BRPI0707599A2

BRPI0707599A2 - sÍntese de peptÍdeo semelhante a glucagon

Info

Publication number: BRPI0707599A2
Application number: BRPI0707599-5A
Authority: BR
Inventors: Oleg Werbitzky; Stephane Varray; Matthieu Giraud; Carsten Meininghaus
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2011-05-10
Also published as: PT1987052E; EP1987052A1; WO2007090496A1; US8445433B2; AU2007214088B2; CN101379075A; DE602007014184D1; TWI404724B; NO20083378L; US9040480B2; US20130324699A1; US20090292106A1; EP1987052B1; AU2007214088A1; ZA200806690B; DK1987052T3; CN101379075B; IL193134A; ES2364982T3; CA2641053A1

Abstract

SÍNTESE DE PEPTÍDEO SEMELHANTE A GLUCAGON. Foi inventado um novo método para a síntese do peptídeo GLP-1.

Description

SÍNTESE DE PEPTÍDEO SEMELHANTE A GLUCAGON

A presente invenção se refere ao campo da síntesede drogas peptídicas, mais exatamente a novos métodos de sesintetizar agonistas de peptídeo GLP-1.

Uma nova classe de drogas diabéticas, agonistas deGLP-I ou de peptídeo semelhante a glucagon 1, constituemuma nova classe promissora de compostos terapêuticos. Noentanto, a sua preparação por técnicas padrão de síntese depeptídeos em fase sólida não é absolutamente fácil.

Basicamente, o GLP-I é um peptídeo que ocorre naturalmenterelacionado na seqüência com o glucagon. Diversas variantesde seqüências ligeiramente geneticamente modificadas doGLP-I natural já foram descritas na literatura, com aintenção de se aumentar a sua potência.

A preparação de tais peptídeos GLP-I já foidescrita em WO 05/027978 e WO 02/90388, no entanto, não foiempregada nenhuma metodologia para a síntese do peptídeoque fosse mais do que a síntese básica padrão em fasesólida com Fmoc.

0 requerente da presente invenção descobriu que aabordagem da técnica anterior não permitia bonsrendimentos, o que é inaceitável para a produçãoindustrial. Aparentemente as etapas de acoplamentoindividuais dependentes de seqüências eram extremamenteineficientes.

0 objetivo da presente invenção consiste emdesenvolver um outro método ou um método melhorado desíntese de agonistas de peptídeo GLP-1. 0 objetivo éatingido com o método da presente invenção que compreende ouso de uma unidade de Fmoc-dipeptídeo de prolina em vez deaminoácidos Fmoc individuais em uma posição específica naseqüência integral durante a síntese em fase sólida.

De acordo com a presente invenção, é desenvolvidoum método de preparação de um peptídeo GLP-I ou de agonistade GLP-1, sendo o peptídeo da fórmula

A-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-B

Ou é da fórmula

A-(RI)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-BOu é da fórmula

A-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B

Ou é da fórmula

A-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B

Ou é da fórmula

A-(Rl)X-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-

Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-

Val-R4-B

Ou é da fórmula

A-(Rl)X-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-

Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-

Val-R4-Gly-B

em que

B = -OH ou -NH2

A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc-

R1 = His, D-His, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidróxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluormetil-histidina ou alfa-metil-histidinaR2 = -Ala, D-Ala, -Vai, D-Val, Gly, Aib (ácido a-aminoisobutírico)

R3 = Glu, Asp, Met, Leu, de preferência, Glu ouAsp, sendo mais preferível AspR4 = -Lys ou Arg

R5 = -GlyiAib, Ala, D-AlaR6 = Arg, Lys ou Gly

R7 = Arg, Lys ou Gly, de preferência, Lys ou GlyR8 = Gly ou Aib

e em que, independentemente, x,y,w,z são 0 ou 1,desde que y = 1 quando χ = 1 e desde que w = 1 quando ζ = 1,

podendo os aminoácidos individuais portar gruposprotetores,

compreendendo as etapas de

a. síntese do peptídeo em uma fase sólida poracoplamento gradual de aminoácidos ou dipeptídeoscompreendendo dipeptídeos de pseudoprolina protegidos porFmoc, opcionalmente ainda com as cadeias secundáriasadequadamente protegidas, de um modo linear, desde que naposição específica de seqüência adequada que corresponde aVal-Ser- e/ou Val-Ser-Ser, respectivamente, e é acentuadapelas letras em negrito nas fórmulas de seqüências dadasacima, um primeiro dipeptídeo de pseudoprolina sejaacoplado à cadeia peptídica em crescimento, sendo odipeptídeo de pseudoprolina selecionado do grupo queconsiste em Fmoc-Val-Ser (^e,Mepro)-0H, Fmoc-Val-Ser (ijrH'Hpro) -OH, Fmoc-Ser (P)-Ser (^'^pro)-OH e Fmoc-Ser(P)-Ser (\irH'Hpro) -0H, e sendo P um grupo protetor de cadeiasecundária clivável por ácido que é clivado em condiçõesmuito ácidas de pelo menos 80% de TFA em água, sendo P depreferência não clivado em condições pouco ácidas, conformedefinido abaixo, sendo o mais preferível que P seja terc-butila ou tritila,

b. clivagem do peptídeo a partir de fase sólida eopcionalmente desproteção da cadeia peptídica.

