídeo de análogo de insulina, em que o aminoácido adicionado é modificado para compreender uma porção hidrofílica ligada ao aminoácido. Em uma modalidade, o aminoácido adicionado à terminação C é uma cisteína modificada, lisina ou acetil fenilalanina. Em uma modalidade, a porção hidrofílica é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína de plasma, cadeia de polietileno glicol e uma porção Fc de uma imunoglobina.
[0301]Em uma modalidade, o grupo hidrofílico é uma cadeia de polietileno glicol, e, em uma modalidade, duas ou mais cadeias de polietileno glicol são covalentemente ligadas a duas ou mais cadeias laterais de aminoácidos do análogo de insulina. De acordo com uma modalidade, a porção hidrofílica é covalentemente ligada a uma cadeia lateral de aminoácido de um análogo de insulina revelado no presente documento em uma posição correspondente a A10, B28, B29, à terminação C da cadeia A ou à terminação N da cadeia B (posições relativas à insulina nativa). Para análogos de insulina e seus derivados de pró-fármaco tendo múltiplas cadeias de polietileno glicol, as cadeias de polietileno glicol podem ser ligadas no aminoácido N- terminal da cadeia B ou à cadeia lateral de um aminoácido de lisina localizado na terminação carbóxi da cadeia B, ou pela adição de um aminoácido único na terminação C do peptídeo em que o aminoácido adicionado tem uma cadeia de polietileno glicol ligada a sua cadeia lateral. De acordo com uma modalidade, proporciona-se um derivado de pró-fármaco em que a cadeia de polietileno glicol ou outra porção hidrofílica é ligada à cadeia lateral de um dos dois aminoácidos que compreendem o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo. Em uma modalidade, o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo compreende uma lisina (na configuração de estereoisômero D ou L) com uma cadeia de polietileno glicol ligada à amina de cadeia lateral da lisina.
[0302]De acordo com uma modalidade, os peptídeos de análogo de insulina, ou derivados de pró-fármaco destes, revelados no presente documento são adicionalmente modificados por substituições de aminoácido, em que a substituição de aminoácido compreende uma cadeia lateral adequada para reticulação com porções hidrofílicas, incluindo, por exemplo, polietileno glicol. Por exemplo, em uma modalidade, um aminoácido nativo em uma posição correspondente a A5, A8, A9, A10, A12, A14, A15, A17, A18, B1, B2, B3, B4, B5, B13, B14, B17, B21, B22, B26, B27, B28, B29 e B30 da insulina nativa é substituído por uma lisina, cisteína ou resíduo de acetil fenilalanina (ou adiciona-se uma lisina, cisteína ou resíduo de acetil fenilalanina à terminação C) para permitir uma ligação covalente de uma cadeia de polietileno glicol.
[0303]Em uma modalidade, o análogo de insulina, ou derivado de pró-fármaco deste, tem uma substituição de cisteína única ou um resíduo de cisteína única adicionado à terminação amino ou carbóxi do análogo de insulina, ou um aminoácido na porção de ligação ou o elemento de dipeptídeo de um derivado de pró-fármaco de insulina é substituído por ao menos um resíduo de cisteína, em que a cadeia lateral do resíduo de cisteína é adicionalmente modificada por um reagente reativo de tiol, incluindo, por exemplo, maleimido, vinil sulfona, 2-piridiltio, haloalquil, e haloacil. Esses reagentes reativos de tiol podem conter grupos carbóxi, ceto, hidroxila, e éter, bem como outras porções hidrofílicas, como unidades de polietileno glicol. Em uma modalidade alternativa, o análogo de insulina, ou derivado de pró- fármaco deste, tem uma substituição de lisina única ou um resíduo de lisina única adicionado à terminação amino ou carbóxi do análogo de insulina, ou um aminoácido na porção de ligação ou o elemento de dipeptídeo de um derivado de pró-fármaco de insulina é substituído por lisina, e a cadeia lateral do resíduo de lisina de substituição é adicionalmente modificado usando reagentes reativos de amina, como ésteres ativos (succinimido, anidrido, etc) de ácidos carboxílicos ou aldeídos de porções hidrofílicas, como polietileno glicol.
[0304]De acordo com uma modalidade, proporciona-se uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos análogos de insulina inovadores revelados no presente documento, de preferência, em um nível de pureza de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Essas composições podem conter um análogo de insulina conforme revelado no presente documento em uma concentração de pelo menos 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml ou maior. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas compreendem soluções aquosas que são esterilizadas e opcionalmente armazenadas contidas em vários recipientes de embalagem. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um pó liofilizado. As composições farmacêuticas podem ser adicionalmente embaladas como parte de um kit que inclui um dispositivo descartável para administrar a composição a um paciente. Os recipientes ou kits podem ser etiquetados para armazenamento em temperatura ambiente ou em temperatura refrigerada.
[0305]Em uma modalidade, proporciona-se uma composição que compreende uma mistura de um primeiro e de um segundo derivado de pró-fármaco de análogo de insulina, em que o primeiro e o segundo derivados de pró-fármaco de análogo de insulina diferem entre si com base na estrutura do elemento de pró-fármaco. Mais particularmente, o primeiro derivado de pró-fármaco de análogo de insulina pode compreender um elemento de dipeptídeo de pró-fármaco que tenha uma meia-vida substancialmente diferente do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo do segundo derivado de pró-fármaco de análogo de insulina. De modo correspondente, a seleção de diferentes combinações de substituintes no elemento de dipeptídeo permitirá a preparação de composições que compreendem uma mistura de derivados de pró-fármaco de análogo de insulina que sejam ativados de maneira controlada durante um período de tempo desejado e em intervalos de tempo específicos. Por exemplo, as composições podem ser formuladas para liberar o peptídeo de análogo de insulina ativo nos horários das refeições seguido por um peptídeo de análogo de insulina de ativação subsequente durante a noite com dosagens adequadas sendo liberadas com base no tempo de ativação.
[0306]Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende uma mistura de um derivado de pró-fármaco de análogo de insulina revelado no presente documento e uma insulina nativa, ou um análogo bioativo conhecido de insulina. A mistura em uma modalidade pode estar sob a forma de um heteroduplex ligando um análogo de insulina e uma insulina nativa, ou um análogo bioativo conhecido de insulina. Os dímeros podem compreender um peptídeo de análogo de insulina ligado a outro análogo de insulina ou a um heteroduplex de insulina de cadeia A à cadeia B ligado por dissulfeto. As misturas podem compreender um ou mais dos análogos de insulina, insulina nativa, ou um análogo bioativo conhecido de insulina, em derivados de pró-fármaco deste ou derivado de depósito deste ou outras formas conjugadas, e qualquer combinação destes, conforme revelado no presente documento.
[0307] Acredita-se que os análogos de insulina revelados, e seus derivados de pró- fármaco correspondentes, sejam adequados para qualquer uso que tenha sido previamente descrito para peptídeos de insulina. De modo correspondente, os análogos de insulina, e seus derivados de pró-fármaco correspondentes, descritos no presente documento podem ser usados para tratar hiperglicemia, ou tratar outras doenças metabólicas que resultem a partir de altos níveis de glicose no sangue. De modo correspondente, a presente invenção abrange composições farmacêuticas que compreendem um análogo de insulina conforme revelado no presente documento, ou um derivado de pró-fármaco deste, e um veículo farmaceuticamente aceitável para uso no tratamento de um paciente que sofre de altos níveis de glicose no sangue. De acordo com uma modalidade, o paciente a ser tratado usando um análogo de insulina revelado no presente documento é um animal domesticado, e, em outra modalidade, o paciente a ser tratado é um ser humano.
[0308]Um método para tratar hiperglicemia de acordo com a presente revelação compreende as etapas de administrar o análogo de insulina presentemente revelado, ou depósito ou derivado de pró-fármaco deste, a um paciente usando qualquer rota de administração padrão, incluindo parenteral, tal como intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular, intratecal, transdérmica, retal, oral, nasal ou por inalação. Em uma modalidade, a composição é administrada subcutânea ou intramuscularmente. Em uma modalidade, a composição é administrada parenteralmente e o análogo de insulina, ou derivado de pró-fármaco deste, é pré-embalada em uma seringa.
[0309]O análogo de insulina revelado no presente documento, e depósito ou derivado de pró-fármaco deste, pode ser administrado sozinho ou em combinação com outros agentes antidiabéticos. Os agentes antidiabéticos conhecidos na técnica ou sob pesquisa incluem insulina nativa, glucágon nativo e análogos funcionais destes, sulfonilureias, como tolbutamida (Orinase), acetoexamida (Dymelor), tolazamida (Tolinase), clorpropamida (Diabinese), glipizida (Glucotrol), gliburida (Diabeta, Micronase, Glynase), glimepirida (Amaril), ou gliclazida (Diamicron);
medglitinidas, como repaglinida (Prandin) ou nateglinida (Starlix); biguanidas, como metformina (Glucophage) ou fenformina; tiazolidinedionas, como rosiglitazona (Avandia), pioglitazona (Actos), ou troglitazona (Rezulin), ou outros inibidores PPARy; inibidores de alfa-glicosidase que inibem a digestão de carboidratos, como miglitol (Glyset), acarbose (Precose/Glucobay); exenatida (Byetta) ou pramlintida; inibidores de dipeptidil peptidase-4 (DPP-4), como vildagliptina ou sitagliptina; inibidores SGLT (transportador de glicose sódio-dependente 1); ou inibidores FBPase (frutose 1,6-bisfosfatase).
[0310]As composições farmacêuticas que compreendem os análogos de insulina aqui revelados, ou depósito ou derivado de pró-fármacos destes, podem ser formuladas e administradas a pacientes usando veículoes farmaceuticamente aceitáveis padrão e rotas de administração conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. De modo correspondente, a presente revelação também abrange composições farmacêuticas que compreendem um ou mais dos análogos de insulina aqui revelados (ou derivado de pró-fármaco destes), ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende uma concentração de 1 mg/ml do análogo de insulina em um pH de cerca de 4,0 a cerca de 7,0 em um sistema de tampão de fosfato. As composições farmacêuticas podem compreender o análogo de insulina como o único componente farmaceuticamente ativo, ou Oo peptídeo de análogo de insulina pode ser combinado com um ou mais agentes ativos.
[0311]Todos os métodos terapêuticos, composições farmacêuticas, kits e outras modalidades similares descritas no presente documento contemplam que os peptídeos de análogo de insulina, ou derivados de pró-fármaco destes, incluem todos os sais farmaceuticamente aceitáveis destes.
[0312]EmM uma modalidade, o kit é dotado de um dispositivo para administrar a composição de análogo de insulina a um paciente. O kit pode incluir, ainda, uma variedade de recipientes, por exemplo, frascos, tubos, garrafas, e similares. De preferência, os kits também incluirão instruções para uso. De acordo com uma modalidade, o dispositivo do kit é um dispositivo de dispensação por aerossol, em que a composição é pré-embalada no dispositivo de aerossol. Em outra modalidade, o kit compreende uma seringa e uma agulha, e, em uma modalidade, a composição de análogo de insulina é pré-embalada na seringa.
[0313]Os compostos da presente invenção podem ser preparados por métodos sintéticos padrão, técnicas de DNA recombinante, ou quaisquer outros métodos para preparação de peptídeos e proteínas de fusão. Embora determinados aminoácidos não-naturais não possam ser expressos por técnicas de DNA recombinante padrão, as técnicas para sua preparação são conhecidas na técnica. Os compostos desta invenção que abrangem porções não-peptídicas podem ser sintetizados por reações de química orgânica padrão, além das reações de química peptídica padrão quando aplicáveis.
[0314]De acordo com a presente revelação, proporcionam-se as modalidades exemplificadoras a seguir:
1.Análogo de insulina de cadeia única que compreende uma cadeia A, uma cadeia B e uma porção de ligação, em que a dita porção de ligação compreende um peptídeo de 18 aminoácidos que liga covalentemente a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A para formar uma cadeia de aminoácido contígua, com a condição de que a porção de ligação não compreenda uma sequência de 18 aminoácidos que seja idêntica a uma sequência de 18 aminoácidos de SEQ ID NO: 53 diretamente ligada à terminação carbóxi da cadeia B.
2.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 1, em que a dita porção de ligação compreende um total de 18 a 158 resíduos de aminoácidos.
3.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 1, em que a dita porção de ligação compreende um total de 28 a 56 aminoácidos.
4.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 2 ou 3, em que a dita porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que a dita sequência contígua com 29 aminoácidos tem uma identidade de sequência superior a 90% a SSSSXssAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXs: (SEQ ID NO: 66), em que X5o e X51 são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina.
5.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 2 ou 3, em que a dita porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que pelo menos 58% dos aminoácidos que compreendem a dita sequência contígua com 29 aminoácidos são selecionados a partir do grupo que consiste em serina e prolina.
6.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 2, 3, 4 ou 5, em que o dito análogo de insulina compreende, ainda, um sítio de glicosilação não-nativo.
7.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 2, 3, 4 ou 5, em que a dita porção de ligação compreende um sítio de glicosilação.
8.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 7, em que a dita porção de ligação compreende um sítio de glicosilação N-ligado.
9.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 7 ou 8, em que a dita porção de ligação compreende um sítio de glicosilação O-ligado.
10.Análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 6 a 8, em que a dita porção de ligação é glicosilada.
11.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 2 ou 3,
em que a dita porção de ligação compreende um análogo de (SEQ ID NO: 64), em que o dito análogo difere de (SEQ ID NO: 64) por 1 a 6 substituições de aminoácido.
12.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 4, em que a dita porção de ligação compreende (SEQ ID NO: 66).
13.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que a sequência SSSSXsoAPPPSLPSPSRLP GPSDTPILPQXs: (SEQ ID NO: 66), SSSSXssAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO; 92) ou MGSSSSXscAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO; 93) é ligada à terminação amino da cadeia B, opcionalmente com uma sequência interveniente que consiste em 1 a 5 aminoácidos acídicos seguidos por uma arginina ou lisina.
14.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que a dita porção de ligação compreende a sequência SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQK (SEQ ID NO: 79) ou SSSSKAPPPSLP SPSRLPGPSDTPILPOR (SEQ ID NO: 64).
15.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que a dita cadeia A compreende a sequência GIVXaXsCCOXaX9X10CX12LX14X15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 18); e a dita cadeia B compreende a sequência R22-X2sLCGX29X30L VX33X3aL YLVCGX41Xa2GFXas (SEQ ID NO: 17) em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico; X; é histidina, treonina ou fenilalanina; Xo é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X1o é isoleucina ou serina; X12 é serina ou ácido aspártico; X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; X17 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, ácido aspártico, ornitina ou lisina; X18 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; Xi9 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X2: é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina,
serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; X25 é histidina ou treonina; X29 É selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X34 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; X41 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; X42 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas é tirosina ou fenilalanina; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina- glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina- glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; e R138 é COOH ou CONH>z.
16.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 15, em que a dita cadeia A compreende a sequência GIVXaXsCCXsaXsX1o0CX12 LX1aX15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55); a dita cadeia B compreende a sequência XasLCGX29X30L VX33X34aL YLVOGX41Xa42GFXas (SEQ ID NO: 17); em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é ácido glutâmico ou glutamina; Xs é treonina, histidina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, ornitina ou alanina; é serina ou isoleucina; X12 é serina ou ácido aspártico; X14 é arginina, tirosina, ornitina ou alanina; é glutamina, arginina, alanina, ornitina ou leucina; Xi1g é metionina, asparagina ou treonina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4- amino fenilalanina; X21 é alanina, glicina ou asparagina; X25 é histidina ou treonina; X29 é alanina, glicina ou serina; X3o é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico ou ácido cistéico; X33 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; X3a é alanina ou treonina; Xa É ácido aspártico ou ácido glutâmico; Xa2 é alanina, ornitina ou arginina; Xas é tirosina ou fenilalanina; e R138 é COOH ou CONHz.
17.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 15 e 16, em que a cadeia B compreende, ainda, uma extensão amino terminal que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados.
18.Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, em que a cadeia B compreende a sequência R22- HLCGSX3ol VEALYLVCGERGFF (SEQ |D NO: 56) ou R24-X2asLOGX29X30 LVX33X3aL YLVOGX41Xa2GFXas (SEQ ID NO: 17) e a cadeia A compreende a sequência — GIVEQCCXsSICSLYQLENX18CX21-Riaz (SEQ I|D NO: 26) ou GIVXa4ECCX8XaSCDLX1aX15LX17X18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 15) em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é arginina, lisina, ornitina ou alanina; X14 é arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; X:7 é glutamina ou ácido glutâmico; X:1s é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é tirosina, 4-metóxi- fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; X22 é selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e desamino-fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X25 é histidina ou treonina; X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e glicina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X3a é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; Xai É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; X4a2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas é tirosina ou fenilalanina; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em X22VNQ (SEQ ID NO: 50), um tripeptídeo de valina-asparagina- glutamina, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, e uma ligação; R2a é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; e R:13 é COOH ou CONH,.
19.Agonista de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 18, em que Xs, X25 e X30 são histidina.
20.Agonista de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 15 a 19, em que Xa é ácido aspártico; Xs é arginina, lisina, ornitina ou alanina, X21 é alanina, glicina ou asparagina; X29 é alanina; X33 é ácido aspártico; Xa1 É alanina; Xa41 É ácido aspártico; e R22 é um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico.
[0315]21. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 20, que compreende, ainda, uma porção hidrofílica ligada ao dito análogo.
[0316]22. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 21, em que a porção hidrofílica é uma proteína de plasma, cadeia de polietileno glicol ou a porção Fc de uma imunoglobina.
[0317]23. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 21, em que a porção hidrofílica é um polietileno glicol ligado ao aminoácido N-terminal da cadeia B ou a uma cadeia lateral de aminoácido da porção de ligação.
