CN102414220A - 使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成 - Google Patents

使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成 Download PDF

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CN102414220A CN2010800192548A CN201080019254A CN102414220A CN 102414220 A CN102414220 A CN 102414220A CN 2010800192548 A CN2010800192548 A CN 2010800192548A CN 201080019254 A CN201080019254 A CN 201080019254A CN 102414220 A CN102414220 A CN 102414220A
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陈林
韩渊奎
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F Hoffmann La Roche AG
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract

本发明涉及利用固相和液相(“杂合”)方法进行的促胰岛素肽的制备，所述促胰岛素肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2其中Z是H-，并且X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。通常，所述方法包括利用固相化学合成三种不同的肽中间体片段。然后，利用液相化学将第二片段与第一片段偶联。备选地，将不同的第二片段与固相中的第一片段偶联。接着，利用液相化学添加第三片段，由此将第三片段偶联到在液相中的偶联的第一和第二片段上。

Description

使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成
本发明涉及利用固相和液相方法制备促胰岛素肽、特别是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其负体的方法。本发明还涉及可以用在这些方法中的中间体肽片段。
在文献中描述了很多肽合成方法(例如，参见美国专利号6,015,881；Mergler等.(1988)四面体通讯(Tetrahedron Letters)29：4005-4008；Mergler等.(1988)四面体通讯(Tetrahedron Letters)29：4009-4012；Kamber等.(编)，肽、化学和生物学(Peptides，Chemistry and Biology)，ESCOM，Leiden(1992)525-526；Riniker等.(1993)四面体通讯(Tetrahedron Letters)49：9307-9320；Lloyd-Williams等.(1993)四面体通讯(Tetrahedron Letters)49：11065-11133；和Andersson等.(2000)生物聚合物(Biopolymers)55：227-250)。许多合成方法以所述合成在其中发生的相的物理状态(即液相或固相)进行区分。
在固相肽合成(SPPS)中，将氨基酸或肽基团结合到固体支持物树脂上。然后，将连续的氨基酸或肽基团附着到结合在支持物上的肽上，直到形成目的肽物质。然后结合在支持物上的肽典型地被从所述支持物上裂解，并且进行进一步的加工和/或纯化。在一些情形中，固相合成产生成熟的肽产物；在另一些情形中，从所述支持物上裂解下的肽(即，“肽中间体片段”)用于制备更大的、成熟的肽产物。
由固相方法生成的肽中间体片段可以在固相或在液相合成过程(本文叫作“液相合成”)中偶联在一起。液相合成可以特别有效地用于通过固相合成有用的成熟肽是不可能的或不实际的情形中。例如，在固相合成中，更长的肽尽管仍然附着在固体支持物上，但是最终可能采取不规则的构象，使得很难将其它的氨基酸或肽物质添加到延长的链上。由于肽链在支持物树脂上变得更长，加工步骤诸如偶联和去保护的效率可能受到损害。除了起始材料如活化的氨基酸、辅助试剂和溶剂的增加的损失之外，这又可能导致更长的加工时间来弥补这些问题。这些问题可能随着肽长度的增加而增加。
因此，仅利用固相方法，发现以单一片段合成长度大于30个氨基酸的成熟的肽相对是不常见的。相反，可以在固相上分开合成个体片段，然后在固相和/或液相中偶联，以构建需要的肽产物。这种方法需要仔细选择片段候选物。尽管一些通用原理可以指导片段选择，但是通常非常需要凭经验检测片段候选物。在一种情形中作用的片段策略可能在其它情形中不起作用。甚至在不包括合理的片段候选物时，对于合成策略仍然可能需要加工创新，以在商业合理条件下起作用。因此，利用杂合方案的肽合成通常是具有挑战性的，并且在许多情形中，在进行实际合成之前很难预测在合成方案中固有什么样的问题。
在液相偶联中，两种肽中间体片段、或肽中间体片段和活性氨基酸在适当的溶剂中偶联，通常在促进偶联反应的效率和质量的其它试剂的存在下进行偶联。所述肽中间体片段是反应性排列的，因此一个片段的N端偶联到另一个片段的C端，或者反之亦然。另外，在液相偶联过程中，在固相合成过程中存在的侧链保护基通常保留在所述片段上，以确保所述片段末端的特异性反应性。这些侧链保护基典型地直到形成成熟的肽之后才去除。
在综合合成方案中的一个步骤或多个步骤中的适度改进可以汇集成制备成熟的肽中的显著的改进。这样的改进可以导致时间和试剂的更大、全面的节约，并且还可以显著提高终产物的纯度和产量。
尽管关于在杂合合成中的改进的重要性的讨论适用于利用这些方法生产的任何种类的肽，但是在治疗有用性的肽和以商业医药用途规模制造的肽的情形中特别重要。合成更大的生物分子药物，诸如治疗性肽，可能是非常昂贵的。由于试剂的成本、合成时间、许多合成步骤，连同其它因素，在这些更大的生物分子药剂的合成过程中的很小的改进可能对于生产这样的药剂是否甚至是经济可行的具有显著影响。这样的改进是必需的，原因在于对于更大的生物分子药剂的这些高生产成本，这是得到这样的事实的支持的，即，在许多情形中，对于这些类型的更大的生物分子药剂，存在很少(如果有一些的话)适当的治疗性备选物。
这在胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其负体的情形中可以清楚的看出。这些肽已经作为可能的治疗剂参与治疗2型非胰岛素依赖型糖尿病(type2 non-insulin-dependent diabetes mellitus)以及相关的代谢病症，诸如肥胖症(obesity)。Gutniak，M.K.，等，糖尿病护理(Diabetes Care)1994：17：1039-44。