A atividade de peptídeos GLP-I é extremamentesuscetível a alterações em seqüência, principalmente noselementos periféricos de seqüência permitindo algumasubstituição conservadora de resíduos. Aparentementepequenas alterações podem ainda ter efeitos imprevisíveissobre a estabilidade ou a ligação do receptor econseqüentemente sobre a atividade farmacológica. Uma boaresenha sobre tal problema é dada em Sarrauste de Menthiereet al, European J. Medicinal Chemistry 39, 2004:473-480. Aporção de seqüência nuclear da família de peptídeos GLP-Inão permite literalmente nenhuma alteração.

A síntese linear em fase sólida de peptídeos decomprimento total, ou de peptídeos parciais, compreendendoesta porção nuclear, se depara com problemas enormes de umatotal ineficiência das etapas de acoplamento individuais aponto de serem praticamente impossíveis, mesmo depois deacoplamentos repetidos. 0 prolongamento de tempos deacoplamento e a elevação de temperatura de acoplamento etc.apresentam o risco de um aumento da racemização ou deprodutos secundários indesejáveis.

Diversos autores (Sarrauste, supra, e Adelhorst etal. J. Biol. Chem. 269 (1994), 6275- 6278) analisaram aestrutura secundária dos peptídeos GLP-I nativos em soluçãoaquosa por espectroscopia de dicroísmo circular (Chen etal. (1974) Determination of the helix and beta form ofproteins in aqueous solution by circular dichroism.Biochemistry 13, 3350-3359, por exemplo). Greenfield, N. eFasman, G. D. (1969) Computed circular dichroism spectrafor the evaluation of protein conformation. Biochemistry 8,4108-4116) e encontraram somente um teor bastante baixo(10%) de estrutura em folha β produzindo a agregação dasestruturas peptídicas, no entanto, além de regiões muitomaiores de estrutura desordenada e helicoidal. Os métodosespectroscópicos aplicados não permitiram a atribuição departes de seqüência de GLP-I correspondentes aos citadoselementos estruturais. - Acredita-se habitualmente que aagregação, e conseqüentemente os problemas, na síntese emfase sólida estejam associados com a ocorrência de regiõesprolongadas da estrutura de folha β. Um baixo teor deestruturas em folha β é comum a maioria de peptídeos compelo menos 10 aminoácidos de comprimento e não estáassociado com nenhum problema incomum em metodologiasintética.

As unidades Fmoc-dipeptídeo de pseudoprolina sãohoje em dia disponíveis no comércio; a sua síntese já foidescrita (Ruckle et al., Tetrahedron 1999, 55(37): 11281-11288; Keller et al., 1998, J. Am. Chem. Soe. 120:2714-2720, por exemplo) . Tais peptídeos de pseudoprolina sãousados pelo menos para a introdução de pelo menos um dosresíduos centrais de serina no segmento de seqüênciaespecífica ou na posição de seqüência ou na seqüênciaparcial -Val-Ser-Ser- permitindo o uso de dipeptídeos depseudoprolina ou para a seqüência parcial -Val-Ser- ou -Ser-Ser- nesta posição de seqüência, sendo esta a essênciada presente invenção, e permitindo, além disso, seintroduzir eventualmente ainda um segundo resíduo depseudoprolina nas seqüências parciais - Gly-Thr- ou -Phe-Thr-, de preferência na seqüência parcial -Gly-Thr-. Taispseudoprolinas da presente invenção são carboxilatos de N-Fmoc-peptidil-(4S)-1,3-oxazolidina derivados de Ser ou Thre tendo, dentro do contexto da presente invenção, aestrutura como da fórmula I

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em que K é um resíduo de aminoácido selecionado do grupoque consiste em Ser, Vai, Phe, Gly e em que Ser porta aindaum grupo protetor de cadeia secundária P que é clivável emcondições ácidas fortes conforme será definido abaixo; Rll,Rl2 são, independentemente, H, metila ou etila e RlO é H oumetila. - A natureza dos substituintes Rll e R12 influenciaa isomerização cis/trans da ligação peptídeo-amida do quala oxazolidina é parte e, portanto, o potencial dapseudoprolina afetar positivamente a estrutura da cadeiapeptídica em crescimento durante a síntese.

É também viável, mas menos preferível, dentro docontexto da presente invenção, se usar ácidospiroglutâmicos como porção pseudoprolina, o que exige umaquímica especial de acoplamento e desproteção (Tomasini, C.et al., Tetrahedron letters 2001, 42:5211-5214).

É mais preferível que somente o primeiro resíduo depseudoprolina em qualquer um dos dois sítios centrais doresíduo de Ser no interior da seqüência de GLP-I, conformeespecificado acima, seja empregado no método de síntese dapresente invenção. Isto significa que nenhuma segundaunidade dipeptídica de pseudoprolina é empregada durante asíntese. O mais preferível é que o primeiro dipeptídeo depseudoprolina seja Fmoc-Val-Ser (ѱ Me, Me)-OH para ser usado nasíntese em fase sólida de acordo com a presente invenção.

Exemplos comparativos buscando inutilmentesintetizar peptídeos GLP-I na ausência do dipeptídeo depseudoprolina específico da presente invenção sãoapresentados na seção experimental, ilustrando o problematécnico objetivo que motivou a presente invenção.