[0318]24. Agonista de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 23, em que uma cadeia lateral de aminoácido do dito agonista de insulina de cadeia única é covalentemente ligada a um grupo acila ou um grupo alquila através de uma ligação alquil amina, amida, éter, éster, tioéter, ou tioéster.
[0319]25. Análogo de insulina, que compreende uma cadeia A, uma cadeia B e um peptíideo CTP, em que a dita cadeia A compreende a sequência GIVXaXsCCX8XaX10C X12L X1aX15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 55); a diat cadeia B compreende a sequência X25LCGX29X30L VX33X34L YLVCGX41 Xa2GFXa5s (SEQ ID NO: 17); e o dito peptíideco CTP compreende a sequência (SSSSXsoAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPOQXs:)n (SEQ ID NO: 66) ou MGSSSSXscAPPPSLPSPS RLPGPSDTPILPQEEEEEXs: (SEQ ID NO; 93), em que as ditas cadeias A e B são ligadas entre si através de ligações de dissulfeto e o dito peptídeo CTP é covalentemente ligado à terminação amino ou carbóxi da cadeia B, em que n é um número inteiro selecionado a partir de 1 a 3; Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é ácido glutâmico ou glutamina; Xs é treonina, histidina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, ornitina ou alanina; X1o é serina ou isoleucina; X12 é serina ou ácido aspártico; X11 é arginina, tirosina, ornitina ou alanina; X:s é glutamina, arginina, alanina, ornitina ou leucina; X18 é metionina, asparagina ou treonina; X19 é tirosina, 4-metóxi- fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X2: é alanina, glicina ou asparagina; Xa5 É histidina ou treonina; X29 é alanina, glicina ou serina; X3o é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico ou ácido cistéico; X33 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; X34 é alanina ou treonina; Xa1 é ácido aspártico ou ácido glutâmico; Xa42 é alanina, ornitina ou arginina; Xas é tirosina ou fenilalanina; Xso e Xs: são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina; e Ri3 é COOH ou CONHz.
[0320]26. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 25, em que o dito peptídeo CTP é covalentemente ligado à terminação amino da cadeia B para proporcionar um peptídeo CTP N-terminal.
[0321]27. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 25, em que o dito peptídeo CTP é covalentemente ligado à terminação carboxila da cadeia B para proporcionar um peptídeo CTP C-terminal.
[0322]28. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 25 ou 27, em que a terminação carbóxi da dita cadeia B é covalentemente ligada à terminação amino da cadeia A através de um ligante peptídico para formar uma cadeia de aminoácido contígua, em que o dito ligante peptídico compreende o dito peptídeo CTP, proporcionando um peptídeo CTP ligante.
[0323]29. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 25, 26, 27 ou 28, em que o peptídeo CTP C-terminal, o peptídeo CTP N-terminal e o peptídeo CTP ligante compreendem uma sequência independentemente selecionada a partir do grupo que consiste em (SSSSXssAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ)n (SEQ ID NO; 92), (SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK)n (SEQ ID NO: 79), e (SSSSKAPPP SLPSPSRLPGPSDTPILPOQR)n (SEQ ID NO: 64), em que né 1 ou 2.
[0324]30. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 29, em que né 1 e o peptídeo CTP ligante compreende a sequência SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPS DTPILPQK (SEQ ID NO: 79).
[0325]31. Análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 25 a 30, em que a cadeia B compreende a sequência SSSSXsoAPPPSLPSP SRLPGPSDTPILPQXs: SEQ ID NO: 66) ligada à terminação carbóxi da cadeia Be a sequência MGSSSSXssAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEXs: (SEQ ID NO; 93) ligada à terminação amino da cadeia B.
[0326]32. Análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 25 a 31, em que o peptídeo CTP é glicosilado.
[0327]33. Análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 25 a 32, em que a cadeia B compreende a sequência R22-HLCGSX3oLVEALYL
VCGERGFF (SEQ ID NO: 56) ou R24-X25LOCGX29X30L VX33X3aL YLVCOGXa41Xa2GFXas (SEQ ID NO: 17) e a cadeia A compreende a sequência GIVEQCCX:SICSL YQLENX:8CX21-R1i3 (SEQ ID NO: 26) ou GIVX4ECCXaXsSCDLX1aX15LX17X18X19 CX21-R13 (SEQ ID NO: 15), em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é arginina, lisina, ornitina ou alanina; Xu é arginina, lisina, ornitina ou alanina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; X:17 é glutamina ou ácido glutâmico; X:8 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X2: é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; X22 é selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e desamino-fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X25 é histidina ou treonina; X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e glicina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X34 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; X41 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; X42 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas é tirosina ou fenilalanina; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em X22VNQ (SEQ ID NO: 50), um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, e uma ligação; R24 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina- ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; e R138 é COOH ou CONH:>.
[0328]34. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 33, em que Xs, X25 e
Xs3o são histidina.
[0329]35. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 33 ou 34, em que Xa é ácido aspártico; Xs é arginina, lisina, ornitina ou alanina; X2: é alanina, glicina ou asparagina; X29 é alanina; X é ácido aspártico; X34 é alanina; X41 é ácido aspártico; e R22 é um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico.
[0330]36. Análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 25 a 35, em que a cadeia B compreende a sequência Ra5-HLCGSX3olVEAL YLVCGERGFF (SEQ ID NO: 56), o peptídeo CTP compreende a sequência de SEQ ID NO 66 e a cadeia A compreende a sequência de GIVEQCCXsSICSLYQL ENX19CX21-R13 (SEQ ID NO: 26), em que X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; Xs é histidina, treonina ou fenilalanina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X2: é alanina, glicina ou asparagina; X22 é selecionado a partir do grupo que consiste em fenilalanina e desamino-fenilalanina; e R25 é selecionado a partir do grupo que consiste em X22VNQ (SEQ ID NO: 50), um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, AYRPSE (SEQ ID NO: 11), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, ácido glutâmico.
[0331]37. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 36, que compreende, ainda, um peptídeo CTP ligado à terminação N da cadeia B.
[0332]38. Análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 25 a 37, que compreende, ainda. uma porção hidrofílica ligada ao dito análogo.
[0333]39. Análogo de insulina, de acordo com a modalidade 38, em que a porção hidrofílica é um polietileno glicol ligado ao aminoácido N-terminal da cadeia B ou uma cadeia lateral de aminoácido da porção de ligação.
[0334]40. Agonista de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 25 a
39, em que uma cadeia lateral de aminoácido do dito agonista de insulina é covalentemente ligada a um grupo acila ou um grupo alquila através de uma ligação alquil amina, amida, éter, éster, tioéter, ou tioéster.
[0335]41. Sequência de ácido nucléico que codifica o análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 37.
[0336]42. Célula hospedeira eucariótica que compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica o análogo de insulina, de acordo com a modalidade 41.
[0337]43. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade 42, em que a célula é uma célula hospedeira de mamífero.
[0338]44. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade 42, em que a célula é uma célula Pichia ou CHO.
[0339]45. Método para produzir um análogo de insulina hiperglicosilado, sendo que o dito método compreende culturar as células, de acordo com a modalidade 42, sob condições em que a dita proteína é produzida; e recuperar a dita proteína a partir da cultura.
[0340]46. Método, de acordo com a modalidade 45, em que o análogo de insulina é expressa como um análogo de cadeia única, sendo que o dito método compreende, ainda, a etapa de clivar a proteína recuperada para produzir um análogo de insulina de duas cadeias.
[0341]47. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 46, em que a porção de ligação compreende a sequência SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQK (SEQ ID NO: 79).
[0342]48. Derivado do análogo de insulina, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 47, que compreende, ainda, a estrutura U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido hidróxi; B é um aminoácido N-alquilado ligado ao dito análogo de insulina de cadeia única através de uma ligação de amida entre uma porção carboxila de B e uma amina do análogo de insulina de cadeia única, em que
U, B, ou o aminoácido do análogo de insulina de cadeia única ao qual U-B é ligado consiste em um aminoácido não-codificado, em que a meia-vida de clivagem química (t12) de U-B do análogo de insulina de cadeia única é pelo menos cerca de 1 hora a cerca de | semana em PBS sob condições fisiológicas.
[0343]49. Derivado, de acordo com a modalidade 48, em que o dito análogo de insulina compreende uma sequência de cadeia A de GIVXaXsCCOXaX9X10CX12L Xt14X15LX17X18X19C0X21-R13 (SEQ ID NO: 18) em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico; Xz é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; Xwo é isoleucina ou serina; X12 é serina ou ácido aspártico; X14 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, ácido aspártico, ornitina ou lisina; X18 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X19 é 4-amino fenilalanina; X2: é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; em que U-B é ligado ao agonista de insulina de cadeia única através de uma ligação de amida entre uma porção carboxila de B e a para amina de 4-amino fenilalanina na posição A19.
[0344]50. Derivado, de acordo com a modalidade 48 ou 49, em que Xa é ácido aspártico; Xs é ácido glutâmico; Xs é histidina ou fenilalanina; Xs é arginina, lisina ou ornitina; X1o é serina; X12 é ácido aspártico; Xi e Xis são independentemente arginina, lisina ou ornitina; X17 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, ácido aspártico, ornitina ou lisina; X18 é metionina; e X21: é alanina ou asparagina.
[0345]51. Derivado, de acordo com qualquer uma das modalidades 47 a 49, em que o primeiro aminoácido e/ou o segundo aminoácido da estrutura U-B é um aminoácido na configuração de estereoisômero D.
[0346]52. Derivado, de acordo com a modalidade 49, em que U-B compreende a estrutura de Fórmula X: R, R, O
TX o R, R x em que R1, R2, Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci8 alquil, C2-C18 alquenil, (C1-Ci18 alquilJOH, (C1-Ci18 alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil)|CONH2, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1- Ca alqui)NHC(NH2*)NH2, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, (C1-Ca alguil)(C3-Ca heteroaril), e C1-Ci2 alquil(W1)C1-C12 alquil, em que W1 é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou Ri: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil ou aril; ou Ra1 e Rg juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Cs6s cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C18 alquil, (C1-Ci1s alquil)OH, (C1-Ci8 alquil)NH2, (C1-Ci8 alquil)SH, (Co-Ca alquil)(C3-Cse)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6s-Ci1o aril)JR7, e (C1-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; R6 é H, C1-Cs alquil ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e
R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, C1-Ci138 alquil, Ca- Cia alquenil, (Co-Ca alquil)|CONH>2, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
[0347]53. Derivado, de acordo com a modalidade 52, em que R1 e R2 são independentemente C1-Ci18 alquil ou aril; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-12 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; e Rs é uma amina ou uma hidroxila.
[0348]54. Derivado, de acordo com a modalidade 52, em que R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C138 alquil e aril, ou R: e R2 são ligados através de -(CH2),-, em que pé 2a 9; R3 é C1-Ci18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; e Rs é uma amina ou amina N-substituída.
[0349]55. Derivado, de acordo com a modalidade 52, em que Ri: e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-Cs alquil e aril; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um 4-6 anel heterocíclico; Ra e Rg são hidrogênio; e Rs é selecionado a partir do grupo que consiste em amina, amina N- substituída e hidroxila.
[0350]56. Derivado, de acordo com qualquer uma das modalidades 48 a 55, que compreende, ainda, uma porção hidrofílica ligada a um aminoácido da estrutura U-B ou a porção de ligação.
[0351]57. Derivado, de acordo com a modalidade 56, em que a porção hidrofílica é polietileno glicol ou albumina.
[0352]58. Análogo de insulina de cadeia única que compreende a estrutura IB-LM- IA, em que IB compreende a sequência J-Ra3R22-XasLOCGX29X30LVX33X3al X36l VOG Xa1Xa2GFXa5s (SEQ ID NO: 16); LM é uma porção de ligação que compreende uma sequência de 18 aminoácidos que liga covalentemente a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A para formar uma cadeia de aminoácido contígua, com a condição de que a porção de ligação não compreenda uma sequência de 18 aminoácidos que seja idêntica a uma sequência de 18 aminoácidos de SEQ ID NO: 53 diretamente ligada à terminação carbóxi da cadeia B; e IA compreende a sequência GIVXaXsCCOXgXaX1oCX12aL X1aX15LEX18X19C0X21- Ri13 (SEQ ID NO: 55) em que J é H ou um dipeptídeo que compreende a estrutura geral de U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N-alquilado ligado através de uma ligação de amida; X« é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico; Xs é histidina, treonina ou fenilalanina; Xo é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X1o é isoleucina ou serina; X12 é serina ou ácido aspártico; X1a é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina; X:5 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina; X:8 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina; X1s é um aminoácido da estrutura geral:
O Sinal. Mm
À
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHR10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado; X2: é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina; X25 é histidina ou treonina; X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico; X33 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico; X34 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina; X36 é um aminoácido da estrutura geral Oo Snes: & b 2
Q X2 em que X12 é selecionado a partir do grupo que consiste em OH e NHRi1, em que R1:1 é um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B; Xa1 é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina; Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina; Xas é um aminoácido da estrutura geral
O Simas: ” 2
Q x) 3 em que X13 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH e NHRi2, em que Ri12 é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U- B; R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina- ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; R23 é uma ligação ou uma sequência de aminoácido que compreende 1 a 6 aminoácidos carregados; e R:13 é COOH ou CONH;3z, com a condição de que U, B, ou o aminoácido do agonista de insulina de cadeia única ao qual U-B é ligado seja um aminoácido não-codificado.
[0353]59. Análogo de cadeia única, de acordo com a modalidade 58, em que X19 é um aminoácido da estrutura geral:
O Eno. la, 2
Q x em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em OH ou NHR10, em que Rio é H ou um elemento de dipeptídeo que compreende a estrutura geral U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido de hidroxila e B é um aminoácido N- alquilado; e X36 e Xa5 são tirosina.
[0354]60. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 58 ou 59, em que a dita porção de ligação compreende a sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi-terminal da cadeia B, em que a dita sequência contígua com 28 aminoácidos tem uma identidade de sequência superior a 95% a (SEQ ID NO: 64).
[0355]61. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 58 ou 59, em que a dita porção de ligação compreende um análogo de (SEQ ID NO: 64), em que o dito análogo difere de (SEQ ID NO: 64) por 1 a 6 substituições de aminoácido.
[0356]62. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 58 ou 59, em que a dita porção de ligação compreende (SEQ ID NO: 66); em que Xs5o e Xs1 são independentemente arginina ou lisina.
[0357]63. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 59, em que a dita porção de ligação compreende SSSSRAPPPSLPSPSRLP GPSDTPILPQK (SEQ ID NO: 64).
[0358]64. Insulina de cadeia única, de acordo com as modalidades 59 a 63, em que Xa é ácido aspártico; Xs é ácido glutâmico; Xs é histidina ou fenilalanina; X9 é arginina, lisina ou ornitina; X1o é serina; X12 é ácido aspártico; X1a e Xi5 são independentemente arginina, lisina ou ornitina; X17 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, ácido aspártico, ornitina ou lisina; X18 é metionina; e X2: é alanina ou asparagina.
[0359]65. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 59 a 64, em que U-B compreende a estrutura de Fórmula X: Ri R» r o SK: o RR x em que R1, R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci8 alquil, C2-C18 alquenil, (C1-Ci18 alguilJOH, (C1-Ci18 alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil) CONH>, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1- Ca alquilNHC(NH2*)NH2, (Co-Ca alquil)(C3-Cs cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, (C1-Ca alquil)(C3-Cs9 heteroaril), e C1-Ci2 alquil(Wi1)C1-C12 alquil, em que Wi é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou Ri: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil ou aril; ou Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam a C3-Cs cicloalquil; R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C13 alquil, (C1-Cis alquil)OH, (C1-Ci8 alquil)NHa, (C1-C18 alquil)SH, (Co-Ca alquil)(C3-Cs)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(Cs-Cio aril)R7, e (Ci-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; R6 é H, C1-Cs alquil ou Re e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, C1-C136 alquil, C2- Cia alquenil, (Co-Ca alquil)|CONH>2, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil)OH, e halo, com a condição de que quando Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formarem um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros, tanto Ri: como R2 sejam diferentes de H.
[0360]66. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 59 a 65, que compreende, ainda, uma porção hidrofílica ligada a um aminoácido da estrutura U-B ou a porção de ligação.
[0361]67. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 66, em que a porção hidrofílica é polietileno glicol ou albumina.
[0362]68. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 59 a 67 em que IA compreende a sequência GIVEQCCTSICSL YQLENX18CX21-R13 (SEQ ID NO: 95), GIVEQCCHSICSLYQLENX18CX21-Ri3 (SEQ ID NO: 37) ou GIVDECCHRSCDLRRLEMX19CX21-R1i3 (SEQ ID NO: 51) e |B compreende a sequência FVYNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRT (SEQ ID NO: 94) FVYNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2), GPETLCGAE LVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 6) ou GPETLCGAELVDALYLVCGD RGFYFNPKT (SEQ ID NO: 52); e Xaa na posição 21 é alanina, glicina ou asparagina.
[0363]69. Análogo de insulina de cadeia única, de acordo com a modalidade 68, em que a porção de ligação compreende a sequência (SSSSXscAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPOQXs:)) (SEQ ID NO: 66), em que n é um número inteiro selecionado a partir do grupo que consiste em 1, 2 ou 3; e Xso e X5si são independentemente arginina ou lisina.
[0364]70. Agonista de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 59 a 69, em que o dito análogo é acilado em uma ou mais posições selecionadas a partir de A14, A15, BO, B1, B10, B22, B28, B29, na cadeia lateral de uma cadeia lateral de aminoácido da porção de ligação, ou na cadeia lateral de um aminoácido do dipeptídeo U-B.
[0365]71. Agonista de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 59 a 69, em que o dito análogo é peguilado em uma ou mais posições selecionadas a partir de A14, A15, BO, B1, B10, B22, B28, B29, na cadeia lateral de uma cadeia lateral de aminoácido da porção de ligação, ou na cadeia lateral de um aminoácido do dipeptídeo U-B.