Lopez等确定天然的GLP-1长度是37个氨基酸残基。Lopez，L.C.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，80：5485-5489(1983)。这一确定得到Uttenthal，L.O.，等，临床内分泌学和代谢学杂志(J.Clin.Endocrinal.Metabol.)，61：472-479(1985)的工作的证实。天然GLP-1可以由符号GLP-1(1-37)表示。这一符号表示所述肽具有从1(N端)到37(C端)的全部氨基酸。天然的GLP-1(1-37)具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列：
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
已经报道天然GLP-1(1-37)通常不能调控胰岛素的生物合成，但是该肽的生物学重要的片段确实具有促胰岛素特征。例如，SEQ ID NO.2所述的长度为31个氨基酸的天然肽GLP-1(7-37)：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
是促胰岛素的，并且具有天然GLP-1的7(N-端)-37(C-端)的氨基酸。GLP-1(7-37)具有末端甘氨酸。当这个甘氨酸不存在时，得到的肽仍然是促胰岛素活性的，并且叫作GLP-1(7-36)，其为SEQ ID NO.3：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR
GLP-1(7-36)通常以C端精氨酸为酰胺化形式存在，并且这种形式可以由符号GLP-1(7-36)-NH2表示。
SEQ ID NO.1-3所述的天然GLP-1(1-37)及其天然的、促胰岛素活性的负体是代谢不稳定的，在体内仅具有1-2分钟的血浆半衰期。外源施用的GLP-1也是快速降解的。这种代谢不稳定性已经限制了天然GLP-1及其天然片段的治疗性潜力。
已经开发了具有提高的稳定性的GLP-1肽的合成负体。例如，在EP1137667B1中描述了SEQ ID NO.4的肽：
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
除了在位置8和35出现α-氨基异丁酸(示意性表示为缩写Aib)的非手性残基取代在这些位置的相对应的天然氨基酸之外，该肽与天然GLP-1(7-36)相似。非手性α-氨基异丁酸还叫作甲基丙氨酸。该肽可以表示为式(Aib8，35)GLP-1(7-36)或酰胺化形式(Aib8，35)GLP-1-(7-36)-NH2。
EP 1137667B1陈述SEQ ID NO.4的肽及其负体可以利用固相技术构建为单一片段。由EP 1137667B1提出的单一片段合成方法是有问题的。如上述，为了能够以商业接受的产量、纯度和数量制造该肽及其负体，需要用于合成SEQ ID NO.4的肽的改进的策略。
本申请涉及利用固相和液相(“杂合”)方法合成的促胰岛素肽的制备。在一种方法中，所述方法包括利用固相化学原理合成三个不同的肽中间体片段。然后，利用液相化学原理将额外的氨基酸物质添加到一个片段上。然后，将所述片段在液相中偶联在一起。本发明非常有效地用于制成促胰岛素肽如GLP-1、GLP-1(7-36)以及这些的天然的和非天然的负体，特别是GLP-1(7-36)以及它的天然的和非天然的负体。
特别地，本申请提供制备去保护的促胰岛素肽的方法，所述去保护的促胰岛素肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO.9)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基，
所述方法选自下述的方法。
本申请提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.5)
Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.6)
Z-SYLEG
其中
Z是N-端保护基；和
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
d)去除第三肽片段的N-端保护基，以提供第四肽片段，所述第四肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
e)提供第五肽片段，所述第五肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供促胰岛素肽，所述促胰岛素肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO.9)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤：
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
本申请提供上述方法，其中由步骤h)产生的所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR
本申请还提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.6)
Z-SYLEG-B’
其中
B’是固相树脂；
Z是H-；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
c)将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.11)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEG-B’
其中
B’是固相树脂；
Z是N-端保护基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.11)的第四肽片段：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEG-B’
其中
B’是-OH；
Z是N-端保护基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.5)
Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤：
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2
本申请还提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.12)
Z-SYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-；并且
B’是固相树脂；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
c)将第二肽片段与第一肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.13)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKE-B’