Os reagentes de acoplamento para a síntese depeptídeos são conhecidos na técnica (veja Bodansky, Μ. ,Principies of Peptide Synthesis, 2a. ed. Springer VerlagBer1in/Heidelberg, 1993; veja também a discussão do papeldos aditivos de acoplamentos ou auxiliares nestareferência). Os reagentes de acoplamento podem seranidridos mistos (T3P, por exemplo: anidrido do ácidopropano fosfônico) ou outros agentes acilantes tais comoésteres ativados ou halogenetos ácidos (ICBF, por exemplo,cloroformiato de isobutila) ou eles podem ser carbodiimidas(l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida, diisopropil-carbodiimida), derivados de benzotriazina ativados de(DEPBT: 3-(dietóxi-fosforilóxi)- 1,2,3-benzotriazino-4(3H)-ona, por exemplo) ou derivados de sais urônicos oufosfônicos de benzotriazol.

Levando-se em conta o melhor rendimento, temporeduzido de reação e proteção contra racemização durante oalongamento da cadeia, é mais preferido que o reagente deacoplamento seja selecionado do grupo que consiste em saisurônicos e sais fosfônicos do benzotriazol capazes deativar uma função ácido carboxílico livre juntamente com ofato de a reação ser conduzida na presença de uma base.Exemplos adequados e também preferidos de tais sais deacoplamento urônicos ou fosfônicos são, por exemplo, HBTU(hexafluorfosfato de O-lH-benzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν' ,N' -tetrametilurônio), BOP (hexafluorfosfato de benzotriazol-1-il-óxi-tris-(dimetilamino)-fosfônio), PyBOP(hexafluorfosfato de benzotriazol-l-il-óxi-tripirrolidino-fosfônio), PyAOP, HCTU (hexafluorfosfato de O-(ΙΗ-6-cloro-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio), TCTU(tetrafIuorborato de Ο-ΙΗ-6-clorobenzotriazol-l-il) -1,1, 3 , 3-tetrametilurônio), HATU (hexafluorfosfato de O-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio), TATU(tetrafluorborato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1, 3, 3-tetrametilurônio), TOTU (tetrafluorborato de O-[ciario(etoxicarbonil)metilenamino]-Ν,Ν,Ν',Ν"-tetrametilurônio), HAPyU (hexafluorfosfato de O-(benzotriazol-l-il)oxibis-(pirrolidino)-urônio.

É preferível que o reagente base seja uma basefraca cujo ácido conjugado tenha um valor pKa de 7,5 a 15,sendo mais preferível de pKa 7,5 a 10, com a exclusão deuma função α-amino de um peptídeo ou aminoácido ou derivadode aminoácido, sendo tal base, de preferência, uma aminaterciária impedida estericamente. Exemplos de tais aminas eainda mais preferidas são a base de Hünig (N, N-diisopropiletilamina), N,N'-dialquilanilina, 2,4,6-trialquilpiridina, 2,6-trialquilpiridina ou N-alquil-morfolina, sendo o alquila um Ci-C4 de cadeia reta ouramificada, sendo mais preferível N-metilmorfolina (NMM) oucolidina (2,4,6-trimetilpiridina), sendo o mais preferívelcolidina.

0 uso de aditivos de acoplamento, especialmenteaditivos de acoplamento do tipo de benzotriazol é tambémconhecido (veja Bodansky, supra). O seu uso é especialmentepreferido quando se usam reagentes de acoplamentoextremamente ativadores, os citados acima sais urônicos oufosfônicos. Portanto, é ainda preferido que o aditivoreagente de acoplamento seja um composto hidróxi nucleófilocapaz de formar ésteres ativados, tendo, maispreferivelmente uma função N-hidróxi nucleófila em que N éimida ou triazeno N-aril ou N-acil substituído, sendo omais preferível que o aditivo de acoplamento seja umderivado de N-hidróxi-benzotriazol (ou derivado de 1-hidróxi-benzotriazol) ou é um derivado de N-hidróxi-benzotriazina. Tais compostos aditivos N-hidróxi deacoplamento foram descritos amplamente em WO 94/07910 e emEP 410 182 e cujos conteúdos respectivos são incorporadosao presente documento a título de referência. Exemplos são,por exemplo, N-hidróxi-succinimida, N-hidróxi-3,4-diidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HOOBt), l-hidróxi-7-azabenzotriazol (HOAt) e N-hidróxi-benzotriazol (HOBt). Osderivados de N-hidróxi-benzotriazina são especialmentepreferidos, em uma modalidade extremamente preferida, oaditivo reagente de acoplamento é hidróxi-3,4-diidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina. Os aditivos de acoplamentoconstituídos por compostos de sais de amônio são conhecidose o seu uso me química de acoplamento foi descrita emUS4806641.

É também possível se empregar, concomitante com oseu papel como um auxiliar de acoplamento HOBt, porexemplo, como um reagente de pareamento de íons para aproteção de cadeias secundárias de Arg durante a síntese,como uma opção à proteção de cadeia secundária covalente deArg. Nesse caso, uma concentração suficientemente elevadade HOBt deve ser mantida durante todas as etapas deprocessamento de ciclização da síntese em fase sólida.

Em uma modalidade especialmente preferida ainda, oreagente de acoplamento sal urônico ou fosfônico é umreagente de sal urônico e de preferência HCTU, TCTU ouHBTU, sendo ainda mais preferível que seja usado na reaçãoem combinação com N-hidróxi-3,4-diidro-4-1,2,3 -benzotriazina ou um sal seu. Esta modalidade éprincipalmente preferida para uso na etapa de alongamentode cadeias da síntese de peptídeos depois da remoção dogrupo protetor de Na instável a bases, mas pode também serusado para a reação de lactamização durante a ciclizaçãodas cadeias secundárias.