[0366]72. Dímero ou multímero, que compreende um agonista de insulina de cadeia única, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 71.
[0367]73. Composição farmacêutica, que compreende um agonista de insulina de cadeia única, ou derivado de pró-fármaco deste, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 72 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0368]74. Método para tratar diabetes, sendo que o dito método compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 73.
[0369]75. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 72, na fabricação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia.
[0370]76. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 72, para tratamento de diabetes.
EXEMPLO 1 Síntese de Cadeias A e B de Insulina
[0371]As cadeias A e B de insulina foram sintetizadas em resina de 4-metilbenziril amina (MBHA) ou em resina de 4-hidroximetil-fenilacetamidometil (PAM) usando química Boc. Os peptídeos foram clivados a partir da resina usando HF/p-cresol 95:5 durante 1 hora a 0ºC. Após a remoção de HF e a precipitação de éter, os peptídeos foram dissolvidos em ácido acético aquoso a 50% e liofilizado. Alternativamente, os peptídeos foram sintetizados usando química Fmoc. Os peptídeos foram clivados a partir da resina usando ácido trifluoroacético (TFA)/triisopropilsilano (TIS/H2O (95:2,5:2,5), durante 2 horas em temperatura ambiente. O peptídeo foi precipitado através da adição de uma quantidade excessiva de dietil éter e a pelota solubilizada em um tampão acídico aquoso. A qualidade dos peptídeos foi monitorada por RP- HPLC e confirmada por Espectrometria de Massa (ES| ou MALDI).
[0372]As cadeias A de insulina foram sintetizadas com uma cisteína livre única no aminoácido 7 e todas as outras cisteínas protegidas como acetamidometil A- (SH)/(Acm)$:11.2º, As cadeias B de insulina foram sintetizadas com uma cisteína livre única na posição 7 e a outra cisteína protegida como acetamidometil B- (SH)/(Acm)'º. Os peptídeos brutos foram purificados por RP-HPLC convencional.
[0373]As cadeias A e B sintetizadas foram ligadas entre si através de sua ligação de dissulfeto nativa de acordo com o procedimento geral descrito na Figura 1. À respectiva cadeia B foi ativada ao análogo Cys'-Npys através da dissolução em DMF ou DMSO e reagida com 2,2'-ditiobis (5-nitropiridina) (Nopys) em uma razão molar 1:1, em temperatura ambiente. A ativação foi monitorada por RP-HPLC e o produto foi confirmado por ESI-MS.
[0374]A primeira ligação de dissulfeto B7-A7 foi formada pela dissolução do respectivo A-(SH)/(Acm)$11-2º é B-(Npys)'(Acm)'º em razão molar 1:1 a uma concentração peptídica total de 10 mg/ml. Quando a reação de combinação de cadeia estava completa, a mistura foi diluída em uma concentração de ácido acético aquoso a 50%. As últimas duas ligações de dissulfeto foram formadas simultaneamente através da adição de iodo. Um excesso molar de 40 vezes foi adicionado à solução e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante uma hora adicional. A reação foi encerrada pela adição de uma solução aquosa de ácido ascórbico. A mistura foi purificada por RP-HPLC e o composto final foi confirmado por MALDI-MS. Conforme mostrado na Figura 2 e nos dados da Tabela 1, a insulina sintética preparada de acordo com este procedimento se compara bem com a insulina purificada para ligação de receptor de insulina.
[0375]Os peptídeos de insulina que compreendem um aminoácido modificado (como 4-amino fenilalanina na posição A19) também podem ser sintetizados in vivo usando um sistema que permita a incorporação de aminoácidos não-codificados em proteínas, incluindo, por exemplo, o sistema ensinado nas Patentes U.S. Nos.
7.045.337 e 7.083.970.
Tabela 1: Atividade de insulina sintetizada em relação à insulina nativa Insulina padrão Insulina A7-B7 Média padrão Média padrão IC5so (nM) 0,24 0,07 0,13 0,08 sms [e | Dm EXEMPLO 2 Peguilação de grupos amina (terminação N e lisina) por alguilação redutiva Síntese
[0376]lInsulina (ou um análogo de insulina), MPEG20Kk-aldeído, e NaBH;CN, em uma razão molar de 1:2:30, foram dissolvidos em um tampão de ácido acético em um pH de 4,1 a 4,4. A solução de reação foi composta por 0,1 N de NaCl, 0,2 N de ácido acético e 0,1 N de NazCOs. A concentração de peptídeo de insulina foi aproximadamente 0,5 mg/ml. A reação ocorre durante seis horas em temperatura ambiente. O grau de reação foi monitorado por RP-HPLC e o rendimento da reação foi de aproximadamente 50%.
Purificação
[0377]A mistura de reação foi diluída 2 a 5 vezes com TFA a 0,1% e aplicada a uma coluna de RP-HPLC preparativa. Condição de HPLC: coluna C4; taxa de vazão ml/min; Tampão A 10% ACN e TFA a 0,1% em água; tampão B 0,1% TFA em ACN; Um gradiente linear B% de O a 40% (0-80 minutos); PEG-insulina ou análogos foi eluído em aproximadamente 35% de tampão B. Os compostos desejados foi verificados por MALDI-TOF, seguindo modificação química através de sulftólise ou degradação de trpsina. Peqguilação de grupos amina (terminação N e Lisina) por acilação de N- hidroxisuccinimida Síntese
[0378]lnsulina (ou um análogo de insulina) junto a mPEG20k-NHS foram dissolvidos em 01 N de tampão de Bicina (pH 8,0) em uma razão molar de 1:1. À concentração de peptídeo de insulina foi aproximadamente 0,5 mg/ml. O progresso da reação foi monitorado por HPLC. O rendimento da reação é aproximadamente 90% após 2 horas em temperatura ambiente. b. Purificação
[0379]A mistura de reação foi diluída 2 a 5 vezes e carregada a RP-HPLC. Condição de HPLC: coluna C4; taxa de vazão 10 ml/min; Tampão A 10% ACN e 0,1% TFA em água; tampão B 0,1% TFA em ACN; Um gradiente linear B% de 0 a 40% (O a 80 minutos); PEG-insulina ou análogos foi coletado em aproximadamente 35% B. Os compostos desejados foram verificados por MALDI-TOF, seguindo a modificação química através de sulftólise ou degradação de tripsina. Peguilação aminada redutiva de grupo acetil no anel aromático da fenilalanina Síntese
[0380]lnsulina (ou um análogo de insulina), MPEG2O0k-hidrazida, e NABH3;CN em uma razão molar de 1:2:20 foram dissolvidos em tampão de ácido acético (pH de 4,1 a 4,4). A solução de reação foi composta por 0,1 N de NaCl, 0,2 N de ácido acético e 0,1 N de NazCOz. A concentração de insulina ou análogo de insulina foi aproximadamente 0,5 mg/ml, em temperatura ambiente durante 24 horas. O processo de reação foi monitorado por HPLC. A conversão da reação foi aproximadamente 50%. (calculada por HPLC) b. Purificação
[0381]A mistura de reação foi diluída 2 a 5 vezes e carregada a RP-HPLC. Condição de HPLC: coluna C4; taxa de vazão 10 ml/min; Tampão A 10% ACN e TFA a 0,1% em água; tampão B 0,1% TFA em ACN; Uma gradiente linear B%e de 0 a 40% (0 a 80 minutos); PEG-insulina, ou análogo de PEG-insulina foi coletado em aproximadamente 35%B. Os compostos desejados foram verificados por MALDI- TOF, seguindo a modificação química através de sulftólise ou degradação de tripsina.
EXEMPLO 3 Ensaio de ligação de receptor de insulina:
[0382]A afinidade de cada peptídeo pela insulina ou receptor IGF-1 foi medida em um ensaio de ligação de competição usando tecnologia de proximidade por cintilação. Diluições seriais de 3 vezes dos peptídeos foram feitas em tampão Tris-Cl (0,05 M de Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 0,1% p/v albumina sérica bovina) e misturada em placas de 96 poços (Corning Inc., Acton, MA, EUA) com 0,05 nM (3- [125I]--iodotirosil) A TyrAt4 insulina ou (3-[125I]--iodotirosil) IGF-1 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). Uma alíquota de 1 a 6 microgramas de fragmentos de membrana plasmática preparada a partir de células que sobre- expressam a insulina humana ou receptores IGF-1 estava presente em cada poço e adicionou-se 0,25 mg/poço de microesferas de ensaio de proximidade por cintilação tipo A de aglutinina de gérmen de trigo tratado com polietileno imina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). Após cinco minutos de agitação em 800 rpm, a placa foi incubada durante 12 horas em temperatura ambiente e a radioatividade foi medida por um contador de cintilação líquida MicroBeta1450 (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, EUA). A radioatividade não especificamente ligada (NSB) foi medida nos poços com um excesso de concentração de 4 vezes de ligante nativo “frio” em relação a maior concentração em amostras de teste. A radioatividade de ligação total foi detectada nos poços sem competidores. A ligação específica percentual foi calculada da seguinte forma: % Ligação Específica = (NSB ligado/ NSB ligado total) x 100. Os valores ICso foram determinados utilizando-se o software Origin (OriginLab, Northampton, MA, EUA).
EXEMPLO 4 Ensaio de fosforilação de receptor de insulina:
[0383]Para medir a fosforilação de receptor por insulina ou análogos de insulina, as células HEK293 transfectadas por receptor foram dispostas em placas de cultura de tecido com 96 poços (Costar 43596, Cambridge, MA, EUA) e culturadas em um meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 100 IUÚ/ml de penicillina, 100 Dg/ml de estreptomicina, 10 mM de HEPES e 0,25% de soro de crescimento bovino (HyClone SH30541, Logan, UT, EUA) durante 16 a 20 horas a 37ºC, CO? a 5% e 90% de umidade. As diluições seriais de insulina ou análogos de insulina foram preparadas em DMEM suplementado com 0,5% de albumina sérica bovina (Roche Applied Science *100350, Indianapolis, IN, EUA) e adicionadas aos poços com células aderidas. Após uma incubação de 15 minutos a 37ºC em uma atmosfera umidificada com CO2 a 5%, as células foram fixas com 5% de paraformaldeído durante 20 minutos em temperatura ambiente, lavadas duas vezes com uma solução salina tamponada de fosfato com pH 7,4 e bloqueadas com 2% de albumina sérica bovina em PBS durante 1 hora. A placa foi, então, lavada três vezes e carregada com anticorpo contra fosfotirosina conjugado por peroxidase de rábano silvestre (Upstate biotechnology f16-105, Temecula, EUA, CA) reconstituída em PBS com 2% de albumina sérica bovina por recomendação do fabricante. Após 3 horas de incubação em temperatura ambiente a placa foi lavada 4 vezes e 0,1 ml de substrato de solução única TMB (Invitrogen, %00-2023, Carlbad, CA, EUA) foi adicionado a cada poço. O desenvolvimento de cor foi interrompido 5 minutos depois pela adição de 0,05 ml! de 1 N HCI. A absorbância a 450 nm foi medida em Titertek Multiscan MCC340 (ThermoFisher, Pittsburghh/ PA, EUA). Representaram-se graficamente as curvas de resposta de dosagem de absorbância vs. concentração de peptídeo e os valores EC5o foram determinados utilizando-se um software Origin (OriginLab, Northampton, MA, EUA). EXEMPLO 5 Determinação da taxa de clivagem de dipeptídeo modelo (em PBS)
[0384]Utilizou-se um hexapeptídeo específico (HSRGTF-NH2; SEQ ID NO: 57) como um peptídeo modelo no qual a taxa de clivagem de extensão N-terminal de dipeptídeo pode ser estudada. Os peptídeos de modelo estendido de dipeptídeo foram preparados, sarcosina protegida por Boc e lisina foram adicionadas com sucesso à resina de ligação de peptídeo modelo para produzir peptídeo A (Lys-Sar- HSRGTF-NH2; SEQ ID NO: 58). O peptídeo A foi clivado por HF e purificado por HPLC preparativa. Purificação preparativa usando HPLC
[0385]A purificação foi realizada usando uma análise HPLC em uma coluna Vydac C18 à base de sílica de 1 x 25 cm (5 yu de tamanho de partícula, 300 A de tamanho de poro). Os instrumentos usados foram: bomba Waters Associates modelo 600, Injetor modelo 717, e detector UV modelo 486. Utilizou-se um comprimento de onda de 230 nm para todas as amostras. O solvente A continha CH3CN a 10% /TFA a 0,1% em água destilada, e o solvente B continha TFA a 0.1% em CH;CN. Um gradiente linear foi empregado (0 a 100% B em 2 horas). A taxa de vazão era 10 ml/minuto e o tamanho de fração era 4 ml. A partir de -150 mgs de peptídeo bruto, obtiveram-se 30 mgs de peptídeo puro.
[0386]O peptídeo A foi dissolvido em uma concentração de d 1 mg/ml em tampão PBS. A solução foi incubada a 37 ºC. As amostras foram coletadas para análise a 5h, 8h, 24h, 31h, e 47h. A clivagem de dipeptídeo foi arrefecida reduzindo-se p pH com um volume igual de TFA a 0,1%. A taxa de clivagem foi quantitativamente monitorada por LC- MS e quantitativamente estudada por HPLC. O tempo de retenção e a área de pico relativo para o pró-fármaco e o peptídeo de modelo pai foram quantificados usando o software Peak Simple Chromatography. Análise usando espectrometria de massa
[0387]Os espectros de massa foram obtidos usando um espectrômetro de massa quadripolar de eletroaspersão Sciex API-Ill com uma fonte de íon ESI padrão. As condições de ionização que foram usadas são as seguintes: ESI| no modo de fon positivo; tensão de aspersão iônica, 3,9 kV; potencial de orifício, 60 V. O gás nebulizante e de cortina usado foi nitrogênio com uma taxa de vazão de 0,9 L/min. Os espectros de massa foram registrados de 600-1800 Thompsons a 0,5 Th por etapa e um tempo de contato de 2 mseg. A amostra (cerca de 1mg/mL) foi dissolvida em acetonitrila aquosa a 50% com ácido acético a 1% e introduzida por uma bomba de seringa externa na taxa de 5 uL/min. Os peptídeos solubilizados em PBS forram dessalinizados usando uma ponta de extração de fase sólida ZipTip contendo 0,6 ul de resina C4, de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA) antes da análise.
Análise usando HPLC
[0388]As análises HPLC foram realizadas usando um sistema Beckman System Gold Chromatography equipado com um detector UV em 214 nm e uma coluna C8 Vydac de 150 mm x 4,6 mm. A taxa de vazão era de 1 ml/min. O solvente A continha TFA a 0,1% em água destilada, e o solvente B continha TFA a 0,1% em CH3;CN a 90%. Um gradiente linear foi empregado (0% a 30%B em 10 minutos). Os dados foram coletados e analisados usando o software Peak Simple Chromatography.
[0389]A taxa de clivagem foi determinada para os respectivos pró-peptídeos. As concentrações dos pró-peptídeos e do peptídeo pai modelo foram determinadas por suas respectivas áreas de pico. As constantes de taxa de dissociação de primeira ordem dos pró-fármacos foram determinadas representando-se graficamente o logaritmo da concentração do pró-fármaco em vários intervalos de tempo. A inclinação deste gráfico fornece a constante de taxa kK. As meias-vidas para clivagem dos vários pró-fármacos foram calculadas usando a fórmula ti2 = 0,693/k. A meia-vida da extensão Lys-Sar para este modelo de peptídeo HSRGTF-NH>2 (SEQ ID NO: 57) foi determinada como sendo 14,0h.
EXEMPLO 6 Taxa de meio tempo de clivagem de dipeptídeo em plasma conforme determinado com um peptídeo modelo de isoforma d
[0390]Um hexapeptídeo modelo adicional (dIHATARGATAF-NH2 SEQ ID NO: 59) foi usado para determinar a taxa de clivagem de dipeptídeo em plasma. O isômero d de cada aminoácido foi usado para evitar a clivagem enzimática do peptídeo modelo, com a exceção da extensão de pró-fármaco. Este hexapeptídeo modelo de isômero d foi sintetizado de maneira análoga ao isômero |. A sarcosina e a lisina foram sucessivamente adicionadas à terminação N conforme previamente reportado para o peptídeo A para preparar o peptídeo B (dLys-dSar-dHdTdRGdATdAF-NH2 SEQ ID NO: 60)
[0391]A taxa de clivagem foi determinada para os respectivos pró-peptídeos. As concentrações dos pró-peptídeos e o peptídeo pai modelo foram determinadas por suas respectivas áreas de pico. As constantes de taxa de dissociação de primeira ordem dos pró-fármacos foram determinadas representando-se graficamente o logaritmo da concentração do pró-fármaco em vários intervalos de tempo. A inclinação deste gráfico proporciona a constante de taxa kK. A meia-vida da extensão Lys-Sar a este peptídeo modelo dHdTdRGATdAF-NH2 (SEQ ID NO: 59) foi determinada como sendo 18,6h.
EXEMPLO 7
[0392]A taxa de clivagem para dipeptídeos adicionais ligados ao hexapeptídeo modelo (HSRGTF-NH2; SEQ ID NO: 57) foi determinada usando os procedimentos descritos no Exemplo 5. Os resultados gerados nesses experimentos são apresentados nas Tabelas 2e 3.