其中
Z是N-端保护基；
B’是固相树脂；
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤：
d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.13)的第四肽片段：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-；
B’是-OH；
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.14)
Z-FIAWLVKX35R-NH2
其中
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2
本申请还提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.14)
Z-FIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.12)
Z-SYLEGQAAKE-B’
其中
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ.ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤：
d)将第三肽片段的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ.ID NO.7)的第四肽片段：
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
h)将由步骤h)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID No.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.5)
Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是H-或N-端保护基；
B’是-OH或固相树脂；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.11)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEG-B’
其中
B’是-OH或固相树脂；
Z是H-或N-端保护基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.12)
Z-SYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-或N-端保护基；并且
B’是-OH或固相树脂。
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.13)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-或N-端保护基；
B’是-OH或固相树脂；
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ.ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ.ID NO.14)
Z-FIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
本申请还提供上述肽的任一种，其中Z是Fmoc。
“N-端保护基”意指选自由下列各项组成的组的基团：
Bz(苯甲酰基)，Ac(乙酰基)，Trt(三苯甲基)Boc(叔丁氧基羰基)，CBz(苄氧基羰基或Z)，Dts(dithiasuccinoyl)，Rdtc(R＝烷基或芳基，dtc＝二硫代氨基甲酸盐)，DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)，Alloc(烯丙氧基羰基)，pNZ(对硝基苄氧基羰基)，Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]-乙氧基]羰基])，Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)，MBz(4-甲氧基CBz)，Poc(2-苯基丙基(2)-氧基羰基)，Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)-乙氧基]羰基]，CBz[(苯基甲氧基)羰基]，Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]。优选的N-端保护基为Fmoc，Bpoc，Trt，Poc和Boc。
在一个方面，上述任一种方法可以利用选自由下列各项组成的组的N-端组氨酸保护基(N-端保护基)：Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)，Boc(叔丁氧基羰基)，CBz(苄氧基羰基或Z)，Dts(dithiasuccinoyl)，Rdtc(R＝烷基或芳基，dtc＝二硫代氨基甲酸盐)，DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)，Alloc(烯丙氧基羰基)，pNZ(对硝基苄氧基羰基)，Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基])，Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)，MBz(4-甲氧基CBz)，Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]-羰基]，CBz[(苯基甲氧基)羰基]，Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]，其中如果可以使用酸在完全侧链去保护步骤中去除N-端组氨酸保护基，则不需要先去除N-端组氨酸保护基。
“非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基”是这样的氨基酸，其可以衍生自天然的非手性甘氨酸或另外的非手性氨基酸。优选地，所述非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基选自由下列各项组成的组：甘氨酸(G)、2-甲基丙氨酸(Aib)和2-苯甲基-苯丙氨酸。最优选地，所述非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基选自G或Aib。