Dentro do contexto da presente invenção, deve-seobservar que HCTU e TCTU são definidos como sendoabrangidas pelo termo "reagente de sal urônico", conforme éhabitualmente subentendido na técnica, apesar do fato deque estes compostos e análogos possíveis mostraram por meiode análise de estrutura cristalina compreender uma fraçãoisonitroso e não uma fração urônio (O. Marder, Y. Shvo, eF. Albericio "HCTU e TCTU: New Coupling Reagents:Development e Industrial Applications", Chimica Oggi 2002,20:37-41), um substituinte N-amidino no núcleoheterocíclico dando origem a uma estrutura de guanídio, emvez disso. Dentro do contexto da presente invenção, talclasse de compostos é denominada "subclasse do tipo doguanídio" de reagentes de sais urônicos de acordo com apresente invenção.

A desproteção de Na instável a bases pode serconduzida conforme é rotineiramente feito na técnica, compiperidina a 20%, por exemplo, em N-metil morfolina (NMP) ,diclorometano (DCM) ou dimetilformamida (DMF). Os doissolventes orgânicos apolares apróticos são rotineiramenteaplicados na técnica para todas as etapas de síntese emfase sólida. NMP é um solvente preferido.

Os Fmoc-aminoácidos ou dipeptídeos são depreferência acoplados com 1-3 eq. normais, sendo maispreferível com somente 1-2 eq. de tal reagente de Fmoc-aminoácido por eq. de função amino reativa ligada a fasesólida, pelo teste de Kaiser, por exemplo. A temperatura deacoplamento é geralmente de 15 a 30°C, especialmente quandose usam os reagentes de acoplamento do tipo fosfônico ouurônico. Tipicamente é aplicada para o acoplamento umatemperatura de aproximadamente 20 a 25°C. - É uma vantagemda presente invenção ter desenvolvido um método de sínteseque permite um rendimento grande de produto ou um excelentegrau de pureza do produto GLP-I sem se ser forçado a usarreagentes dispendiosos e que apresentam risco biológico emquantidade excessiva, desperdiçando essencialmente a maiorparte daquele excesso nos efluentes de reação.

Os grupos protetores e seu uso, principalmente paraa proteção das cadeias secundárias de aminoácidos ou gruposamino de terminal Na, são conhecidos nas técnicas (vejaBodanzsky, acima). Os grupos protetores de carbóxiempregados habitualmente para Glu, Asp são, por exemplo,Mpe, O-l-adamantila, O-benzila, podendo até mesmo serusados simplesmente ésteres alquílicos, embora não sejamhabitualmente usados. Para facilitar, tipicamente e depreferência são usados os grupos terc-butila. A tirosinapode ser protegida por diferentes grupos protetores, taiscomo éter terc-butíIico ou ésteres Z, mais preferivelmente,2-bromo-Z ésteres. É também possível se usar gruposprotetores de álcool tritílico tais como os grupos 2-cloro-tritila ou 4-metóxi ou 4,4'-metóxi-tritila. É preferívelque seja um grupo protetor tritila ou um terc-butila. Emais preferível que seja um grupo protetor terc-butila(tBu), significando que a cadeia secundária de tirosila émodificada em um éter terc-butílico. O grupo tBu é somenteeficientemente removido em condições ácidas fortes. O grupoprotetor de arginina pode ser, de preferência, selecionadodo grupo que consiste em 2,2,4,6,7-pentametil-diidro-benzofuranil-5-sulfonila (Pbf), adamantilóxi-carbonila eisobornil-óxi-carbonila, 2,2,5,7,8-pentametileno-cromano-sulfonil-6- sulfonila (Pmc), 4-metóxi-2,3,6-trimetilbenzeno-sulfonila (Mtr) e seu homólogo 4-terc-butil-2,3,5,6-tetrametila (Tart) ou Boc, que são somenteclivados em condições muito ácidas, conforme foi definidoacima. É mais preferível, que ele seja Pbf, Pmc, Mtr, sendoo mais preferível Pbf; depois da desproteção global dascadeias secundárias em condições extremamente ácidas,geralmente em meio aquoso, não é observada uma alquilaçãode espectador de tirosina desprotegida com Pmc, Mtr eespecialmente com Pbf. A taxa de clivagem de Pbf é amáxima. Observe-se a indicação para o modo de proteçãoótimo de pareamento de íons com HOBt. Ser, Thr podem sertipicamente e de preferência protegidas por terc-butila outritila, por exemplo, sendo o mais preferível terc-butila.Outros modos de proteção são igualmente viáveis, como com oemprego de benzila, por exemplo, embora sejam menospreferidos, uma vez que eventualmente exigem a remoçãohidrogenolítica ou uma incubação prolongada em condiçõesextremamente ácidas, ambos igualmente indesejáveis.

Considerações análogas se aplicam à proteção de Lys ou Nor-ou Homo-lisina; Lys é, tipicamente e de preferência,protegida com BOC. Trp deve ser necessariamente protegidadurante a síntese em fase sólida, embora a proteção com BOCseja tipicamente a preferida. No tocante a gruposprotetores de cadeias secundárias, o exposto acima é válidotanto para os L-aminoácidos naturais como para os seushomólogos D.