Tabela 2: Clivagem dos dipeptídeos U-B que são ligados à cadeia lateral de um para-amino-Phe N-terminal a partir do hexapeptídeo modelo (HSRGTF-NH>; SEQ ID NO: 57) em PBS meo
NH el ns TF— NH, o Compostos U (aminoácido) O (aminoácido) te 1 F P 58h 2 Hidroxil-F P 327h 3 d-F P 20h 4 d-F d-P 39h G P 72h 6 Hidroxil-G P 603h 7 L P 62h 8 terc-L P 200h 9 Ss P 34h P P 97h 1 K P 33h 12 dK P 11h 18 E P 85h 14 Sar P =1000h Aib P 69 min 16 Hidroxil-Aib P 33h 17 cicloexano P 6min
19 Hidroxil -G G Sem clivagem 20 Ss N-Metil-Gly 4,3h 21 K N-Metil-Gly 5,2h 22 Aib N-Metil-Gly 7, Imin Tabela 3: Clivagem dos dipeptídeos U-B ligados à histidina (ou análogo de histidina) na posição 1 (X) a partir do hexapeptídeo modelo (XSRGTF-NH2; SEQ ID NO: 61) em PBS
[0393]NH2-U-B-XSRGTF-NH>2 (SEQ ID NO: 61 Comp. | U (aminoácido) — O (aminoácido) | X (aminoácido) Tr 1 F P 1 Sem clivagem 2 Hidroxil-F P H Sem clivagem 3 G P 111 Sem clivagem 4 Hidroxil-G P H Sem clivagem A P H Sem clivagem 6 Cc P H Sem clivagem 7 Ss P H Sem clivagem 8 P P H Sem clivagem 9 K P H Sem clivagem E P H Sem clivagem 111 Deidro V P H Sem clivagem 12 P d-P H Sem clivagem 13 d-P P H Sem clivagem 14 Aib P H 32h Aib d-P H 20h 16 Aib P d-H 16h 17 Cicloexil- P H 5h 18 Ciclopropil- P H 10h 19 N-Me-Aib P H >500h a, a-dietil-Gly P H 46h 21 Hidroxil-Aib P H 61 22 Aib P A 58
E O O O A ET
| Comp. | U (aminoácido) | O (aminoácido) | X(amincácido) | TT, = Aib N-Hexil-Gly H 1omin 26 Aib Ácido azetidina-2- H >500h 27 G N-Metil-Gly H 104h 29 G N-Hexil-Gly H 70h dK N-Metil -Gly H 27h 31 dK N-Metil-Ala H 14h 32 dK N-Metil-Phe H 57h 33 K N-Metil-Gly H 14h 34 F N-Metil-Gly H 29h [86 TOP Nverey TOR | sin EXEMPLO 8 Identificação de um análogo de insulina com uma estrutura adequada para construção de pró-fármacos
[0394]A posição 19 da cadeia A é conhecida como sendo um sítio importante para atividade de insulina. Portanto, a modificação neste sítio para permitir a ligação de um elemento de pró-fármaco é desejável. Os análogos específicos de insulina em A19 foram sintetizados e caracterizados por sua atividade nos receptores de insulina. Dois análogos estruturais altamente ativos foram identificados em A19, em que as alterações estruturais comparáveis em um segundo resíduo aromático de sítio ativo (B24) não foram bem sucedidas na identificação de análogos de insulina de atividade similarmente completa.
[0395]As Tabelas 4 e 5 ilustram a alta conservação estrutural na posição A19 para atividade completa no receptor de insulina (ligação ao receptor determinada usando o ensaio descrito no Exemplo 3). A Tabela 4 demonstra que somente dois análogos de insulina com modificações em A19 têm atividades de ligação ao receptor similares à insulina nativa.
Para o análogo de insulina 4-amino, proporcionam-se dados de três experimentos separados.
A coluna marcada como “Atividade (em teste)” compara a ligação percentual do análogo de insulina em relação à insulina nativa para dois experimentos separados conduzidos simultaneamente.
A coluna marcada como “Atividade (0,60 nM)” é a ligação percentual relativa do análogo de insulina em relação ao valor médio histórico obtido para ligação à insulina usando este ensaio.
Sob qualquer análise, dois análogos de insulina A19 (4-amino fenilalanina e 4-metóxi fenilalanina») demonstram uma ligação ao receptor aproximadamente equivalente à insulina nativa.
A Figura 3 representa um gráfico que demonstra a respectiva ligação específica de insulina nativa e do análogo de insulina A19 ao receptor de insulina.
A Tabela 5 apresenta dados que mostram que os dois análogos de insulina A19 (4-amino e 4-metóxi) que demonstram atividades de ligação equivalentes visto que a insulina nativa também demonstra uma atividade equivalente no receptor de insulina (atividade de receptor determinada usando o ensaio descrito no Exemplo 4). Tabela 4: Atividade de ligação ao receptor de insulina de análogos de insulina A19 PADRÃO teste) nM) 4-OH (insulina nativa)! 0,64 0,15 100,0 100,0 4-COCHz3 31,9 9,47 0,6 1,9 4-NH2 0,31 0,12 203,0 193,5 0,83 0,15 103,0 72,8 0,8 0,1 94,0 75,0 4-NO>2 215,7 108,01 0,3 1,8 3,4,5-3F 123,29 | 31,10 0,5 0,5 4-0CHs3 0,5 0,50 173,0 120,0 3-0CHs 4,74 1,09 28,0 12,7
5,16 3,88 18,0 11,6 4-OH, 3,5-2Br 1807,17 | 849,72 0,0 0,0 4-OH, 3,5-2 NO? 2346,2 | 338,93 0,0 0,0 Tabela 5: Atividade de fosforilação de receptor de insulina de análogos de insulina A19 | Receptor de insulina Análogo EC50 DESVIO % de ligante nativo PADRÃO Atividade (em teste) == ES | 4-NHz2 031 | ot 393,5 4-OCHz3 0,94 0,34 129,8 EXEMPLO 9 Análogo IGF1 (YB!6LB!7) de fator de crescimento tipo insulina (IGF)
[0396]Os requerentes constataram um análogo IGF que demonstra uma atividade similar no receptor de insulina à insulina nativa. Mais particularmente, o análogo IGF (IGF1 (Y8'8LB!7) compreende a cadeia A IGF nativa (SEQ ID NO: 5) e a cadeia B modificada (SEQ ID NO: 6), em que a glutamina e a fenilalanina nativas nas posições 15 e 16 da cadeia B IGF nativa (SEQ ID NO: 3) foram substituídas por resíduos de tirosina e leucina, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 4 e na Tabela 6 abaixo, as atividades de ligação de IGF1 (YB'!S8LB!7) e insulina nativa demonstram que cada uma destas consiste em agonistas altamente potentes do receptor de insulina.
Tabela 6
IGF OO em
FEB = | [=] EXEMPLO 10 Análogos de pró-fármaco IGF
[0397]Com base na atividade do análogo de insulina A19 (vide o Exemplo 5), realizou-se uma modificação similar ao análogo IGF1 A:B(YE'SLB!7) e sua capacidade em ligar e estimular a atividade de receptor de insulina foi investigada. A Figura 6 proporciona um esquema sintético geral para preparar IGF1 A:B(Y8'16L8!7) em que a tirosina nativa é substituída por uma 4-amino fenilalanina [IGF1 A:B(Y8!6L8!7)(p-NH2-F)A!ºamida] bem como a preparação de seu análogo estendido por dipeptídeo [IGF1 A:B(YB'6LB!7)A!9-AiBAla amida], em que um dipeptídeo que compreende AiB e Ala é ligado ao peptídeo através de uma ligação amida à 4-amino fenilalanina A19. Conforme mostrado na Figura 7 e na Tabela 7, o análogo IGF, IGF1 (YB!6LB!7) A(p-NH2-F)'* se liga especificamente ao receptor de insulina em que o análogo estendido por dipeptídeo de tal análogo deixa de se ligar especificamente ao receptor de insulina. Nota-se que a extensão de dipeptídeo é desprovida de uma estrutura apropriada para permitir uma clivagem espontânea do dipeptídeo (ausência de um aminoácido N-alqguilado na segunda posição do dipeptídeo) e, portanto, não há restauração da ligação ao receptor de insulina.
[0398]Os peptídeos de análogo de insulina IGF A:B(Y8'6L8!7) que compreendem um aminoácido modificado (como 4-amino fenilalanina na posição A19) também podem ser sintetizados in vivo usando um sistema que permita a incorporação de aminoácidos não-codificados em proteínas, incluindo, por exemplo, o sistema ensinado nas Patentes U.S. Nos. 7.045.337 e 7.083.970.
Tabela 7 suma padrão | REL uid | (adEnd méoia [2ESYO | menu [2ESVO] mena BESSS,
FE = [=] |
[0399]Preparou-se um análogo de pró-fármaco adicional de um peptídeo análogo IGF8'6817 em que o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo (alanina-prolina) foi ligado através de uma ligação amida à terminação amino da cadeia A (IGF1(Y B16| B17) (AlaPro)A“1-o). Conforme mostrado na Tabela 8, IGF1(Y 8'8LBi7)(AlaPro)A-4o tem atividade reduzida para o receptor de insulina. Nota-se, com base nos dados da Tabela 3, que o elemento de pró-fármaco de dipeptídeo é desprovido de uma estrutura apropriada para permitir uma clivagem espontânea do elemento de pró- fármaco de dipeptídeo, e, portanto, a ligação ao receptor de insulina detectada não é o resultado da clivagem do elemento de pró-fármaco. Tabela 8 Insulina padrão IGF1(Y8!6LB!7)(AlaPro)A-1o se Cso(nno ss sm e | [se | EXEMPLO 11 Análogos de insulina IGF adicionais
[0400]Modificações adicionais da sequência peptídica IGF1 (Y8'SLB'7) revelam análogos de insulina IGF adicionais que variam em sua potência na insulina e no receptor IGF-1. Os dados de ligação são apresentados na Tabela 9 para cada um desses análogos (usando o ensaio do Exemplo 3), em que a posição da modificação é designada com base na posição correspondente no peptídeo de insulina nativa (DPI = des B26-30). Por exemplo, uma referência no presente documento à “posição B28” desprovida de quaisquer elaborações adicionais significaria a posição B27 correspondente da cadeia B de um análogo de insulina no qual o primeiro aminoácido de SEQ ID NO: 2 foi excluído. Portanto, uma referência genérica a “B(Y16)” se refere a uma substituição de um resíduo de tirosina na posição 15 da cadeia B da sequência IGF-1 nativa (SEQ ID NO: 3). Os dados referentes à ligação ao receptor relativa de insulina e análogos IGF são fornecidos na Tabela 9, e os dados referentes à fosforilação estimulada por análogo IGF (usando o ensaio do Exemplo 4) são fornecidos na Tabela 10. Tabela 9 Afinidade de ligação ao receptor de insulina e análogos IGF Receptor de insulina Receptor IGF-1 % de o, o Análogo nM Desvio pa, insulha de 1C5o Desvio nata 1 IGF; Razão I1Cso padrão, (em insulina padrão (em | nativo test ti Sto) an teste) (0,55 nM)
E O IGF-1A:B [10,41] 1,65 [4/9/2007] 5,8 | 58 Lo
E O IGF-1 A:B(ETOY16L17)| 0,66 | 0,36 [22/5/2007 58,7 90,9 7,85) 1,98/6/4/2007) 6,8 7,0 | 11,9 29/5/2007 98,8 117,5 12,19 2,179/18/2007 50 45 | | IGF-1 A:B(E1OYIGL17) TA: O RR O RR O O A E31E3 2B-COOH 20/3/2008 36,5 50,0 17,50 2,25] 4/4/2007 30 31 IGF-1 A:B(D1OY16L17) DPI A- 0,02 [9/11/2007 301,0 231,0 | 6,79) 1,50 4/4/2008 7,7 81 COOoH Lo | 02002 [4/12/2007 380,1] 3000 Lo |042[0,06|5/6/2008| 1741] tag
E I6F1 ABIEIOYVIGL17) 0,38 | 0,08 [10/8/2007 51,1 157,9 22,89 5,26/9/18/2007 3,3 24 | 602 IGF-1 A:B IGF-1 AB (HSD1OY16L17) |0,25|0,04 9/11/2007 316,0 S=0O )DP!
NM NS O O O O O O IGF-1 A (H8 A9 N21): B(H5D10Y16L17) DPI | 0,05 | 0,01 [14/12/2007 1576,7 4,03) 0,50 4/4/2008 12,9) 13,6 | 806 A-COOH 0,09 | 0,02 [14/12/2007 1667,0 IGF-1 A (H8 A9 N21) ABOHSO1OVISLIT A22)-| 9,12 | 0,02 a/12/2007/1171,4 22,83 3,53 [4/4/2006 23 24 1903 CCoH
E IGF-1 A (H8 A9 N21) :B(H5010Y16L17A22) (S=0) DP! 0,36 | 0,10 14/12/2007, 400,7 A-COOH IGF-1 A: IGF-1 B(1-8) -1 A: -1 B(1-8)-In 9:17) IGF-1 B(18-30 | 1.59] 0,62 22/5/2007 19,1 / 37,7 131,30/58,05/6/4/2007/ 0,3 OA ip TIE en] no esa summon os| 09 Tees
% de ., o % de atividade SE atrdets Análogo nM Desvio pa, insulina de) Desvio pa 4 Maes Razão I1Cso padrão ata (em insulina, “º padrão EP (em | nativo teste) nativa teste) (0,55 nM) (0,6 nM) ' | 2.67] 4,67 18/5/2007 11,8 225 | 2.48] 1,35 29/5/2007] 20,1 242 IGF1 A: In B(1-5): IGF -1 A: In B(1-5 4 1GF-2 nativo O 1333 1,85/9/25/2007 7,5) 45 | | Lo E E EA IGF-2 AB Lo E E EA
E O IGF-2ABMYL) | 6,81) 3,81/10/10/2007 84] BB o O INA:IGF1BMYD [82,62/31,75/4/9/2007 09 | O7 107,24 65,38 | 4/9/2007 | o7 ae LI LEI E IT ID 1 ARES [os] ou aummor raro Tiso n55 asomemers sue | | *Todos os terminais C são amidas (DP!) exceto onde especificado em contrário Tabela 10: Fosforilação total por análogos IGF-1 e IGF-2 Receptor de insulina Receptor IGF-1 Razão Análogo Desvio % de Desvio % de i seletiva ECso padrão Data insulina ECso padrão Data IGF w Insulina 1,26 | 0,098 [14/12/2007 114,88 46,66 [1/23/2008 90,89 1,48 | 0,72 | 1/4/2008 86,02 | 29,35 15/20/2008 1,12 | 0,11 [31/3/2008 po pp 1,58 | 0,18 [11/4/2008 Fo 2,70 | 071 [16/4/2008 EA 1,22 | 0,40 [20/5/2008 po pp IGF 1 54,39/21,102/14/12/2007] 2,3 | 0,87 | 0,16 [1/23/2008] 100 | 0,02 0,49 | 0,13 |5/20/2008 0,97 | 0,48 [7/23/2008 IGFTAB EoE IGF 1 A: B(E10Y16L17) |2,57 | 0,59 [31/3/2008 | 49,2 | 7,42 | 5,59 [7/23/2008] 13 - ICF-1 A:B(E10Y16L17)- E31E32 7,00 | 2,82 [31/3/2008 | 18,1 B-COOH 8,52 | 4,34 [16/4/2008 | 31,7 Pr
Receptor de insulina Receptor IGF-1 z Análogo Ecs lPesvio| Data %de | pe, Desvio) pa | % de ação “º Ipadrão insulina] =“ |padrão IGF IGF 1 AB(D10Y16L17) DPI A-COOH 0,08 | 0,006 [14/12/2007] 1575 | 0,78 | 0.17 [v23/2008|111,538 9,75 age 208 16200 DP [| [| | [| 1 IGF-1 AB (E10Y16L17)
DPI IGF-1 AB (H5D1OY16L17) DPI 12,22 | 546 [ves/2006 71 IGF-1 AB (H5D10Y16L17) (S=O)DP| IGF-1 A (H8 A9 N21) B(H51D10Y16L17) [015 0,054/14/12/2007) 840 | 0,43 | 0,44 1/23/2008/181,395] 2,81 DPI A-COOH 025 02 |16aea Tosa | DDD) IGF-1 A (H8 A9 N21) B(H5D1OY16L17A22) |0,35 | 0,064/14/12/2007] 360 |11,26| 2,55 |1/23/2008] 7,7 |32,54 DPI A-COOH oa | on 1a ema o DD) IGF-1 A (H8 A9 N21) B(H5D1OY16L17A22) |0,72 | 0,098 [14/12/2007 (S=0O) DPI A-COOH *Todos os terminais C são amidas, exceto onde especificado em contrário. EXEMPLO 12 Meia-vida de dipeptídeo em análogos de (p-NH2-F)º!ºamida estendidos por dipeptídeo IGF1
[0401]A clivagem de um dipeptídeo AibPro ligado à amida (pbNH2-Phe) de vários peptídeos IGF-1 foi medida para determinar o impacto da sequência peptídica ou heteroduplex sobre a clivagem de dipeptídeo. Os resultados para os peptídeos testados são mostrados na Tabela 11 e os dados revelam que a cadeia IGF1-A sozinha representa um bom modelo para o estudo de meia-vida de pró-fármaco para peptídeos IGF1 B:A (YB'6LB'7), Tabela 11 IGF1A(Acm)611:20(pNH2-Phe)A1º 1,8 IGF1 B:A(S-S)A7.87(Acm)AS.11,20,819(pNH2-PHe)A!º 1,8
[0402]A comparação de análogos de pró-fármaco da cadeia A IGF em relação à construção de cadeias A e B de ligação de dissulfeto (IGF1 A:B(Y8'8LB17)) revelou os que dois compostos apresentam meias-vidas similares para a forma de pró-fármaco. O análogo AibAla não cliva e, portanto, não é um pró-fármaco, mas serve para mostrar que a modificação pode inativar o análogo de insulina IGF1 A:B(YB'6LB!7)(p- NH>2-F)A!ºamida. De modo correspondente, a cadeia IGF1A sozinha foi determinada como sendo um modelo bom para o estudo da meia-vida de pró-fármaco em peptídeos de análogo IGF1 B:A (Y8'8LB!7). O análogo AibAla não cliva e, portanto, não é um pró-fármaco, mas serve para mostrar que a modificação pode inativar o análogo de insulina IGF1 A:B(Y8'8LB!7)(p-NH2-F)A!ºamida. Para simplicidade, as meias-vidas de pró-fármaco foram determinadas usando somente a cadeia A IGF1 na ausência da cadeia B. As meias-vidas de cada pró-peptídeo foram determinadas conforme descrito no Exemplo 5. Os dados são apresentados na Tabela 12 Tabela 12: Meia-vida de dipeptídeo em análogos de (p-NH2-F)º!ºamida estendidos por dipeptídeo IGF1 Dipeptídeo Meia-vida (h) AÍB Pro 2,2 AIiBOH Pro 165,0 AÍB dPro 1,9
AIBOH dK(acetil) 16,3
[ Kecetil [| Nmemaa |] 236 |
[0403]Os dados mostram que alterando-se os substituintes no elemento de pró- fármaco de dipeptídeo que a meia-vida do pró-fármaco pode variar de 2 horas >100 horas.