本发明针对利用固相和/或液相技术制备肽如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)以及它的天然和非天然的促胰岛素活性负体的合成方法。本发明的肽分子可以是被保护的、未被保护的、或部分保护的。保护可以包括N端保护，侧链保护，和/或C端保护。尽管本发明通常针对这些胰高血糖素样肽、它们的负体、片段以及它们的负体、和融合产物以及它们的这些的负体的合成，但是本发明的创造性教导还可以适用于合成其它肽，特别是利用固相和液相方法的组合合成的那些。本发明还适用于合成与杂质特别是与焦谷氨酸杂质缔合的肽中间体片段。用于实施本发明的优选的GLP-1分子包括天然的和非天然的GLP-1(7-36)以及它们的负体。
当用于本文时，术语“包含氨基酸序列”优选地意指“具有氨基酸序列”。
当用于本文时，“负体”是指肽的天然的和非天然的类似物、衍生物、融合化合物、盐等。当用于本文时，肽类似物通常是指相对于另一种肽或肽负体具有修饰的氨基酸序列的肽，诸如通过一个或多个氨基酸取代、缺失、翻转、和/或添加而进行的修饰。取代可以包括一个或多个天然的或非天然的氨基酸。取代优选地可以是保守的或高度保守的。保守取代是指用通常具有相同的净电荷和通常相同的大小和形状的另一种氨基酸取代氨基酸。例如，当在它们的侧链中的碳和杂原子总数的差别不多于约4个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有近似相同的大小。当在它们侧链中的分支数目的差别不多于约一个或两个时，它们具有近似相同的形状。认为在它们的侧链中具有苯基或取代的苯基的氨基酸具有大约相同的大小和形状。以下列出的是5组氨基酸。用同一组的另一种氨基酸取代化合物中的氨基酸通常导致保守取代。
组I：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链的(直链或单分支的)非天然存在的氨基酸。
组II：谷氨酸，天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。
组III：赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。
组IV：谷氨酰胺，天冬酰胺，和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。
组V：苯丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。
当用于本文时，术语“负体”更优选地是指肽的盐，或指它的在C端酰胺化的衍生物。
“高度保守的取代”是用在侧链上具有相同的官能团并且大小和形状几乎相同的另一种氨基酸取代氨基酸。当在它们侧链中的碳和杂原子的总数的差别不多于2个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有几乎相同的大小。当它们在它们的侧链中具有相同数目的分支时，它们具有几乎相同的形状。高度保守的取代的实例包括缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，和苯基甘氨酸取代苯丙氨酸。
“肽衍生物”通常是指具有其侧链基团、α碳原子、末端氨基、和/或末端羧酸基中的一个或多个的化学修饰的肽、肽类似物、或其它肽负体。例如，化学修饰包括，但不限于，添加化学结构部分，生成新的键，和/或去除化学结构部分。在氨基酸侧链基团的修饰包括，但不限于，赖氨酸e-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括，但不限于，脱氨基，N-低级烷基、N-二-低级烷基、和N-酰基(例如，-CO-低级烷基)修饰。末端羧基的修饰包括，但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺、和低级烷基酯修饰。因此，部分或完全保护的肽组成了肽衍生物。
在本发明的实施中，如果化合物能够刺激、或引起刺激、或辅助引起刺激激素胰岛素的合成或表达，那么该化合物具有“促胰岛素”活性。在优选的实施方式中，促胰岛素活性可以依据在美国专利号6,887,849和6,703,365中所述的测定证明。
在优选的实施方案中，本发明提供用于合成合成的(X8，X35)GLP-1(7-36)肽及其负体的方法，所述(X8，X35)GLP-1(7-36)肽具有下式(SEQ.ID NO.9)：
HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中在位置8和35的符号X的每个独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。X8和/或X35残基中的任一个任选地可以包含侧链保护基。依据该式所述的肽与天然GLP-1(7-36)不同，不同至少在于，所述非手性的、任选地是空间位阻的X8和X35残基取代在位置8和35的天然氨基酸残基。非手性X8和X35氨基酸的应用不但帮助稳定得到的肽，而且现在还发现使用这些氨基酸作为结构单元的接头还有利于如在方案1所示和在下文进一步描述的本发明的合成途径。
可以按照本发明的原理合成的(X8，X35)GLP-1(7-36)肽的特别优选的实施方案包括依据式(SEQ.ID NO.4)：
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2
所述的肽及其负体，其优选地在C端酰胺化(如所示)。该肽使用非手性α-氨基异丁酸残基(示意性表示为缩写Aib)作为X8和X35，优选地在C端具有酰胺，在位置10使用天然G残基，并且可以指定为式(Aib8，35)GLP-1(7-36)-NH2。这种符号表示与氨基酸“Aib”相对应的氨基酸残基出现在位置8和35，取代天然的丙氨酸。非手性α-氨基异丁酸也叫作甲基丙氨酸。SEQ ID NO.4的肽在EP 1137667B1中描述。在位置8和35存在Aib残基减缓了在体内的代谢降解，使得该肽在体内比天然GLP-1(7-36)肽更稳定得多。
本发明提供用于制备GLP-1(7-36)肽如(Aib8，35)GLP-1(7-36)-NH2的改进的方法。例如，方案1和方案2显示用于合成GLP-1(7-36)肽以及它们的负体的示例性方案。据信方案1和方案2特别适用于GLP-1(7-36)肽的按比例增加合成。典型地进行按比例增加的步骤，以提供用于商业销售数量的肽。例如，在按比例增加步骤中的肽的量可以是500g或1kg/批次，并且更典型地数十千克至数百千克/批次或更多。在优选实施方案中，所述创造性方法可以提供这样的改进：减少加工(合成)时间，提高产物产量，提高产物纯度，和/或减少需要的试剂和起始原料的量。
在方案1所示的合成利用固相和液相技术的组合来制备肽产物。
Figure BDA0000104415680000181