Deve ficar subentendido que a fase sólida Sconsiste em um material de suporte sólido insolúvel talcomo vidro com o tamanho de poro controlado, sílica e maishabitualmente uma resina orgânica polimérica tal como, porexemplo, a clássica resina de poliestireno-divinilbenzeno(resina PS) usada por Merrifield juntamente com porçõeslinker integrais de hidróxi-benzil-fenila para ligar opeptídeo a ela ou resina PS usada por Wang com porçõeshidróxi-benzil-p-benzilóxi diretamente ligadas à resina.

Tais sítios funcionais para a ligação do peptídeo sãodenominadas linkers dentro do contexto da presenteinvenção, e deve ficar subentendido como uma característicaobrigatória, pelo termo "fase sólida" dentro do contexto dapresente invenção. Se houver necessidade, outras porçõeslinkers mais especializados, mais instáveis a ácido, porexemplo, podem ser ainda enxertados nos primeiros linkersintegrais na fase sólida pré-preparada e é entãofreqüentemente denominado um "cabo" na técnica. Outrosexemplos de compósitos de linker-resina ou de cabo-resinasão (4-metoxifenil)-aminometil ou -hidroximetil e fasessólidas de (4-metilfenil)-aminometil ou -hidroximetil-PS(Atkinson et al. , 2000, J. Org. Chem. 65, 5048) em 0 ou naligação N à fração peptideo, respectivamente, permitindotanto a geração de ácido de terminal C ou grupo carboxamidadepois da clivagem final do peptideo da resina. Para osfins da presente invenção, uma resina em fase sólida, parase usada em síntese, compreende obrigatoriamente pelo menosum linker ou cabo integral que é parte do material donúcleo de fase sólida; tal linker ou cabo pode serconsiderado como um grupo protetor imobilizado (Guillier etal., Chem. Rev. 100, 2091-2157, 2000). Tipicamente, umafase sólida dada compreendendo um suporte sólido inerte ouresina é selecionada devido à natureza química do seu grupolinker ou cabo permitindo a acilação com o aminoácido oupeptideo.

Resinas de poliestireno enxertadas com PDG maiscomplexas tais como Novasyn TG à base de tentagel(Novabiochem, Merck Biosciences, Alemanha), que sãodisponíveis com diferentes cabos ou linkers enxertados, sãomais anfí filas do que a resina de PS padrão e por estemotivo tem efeito sobre a eficiência da síntese. Dentro docontexto da presente invenção, é preferido o uso de umafase sólida constituída por uma fração linker ou cabo e umaresina PS que é desprovida de PEG ou de outros segmentospolioxialquileno. Resinas de polioxialquileno ou PEGintegrais ou enxertadas e, portanto, em fase sólida sãomenos preferidas e não são, de preferência, reivindicadaspela presente invenção.

As resinas usadas na presente invenção são detamanho de malha padrão (Instituto de pesos e medidas dosEstados unidos) que é de malha 50-500, sendo maispreferível de malha 100 a 400.

É possível se usar linkers fotocliváveis tais como,por exemplo, um linker fotoclivável que gera carboxamidadescrito em Holmes et al. , 1995, J. Org. Chem. 60, 2318).Em uma outra modalidade preferida, as fases sólidas dapresente invenção permitem a clivagem do peptídeo de umafase sólida em condições extremamente ácidas. Pordefinição, de acordo com a presente invenção, uma condiçãoextremamente ácida como oposta a uma condição levementeácida significa que se aplica pelo menos 50% (v/v) de ácidotrifluoracético (TFA) no solvente. Além disso, por outrolado, um grupo protetor que necessitar de condiçõesextremamente ácidas para a remoção é um grupo protetor quepode ser removido, no mínimo, por TFA a 8 0%.Conseqüentemente, os grupos protetores que necessitam deácidos ainda mais fortes tais como HF não entram nadefinição mencionada acima dentro do contexto da presenteinvenção. Uma condição levemente ácida é definida comosendo de 0,01% (v/v) a < 50% de TFA, de preferência sendode 0,1% a 30% de TFA. O termo "instável a ácido" se referea uma clivagem essencialmente quantitativa em TFA a 2-10%em diclorometano à temperatura ambiente durante pelo menosuma hora.

Dentro do contexto específico da presente invenção,os peptídeos GLP-I especificados acima clivados da fasesólida e tendo sido prática ou completamente desprotegidosresultam em soluções espumosas, em forma de gel, com amaioria das soluções ou misturas de solventes habitualmenteempregado. O manuseio de tais soluções em forma de gelfacilmente resulta em perdas consideráveis de material,especialmente juntamente com operações de filtração para aseparação da fase sólida. Em uma modalidade preferida, afase sólida é uma fase sólida que é clivável do peptídeoainda protegido em condições levemente ácidas conformedefinido acima, usando fase sólida instável em ácido, emtal modalidade, primeiro o peptídeo é clivado da fasesólida e em seguida em uma segunda etapa as cadeiassecundárias são desprotegidas em condições extremamenteácidas conforme definido acima.

Em uma modalidade preferida ainda, os peptídeosGLP-I são liberados da resina em forma de uma carboxamidade terminal C. Exemplos de tais resinas que geramcarboxamida são, por exemplo, resina PAL (éster do ácido 5-(4-amino-metil-3,5-diidroxifenóxi)valérico), resina Sieber(Sieber, P. 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2107) ou resinas dotipo de xantenilamida relacionada (patente U.S. No. 5 306562, por exemplo), resina de amida Rink (Rink, H. 1987,Tetrahedron Lett. 28:3787), resina BAL (éster do ácido 4-(4-formil-3,5-dimetoxifenóxi)-butírico, Tetrahedron Lett.43:3543), usando-se, de preferência, uma resina que geracarboximida instável a ácido, tal como, por exemplo, aresina Sieber ou outra resina do tipo de xantenilamida ouresina BAL, que constituem também as modalidades maispreferidas.