[0404]Prepararam-se peptídeos análogos de pró-fármaco adicionais usando um peptídeo de base IGF1-A(pNH2-F)'º* e alterando a composição de aminoácido do elemento de pró-fármaco de dipeptídeo ligado através de 4-amino fenilalanina na posição A19. As meias-vidas de dipeptídeo foram medidas para diferentes construções tanto em PBS como em 20% de plasma/PBS (isto é, na presença de enzimas séricas). Os resultados são fornecidos na Tabela 13. Os resultados indicam que três dos quatro peptídeos testados não foram impactados por enzimas séricas.
Tabela 13: Meia-vida de dipeptídeo em IGF1-A(pNH2-F)'!º Meia-vida (h) AÍB Pro 2,2 2,1 AIBOH Sar 2,3 dK N-isobutil Gly 4,4 4,1 do NG oe x Kíaceti) | ==—=—UgNmemala 0 236 | = | dk(acet) AIBOH Pro 165,0 Kí(acetil) Ácido azetidina-2-carboxílico | Não clivável EXEMPLO 13 Ligação ao receptor de peptídeos análogos IGFB!68!7 ao longo do tempo
[0405]As formulações de pró-fármaco de peptídeos análogos IGF8'98!7 foram preparadas e sua degradação com o passar do tempo foi medida usando o ensaio de ligação ao receptor de insulina do Exemplo 3. Os peptídeos usados no ensaio foram preparados da seguinte forma: Análogos de dipeptídeo-IGF1A
[0406]Caso não seja especificado, aplicou-se química Boc na síntese de análogos de peptídeo designados. Adicionou-se o dipeptídeco H2aN-AA1I-AA2-COOH selecionado a (pbNH2-Phe)'*º em IGF1A (Ala)é671120, O tripeptídeo C-terminal de cadeia A IGF-1 Boc(Fmoc-pNH-Phe)-Ala-Ala foi sintetizado em resina MBHA. Após a remoção de Fmoc pelo tratamento com 20% de piperidina/DMF em temperatura ambiente durante 30 minutos, Fmoc-AA2 foi acoplado à cadeia lateral de p-amino benzil em A19 utilizando-se um excesso triplicado de aminoácido, PyBop, DIEA e quantidade catalítica de piridina. A síntese de Boc da sequência (Ala)é7:1120º de cadeia A IGF-1 restante foi completa usando um Sintetizador de Peptídeo Applied Biosystems 430A, produzindo (Boc)º(Ala)$7:11-20(Fmoc-AA2-pNH-Phe)'!*-MBHA de cadeia A IGF-1. Após o grupo Fmoc ser removido da terminação N de AA2Z, Boc-AA1 foi, então, acoplado à amina usando um excesso triplicado de aminoácido, DEPBT e DIEA. A remoção dos dois grupos Boc restantes na cadeia A por TFA foi seguida por clivagem HF, produzindo (Ala)$711-20(HAN-AA1-AA2-pNH-Phe)'ºamida de cadeia À IGF-1. No caso de AA1 ser d-lisina, a acetilação na e-amina foi realizada antes da remoção Boc. Os análogos de cadeia A de dipeptídeo-IGF-1 A foram purificados por RP-HPLC semi-preparativa e caracterizados por espectrometria de massa RP-HPLC e MALD! analítica.
Análogos de dipeptídeo-IGF-1 (YL
[0407]Adicionou-se um dipeptídeo H2aN-AA1-AA2-COOH selecionado a (pNH>2- Phe)'* na cadeia A IGF-1 (Acm)$ 112º conforme descrito logo acima, exceto pelo fato de que uma resina PAM foi usada para a síntese de cadeia A IGF-1 para produzir um ácido C terminal mediante clivagem HF. A cadeia B IGF-1 (Y8'8LB!7)(Acm)'º foi sintetizada em resina MBHA para produzir uma amida C terminal. O tiol livre em Cys8” foi modificado por Npys através da reação com DTNP em uma razão molar 1:1 em DMSO a 100%. Os análogos de cadeia A IGF-1 e cadeia B IGF-1 de dipeptídeo purificado (Y8'8L8!7) foram montados usando a estratégia de combinação de cadeia de duas etapas “1+2" ilustrada no Esquema 1. Realizaram-se purificações intermediárias e finais em RP-HPLC semi-preparativa e caracterizadas por espectrometria de massa RP-HPLC e MALD! analíticas.
[0408]Os pró-fármacos de peptídeo análogo IGF8!68!7 foram incubados em PBS, pH 7,4 a 37ºC e em intervalos de tempo predeterminados coletava-se uma alíquota e uma degradação adicional foi arrefecida com TFA a 0,1% e a alíquota foi submetida à análise HPLC analítica. Picos a e b, que representam o pró-fármaco e as formas ativas do peptídeo análogo IGF8'68'7 foram identificados com LO-MS e quantificados por integração da área de pico de uma HPLC. As Figuras 9A-9C mostram a saída de uma análise HPLC da degradação do pró-fármaco de peptídeo análogo IGFB'6817: IGF1A(Ala)$711-20(Aib-Pro-pNH-F)'*. Coletaram-se alíquotas em minutos (Figura 9A), 81 minutos (Figura 9B) e 120 minutos (Figura 9C) após o início da incubação do pró-fármaco em PBS. Os dados indicam a conversão não- enzimática — espontânea — de — IGF1A(Ala)ê67:1120(Aib-Pro-pNH-F)'ºamida — em IGF1A(Ala)67:11.20(ÕNH2-F)'amida com o passar do tempo.
[0409]A degradação da forma de pró-fármacos de peptídeos análogos IGF8!68!7 a sua forma ativa também foi medida com base na capacidade dos compostos de se ligarem ao receptor de insulina conforme medido usando o ensaio in vitro do Exemplo 3. As Figuras 10A e 10B são gráficos que mostram a atividade in vitro do pró-fármaco Aib,dPro-IGF1IYL (dipeptídeo ligado através de 4-aminoPhe A19). À Figura 10A é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa (medida em 1 hora a 4ºC) e o derivado de pró-fármaco A19 IGF
(Aib,dPro-IGF1YL) com o passar do tempo (0 hora, 2,5 horas e 10,6 horas) incubado em PBS. A Figura 10B é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (Aib,dPro-IGF1YL) com o passar do tempo (0 hora, 1,5 horas e 24,8 horas) incubado em 20% de plasma/PBS a 37ºC. Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, a atividade aumentada é recuperada a partir da amostra de derivado de pró-fármaco A19 IGF à medida que a forma de pró-fármaco é convertida em peptídeo IGF1YL ativo. A atividade dos peptídeos análogos IGF8'6B!7 foi medida em relação à ligação ao receptor de insulina, e visto que os peptídeos análogos IGFB!68!7 subjacentes têm uma atividade maior que a insulina nativa, uma atividade superior a 100% em relação à insulina é possível.
[0410]As Figuras 11A e 11B são gráficos que mostram a atividade in vitro do pró- fármaco dK,(N-isobutilG)-IGF1YL (dipeptídeo ligado através do 4-aminoPhe A19). A Figura 11A é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa (medida em 1 hora at 4ºC) e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (IGF1YL: dK (N-isobutilG) com o passar do tempo (0 horas, 5 horas e 52 horas) incubado em PBS. A Figura 11B é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (IGF1IYL: dK,(N-isobutilG) com o passar do tempo (O horas, 3,6 horas e 24,8 horas) incubado em 20% de plasma/PBS a 37ºC. Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, a atividade aumentada é recuperada a partir da amostra de derivado de pró- fármaco A19 IGF à medida que a forma de pró-fármaco é convertida em peptídeo IGF1YL ativo.
[0411]As Figuras 12A e 12B são gráficos que mostram a atividade in vitro do pró- fármaco dK(e-acetil), Sar)-IGF1YL (dipeptídeo ligado através de 4-aminoPhe A19). A Figura 12A é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa (medida em 1 hora a 4ºC) e o derivado de pró-fármaco A19 IGF
(IGF1YL: dK(e-acetil) Sar) com o passar do tempo (0 horas, 7,2 horas e 91,6 horas) incubado em PBS. A Figura 12B é um gráfico que compara a ligação ao receptor de insulina relativa de insulina nativa e o derivado de pró-fármaco A19 IGF (IGF1IYL: dK(e-acetil), Sar) com o passar do tempo (O horas, 9 horas e 95 horas) incubado em 20% de plasma/PBS a 37ºC. Conforme indicado pelos dados apresentados no gráfico, a atividade aumentada é recuperada a partir da amostra de derivado de pró- fármaco A19 IGF à medida que a forma de pró-fármaco é convertida em peptídeo IGF1YL ativo.
EXEMPLO 14 Biossíntese e purificação de análogos de insulina de cadeia única
[0412]Um minigene de insulina-IGF-I| que compreende cadeias A e B de insulina nativa ligadas através da cadeia C IGF-I (BO-C1-AO) foi clonado em vetor de expressão pGAPZa A (adquirido junto a Invitrogen) sob promotor GAP (promotor da gliceraldeído-3-fosfato deidrogenase (GAPDH)) para expressão constitutiva e purificação de proteína recombinante em levedura Pichia pastoris. O minigene foi fundido a um peptídeo N-terminal que codifica o sinal líder de fator de o- acasalamento de Saccharomyces cerevisiae para secreção da proteína recombinante no meio. Um sítio de clivagem Kex2 entre o minigene e a sequência líder de fator de a-acasalamento foi usado para clivar a sequência líder para secreção do minigene com terminações amino nativas. Introduziram-se mutações de alanina de sítio único no C peptídeo nas posições 1 (G1A), 2 (Y2A), 3 (G3A), 4 (S4A), 5 (S5A), 6 (S6A), 7 (R7A), 8 (R8A), 10 (P10A), 11 (Q11A), e 12 (T12A) do minigene BOC1AO0.
[0413]Os minigenes incluindo BOC1AO, onze mutantes de alanina, e outros derivados selecionados foram transformados em levedura Pichia pastoris por eletroporação. Os transformantes positivos foram selecionados em placas mínimas de metanol e uma preparação genômica de cada isolado de Pichia foi realizada e a integração das construções no genoma de levedura foi confirmada por PCR. Um produto PCP de par de base 833 foi visualizado em um gel de DNA de agarose. Os análogos de insulina foram produzidos por fermentação de uma linhagem de levedura correspondente. As células de levedura foram pelotizadas por centrifugação a 5 K durante 20 minutos em tubos de centrífuga Beckman de 500 ml e o meio foi mantido para purificação de proteína subsequente.
[0414]Os sobrenadantes em meio de crescimento foram filtrados através de um filtro Millipore de 0,2 um. Adicionou-se acetonitrila (ACN) ao sobrenadante a um volume final de 20%. O sobrenadante foi purificado por uma resina de Amberlite XAD7HP disponível junto a Sigma, pré-equilibrada com ACN aquoso a 20%. À resina foi, então, enxaguada duas vezes com 30 ml de ACN aquoso a 20% e os contaminantes foram removidos com ACN aquoso a 30% contendo TFA a 0,1%. Os análogos de insulina parcialmente purificados foram eluídos a partir da coluna com ACN aquoso a 54% contendo TFA a 0,1% e liofiizados. As amostras liofilizadas foram ressuspensas em 0,025M de NHa3HCO; pH 8 e purificadas em uma coluna Luna C18 (tamanho de partícula 10 um, tamanho de poro 300A). A proteína foi eluída a partir da coluna usando um gradiente linear de ACN aquoso a 20 a 60%. As frações positivas MALDI-MS foram agrupadas e transferidas a um frasco de cintilação descartável para liofilização subsequente. As amostras liofilizadas foram, então, ressuspensas em ACN aquoso a 20% contendo TFA a 0,1%, e purificadas em uma coluna Luna C18 (10 um tamanho de partícula, tamanho de poro 300A). À proteína foi eluída a partir da coluna usando um gradiente linear de ACN aquoso a 18 a 54% com TFA a 0,1%. A eluição da proteína foi monitorada em uma absorbância de 280 nm. Frações positivas MALDI-TOF MS foram analisadas através de uma coluna analítica C8 para assegurar a pureza.
[0415]A Figura 15 ilustra a potência dos análogos de insulina de cadeia única. O análogo BO-C1-AO demonstrou uma potência igualmente eficaz em ambas as isoformas de receptor de insulina e receptor IGF-1. A mutação da tirosina na posição 2 em alanina ou o encurtamento do peptídeo C para oito aminoácidos através da exclusão de C9-12 forneceu um aprimoramento seletivo na especificidade da ação de insulina pela redução significativa na atividade de receptor IGF-1. Vide, também, os dados fornecidos nas Tabelas 14A e 14B: Tabela 14A Análise de Ligação e fosforilação de Insulina (BºC'Aº) , Ligação IR-A Fosforilação IR-A Peptídeo Insulina 0,54+0,02 4 1,67+0,13 IGF-1 | 18,81+1,77 | 3 29,20+8,41 | 1 010 (BºC'Aº) 2,83+0,52 2 1,93+0,43 1 G1A 1,21+0,15 1 2,4+0,24 1 Y2A | 1,95+0,28 | 38 1,85+0,42 | 1 G3A 1,41 +0,05 2 2,13+0,02 1 S4A 0,84+0,47 2 0,76+0,35 1 S6A 1,15+0,24 1 2,33+1,65 2 R7A 6 04+0,82 1 5,21+4,14 1 R8A 0,63+0,09 1 2,03+0,06 2 P10A 2,86+ 0,93 1 2,59+1,2 1 Q11A 1,79+0,47 1 2,58+0,83 1 Tabela 14B Análise de Ligação e fosforilação de IGF-1 (BºC'Aº) , Ligação IGF-IR Fosforilação IGF-IR Peptídeo Insulina 60,63:+4,43 1 48,66:+1,59 IGF-1 0,38+0,07 0,88:0,41
010 (BºC'Aº) 4,49+1,04 1 1,29+2,28 1 Y2A 257,9+29,59 1 35,6+14,55 1 G3A 34,02+16,09 1 7,85+0,78, 1 S4A 15,30+3,10 1 1,64+1,65 1 S5A 13,06+3,01 1 2,63+1,88 1 R7A 43,36+8,72 1 1,26+1,55 1 ava 1 [ma | ssso8s [1 | ess | |
[0416]A Figura 16 demonstra que as posições 2 e 3 no peptídeo C são mais sensíveis à modificação no receptor IGF-1 com o receptor de insulina provando-se ser relativamente imune à modificação. Finalmente, as Figuras 17 e 18 apresentam a análise in vitro dos mutantes de insulina de cadeia única como uma razão entre a afinidade de ligação (IC50) e a sinalização bioquímica através de fosforilação de tirosina (EC50). As duas medições independentes demonstram uma consistência considerável, validando, assim, esta abordagem in vitro à análise de função estrutural. Todos os análogos mantiveram uma atividade nanomolar unitária com determinados análogos específicos provando-se ser ligeiramente acentuados em potência (nanomolar unitário baixo). Os análogos mais seletivos à insulina foram aqueles que estavam ausentes nos quatro últimos resíduos do peptídeo C, aqueles que apresentaram uma mutação de alanina na posição dois do peptídeo C, ou uma combinação das duas alterações. EXEMPLO 15 Procedimento de biossíntese para células procarióticas
1. Expressão e purificação de DP20 com expressão nativa em E. coli
[0417]O DP20 gene foi códon-otimizado, sintetizado e clonado em um vetor LIC- SUMO. LIC-SUMO é modificado a partir de pET22b (Novagen), tem uma sequência sumo como um tag de fusão N-terminal com um sítio de clivagem de TEV protease entre o SUMO e a sequência de proteína alvo.
[0418]DP20 foi expresso em OrigamiB(DE3) (Novagen). As células foram culturadas em meio de Luria Broth com 5Oug/ml de ampicilina, 25ug/ml de canamicina e Sug/ml de tetraciclina. Quando ODgoonm alcançou 0,8 a 1,0 a 37ºC a cultura foi transferida para 16ºC. Adicionou-se IPTG à cultura a uma concentração de 0,2 mM. Deu-se continuidade à cultura durante a noite e as células coletadas com centrifugação a 5000 rpm durante 15 minutos.
[0419]A pelota de célula foi ressuspensa em tampão de lise que consiste em 50 mM de fosfato de sódio, 3800 mM de NaCl, 10 mM de imidazola. As células foram lisadas por sonicação (1 segundo ligada, 2 segundos desligada, 180 ciclos). O lisato foi centrifugado a 15000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante foi aplicado a uma coluna de NI-NTA (Qiagen) pré-equilibrada com tampão de lise. A coluna foi lavada com um tampão de 50 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, 40 mM de imidazola. DP20 foi eluído com tampão de eluição de 50 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, 500 mM de imidazola.
[0420]O DP20 eluído a partir da coluna Ni foi digerido com TEV protease a 4ºC de um dia para o outro. A amostra foi purificada por cromatografia em uma coluna C8 HPLC à base de sílica (Phenomenex) após o pH ter sido ajustado para 2a 3. À amostra foi aplicada à coluna e eluída com um gradiente de 15% a 25% de acetonitrila em TFA(aq) a 0,15%. A identidade da proteína desejada foi confirmada por HPLC analítica e análise espectral de massa. As frações contendo DP20 foram agrupadas e liofilizadas.