如所示，方案1包括在固相上合成肽中间体片段1、2和3。片段1是包含SEQ ID NO.8，即HX8EGTFTSDVS的氨基酸残基的肽，其中X8如上文所定义，或者是其包括X8残基的负体。依据常规实践，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。在一些实施方案中，肽片段1可以通过C端与树脂结合。这一片段任选地可以携带N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有用的N端组氨酸保护基。已经发现Trt(三苯甲基)是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有用的N-端组氨酸保护基。Boc、CBz、DTS、Rdtc(R＝烷基或芳基)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc)、Alloc、pNZ(对硝基苄酯)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基]-)、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、和MBz(4-甲氧基CBz)也是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有用的N-端组氨酸保护基。[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]，[(苯基甲氧基)羰基]，[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的特别有用的N-端组氨酸保护基。
片段1包括与天然GLP-1(7-36)肽的位置7-17的氨基酸相对应的11个氨基酸残基，并且因此可以用符号(X8)GLP-1(7-17)表示。在优选实施方案中，X8是Aib或者是在位置10包括Aib残基的它的负体。SEQ ID NO.8的肽片段可以用符号(Aib8)GLP-1(7-17)表示，以表示用Aib取代天然GLP-1(7-36)位置8的天然丙氨酸。
固相合成通常以片段1的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的S17氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端组氨酸残基(H))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。
片段2是包含SEQ ID NO.6：SYLEG的氨基酸残基的肽片段。
片段2包括通常与天然GLP-1(7-36)肽的位置18-22中的氨基酸残基相对应的氨基酸残基。
依据常规实践，片段2的氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。在一些实施方案中，肽片段2可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段的固相合成的特别有用的N端保护基。SEQ ID NO.6的肽片段可以由符号GLP-1(18-22)表示。
固相合成通常以从片段1的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的G氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端丝氨酸残基(S))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。
片段3′是包括其中X35如上文定义的根据SEQ ID NO.5：QAAKEFIAWLVKX35R所述的氨基酸残基的肽片段，或其负体，或其包括X35残基的负体。依据常规实践，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。除了在位置35是X35替代在该位置的天然氨基酸之外，片段3′包含与天然GLP-1(7-36)肽的位置23-36中的氨基酸相对应的氨基酸残基。片段3可以表示为符号(X35)GLP-1(23-36)。
片段3′便利地由片段3(SEQ ID NO.10)：QAAKEFIAWLVKX35制备。
片段3利用标准偶联方法通过固相合成由Fmoc-Aib35-O-2CT制备。将赖氨酸和色氨酸侧链用Boc保护。将谷氨酸侧链作为叔丁酯(tert-Buester)进行保护，并通过三苯甲基基团保护谷氨酰胺侧链。将片段3由树脂上裂解下来并与H-Arg(2HCl)-NH2偶联。片段3包含与天然GLP-1(7-36)的位置23-35中的氨基酸相对应的氨基酸残基，不同的是X35是Aib。
在一些实施方案中，肽片段3可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带侧链、N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段固相合成的特别有用的N端保护基。在优选的实施方案中，X35是Aib或在位置35包含Aib的它的负体，并且可以由符号(Aib35)GLP-1(23-35)表示，从而注释Aib取代天然GLP-1(7-36)的位置35的天然氨基酸。
由于与负载X35的支持物树脂邻近的空间位阻，将赖氨酸(34)和缬氨酸(33)偶联到肽链上可能是有问题的。即使使用过量的氨基酸，也难以促使这些偶联反应完成。溶剂选择和/或末端-封端可以帮助减轻这一问题。已经发现偶联溶剂的性质可以影响偶联继续完成的程度。在一组试验中，例如，偶联反应以3∶1NMP/DCM，1∶1NMP/DCM，1∶1DMF/DCM，和3∶1DMF/DCM进行。这些溶剂组合中的比例是基于体积计算的。NMP是指N-甲基吡咯烷酮，DCM是指二氯甲烷，和DMF是指二甲基甲酰胺。发现当使用1∶1DMF/DCM时，偶联反应进行得更远至完成。
在赖氨酸和缬氨酸分别偶联后的末端-封端还可以用来防止未反应的树脂-支持的物质在进一步的偶联反应中继续反应。在纯化过程中(如果需要纯化的话)，末端-封端的物质更容易去除。可以利用常规末端-封端技术。
继续参考方案1，组装片段1、2和3’，以完成所需要的肽。
方案1显示将片段2添加到片段3’以产生更大的、结合SEQ ID NO.7：SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2的氨基酸残基的中间体片段，其中X35如上文定义，并且优选地是如上文定义的Aib。该中间体片段可以指定为符号(X35)GLP-1(18-36)。至氨基酸携带侧链保护的程度，需要在该步骤过程中保持这一保护。
方案1进一步显示接着在溶液中将片段1添加到该中间体片段上，以产生所需要的肽(SEQ ID NO.9)：
HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
在备选优选的实施方案中，本发明提供用于合成具有下式(SEQ.IDNO.9)：
HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
的合成(X8，X35)GLP-1(7-36)肽及其负体的方法，其中在位置8和35的符号X的每一个独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。X8和/或X35残基中的任一个任选地可以包含侧链保护基。依据该式所述的肽与天然GLP-1(7-36)不同，不同至少在于，所述非手性的、任选地是空间位阻的X8和X35残基取代在位置8和35的天然氨基酸残基。非手性X8和X35氨基酸的应用不但帮助稳定得到的肽，而且现在还发现使用这些氨基酸作为结构单元还有利于如在方案1所示和在下文进一步描述的本发明容易的合成途径。