Em uma outra modalidade preferida, a fase sólida éuma fase sólida instável ao ácido que está liberando umácido carboxílico de terminal C depois da clivagem dopeptideo protegido de uma fase sólida. Os dois exemplos eoutras modalidades preferidas de tais são resinas de 2'-cloro-tritila, 4-metóxi ou 4,4'-dimetóxi-tritila, 4-metiltritila ou resinas relacionadas, mas diferentes de 2-(4- hidróxi-fenil)-2,2-difenil-acetila derivável de umaresina amino- ou hidróxi-funcionalizada por acilação comlinker de 4-carboxitritila da Bayer, e vendida, porexemplo, com a marca de resina Novasyn TG. Outros exemplossão resina de ácido de Rink instável a ácido (4-(2',4'-dimetoxifenil-hidroximetil)fenóxi, Rink et al. , 1987,Tetrahedron Lett. 28,3787) e resina HMPB (Sieber et al. ,1987, Tetrahedron Lett. 28, 6147; HMPB: 4-hidroximetil-3-metóxi-fenóxi-butirila, geralmente acoplada em forma de umcabo secundário a uma resina de amida Rink ou a um derivadoseu.

O mais preferível é que o peptideo de acordo com apresente invenção seja acoplado no terminal carbóxi àresina ou ao cabo da resina (S = fase sólida ou resinaopcionalmente resina com cabo).

São ainda preferidas seqüências peptídicasespecíficas e conjugados respectivos de peptideo-fasesólida conforme relacionados abaixo,7 sozinhos ou emcombinação com outras modalidades preferidas acima.

1. A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-S ou A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-

Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-

Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2

2. A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-

Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-S ou A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH ou -NH2

3. A-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-

Leu-Val-Lys-Gly-Gly-S ou A-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-OH ou -NH2

4. A-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-

Val-Lys-Gly-Arg-Lys-S ou A-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-

Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-

Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-NH2

5. A-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-

Lys-NorVal-Arg-S ou A-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-NorVal-Arg-NH2 sendo NorVal Nor-l-valina que éo ácido α-amino-isobutxrico ou α-metilalanina, a que serefere habitualmente pelo acrônimo abreviado Aib.

Experimentos

Exemplo 1: Síntese de H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH empregando-se Fmoc-Val-Ser (VtetltePro)-OHO peptídeo acima foi obtido por síntese Fmoclinear. Todos os aminoácidos acoplados eram Fmoc-monoaminoácidos disponíveis no comércio, exceto por umaetapa de acoplamento em que o dipeptídeo de pseudoprolinaFmoc-Val-Ser (TirweiwePro)-OH (obtido de Merck BiosciencesGmbH, Schwalbach/Alemanha, produtos da marca Novabiochem)foi acoplado à seqüência de terminal N Ser-Tyr-Leu-Glu-, nodecorrer da síntese. Uma outra exceção, o último resíduo deHis estava acoplado em forma de um resíduo de BOC-His;nenhuma proteção foi conferida à cadeia secundária de His.

Os grupos protetores de cadeias secundárias empregados;para facilitar a listagem, o uso de proteção por Fmoc determinal N não é mais mencionado: Arg(Pbf), Asp(tbu),Gln(Trt), Glu(tbu), Lys(Boc), Ser(tbu), Thr(tbu), Trp(Boc),Tyr(tbu).

A síntese na escala de 3 mmol começou sobre umaresina Fmoc-Gly-2-clorotritil-poliestireno (isto é, resina2-CTC pré-carregada com Fmoc-glicina, número de encomendaRAA-103 9, Carregamento: > 0,5 mmol/mL, malha 100-200,obtida de CBL-Patras, Grécia). Inicialmente foi inflada comdiclorometano. Síntese Fmoc Padrão usando 2 a 2,5 eq. deFmoc-aminoácidos para acoplamento, empregando ativação deaminoácidos por HBTU a 25°C durante 30 minutos na presençade diisopropilamina/HOBt em sistema de solventesdiclorometano-N-metilmorfolina (DCM:NMP = 1:3). Nenhumapré-ativação foi conduzida mas todos os reagentes foramsimplesmente misturados em uma única etapa. A desproteçãode Fmoc foi obtida por de piperidina a 20% (peso/peso) emNMP lavando-se em seguida com NMP para removercompletamente a base reagente. A eficiência da lavagem foiavaliada por teste com cloranil; a lavagem foi repetida aténão poder ser mais detectada a coloração azul antes doacoplamento. Todos os acoplamentos foram bem-sucedidos enão houve necessidade de re-acoplamento, exceto peloterminal BOC-His, provavelmente devido a problema desolubilidade em DCM que poderia ter sido reduzido caso seacrescentasse uma pequena quantidade de DMSO como um co-solvente. A eficiência de acoplamento poderia ainda sermoderadamente melhorada com o uso de Fmoc-Gln com a cadeiasecundária não protegida em vez de Fmoc-Gln(Trt) para aposição Gln-17.