2. Expressão e purificação de DP31 sob condições desnaturadas em E.coli.
[0421]O gene para DP31 foi códon-otimizado, sintetizado e clonado ao vetor LIC-
SUMO. LIC-SUMO é modificado a partir de pET22b (Novagen), tem uma sequência sumo como o tag de fusão N-terminal com um sítio de clivagem de TEV protease entre o SUMO e a sequência de proteína alvo.
[0422]DP31 foi expresso em OrigamiB(DE3) (Novagen). As células foram culturadas em meio de Luria Broth com 50 ug/ml de ampicilina, 25 ug/ml de canamicina e 5 ug/ml de tetraciclina. Quando o ODsoonm alcançou 0,8 a 1,0 a 37ºC, a cultura foi transferida para 16ºC. Adicionou-se IPTG à cultura a uma concentração de 0,2 mM. Deu-se continuidade à cultura durante a noite e as células coletadas com centrifugação a 5000 rpm durante 15 minutos
[0423]O esquema geral para sintetização de análogos de cadeia única sob condições de desnaturação é mostrado na Figura 17. A pelota de célula foi ressuspensa em um tampão de lise que consiste em 50 mM de fosfato de sódio, 300 MM de NaCl, 10 mM de imidazola, 8 M de ureia. A lise foi realizada por sonicação (1 segundo ligada, 2 segundos desligada, 180 ciclos). O lisato foi centrifugado a 15000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante foi carregado a uma coluna de NI-NTA (Qiagen) pré-equilibrada com tampão de lise. A coluna foi lavada com um tampão de 50 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, 40 mM de imidazola. DP31 foi eluído com tampão de eluição de 50 mM de fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, 500 mM de imidazola.
[0424]DP31 purificado por cromatografia em coluna de Ni foi digerido com TEV protease a 4ºC de um dia para o outro. Alternativamente, o peptídeo líder pode ser clivado usando um sítio de clivagem de triptofano (W), ou clivagem Lys C em um resíduo de lisina inserido quando nenhuma lisina estiver presente no análogo de insulina de cadeia única. O pH da solução foi ajustado para 10.5; adicionaram-se glicina e cisteína a uma concentração de 20 mM e 4 mM, respectivamente. À proteína foi oxidada por dissulfeto e dobrada durante um período de 24 a 48 horas. A amostra foi purificada por cromatogradia em uma coluna C8 HPLC de sílica
(Phenomenex) após o pH ter sido ajustado para 2-3. DP-31 foi eluído com 15%-25% de acetonitrila em TFA(aq) a 0,15%. A identidade da proteína foi confirmada por HPLC analítica e análise espectral de massa. As frações contendo DP31 foram agrupadas e liofilizadas. EXEMPLO 16 Expressão e purificação de DP31 em Pichia pastoris.
[0425]O gene códon-otimizado de DP31 será sintetizado e clonado em pPICZa (Invitrogen). A construção incluirá um peptídeo espaçador de EEAEAEAEPK colocado entre um sítio de clivagem Kex2 e o gene DP31. O plasmídeo pPICZa- DP31 será aberto (linearizado) com Sacl e eletroporado em cepa de P. Pastoris X-33 (Invitrogen). Os clones de levedura transformados serão selecionados em placas de Zeocina que continham uma concentração crescente de Zeocina. Os clones mais viáveis (maior concentração de Zeocin) serão selecionados e usados para expressar a proteína DP31.
[0426]As células P. Pastoris selecionadas serão inoculadas em 100 ml de meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de dextrose) e agitadas a 30ºC e 220 rpm durante 24 horas. Então, o inoculado será colocado em 2L de meio BMGY (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 100 mM de fosfato de potássio PH 6,0, 1,84% YNB, 4X10* biotina, 1% de glicerol) e agitados a 30ºC e 220 rpm até que ODeoonm alcance entre 5 e 6. Em seguida, as células serão coletadas por centrifugação a 5000 rom durante 5 minutos a 4ºC, ressuspensas em 11 de meio BMMY (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 100mM de fosfato de potássio PH 6,0, 1,34% YNB, 4X10* biotina, 0,5% de metanol ) para induzir a produção de DP31. Metanol será suplementado a cada 24 horas a uma concentração final de 1,0% (V/V) ao longo da fase de indução (4 a 6 dias)
[0427]O meio de cultura será clarificado por centrifugação a 5000 rom durante 15 minutos, carregado em uma coluna XAD7HP (Rohm and Haas). A coluna será lavada com ácido acético a 5% contendo etanol a 15%, seguido por ácido acético a 5% repetidamente para remover as impurezas. O DP31 será eluído a partir da coluna com etanol a 45% e com ácido acético a 5%. A proteína eluída será, então, concentrada por evaporação e adicionalmente purificada por HPLC preparativa usando as mesmas condições fornecidas no Exemplo 15.
EXEMPLO 17 Expressão e purificação de DP31 em células CHO eucarióticas
[0428]Para expressar DP31 em células CHO, um gene sintético (vide o diagrama abaixo) será sintetizado e ligado a pcDNAS.1 contendo sítios Nhel e Not.
[0429]Hormônio de crescimento humano (hGH) fundido ao N-terminal de DP31 pode ser facilmente detectado por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Este também acentua a expressão e direciona a secreção. Oito resíduos de histidina e um sítio de clivagem de TEV protease serão colocados entre hGH e DP31 para facilitar a purificação e a remoção proteolítica do parceiro de fusão.
[0430]As células CHO serão transfectadas com o plasmídeo pcDND3.1-hGH-DP31 usando um reagente de transfecção Fugene6 (Roche). As linhagens celulares estáveis serão triadas em um meio contendo 200 ug/ml de Zeocina. As linhagens celulares estáveis serão amplificadas e adaptadas ao meio isento de soro (EX-cell 301 JRH Biosciences) e expandidas para crescimento em garrafas cilíndricas de 850-cm?. Cem mililitros do meio serão mantidos em cada garrafa cilíndrica permitindo a produção de 1 litro de meio condicionado a cada três dias a partir de dez garrafas cilíndricas.
[0431]O meio isento de soro condicionado será centrifugado e filtrado para remover os detritos celulares. Em seguida, adicionam-se Tris e NaCl ao meio em uma concentração de 20 MM e 300 mM, respectivamente. Então, ajusta-se o pH para 8,0 e o meio aplicado a uma coluna de Ni-NTA. A coluna será lavada com cinco volumes de leito de 20 mM de Tris, 20 mM de imidazola, 300 mM de NaCl em pH 8. A proteína de fusão DP31 estendida será eluída com 20 mM de Tris, 500 mM de imidazola, 500 mM de NaCl em pH 8. A proteína de fusão será digerida com TEV protease e adicionalmente purificada por HPLC preparativa usando as mesmas condições reveladas no Exemplo 15. EXEMPLO 18 Ligação ao receptor de análogos de insulina de cadeia única contendo CTP
[0432]A afinidade de cada peptídeo à insulina ou receptor IGF-1 foi medida em um ensaio de ligação de competição conforme descrito no Exemplo 3 e a atividade de fosforilação de receptor de subtipos A e B de insulina dos análogos de insulina foi medida usando células HEK293 transfectadas por receptor conforme descrito no Exemplo 4. Cada um dos compostos também foi testado para determinação de sua capacidade em induzir a proliferação de células HMEC. Os resultados são fornecidos na Tabela 15. Os compostos testados incluem: DP19: CTP-EsK-cadeia B-peptídeo C-cadeia A (SEQ ID NO: 67); DP20: GEsK-cadeia B-CTP(K)-cadeia A (SEQ ID NO: 68); e DP22: CTP-EsR-cadeia B-CTP(K)-cadeia A (SEQ ID NO: 91). Tabela 15: Perfil in vitro de DP19, 20 & 22 Análogo Desvio Desvio Desvio Desvio Desvio Desvio Desvio Insulina DP19 jo5s24 0,263 1,214 /1,253 /216,270 *DIV/01|0,985| 0,163 | 4,340 | 3,055 [26,723 [17,215 HDIV/0! | FDIV/O!| DP20 DP1SLysC 0,434 0,136 1,832 0,096 162,257 $DIV/01|o,300/FDIV/01| 1,200 $DIV/0! 20,720 | HDIV/0! HDIV/0! | FDIV/0!| DP20LysC|0,231 0,184 0,433 (0,497 50,027 22,137 DP22 DP22LysC ** - inter-experimental
[0433]A Figura 18A é um gráfico que mostra a capacidade de DP20 e DP22 em relação à insulina nativa e IGF-1 para induzir a fosforilação no receptor de subtipo À de insulina. Os valores de EC50 (em nM) obtidos para cada composto neste experimento foram:
Insuina — DP-20 — DP-201ys | DP22 | DES es
[0434]A Figura 18B é um gráfico que mostra a capacidade de DP19 e DP20 em relação à insulina nativa e IGF-1 para induzir a fosforilação no receptor de subtipo B de insulina. Os valores de EC50 (em nM) obtidos para cada composto neste experimento foram:
[0435]A Figura 18C é um gráfico que mostra a capacidade de DP20 e DP22 em relação à insulina nativa e IGF-1 para induzir a fosforilação no receptor IGF-1. Os valores de EC50 (em nM) obtidos para cada composto neste experimento foram:
[0436]As Figuras 19A-19C mostram os resultados dos testes de tolerância à insulina comparativos conduzidos em camundongos comparando a capacidade da insulina humana em relação a dois análogos de insulina de cadeia única contendo CTP. Conforme mostrado pelos dados, tanto D19 (tendo um CTP ligado à terminação N da cadeia B) como D20 (tendo um CTP como a porção de ligação) são agonistas de receptor de insulina potentes.
[0437]O peptídeo CTP tem um alto teor de resíduos de serina e prolina. Para determinar se os resíduos de serina funcionam para fornecer ao CTP suas atividades surpreendentes, as serinas do peptídeo de ligação CTP foram substituídas por alaninas e a capacidade dos análogos de induzirem a fosforilação pelos receptores de subtipos A e B de insulina foi medida. Além disso, os análogos de insulina de cadeia única foram preparados tendo o peptídeo CTP servindo como a porção de ligação entre as cadeias B e A em que o aminoácido que compreende o peptídeo CTP permanece igual, mas a sequência do peptídeo CTP foi aleatorizada
(DP20RCTP). Preparou-se um análogo adicional com base na estrutura DP20, em que o peptídeo de ligação compreende o peptídeo C de pró-insulina nativa. As Figuras 20A e B são gráficos que mostram as atividades dos análogos de insulina para induzir a fosforilação pelos receptores de subtipos B e A de insulina, respectivamente. O IC5o de cada análogo é fornecido nas Tabelas 16A e 17B.
Tabela 16A: Fosforilação em subtipo A de receptor de insulina Insuíina | DP-20 | DP-206,0º DP20,s2a| DSL, | Gel Tabela 16B: Fosforilação em subtipo B de receptor de insulina
[0438]Os dados revelam que os análogos de insulina de cadeia única que compreendem um peptídeo CTP como a porção de ligação, mesmo quando as serinas tiverem sido substituídas por alaninas ou quando a sequência tiver sido aleatorizada, ainda manterão potência em ambos os receptores de insulina em relação à pró-insulina nativa ou peptídeos IGF em ambos os subtipos de receptor de insulina em relação à pró-insulina nativa ou peptídeos IGF.
[0439]Para investigar adicionalmente a funcionalidade os peptídeos CTP como uma porção de ligação de cadeia única de insulina, prepararam-se análogos de cadeia única adicionais. Uma análogo de cadeia única compreendia um peptídeo CTP como o peptídeo de ligação em que as prolinas foram substituídas por alanina (DP20 P a A (SEQ ID NO: 70)) e sua atividade foi comparada com DP20 modificado para ter o peptídeo C de pró-insulina nativa, o peptídeo C IGF 1 nativo ou o peptídeo CTP clivado na terminação carbóxi do peptídeo CTP. A atividade desses compostos no receptor subtipo A de insulina é mostrada na Figura 21. Um análogo de cadeia única que compreende uma porção de ligação de peptídeo CTP em que as prolinas do peptídeo CTP foram substituídas por alanina ainda apresenta atividade notável no receptor de insulina, equivalente àquela de IGF-1 nativo. Adicionalmente, quando um análogo de insulina de cadeia única que compreende o peptídeo CTP como a porção de ligação for clivado na junção entre o CTP ea cadeia A de insulina, o análogo de cadeia dupla resultante é pelo menos tão potente quanto a insulina de cadeia dupla nativa.
[0440]Para investigar se o peptídeo C de pró-insulina nativa interfere na capacidade da insulina em ativar o receptor de insulina, análogos de insulina de cadeia única foram construídos compreendendo uma porção de ligação que inclui tanto um peptídeo CTP como o peptídeo C de pró-insulina nativa. O peptídeo C nativo foi inserido entre a cadeia B e o peptídeo CTP (DP20 CºCTP (SEQ ID NO: 74)), ou entre o peptídeo CTP e a cadeia A (DP20 CTPCº (SEQ ID NO: 73)). Preparou-se um análogo adicional que compreende dois peptídeos CTP ligados cabeça à cauda como a porção de ligação (DP20 2CTP (SEQ ID NO: 75)). As Figuras 22A e 22B são gráficos que demonstram a atividade de fosforilação in vitro desses análogos de insulina de cadeia única. Conforme mostrado pelos dados, todos os análogos de insulina aparentam ter uma atividade no receptor de insulina embora DP20 CTPCº aparente ser mais potente que DP20 CºCTP. Adicionalmente, um análogo de cadeia única que compreende dois peptídeos CTP como o peptídeo de ligação também aparenta ser ativo como um agonista de insulina.
[0441]Para investigar se remover um segmento do peptídeo C de pró-insulina nativa permitiria que a sequência fosse usada como uma porção de ligação em análogos de cadeia única, realizou-se uma série de 6 exclusões de aminoácidos na sequência de peptídeo C de pró-insulina nativa. Seis aminoácidos foram removidos para ajustar o peptídeo C de pró-insulina nativa ao mesmo tamanho do peptídeo CTP. De modo correspondente, um análogo de cadeia única foi preparado usando o peptídeo C de pró-insulina nativa como a porção de ligação em que os primeiros 6 aminoácidos foram removidos, DP20 CO (desC1-6) (SEQ ID NO: 76), aminoácidos
15-21 foram removidos, DP20 CO (desC15-21) (SEQ ID NO: 77), ou aminoácidos 27- 33 foram removidos, DP20 CO (desC27-33) (SEQ ID NO: 78). A Figura 23 é um gráfico que demonstra a atividade de fosforilação in vitro no receptor de subtipo A de insulina de análogos de insulina de cadeia única em relação a uma insulina nativa de cadeia dupla e um análogo de insulina tendo CTP como o peptídeo de ligação. Cada um dos análogos de insulina de cadeia única que compreendem um peptídeo C de pró-insulina nativa truncado demonstrou uma atividade fraca no receptor de subtipo A de insulina, enquanto DP20 era quase equivalente ao hormônio nativo.
EXEMPLO 19 Análogos de CTB à base de insulina de cadeia única
[0442]Para investigar a atividade de sequências de insulina nativa em um análogo de insulina de cadeia única que compreende um peptídeo CTP como a porção de ligação, construiu-se o peptídeo DP25M: GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVC
GERGFFYTDRTSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCN (SEQ ID NO: 81). Esse composto foi testado para atividade no subtipo A de insulina (IRA-DP25M) e no subtipo B de insulina (IRB-D25M), vide a Figura 24, e constatou-se que este é ativo, mas cerca de 3 a 4 vezes menos ativo que o análogo DP20 correspondente. De modo correspondente, preparou-se uma série de derivados de insulina de DP25 M em que os aminoácidos carbóxi terminais 5 foram removidos da cadeia B: DP30: GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF-----
SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ IDNO: 83); DP31: GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF-----
SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ IDNO: 84); e DP32: GEEEEEKGPEHLCGSHLVEALYLVCGERGFF-----
SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ IDNO: 85).
[0443]A atividade desses compostos foi testada nos receptores de subtipo A e B de insulina, bem como os receptores IGF-1 e é comparada à atividade de análogos de cadeia única usando o peptídeo C IGF-1 como a porção de ligação: DR3:
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGYGSSSRRAPQTGIVEQC CTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 86) DR4
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGAGSSSRRAPQTGIVEQC CTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 87)
[0444]Os resultados são fornecidos nas Tabelas 17A e 17B. Conforme os dados mostram, DP30 e DP31 são agonistas de insulina bastante potentes que se aproximam da potência de insulina nativa, tendo, ainda, uma seletividade maior para ambos receptores de insulina pelo receptor IGF-1 em relação a DR3 e DR4 (Tabela 17A). Adicionalmente, a comparação de DP30 e DP31 a DP25 revela que DP25 não é tão potente quanto DP30 e DP31, indicando que os últimos 5 aminoácidos da cadeia B de insulina não são desejáveis em agonistas de insulina de cadeia única (vide a Tabela 17B). Quando o análogo DP31 único tiver sido clivado entre o peptídeo CTP e a cadeia A (DP31 LysC), a potência do análogo de cadeia dupla resultante é ligeiramente aumentada no receptor de insulina, mas sua atividade no receptor IGF-1 é substancialmente aumentada. De acordo com esses resultados, constatou-se que DR3 e DR4 têm mais atividade em estimular o crescimento celular de células HMEC do que DP30 e DP 31. Constatou-se que DP30 e DP 31 têm uma atividade similar à insulina nativa em estimular o crescimento celular de células HMEC.