可以按照本发明的原理合成的(X8，X35)GLP-11(7-36)肽的特别优选的实施方案包括依据式(SEQ.ID NO.4)：
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2
所述的肽及其负体，其优选地在C端酰胺化(如所示)。该肽使用非手性α-氨基异丁酸残基(示意性表示为缩写Aib)作为X8和X35，优选地在C端具有酰胺，并且可以指定为式(Aib8，35)GLP-1(7-36)-NH2。这种符号表示与氨基酸“Aib”相对应的氨基酸残基出现在位置8和35，取代天然的丙氨酸。非手性α-氨基异丁酸也叫作甲基丙氨酸。SEQ ID NO.4的肽在EP 1137667B1中描述。在位置8和35存在Aib残基减缓了在体内的代谢降解，使得该肽在体内比天然GLP-1(7-36)肽更稳定得多。
在方案2中显示的合成使用固相和液相技术的组合来制备肽产物。
Figure BDA0000104415680000221
如所显示，方案2包括在固相上合成肽中间体片段1和2。片段1是包含SEQ ID NO.8，即HX8EGTFTSDVS的氨基酸残基的肽片段，其中X8如上文所定义，或者是其包括X8残基的负体。依据常规实践，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。在一些实施方案中，肽片段1可以通过C端与树脂结合。这一片段任选地可以携带N端和/或C端保护基。Fmoc是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的有用的N端组氨酸保护基。Trt(三苯甲基)是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的有用的N-端组氨酸保护基。Boc(叔丁氧基羰基)、CBz(苄氧基羰基或Z)、Dts(dithiasuccinoyl)、Rdtc(R＝烷基或芳基，dtc＝二硫代氨基甲酸盐)、DBFmoc(2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)、Alloc(烯丙氧基羰基)、pNZ(对硝基苄氧基羰基)、Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基])、Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)、和MBz(4-甲氧基CBz)也是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的有用的N-端组氨酸保护基。Bpoc[(1-[1，1′-联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，Bnpeoc[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]羰基]，CBz[(苯基甲氧基)羰基]，Aoc[(1，1-二甲基丙氧基)羰基]，和Moz[[(4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]是关于肽片段的固相合成和液相或固相偶联的有用的N-端组氨酸保护基。
片段2a包含与天然GLP-1(7-36)肽的位置18-27中的氨基酸相对应的10个氨基酸残基，并且因此可以由符号GLP-1(18-27)表示，且是SEQ IDNO.12：SYLEGQAAKE的片段。
固相合成通常以从片段2a的C端到N端的方向进行。因此，存在于所述片段的C端部分的E27氨基酸是与固相树脂支持物偶联的第一氨基酸残基。然后，通过以与需要的序列相对应的方式连续添加氨基酸残基而进行固相合成。在N端残基(例如，N端丝氨酸残基(S))已经添加到新生肽链上后，完成肽中间体片段的合成。
片段3’a是包括其中X35如上文定义的根据SEQ ID NO.14：FIAWLVKX35R所述的氨基酸残基的肽片段，或其负体，或其包括X35残基的负体。依据常规实践，所述氨基酸残基中的一个或多个可以包含侧链保护基。除了在位置35是X35替代在该位置的天然氨基酸之外，片段3’a包含与天然GLP-1(7-36)肽的位置28-36中的氨基酸相对应的氨基酸残基。片段3’可以表示为符号(X35)GLP-1(28-36)。片段3′便利地由片段3a(SEQID NO.15)：FIAWLVKX35制备。
片段3a利用标准偶联方法通过固相合成由Fmoc-Aib35-O-2CT制备。将赖氨酸和色氨酸侧链用Boc保护。将谷氨酸侧链作为叔丁酯(tert-Buester)进行保护，并通过三苯甲基基团保护谷氨酰胺侧链。将片段3a由树脂上裂解下来并与H-Arg(2HCl)-NH2偶联。片段3a包含与天然GLP-1(7-36)的位置28-35中的氨基酸相对应的氨基酸残基，不同的是X35是Aib。
在一些实施方案中，肽片段3a可以通过C端与树脂结合。该片段任选地可以携带侧链、N端和/或C端保护基。已经发现Fmoc是关于肽片段固相合成的特别有用的N端保护基。在优选的实施方案中，X35是Aib或在位置35包含Aib的它的负体，并且可以由符号(Aib35)GLP-1(28-35)表示，从而注释Aib取代天然GLP-1(7-35)的位置35的天然氨基酸。
由于与负载X35的支持物树脂邻近的空间位阻，将赖氨酸(34)和缬氨酸(33)偶联到正在增长的肽链上可能是有问题的。即使使用过量的氨基酸，也难以促使这些偶联反应完成。溶剂选择和/或末端-封端可以帮助减轻这一问题。已经发现偶联溶剂的性质可以影响偶联继续完成的程度。在一组试验中，例如，偶联反应以3∶1NMP/DCM，1∶1NMP/DCM，1∶1DMF/DCM，和3∶1DMF/DCM进行。这些溶剂组合中的比例是基于体积计算的。NMP是指N-甲基吡咯烷酮，DCM是指二氯甲烷，和DMF是指二甲基甲酰胺。发现当使用1∶1DMF/DCM时，偶联反应进行得更远至完成。
在赖氨酸和缬氨酸分别偶联后的末端-封端还可以用来防止未反应的树脂-支持的物质在进一步的偶联反应中继续反应。在纯化过程中(如果需要纯化的话)，末端-封端的物质更容易去除。可以利用常规末端-封端技术。
继续参考方案2，组装片段1、2a和3’a，以完成所需要的肽。
片段2a和3’a首先在溶液中偶联，以形成片段2a+3’a，并且为SEQ.IDNO.7：
SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其可以指定为符号(X35)GLP-1(18-36)。接着，片段2a+3’a偶联到在液相中的片段1上。至其他氨基酸携带侧链保护的程度，需要在该步骤过程中保持这一保护。接着，形成结合片段1+2a+3’a的SEQ ID NO.9：HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2的所需要的肽，其中，在优选实施方案中，X8和X35是如上文定义的Aib。