Em uma primeira etapa, o peptídeo ainda protegidopor BOC foi clivado da resina em TFA a 2% em DCM a O0Cdurante pelo menos 10-30 minutos; três ciclos de 15 minutosrepetidos com TFA mostraram funcionar melhor, cada um delesseguido por tratamento com piridina e enxágüe. Usou-se comocoletor trietilsilano (TES) a 1% (peso/peso). A reação foiagitada borbulhando-se nitrogênio. Depois da clivagem, TFAfoi neutralizado usando-se piridina, vertendo-se a soluçãode reação em piridina diluída (piridina/etanol a 1:9(v/v) ) . A resina é enxaguada com DCM e o solvente éextraído por filtração. Uma troca de solvente do filtradode DCM para etanol foi feita destilando-se fora o DCM avácuo e finalmente fazendo o peptídeo protegido seprecipitar por adição de água e f iltrando-se. 0 bolo foilavado três vezes com água e o peptídeo foi secado a vácuoà temperatura ambiente. Neste estágio, foi obtido materialcom uma pureza de aproximadamente 77,3% da área (conformeavaliado por HPLC) chegando a um rendimento de 77%. A massamolecular observada com HPLC-MS correspondia à massateoricamente esperada. A solubilidade deste produto emsolvente padrão tal como DCM foi perfeita.

Em uma segunda etapa, a desproteção global foiconduzida em DCM diluído com um coquetel de clivagem('CC'), DCM: 4CC' = 1:10 (v/v). Para o peptídeo GLP-I, emvez de DCM puro, a adição de 0,1 a 1 parte de triflúor-etanol por parte de DCM puro foi considerada ótima paraotimizar a solubilidade do peptídeo durante a desproteção.iCC' foi preparada a partir de TFA/tioanisol/fenol/água/TESem uma proporção de mistura (% peso/peso) de:89:2,5:2,5:5,0:1,0. O produto seco proveniente da etapa declivagem precedente foi dissolvido em 10 mL de DCM diluídoconforme acima com iCC' e agitado durante 5 horas àtemperatura ambiente. O produto foi então recuperadoadicionando-se 50 mL de éter metil-terc-butílico (MTBE,Fluka Chemie, Buchs/Suíça), resfriando-se a reação até 0°Cem um banho-maria durante 3 0 minutos, agitando-se efiltrando-se em seguida o precipitado sal que tinha seformado. O bolo do filtro é enxaguado com MTBE diversasvezes, sendo então secado à temperatura ambiente,resultando em 0,8 g de um produto bruto com uma pureza deaproximadamente 95% conforme determinada por HPLC. Orendimento total do conjunto das etapas 2 e 3 foi deaproximadamente 75%.

Exemplo 2: Exemplo comparativo - síntese dofragmento H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-OH (fragmento 1 a 16) de terminal N naausência de pseudoprolina

Inicialmente a síntese em fase sólida do pequenofragmento foi conduzida essencialmente conforme foidescrito no Exemplo 1, exceto que somente foi destacado umfragmento mais curto para ser sintetizado. Usando-se 2,5 a3 eq. de aminoácido para cada reação de acoplamento, osaminoácidos 15 a 9 foram todos acoplados facilmente. Noentanto os seguintes Fmoc-aminoácidos 8 a 1 apresentaramgraves problemas. Somente em duas posições, o acoplamentoprocedeu com uma facilidade análoga. Todas as demaisposições exigiram pelo menos dois ciclos repetidos deacoplamento, mas mesmo assim não produziram rendimentossatisfatórios com uma pureza acima de 30%. Para se avaliara gravidade do problema e não se levando em conta o aspectodo conhecimento geral de uma excessiva racemização, asimples abordagem de acoplamento forçado usou 4 eq. deaminoácido, aumentou a temperatura, pelo menos durante oacoplamento dos aminoácidos mais habitualmente menospropensos a racemização, a 30 a 40°C, e usou 6-Cl-HOBt queé mais ativo. NO entanto, mesmo assim foram necessários re-acoplamentos estáveis e não pôde ser observado nenhummelhoramento significativo da eficiência de acoplamentopropriamente dita. A clivagem da resina procedeu em umaprimeira etapa conforme descrito no exemplo 1 em TFA a 2%,exceto que o fragmento provou ter um comportamento desolubilidade muito específico. 0 fragmento protegido nãoclivado formou um gel depois da adição de piridina.

Conseqüentemente, a piridina precisou ser acrescentadadepois da etapa de filtração ao filtrado somente;constatou-se que a destilação de DCM era muito difícil poiso gel estava espumando, deixando partículas sólidas portoda parte e reduzindo drasticamente o rendimento. Depoisque se acrescentou água, formou-se um sólido que não pôdeser isolado. No entanto, em seguida, a solubilização doproduto sólido novamente provou ser difícil. O fragmentoprotegido é predominantemente insolúvel em DCM, THF,acetonitrila e suas misturas. A adição de LiCl em THF nãomelhorou a solubilidade. O peptídeo provou ser ligeiramentesolúvel em NMP, DMF ou DMSO, resultando em uma aparênciasemelhante a gel a concentrações mais razoáveis, eobrigando assim a se trabalhar em solução extremamentediluída, o que foi considerado subótimo para o rendimento.