Tabela 17A Fosforilação in vitro de bioatividade DR 3, 4, 30 e 31 de análogos de insulina (ECsonM) Insulina! DP ECso médio em IRA | 0,81 0,45) 6 [0,55 0,19 4 0,79 0,23 3 1,41 0,89 3 0,83/041 4| ECso médio Em IRB — 0,56 0,28 7 0,56 0,28) 5 0,68 0,31 3 1,12 0,52 3 0,91/0,20 4 | fonmánsa nat] ssa [oz [2 [aze Jose] a ensposd o Foral - |- [res] 07 2, Tabela 17B Fosforilação in vitro de bioatividade DR25, 30 e 31 de análogos de insulina (ECsonM Insulina/ DP | N /DR3] DP | N] DR4 | DP/NDP30/DP|N ECso médio em IRA — 0,81 0,45 6 4,11 1,3/ 2] 1,41 [089] 3 [0,83 0,41] 4 ermeggenio [154 la [e| = [=] fora] -[- Lu] ar [soa] - | EXEMPLO 20 Análogos de insulina acilados
[0445]Conduziram-se testes comparativos de tolerância à insuliha em camundongos comparando a capacidade de insulina humana em relação a três análogos de insulina acilados diferentes para reduzir e sustentar uma baixa concentração de glicose sanguínea. Os compostos foram testados em duas concentrações diferentes (27 nmol/kg e 90 nmol/kg). As insulinas aciladas incluíam MIU-41 (um análogo de insulina de cadeia dupla tendo uma acilação C16 através de um ligante de ácido gama glutâmico ligado a um resíduo de lisina localizado na posição A14), MIU-36 (um análogo de insulina de cadeia dupla tendo uma acilação C16 ligada à terminação N da cadeia B) e MIU-37 (um análogo de insulina de cadeia tendo uma acilação C16 através de um ligante de ácido gama glutâmico ligado a um resíduo de lisina localizado na posição B22). Todos os três análogos de insulina acilados forneceram níveis de glicose reduzidos mais basais e sustentados em relação à insulina nativa, mesmo após 8 horas (Vide as Figura 25A-25D).
[0446]As Figuras 26A-26D mostram os resultados dos testes comparativos de tolerância à insulina conduzidos em camundongos comparando a capacidade do análogo de insulina acilado comercialmente disponível (Detimer) ao agonista de insulina de cadeia dupla acilado MIU-55. MIU-55 [B1(H5,10,Y16,L17,C16rE-K22)25a : ANT(NI8,N21)] tem os 5 aminoácidos C-terminais da cadeia B excluídos e é acilado com um ácido graxo C14 (ácido miristoílico) através de um ligante gama Glu no grupo e-amino de Lys B29. Os resultados indicam que MIU-55 é cerca de um terço tão potente quanto Detimer (vide as Figuras 26A e 26B). Os dados indicam que as formas aciladas de insulina têm uma ação mais longa que as formas não-aciladas e que MIU-55 embora menos potente que Detimir, exibe um perfil similar a Detimir. As Figuras 26C e 26D fornecem dados sobre os valores de AUC de glicose sanguínea após a administração desses análogos listados. Uma comparação de Detimir e MIU- 49 em testes de tolerância à insulina revelaram resultados similares (vide as Figuras 27A-27D. MIU-49 [B1(C16-rE0,H5,Aib9,H10,E13-K17,Y16)25a : A1(N18,N21)] é um agonista de insulina de cadeia dupla tendo os 5 aminoácidos C-terminais da cadeia B excluídos e acilados com um ácido graxo C16 através de um ligante gama Glu no grupo a-amino de Gly B2. Novamente, os dados mostram que MIU-49 é cerca de um terço tão potente quanto Detimer (vide as Figuras 27A e 32B) e que MIU-49 embora seja menos potente que Detimir, exibe um perfil similar a Detimir.
EXEMPLO 21 Análogos de insulina peguilados
[0447]Vários análogos de insulina peguilados foram preparados e testados in vitro. A Tabela 18 mostra a atividade percentual de cada análogo em relação à insulina nativa.
Tabela 18 IGF-1 peguilado e análogos de insulina % de atividade de insulina mw. Nm [BRA GAIA) [Muse assi masteGe Pace mnmenen| [149
MIU-57 B1-PEG20K MIU-35 MIU-59 B1-PEG20K insulina MIU-61 B1,B29,A1-tri-PEG5K insulina <0,1 0,2) <<<0,3 MIU-S6| — B1-PEG20K, A1-NH=CO insulina MIU-67 BO, C8-PEG10K di-PEGuiladoMIU-35 MIU-S68/ Bo, B22-PEG1OK di-PEGuilado — MIU-35
[0448]Conduziram-se testes comparativos de tolerância à insulha em camundongos comparando a capacidade do análogo de insulina acilado Detimir em relação ao análogo de insulha de cadeia única peguilado MIU-56: B'(H5,Y16,L17)25a-PEG8-K-PEGA4-A'(N18,21). Esse análogo de cadeia única compreende um 20 kDa PEG ligado à cadeia lateral do resíduo de lisina único na porção de ligação (PEG8-K-PEG4) que une a cadeia A e a cadeia B. Conforme mostrado nas Figura 28A-28D, o análogo peguilado tem uma duração sustentada de ação de 24 horas e seu princípio é gradual o suficiente para evitar a sedação de animais na dosagem necessária para uma ação sustentada ao longo de 24 horas. As Figuras 28C e 28D mostram a glicose sanguínea AUC24 noras em camundongos administrados com Detimir e MIU-56, respectivamente. Obtiveram-se resultados similares para outro análogo de insulina de cadeia única peguilado MIU-57 (vide as Figuras 29A-29D) MIU-57 é um análogo de insulha de cadeia única (B'(H5,Y16,L17)25-C'!-A'(N18,21) que compreende um 20 kDa PEG ligado à cadeia lateral da terminação N da cadeia B. As Figuras 29A e 29B mostram os resultados de uma titulação comparativa de dose de insulina de análogos de insulina de cadeia única peguilados na porção de ligação (MIU-56) ou peguilados na terminação N da cadeia B (MIU-57), respectivamente. As Figuras 29C e 29D mostram a glicose sanguínea AUC24 noras em camundongos administrados com MIU-56 e MIU-57,
respectivamente. Os dados mostram que esses análogos permanecem potentes e apresentam um índice terapêutico aperfeiçoado em relação à insulina nativa. Os resultados das titulações comparativas de dose de insulina de MIU-56 e MIU-57 revelam que um perfil similar é obtido em camundongos para dosagens variando de nmol/kg a 80 nmol/kg (vide as Figuras 29E e 29F)
[0449]Preparou-se um dímero (MIU 58) que compreende dois análogos de insulina de cadeia única (B'(H5,Y16,L17)25-C!-A'(N18,21) ligados cabeça à cabeça através de uma cadeia 20 kDa PEG. As Figuras 29G-29J representam os resultados obtidos a partir de um teste comparativo de tolerância à insulina para MIU-57 e MIU-58 usando camundongos C57/BIk. As Figuras 29G e 29H são gráficos que mostram os resultados de testes de tolerância à insulina comparando MIU-57 e MIU-58. As Figuras 29| e 29J mostram a glicose sanguínea AUC24 horas em camundongos administrados com MIU-57 e MIU-58, respectivamente. O dímero é menos potente que o composto pai, mas ainda é ativo.
[0450]As Figuras 30A e 30B fornecem dados de uma titulação comparativa de dose de insulina de dois heterodímeros peguilados de insulina nativa. Os análogos compreendem duas sequências de cadeia A e B de insulina nativa ligadas através de ligações de dissulfeto nativo, e modificados para que tenham um 20 kDa PEG ligado na terminação N da cadeia B ou na posição B29 (com a terminação amino da cadeia A e B carbamilada). Os dados mostram que embora esses compostos difiram ligeiramente em suas atividades in vitro (vide a Tabela 18), eles se comportam similarmente in vivo em camundongos. Ambos os compostos permanecem potentes e têm um índice terapêutico aperfeiçoado em relação à insulina nativa não-peguilada (princípio lento, atividade sustentada durante 24 horas e monotonia relativa da resposta).
[0451]Os análogos de insulina também são construídos tendo duas ou mais cadeias de polietileno glicol covalentemente ligadas e comparados a um análogo de insulina nativa tendo um 20 kDa PEG único ligado a sua terminação N. Mais particularmente, as atividades de um análogo de insulina de cadeia única (B'(H5,Y16,L17)25-C'(K8)-A'(N18,21)) tendo duas cadeias PEG (10K cada) ligadas na terminação N e no aminoácido 8 da porção de ligação (C8), um análogo de insulina de cadeia única (B'(H5,Y16,L17, K22)25-C'(K8)-A'(N18,21)) tendo duas cadeias PEG (10K cada) ligadas na terminação N e no aminoácido B22, e um análogo de insulina de cadeia única (B'(H5,Y16,L17)25-C'(K8)-A'(K14, N18,21)) tendo duas cadeias PEG (10K cada) ligadas na terminação N e no aminoácido A14 foram comparadas. As Figuras 31A-31D fornecem dados de uma titulação comparativa de dose de insulina dos três análogos de insulina peguilados em relação ao único derivado de insulina nativa peguilado. A atividade in vitro é dramaticamente reduzida em pelo menos 10x. No entanto, embora os dados in vivo mostrem que parte da potência é perdida, os análogos de insulina peguilados duplos ainda são eficazes (particularmente para o análogo peguilado na porção de ligação). De modo correspondente, os análogos de insulina podem ser preparados tendo duas cadeias PEG de 10 kDa de comprimento que fornecerão um índice terapêutico aperfeiçoado em relação a análogos de insulina não-peguilados. Além disso, a peguilação na porção de ligação de análogos de cadeia única aparenta estar em um sitio preferencial de peguilação.
[0452] Camundongos diabéticos (camundongos db/db) foram administrados com análogos de insulina peguilados para comparar sua eficácia a análogos de insulina comercialmente disponíveis. Em particular, os análogos de insulina Levemir e Humulin foram comparados aos análogos de insulina peguilados MIU-59 (análogo de insulina nativa tendo um 20 kDa PEG único ligado a sua terminação N) e MIU-66 (análogo de insulina nativa tendo um 20 kDa PEG único ligado a sua terminação N à terminação amino das cadeias A e B carbamiladas). Tanto MIU-59 como MIU-66 apresentam uma atividade aperfeiçoada em relação a Levemir e Humulin (vide as
Figuras 32A e 32B). EXEMPLO 22 Tolerância comparativa à insulina para análogos de pró-fármaco de insulina
[0453] Camundongos “normais foram administtados com um análogo de heterodímero de insulina [B'(Y16,L17,Y25)29a : A'(aF19-NH2)], ou com um derivado de pró-fármaco deste. O derivado de pró-fármaco [B'(Y16,117,Y25)29a : A'(aF19-dLys(Ac),NLeu)] compreende uma substituição de 4-amino-fenilalnina na posição A19 em que um dipeptídeo dLys(Ac),NLeu foi covalentemente ligado na posição 4-amino no resíduo A19. Este dipeptídeo se autoclivará sob condições fisiológicas com uma meia-vida de aproximadamente 5 horas. Após incubar o derivado de pró-fármaco [B'(Y16,L17,Y25)29a : A'(aF19-dLys(Ac),NLeu)] durante 24 horas ex vivo, o composto resultante foi administrado aos camundongos e sua capacidade de reduzir glicose sanguínea foi comparada ao composto pai. Conforme mostrado na Figura 33, os dois compostos funcionaram quase identicamente.
[0454]A acilação dos análogos de pró-fármaco de insulina foi investigada para determinar se os tempos de retenção in vivo poderiam ser aumentados. A atividade in vitro de MIU 42 [B'(Y16,L17,Y25)29a : A'(dLys(rE-C14),Sar-aF19)], tendo um elemento de pró-fármaco de dipeptídeo acilado, aumenta com o tempo incubado ex vivo em 30%ACN/PBS & pH 7,4 37ºC (proporcionando tempo para a conversão de pró-fármaco) em relação ao pró-fármaco não-acilado. Os testes comparativos de potência de insulina conduzidos usando o pró-fármaco MIU 42 (Figura 34B) administrado sem uma etapa de pré-incubação mostram que o pró-fármaco não é muito potente em relação ao composto pai sem pró-fármaco (MIU-27; Figura 34A). De modo correspondente, pelo menos em camundongos a acilação não produz o perfil desejado. Constatou-se que isso também é verdadeiro para um análogo de insulina acilado MIU-46 [B'(H5,10 Y1I6,L17,Y25, K29-Ci14)28a : A'(N18,21, aF19NH2)] tendo acilação na posição B29. O composto não exibiu potência in vivo suficiente nem um perfil basal quando testado in vivo em camundongos (dados não mostrados).
EXEMPLO 23 Comparação de ligação ao receptor de análogos de insulina contendo CTP vs. análogos de insulina de cadeia única de proteína C
[0455]A atividade de fosforilação de quatro análogos de insulina de cadeia única (DR3, DR4, DP30 e DP31) nos receptores de subtipo A e B de insulina foi medida usando células HEK293 transfectadas por receptor conforme descrito no Exemplo 4. DR5 e DR4 representam análogos de insulina de cadeia única tendo o peptídeo C IGF-1 como a porção de ligação unindo as cadeias B e A. DP30 e DP31 representam análogos de insulina de cadeia única tendo o peptídeo C IGF-1 como a porção de ligação unindo uma cadeia B truncada C-terminal (tendo os últimos cinco aminoácidos carbóxi removidos e uma cadeia A. Proporciona-se a sequência completa dessas construções: DR3:
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGYGSSSRRAPQTGIVEQC CTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 96 DR4
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTGAGSSSRRAPQTGIVEQC CTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 97) DP30
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 98) DP31
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 99)
[0456]DR3 e DR4 diferem entre si na substituição da tirosina nativa no peptídeo C
IGF1 por alanina em DR4. DP30 e DP31 diferem entre si na substituição da arginina terminal do peptídeo CTP por uma lisina, permitindo a clivagem da insulina de cadeia única em uma insulina de cadeia dupla. DR3 e DR4 são análogos de alta potência tendo uma atividade aproximadamente equivalente nos receptores de insulina de subtipo A e B (vide a Tabela 19). DR4 é aproximadamente 10 vezes menos ativo no receptor IGF1 devido à substituição YC2A. DP30 e DP31 também são análogos de alta potência tendo uma atividade aproximadamente equivalente nos receptores de insulina de subtipo A e B (vide a Tabela 19) com potência baixa na atividade IGF1 (nota-se que embora um valor não tenha sido determinado para a atividade de DP30 em IGF1, a atividade era similar àquela de DP31).
[0457]A atividade de fosforilação de dois análogos de insulina de cadeia única adicionais (DP25M e DP31LysC) em relação a DP30 e DP31 nos receptores de subtipo A e B de insulina foi medida usando células HEK293 transfectadas por receptor. DP31LysC representa a construção DP31 que foi clivada na lisina que liga o peptídeo CTP à terminação N da cadeia A, gerando, assim, um análogo de insulina de cadeia dupla com o peptídeo CTP permanecendo ligado à terminação carbóxi da cadeia B. Após a clivagem, a atividade de insulina aumenta ligeiramente (aproximadamente 2X), mas a atividade IGF aumenta quase 20 vezes.
[0458]DP25M é um análogo de insulina de cadeia única que compreende um peptídeo CTP como a porção de ligação que é similar em estrutura a DP30 com a exceção que uma cadeia B de comprimento completo é usada na construção. De modo específico, DP25M compreende a sequência:
GEEEEEKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDRTSSSSRAPPPSLPSPSRLPG PSDTPILPQRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 100). Esse composto tem uma atividade menor nos receptores de insulina.
[0459]Os dados apresentados nas Tabelas 19 e 20 representam uma montagem de vários pontos de dados onde a insulina e os análogos foram testados com o passar do tempo, nem sempre lado-a-lado. Consequentemente, a média pode estar reduzindo a capacidade de distinguir as diferenças sutis em atividade entre cada análogo, mas os dados refletem as atividades gerais de cada composto individual na respectiva insulina e receptores IGF e as atividades relativas gerais dos compostos testados. Tabela 19 jrsuinal 96 [ N Jonas [DP | nJoRs] Dº | niDPo DA Tn pre oF | n] re om Jos] em IRA em IRB coa es les em IGF-1 R Tabela 20 |n fores e Lo Jorso De Tn Jorador In Br oe [o insulina| DP | N ÍDP25M N | DP30 N [DP31 N N LysC é] so ou)o em IRA ECsomédio| 956 o28| 5 | 5,49 [1,5] 2 [1,12 0,52] 3 Jo91 0,20] 4 foas/o,28] 2 em IRB EC50 médio emiaria | se 197 [e] |] for | fins) er o fool do Proliferação de células epiteliais mamárias humanas:
[0460]Para medir o potencial mitogênico de análogos de insulina, células epiteliais mamárias humanas (HMEC HCC-2551, Cambrex East Rutherford, NJ, EUA) foram culturadas em MEGM completo (XCC-3051, Cambrex, East Rutherford, NJ, EUA) para confluência de 90%. As células foram tripsinizadas utilizando-se TryplE Express (Invitrogen Grand Island, NY, EUA), lavadas com Meio de Eagle modificado pro Dubecco (HyClone, Logan, UT, EUA), reconstituídas em um kit MEGM Bullet insulina-deficiente (XCC-3150, Cambrex East Rutherford, NJ) e semeadas em confluência de 40% em microplacas de cintilação Cytostar-T (%RPNQO0162, Perkin- Elmer, Waltham, MA, EUA). Diluições seriais de cinco vezes de análogos de teste,
insulina humana recombinante, (Eli Lilly & Co Indianapolis, IN, EUA) e fator de crescimento | semelhante à insulina humana sintética (IGF-1) foram preparados a partir de estoques estéreis no MEGM insulina-deficiente e transferidos para a placa Cytostar-T com HMEC. A placa foi incubada por 4 horas a 37ºC, CO? a 5% e 90% de umidade. As células foram pulsadas com 0,1 mCi/poço [!ºC]-timidina (HNECS68050UC, Perkin-Elmer, Waltham, MA, EUA) e incubadas a 37ºC em uma atmosfera umidificada com CO? a 5% durante 48 horas.