在进行方案1和2的反应方案中，固相和液相合成可以通过工业上已知的标准方法进行。在代表性实施模式中，利用化学法在固相中合成肽，通过化学法将氨基酸从C-端添加到N-端。因此，最接近特定片段的C端的氨基酸或肽基团是第一个添加到树脂上的。这通过将氨基酸或肽基团C端的官能度与树脂支持物上的互补官能度反应而发生的。所述氨基酸或肽基团的N端侧被掩蔽，以防止不需要的副反应。所述氨基酸或肽基团理想地还包含侧链保护。然后，将连续的氨基酸或肽基团附着到与支持物结合的肽物质上，直到形成目的肽。依据常规实践，这些中的大部分还包含侧链保护。随着每次连续的偶联，在与树脂结合的肽物质的N端掩蔽基被去除。然后，这与N端被掩蔽的下一个氨基酸或肽基团的C端反应。因此，固相合成的产物是与树脂支持物结合的肽。
可以使用适合实施固相肽合成的任何类型的支持物。在优选实施方案中，所述支持物包括可以由一种或多种聚合物、聚合物的共聚物或组合制成的树脂，所述聚合物诸如聚酰胺、聚硫酰胺、取代的聚乙烯、聚乙二醇、酚醛树脂、多糖、或聚苯乙烯。聚合物支持物还可以是对肽合成中所用的溶剂是充分不溶和惰性的任何固体。固体支持物典型地包括连接结构部分，在合成过程中正在增长的肽与其偶联，并且所述连接结构部分可以在需要的条件下裂解，以将肽从支持物上释放。适当的固体支持物可以具有接头，所述接头是光-可裂解性的、TFA-可裂解性的、HF-可裂解性的、氟化物离子-可裂解性的、还原剂-可裂解性的；Pd(O)-可裂解性的；亲核-可裂解性的；或自由基-可裂解性的。优选的连接结构部分是在某些条件下可裂解的，以致被裂解的肽的侧链基团仍然是基本上完全被保护的。
在一种优选的合成方法中，肽中间体片段在包含三苯甲基基团的酸敏性固体支持物上合成，并且更优选地在包含具有悬垂的氯基团的三苯甲基基团的树脂，例如2-氯三苯甲基氯(2-CTC)树脂(Barlos等.(1989)四面体通讯(Tetrahedron Letters)30(30)：3943-3946)上合成。实例还包括三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂、4-甲氧基三苯甲基氯树脂。一些优选的固体支持物包含聚苯乙烯，其可以与二乙烯基苯共聚，形成反应基团与其锚定的支持物质。
用于固相合成的其它树脂包括“Wang”树脂，其包含苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，所述共聚物具有4-羟甲基苯基氧基甲基锚定基团(Wang，S.S.1973，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.))，和4-羟甲基3-甲氧基苯氧丁酸树脂(Richter等.(1994)，四面体通讯(Tetrahedron Letters)35(27)：4705-4706)。所述Wang、2-氯三苯甲基氯和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂可以购自，例如，加利福尼亚州圣地亚哥的Calbiochem-Novabiochem公司(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，California)。
为了准备用于固相合成的树脂，树脂可以在适当的溶剂中预先洗涤。例如，将固相树脂如2-CTC树脂添加到肽室中，并且用适当的溶剂预先洗涤。预洗的溶剂可以基于偶联反应中所用的溶剂(或溶剂混合物)的类型进行选择，或反之亦然。适用于洗涤以及随后的偶联反应的溶剂包括二氯甲烷(DCM)，二氯乙烷(DCE)，二甲基甲酰胺(DMF)等，以及这些试剂的混合物。其它有用的溶剂包括DMSO，吡啶，氯仿，二噁烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷酮，以及它们的混合物。在一些情形中，偶联可以在二元溶剂***中进行，诸如在以体积比在9∶1至1∶9、更普遍的4∶1至1∶4范围内的DMF和DCM的混合物中进行。
除非另外指明，本发明的合成优选地在适当的保护基的存在下进行。保护基的性质和应用是本领域公知的。通常，适当的保护基是可以在加工和合成过程中帮助防止附着在其上的原子或结构部分如氧或氮参与不需要的反应的任何种类的基团。保护基包含侧链保护基和氨基-或N端保护基。保护基还可以防止羧酸、硫醇等的反应或键合。
侧链保护基是指与氨基酸的侧链(即，在通用氨基酸式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基团)偶联的化学结构部分，其帮助防止所述侧链部分与肽合成、加工等步骤中所用的化学试剂反应。侧链-保护基的选择可以取决于许多因素，例如，进行的合成的类型、肽要进行的加工、和需要的中间体产物或终产物。侧链保护基的性质还取决于氨基酸自身的性质。通常，选择这样的侧链保护基，即，所述侧链保护基在固相合成过程中在α-氨基基团的去保护过程中不被去除。因此，所述α-氨基保护基和所述侧链保护基典型地是不相同的。
在一些情形中，并且取决于固相合成和其它肽加工中所用的试剂的类型，氨基酸可以不需要存在侧链保护基。这样的氨基酸在侧链中典型地不包含活性氧、氮、或其它活性结构部分。
侧链保护基的实例包括乙酰基(Ac)，苯甲酰基(Bz)，叔-丁基，三苯基甲基(三苯甲基)，四氢吡喃基，苯甲醚(Bzl)和2，6-二氯苯基(DCB)，叔-丁氧基羰基(Boc)，硝基，对甲苯磺酰基(Tos)，金刚烷基氧基羰基(adamantyloxycarbonyl)，呫吨基(Xan)，苄基，2，6-二氯苄基，甲基，乙基和叔-丁基酯，苄氧基羰基(cBz或Z)，2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)，t-戊氧基羰基(Aoc)，和芳香族或脂肪族尿烷型保护基，光不稳定的基团如硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)；和氟化物易变基团如2-三甲基甲硅烷基氧基羰基(TEOC)。
在本发明的实践中，用于合成GLP-1肽通常所用的氨基酸的优选侧链保护基在下表A中显示：
表A
  氨基酸   侧链保护基
  Aib   无
  Ala   无
  Arg   无
  Asp   叔-丁基酯(OtBu)
  Gln   三苯甲基(trt)
  Glu   OtBu
  Gly   无
  His   三苯甲基(trt)
  Ile   无
  Leu   无
  Lys   叔丁氧基羰基(Boc)
  Phe   无
  Ser   叔丁基(tBu)
  Thr   tBu
  Trp   Boc
  Tyr   tBu
  Val   无
氨基端保护基包括与氨基酸的α氨基基团偶联的化学结构部分。典型地，在下一个氨基酸被添加到正在增长的肽链上之前，氨基端保护基在去保护反应中去除，但是当肽从支持物上裂解下来时可以保留。氨基端保护基的选择可以取决于许多因素，例如，进行的合成的类型和需要的中间体产物或终产物。