Claims

1. Método de preparação de um peptídeo agonista deGLP-I ou GLP-1, em que o peptídeo é da fórmula A-(Rl)X-(R2) y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)Z-BOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-BOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-BOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Bou é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-He-Ala-Trp-Leu-Val-R4-BOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-He-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-BEm queB = -OH ou -NH2-A=H-, Ac-, Boc-, Fmoc-Rl = His, D-His, desamino-histidina, 2-amino-histidina, {3-hidróxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluormetil-histidina ou alfa-metil-histidinaR2 = -Ala, D-Ala, -Vai, D-Val, Gly, Aib (ácido a-aminoisobutírico)R3 = Glu, Asp, Met, Leu, é, de preferência, Glu ouAsp, sendo mais preferível AspR4 = -Lys ou Arg R5 = -Gly,Aib, Ala, D-AlaR6 = Arg, Lys ou GlyR7 = Arg, Lys ou Gly, de preferência Lys ou GlyR8 = Gly ou Aibe em que x, y, w, ζ são, independentemente, O ou 1,desde que y = 1 quando χ = 1 e desde que w = 1 quando ζ =-1, e em que ainda aminoácidos individuais podem portargrupos protetores,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas dea. síntese do peptídeo em uma fase sólida poracoplamento gradual de aminoácidos ou dipeptídeoscompreendendo dipeptídeos de pseudoprolina protegidos porFmoc, opcionalmente ainda com as cadeias secundáriasadequadamente protegidas, de um modo linear, desde que naposição específica de seqüência adequada um primeirodipeptídeo de pseudoprolina selecionado do grupo queconsiste em Fmoc-Val-Ser (^'^pro)-OH, Fmoc-Val-Ser (nrH'Hpro) -OH, Fmoc-Ser (P) -Ser (y^^pro) -OH e Fmoc-Ser (P) -Ser (yH'Hpro)-OH, em que P um grupo protetor clivável porácido que é clivado em condições muito ácidas de pelo menos80% de TFA em água, sendo P de preferência terc-butila outritila,seja acoplado à cadeia peptídica em crescimentob. clivagem do peptídeo a partir de fase sólida eopcionalmente desproteção da cadeia peptídica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que, pelo menos um resíduo deglicidila que pode ainda estar acoplado em forma de umFmoc-resíduo de glicidila ou em forma de um Fmoc-resíduo deaminoacilglicidila tem ainda o N protegido na sua estruturaNa com N-(o,p-dialcóxi-benzila) ou com N-(o-hidróxi-p-alcóxi-benzila) ou com N-(o-acilóxi-p-alcóxi-benzila) ,sendo o acilóxi e alcóxi, independentemente, alcóxi C1-C4 eacilóxi Ci-C4, respectivamente, desde que o resíduo deglicidila não esteja compreendido em uma seqüência -Gly-Thr (Tjrwe'Mepro) - ou -Gly-Thr (iyH'Hpro) - e esteja espaçado, depelo menos dois resíduos de aminoácidos intercalados, deuma outra pseudoprolina ou do resíduo de glicidila com Naprotegido.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que são usados dois dipeptídeosde pseudoprolina, sendo o segundo afastado do primeiro depelo menos quatro aminoácidos intercalados e sendo, depreferência, Fmoc-Gly-Thr (ye,Mepro) -OH.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que somente uma unidadedipeptídeo de pseudoprolina é usada na síntese, que depreferência seja usado Fmoc-Val-Ser (y"e,Mepro) -OH para oacoplamento à cadeia peptídica em crescimento.

5. Peptídeo GLP-I ou de agonista de GLP-I conjugadoa fase sólida, CARACTERIZADO pelo fato de que é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-SOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-SOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-SOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-R4-SOu é da fórmulaA-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-Sem queS= fase sólida ligada covalentemente no terminal Cà fração peptidila por meio de um grupo tioéster, éster ouamido ou opcionalmente covalentemente, no caso em que oaminoácido de terminal C é uma lisina, por meio da fraçãoε-amino da lisina,A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc-Rl = His, D-His, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidróxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluormetil-histidina ou alfa-metil-histidinaR2 = -Ala, D-Ala, -Vai, D-Val, Gly, Aib (ácido a-aminoisobutírico)R3 = Glu, Asp, Met, Leu, de preferência, Glu ouAsp, sendo Asp o mais preferível.R4 = -Lys ou ArgR5 = -Gly, Aib, Ala, D-AlaR6 = Arg, Lys ou GlyR7 = Arg, Lys ou Gly, de preferência Lys ou GlyR8 = Gly ou AibE em que, x,y,w,z são, independentemente, O ou 1,desde que y = 1 quando χ = 1 e desde que w = 1 quando ζ =-1, portando as cadeias secundárias individuais de pelomenos Lys, Thrf Ser, Glu, Asp grupos protetores, depreferência cliváveis por ácido, não instáveis a bases,podendo os grupos protetores ser grupos protetores depseudoprolina no caso de Thr ou Ser, e sendo um Ser nosegmento de seqüência específico -Val-Ser-Ser um derivadopseudoprolina-oxazolidina de serina, de preferênciaselecionado do grupo que consiste em - Ser (T|rMe,Mepro) - ou -Ser (TjrH,Hpro).

6. Peptideo conjugado a fase sólida, de acordo coma reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que aSer (ijrpro) -pseudoprolina é o único resíduo com pseudoprolinaprotegida no peptídeo

7. Peptídeo conjugado a fase sólida, de acordo coma reivindicação 5, CARACTERI ZADO pelo fato de quecompreende pelo menos um segundo resíduo com pseudoprolinaprotegida que é -Thr (Vwe,Mepro) - ou é Thr (ijrH'Hpro) - e estálocalizado no segmento de seqüência específica -Gly-Thr-,sendo preferível que o peptídeo compreenda somente doisresíduos com a pseudoprolina protegida que são o primeiro eo segundo resíduos de pseudoprolina.