[0461]Ao término da incubação, o sinal de cada poço da placa foi lido durante 1 minuto em um contador de cintilação MicroBeta 1640 (Perkin-Elmer, Waltham, MA, EUA) e a incubação continuou por mais 72 horas com as leituras de placa em intervalos de 24 horas. Os resultados foram representados graficamente como contagens por minuto (CPM) versus concentração de peptídeo e os valores ECso foram determinados usando o software Origin (OriginLab, Northampton, MA, EUA).
[0462]Os dados apresentados na Tabela 21 representam a potência média medida em 24, 48, 72 e 96 horas após o contato das células com o análogo específico. Conforme esperado, IGF-1 é muito mais potente que a insulina em estimular a proliferação (uma diferença de aproximadamente 30 vezes). Lantus, um análogo de insulina basal de longa ação comercializado junto a Sanofi-Aventis, é um mitógeno mais potente que a insulina nativa similar em potência a IGF-1. DP3 e DP4 também são mitógenos potentes, muito mais potentes que a insulina nativa. Isto ocorre provavelmente devido à presença do peptídeo C IGF-1 sendo usado como a porção de ligação que une as cadeias A e B. Nota-se que a substituição da C2 tirosina pro alanina reduz a atividade mitogênica de DP4 em relação a DP3. No entanto, DP4 permanece sendo 10 vezes mais potente que a insulina nativa.
[0463]A atividade proliferativa de DP30, DP31 e DP25M é mais próxima àquela de insulina nativa e, ademais, esses análogos exibem uma atividade proliferativa ainda menor que a insulina nativa. Nota-se que a clivagem do análogo de insulina de cadeia única DP31 produz um análogo de cadeia dupla exibindo uma atividade maior que IGF-1.
Tabela 21 Peptídeo ECso(nM) IGF-1 0,22 Insulina 6,16 Lantus 0,37 DR3 0,11 D R4 0,70 DP25M 31,4 DP30 12,1 DP31 10,9
[0464]EXEMPLO 24 Comparação de peptídeos CTP encurtados como porções de ligação em análogos de insulina de cadeia única
[0465]Para investigar a relação de atividade estrutural do peptídeo CTP considerando a atividade nos receptores de insulina e IGF-1, os análogos de insulina de cadeia única foram preparados usando fragmentos do peptídeo CTP. Prepararam-se três construções da seguinte forma DP47:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPGIVEQCCTSICSLYQLENYC N (SEQ ID NO: 101) DP48:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPILPQKGIVEQCCTSICSLYQLENYC N (SEQ ID NO: 102) DP49:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFSSSSRAPPPSLPILPQKGIVEQCCTSICSLYQ LENYCN (SEQ ID NO: 103
[0466]DP47 representa uma cadeia A e B de insulina nativa em que os 5 aminoácidos C-terminais foram excluídos e a cadeia B é ligada à cadeia A por um ligante de 12 aminoácidos representando os primeiros 12 aminoácidos de CTP (DesV, CTP primeiro 12AA). Doze aminoácidos foram selecionados porque este é o tamanho do peptídeo C IGF-1. DP48 representa uma cadeia A e B de insulina nativa em que os 5 aminoácidos C-terminais foram excluídos e a cadeia B é ligada à cadeia A por um ligante de 17 aminoácidos representando os primeiros 12 aminoácidos de CTP e os últimos 5 aminoácidos de CTP. DP49 representa uma cadeia A e B de insulina nativa em que os 5 aminoácidos C-terminais foram excluídos e a cadeia B é ligada à cadeia A por um ligante de 12 aminoácidos representando os primeiros 6 aminoácidos de CTP e os últimos 6 aminoácidos de CTP (DesV, CTP Primeiro 8AA e Último 6AA) (DesV, CTP primeiro 12AA + último 5AA). A atividade desses três compostos, medida usando células HEK293 transfectadas por receptor conforme descrito no Exemplo 4, é mostrada na Tabela 22
[0467]Neste ensaio, a insulina nativa mostra uma potência igual em ambos os receptores A e B. No entanto, para DP31 há uma seletividade para o receptor de subtipo B de insulina que é o receptor preferencial para ativação. Adicionalmente, DP31 é ainda menos potente no receptor IGF-1 do que a insulina nativa. A seletividade para os receptores de insulina em relação ao receptor IFG-1 aparenta diminuir à medida que o peptídeo CTP é reduzido em tamanho (vide DP49>DP48>DP47) Tabela 22 | Peptídeo Es Insulina 0,50
DP47 (CTP!1?) 0,69 0,83 29,7 DRa48 (CTP16; 23-28 K) 0,29 0,47 27,1 DP49 (CTP1-12; 24-28 K) 0,72 0,37 82,6 DP31 (CTP' 28, K) 0,57 0,19 132,9

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES
1. Análogo de insulha de cadeia única CARACTERIZADO por compreender uma cadeia A, uma cadeia B e uma porção de ligação, em que a dita porção de ligação covalentemente liga a terminação carbóxi da cadeia B à terminação amino da cadeia A para formar uma cadeia contígua de aminoácido, em que a dita porção de ligação compreende um peptídeo CTP, em que o dito peptídeo CTP compreende uma sequência de aminoácido que compreende a sequência SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQR (SEQ ID NO: 64); uma sequência que compreende um fragmento de 18 a 28 aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou uma sequência que compreende uma sequência de 18 a 29 aminoácidos que compartilhe pelo menos 50% de identidade de sequência a uma sequência de 18 a 29 aminoácidos de (SEQ ID NO: 64), com a condição de que a porção de ligação não compreenda uma sequência de 18 aminoácidos que seja idêntica a uma sequência de 18 aminoácidos de SEQ ID NO: 53 diretamente ligada à terminação carbóxi da cadeia B.
2. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita porção de ligação compreende um total de 18 a 158 resíduos de aminoácidos.
3. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita porção de ligação compreende um total de aminoácidos 28 a 56.
4, Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita porção de ligação compreende uma sequência contígua com 29 aminoácidos, diretamente ligada ao aminoácido carbóxi- terminal da cadeia B, em que dita a sequência contígua com 29 aminoácidos tem uma identidade de sequência superior a 90% a SSSSXssAPPPSLPSPSRLPGPSD TPILPQXs: (SEQ ID NO: 66), em que Xso e X5s1 são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina.
5. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito análogo de insulina compreende, ainda, um sítio de glicosilação insulina não-nativa à nativa.
6. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita porção de ligação compreende um sítio de glicosilação N-ligado.
7. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita porção de ligação compreende um sítio de glicosilação O-ligado.
8. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita porção de ligação compreende um análogo de (SEQ ID NO: 64), em que o dito análogo difere de (SEQ ID NO: 64) por 1 a 6 substituições de aminoácido.
9. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita porção de ligação compreende SEQ ID NO: 66 ou SEQ ID NO: 79.
10. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 1, 4, 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita cadeia A compreende a sequência GIVXaXs CO X8XaX1o0CX12LX1aXi5sLX17X18X19CX21 Ria (SEQ ID NO: 18); e a dita cadeia B compreende a sequência R22 X25LCGX29X30L VX33X3aL YLVCGXa41 Xa2GFXas (SEQ ID NO: 17) em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xs é glutamina ou ácido glutâmico;
Xs é histidina, treonina ou fenilalanina;
Xs é serina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X1o é isoleucina ou serina;
X12 é serina ou ácido aspártico;
X1 é tirosina, arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina;
X17 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, ácido aspártico, ornitina ou lisina;
X18 é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina;
X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina;
X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina;
Xa5 é histidina ou treonina;
X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina;
Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico;
Xs3 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico;
X31 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina;
Xa41 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina;
Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina;
Xas é tirosina ou fenilalanina;
R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), FVUNQ (SEQ ID NO: 10), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-
prolina-ácido glutâmico, um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de asparagina-glutamina, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; e R13 é COOH ou CONH>.
11. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita cadeia A compreende a sequência GIVEQCCOXsáSICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 23) e ta cadeia B que compreende a sequência X2aL CGX29X3oL VEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 24) em que X;z é selecionado a partir do grupo que consiste em treonina e histidina; Xi17 é ácido glutâmico ou glutamina; X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina; X23 é asparagina ou glicina; X24 é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina e treonina; X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina e serina; Xso é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico.
12. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia B compreende a sequência R22 HLCGSX3oLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 56) ou Ra X25LCGX29X30LVX33 XaalL YLVOGX41 X42GFX4a5 (SEQ ID NO: 17) e a cadeia A compreende a sequência GIVEQCCXsSICSLYQLENX19CX21 Ria (SEQ ID NO: 26) ou GIVXa4ECCXaXs6SCDL X1aX15sLX17X18X19CX21 Ri3 (SEQ ID NO: 15) em que Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico; Xz é histidina, treonina ou fenilalanina; Xs é arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X14 é arginina, lisina, ornitina ou alanina;
X15 é glutamina, ácido glutâmico, arginina, alanina, lisina, ornitina ou leucina;
X17 é glutamina ou ácido glutâmico;
X1is é metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou treonina;
X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina;
X21 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, glicina, serina, valina, treonina, isoleucina, leucina, glutamina, ácido glutâmico, asparagina, ácido aspártico, histidina, triptofano, tirosina, e metionina;
Xas é histidina ou treonina;
X29 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e glicina;
X3o é selecionado a partir do grupo que consiste em histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico e ácido cistéico;
X33 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido aspártico, glutamina e ácido glutâmico;
X31 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina e treonina;
Xa41 É selecionado a partir do grupo que consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico ou asparagina;
Xa2 é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, lisina, ornitina e arginina;
Xas é tirosina ou fenilalanina;
R22 é selecionado a partir do grupo que consiste em X22VNQ (SEQ ID NO: 50), um tripeptídeo de valina-asparagina-glutamina, um dipeptídeo de asparagina- glutamina, glutamina, e uma ligação;
R24a é selecionado a partir do grupo que consiste em AYRPSE (SEQ ID NO: 11), PGPE (SEQ ID NO: 9), um tripeptídeo de glicina-prolina-ácido glutâmico, um dipeptídeo de prolina-ácido glutâmico, glutamina, ácido glutâmico e uma ligação; e
R13 é COOH ou CONH,>.
13.Agonista de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que Xs, X25 e X3o são histidina.
14. Agonista de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita cadeia B compreende a sequência FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 104), a cadeia A compreende a sequência GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1), e a porção de ligação compreende a sequência (SSSSXscAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQXs1:)n (SEQ ID NO: 66), em que Xso e Xs1 são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina; e né1ou2.
15. Análogo de insulina de cadeia única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO por compreender, ainda, uma porção hidrofílica ligada a dito análogo, em que a porção hidrofílica é uma proteína de plasma, cadeia de polietileno glicol ou a porção Fc de uma imunoglobina.
16. Agonista de insulina de cadeia única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que uma cadeia lateral de aminoácido do dito agonista de insulina de cadeia única é covalentemente ligada a um grupo acila ou um grupo alquila através de uma ligação alquil amina, amida, éter, éster, tioéter, ou tioéster.
17. Análogo de insulina que compreende uma cadeia A, uma cadeia B e um peptídeo CTP, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita cadeia A compreende a sequência GIVXaXs CCO X8aXaX1o0CX12LX1aX1isLEX18X19CX21 R1i3 (SEQ ID NO: 55); a dita cadeia B compreende a sequência XasLCGX29X30L VX33X3aL YLVCGX41Xa42GFXa5s (SEQ ID NO: 17); e o dito peptídeo CTP compreende a sequência
(SSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQXSs1)n (SEQ ID NO: 66) ou
MGSSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEXs: (SEQ ID NO; 93), em que as ditas cadeias A e B são ligadas entre si através de ligações dissulfeto e o dito peptídeo CTP é covalentemente ligado à terminação amino ou à terminação carbóxi da cadeia B, em que n é um número inteiro selecionado de 1 a 3;
Xa é ácido glutâmico ou ácido aspártico;
Xs é ácido glutâmico ou glutamina;
Xz é treonina, histidina ou fenilalanina;
Xs é serina, arginina, ornitina ou alanina;
X1o é serina ou isoleucina;
X12 é serina ou ácido aspártico;
X1a é arginina, tirosina, ornitina ou alanina;
X15 é glutamina, arginina, alanina, ornitina ou leucina;
X18 é metionina, asparagina ou treonina;
X19 é tirosina, 4-metóxi-fenilalanina ou 4-amino fenilalanina;
X21 é alanina, glicina ou asparagina;
Xas é histidina ou treonina;
X29 é alanina, glicina ou serina;
X3o é histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido homocistéico ou ácido cistéico;
X33 é ácido aspártico ou ácido glutâmico;
X34 é alanina ou treonina;
Xai é ácido aspártico ou ácido glutâmico;
Xa? é alanina, ornitina ou arginina;
Xas é tirosina ou fenilalanina;
Xso e X5s1 são independentemente selecionados a partir de arginina e lisina; e R13 é COOH ou CONH>.
18. Análogo de insulha de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a terminação carbóxi da dita cadeia B é covalentemente ligada à terminação amino da cadeia A através de um ligante peptídico para formar uma cadeia contígua de aminoácido, em que o dito ligante peptídico compreende o dito peptídeo CTP.
19. Análogo de insulina, de acordo com uma das reivindicações 17 ou 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo CTP compreende uma sequência independentemente selecionada a partir do grupo que consiste em (SSSSXsoAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPOQ)r (SEQ ID NO; 92), (SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK)n (SEQ ID NO: 79), e (SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR)n (SEQ ID NO: 64), em que né1ou2.
20. Sequência de ácido nucléico, CARACTERIZADA por codificar o análogo de insulina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
21. Célula hospedeira eucariótica, CARACTERIZADA por compreender uma sequência de ácido nucléico que codifica o análogo de insulina, como definido na reivindicação 20.
22. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma Pichia ou célula CHO.
23. Método para produzir um análogo de insulina hiperglicosilado, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método compreende cultivar as células, como definidas na reivindicação 21, sob condições em que a dita proteína é produzida; e recuperar a dita proteína a partir da cultura.
24. Derivado do análogo de insulina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO por compreender a estrutura U-B, em que U é um aminoácido ou um ácido hidróxi; B é um aminoácido N-alquilado ligado ao dito análogo de insulina de cadeia única através de uma ligação amida entre uma porção caraboxila de B e uma amina do análogo de insulina de cadeia única, em que U, B, ou o aminoácido do análogo de insulina de cadeia única ao qual U-B é ligado consiste em um aminoácido não- codificado, em que a meia-vida de clivagem química (t1/2) de U-B a partir do análogo de insulina de cadeia única é pelo menos cerca de 1 hora a cerca de | semana em PBS sob condições fisiológicas.
25. Derivado de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que U-B compreende a estrutura de Fórmula X: R, Ro É O Da Rs o RR x em que R1, R2, Ra e Ra são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H, C1-Ci8 alquil, C2-C18 alquenil, (C:-Ci18 alqguil)OH, (C1-Ci8 alquil)SH, (C2-C3 alquil)|SCHs, (C1-Ca alquil) CONH2, (C1-Ca alquil)|COOH, (C1-Ca alquil)NH2, (C1- Ca alquil)|NHC(NH2*)NH2, (Co-Ca alquil)(C3a-C6s cicloalquil), (Co-Ca alquil)(C2-Cs heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Ci1o aril)R7, (C1-Ca alquil)(C3-Co heteroaril), e C1- Ci2 alquil(W1)C1-C12 alquil, em que W1 é um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em N, S e O, ou R: e R2 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Ci2 cicloalquil ou aril; ou Ra e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um C3-Cs cicloalquil;
R3 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C18 alquil, (C1-Ci1s alquil)OH, (C1-Ci8 alquil)NH2, (C1-Ci8 alquil)SH, (Co-Ca alquil)(C3a-Ce)cicloalquil, (Co- Ca alquil)(C2-C5s heterocíclico), (Co-Ca alquil)(C6-Cio aril)JR7, e (C1-Ca alquil)(C3-Co heteroaril) ou Ra e R3 juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; R5 é NHRs ou OH; Rs: é H, C1-Cs alquil ou Rg e Ri juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel heterocíclico com 4, 5 ou 6 membros; e R7 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, C1-C18 alquil, C2- C18 alquenil, (Co-Ca alquil)|CONH>2, (Co-Ca alquil)COOH, (Co-Ca alquil)NH2, (Co-Ca alquil) OH, e halo.
26. Derivado de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que R: e R2 são independentemente C1-Ci138 alquil ou aril; R3 é C1-Ci18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel 4-12 heterocíclico; Ra e Rg são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; e Rs é uma amina ou uma hidroxila.
27. Derivado de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C18 alquil e aril; R3 é C1-C18 alquil ou R3 e Ra juntos aos átomos aos quais eles são ligados formam um anel 4-6 heterocíclico; Ra e Rg são hidrogênio; e Rs é selecionado a partir do grupo que consiste em amina, amina N-
substituída e hidroxila.
28. Agonista de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito análogo é acilado em uma ou mais posições selecionadas a partir de A14, A15, BO, B1, B10, B22, B28, B29, na cadeia lateral de uma cadeia lateral de aminoácido da porção de ligação, ou na cadeia lateral de um aminoácido do dipeptídeo U-B.
29. Agonista de insulina de cadeia única de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito análogo é peguilado em uma ou mais posições selecionadas a partir de A14, A15, BO, B1, B10, B22, B28, B29, na cadeia lateral de uma cadeia lateral de aminoácido da porção de ligação, ou na cadeia lateral de um aminoácido do dipeptídeo U-B.
30. Dímero ou multímero, CARACTERIZADO por compreender um agonista de insulina de cadeia única, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
29.
31. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA por compreender um agonista de insulina de cadeia única, ou derivado de pró-fármaco deste, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
32. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, CARACTERIZADO por ser na fabricação de um medicamente para o tratamento de hiperglicemia.
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