氨基端保护基的实例包括(1)酰基型保护基，诸如甲酰基，烯丙酰(Acr)，苯甲酰基(Bz)和乙酰基(Ac)；(2)芳香族尿烷型保护基，诸如苄氧基羰基(Z)和取代的Z，诸如对-氯苄氧基羰基，对-硝基苄氧基羰基，对-溴苄氧基羰基，对-甲氧基苄氧基羰基；(3)脂肪族尿烷保护基，诸如叔-丁氧基羰基(Boc)，二异丙基甲氧基羰基，异丙基氧基羰基，乙氧基羰基，烯丙氧基羰基；(4)环烷基尿烷型保护基，诸如9-芴基-甲基氧基羰基(Fmoc)，环戊氧基羰基，金刚烷基氧基羰基，和环己基氧基羰基；和(5)硫代尿烷-型保护基，诸如苯硫羰基。优选的保护基包括9-芴基-甲基氧基羰基(Fmoc)，2-(4-联苯基)-丙基(2)氧基羰基(Bpoc)，2-苯基丙基(2)-氧基羰基(Poc)和叔-丁氧基羰基(Boc)。
Fmoc或Fmoc-样化学试剂是固相肽合成高度优选的，因为利用微酸性裂解试剂裂解处于保护状态的所得到的肽相对直接地进行。在得到的副产物、杂质等方面，这种裂解反应相对比较干净，使得以大规模基础从溶胀和收缩洗液中回收肽、增加产量是技术和经济可行的。当用于本文时，关于肽合成的“大规模”通常包括合成在至少500g、更优选至少2kg/批次的范围内的肽。大规模合成典型地在大反应容器中进行，诸如在钢反应容器中，其可以容纳大量试剂如树脂、溶剂、氨基酸、用于偶联的化学试剂、和去保护反应，其被定制允许生产在千克到公制的吨范围内的肽。
另外，Fmoc保护基可以相对于侧链保护基选择性地从肽上裂解下来，以致当裂解Fmoc时，侧链保护留在原位。这种选择性在氨基酸偶联过程中对最小化侧链反应是重要的。另外，所述侧链保护基可以相对于Fmoc选择性地裂解以去除它们，将Fmoc留在原位。在下文所述的纯化方案过程中，非常有利地依赖于后一种选择性。
固相偶联反应可以在增强或改善偶联反应的一种或多种化合物的存在下进行。可以提高反应速率并且减小副反应速率的化合物包括鏻盐和脲盐，在叔碱如二异丙基乙胺(DIEA)和三乙胺(TEA)的存在下，所述鏻盐和脲盐可以将被保护的氨基酸转化成活化的种类(例如，产生HOBt酯的BOP，PyBOP，HBTU，和TBTU，以及产生HOOBt酯的DEPBT)。其它试剂通过提供保护试剂而辅助防止外消旋作用。这些试剂包括具有加入的辅助亲核体(例如，1-羟基-苯并***(HOBt)，1-羟基-氮杂苯并***(HOAt)，或HOSu)的碳二亚胺(例如，DCC或WSCDI)。还可以使用混合的酐方法，其利用异丁基氯甲酸酯，具有或没有添加的辅助亲核体，由于与叠氮化物相关的低外消旋作用，所述方法可以是叠氮化物方法。这些类型的化合物还可以增加碳二亚胺-介导的偶联的速率，以及防止Asn和Gln残基脱水。
在确定偶联完成后，将偶联反应混合物用溶剂洗涤，并且对于肽物质的后续氨基酸残基的每一个重复偶联循环。为了偶联下一个氨基酸，从与树脂结合的物质去除N端保护基(例如，Fmoc基团)典型地通过用在溶剂如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)中包含10-50％(基于重量)的哌啶的试剂处理而实现。在去除Fmoc保护基之后，典型地进行一些洗涤，以去除残留的哌啶和Fmoc副产物(诸如二苯并富烯和其哌啶加合物)。
后续氨基酸可以以相对于在树脂支持物上的肽物质的负载因子以化学计量过量的氨基酸进行使用。通常，偶联步骤所用的氨基酸的量至少等于在树脂上的第一氨基酸的负载因子(1当量或更多)。优选地，偶联步骤所用的氨基酸的量为1.7-2.0当量。
在最后的偶联循环之后，树脂用溶剂如NMP洗涤，然后用惰性第二溶剂如DCM洗涤。为了从树脂上取下合成的肽物质，裂解处理以这样的方式进行，以致裂解的肽物质仍然携带充分的侧链和末端保护基。在树脂裂解过程中或之后，使得保护基保留在原位帮助防止肽片段的不需要的偶联或其它不需要的反应。在当使用Fmoc或相似的化学试剂合成肽的情形中，被保护的裂解可以以任何需要的方式实现，诸如通过使用相对弱酸试剂如醋酸，或将TFA稀释在如DCM的溶剂中。典型的是在DCM中使用0.5-10重量％、优选1-3重量％的TFA。参见，例如，美国专利号6,281,335。
从固相树脂裂解肽中间体片段的步骤可以按照下述示例性过程的顺序进行。然而，可以利用有效从树脂裂解肽中间体片段的任何适当的方法。例如，将约5-20、优选约10体积的含有酸性裂解试剂的溶剂加入到含有与树脂结合的肽物质的容器中。因此，所述树脂，典型地以珠子的形式，浸没在该试剂中。当液体内容物在适当温度下搅拌适当的时间阶段时，发生裂解反应。搅拌帮助防止珠子结块。适当的时间和温度条件将取决于这样的因素，诸如所用的酸试剂、肽的性质、树脂的性质等。作为通用的指导，在约-15℃-约5℃、优选地约10℃-约0℃持续约5分钟-2小时、优选地约25分钟-约45分钟的搅动将是适宜的。裂解时间可以在约10分钟-约2小时或者甚至如一天之久的范围内。裂解理想地在这样冷却的温度范围内进行，以调节典型地可能在反应过程中发生的反应放热曲线。另外，裂解反应的更低温度防止酸敏性侧链保护基如trt基团在这一阶段被去除。
在裂解处理结束时，反应被猝灭。这可以，例如，通过将裂解试剂与适当的碱诸如吡啶等结合，并且继续搅拌和搅动额外的时间阶段如额外的5分钟-2小时、优选地约20分钟-约40分钟而实现。加入碱和持续的搅拌使得容器内容物的温度增加。在搅拌结束时，容器内容物可以处于约0℃-约15℃、优选地约5℃-约10℃的范围内的温度。
诸如溶胀和收缩树脂以改善肽回收的方面的因素可以任选地结合在整个合成过程中。例如，这些技术在美国专利公布号2005/0164912A1中描述。
在一些方面，可以制备裂解的肽片段，用于液相，与其它肽片段和/或氨基酸偶联。在液相的肽偶联反应综述于，例如，肽偶联试剂的新趋势(New Trends in Peptide Coupling Reagents)；Albericio，Fernando；Chinchilla，Rafeal；Dodsworth，David J.；和Najera，Armen；国际有机制备和方法(Organic Preparations and Procedures International)(2003)，33(3)，203-303。
肽中间体片段与其它片段或氨基酸在液相中的偶联可以使用原位偶联试剂进行，所述原位偶联试剂例如苯并***-1-基-氧基-tris-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸酯(BOP)，苯并***-1-基-氧基-三吡咯烷磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)，o-(苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，o-(7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟硼酸酯(HATU)，o-(7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟磷酸酯(TATU)，o-(1H-6-氯-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，o-(1H-6-氯-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TCTU)，o-(苯并***-1-基)氧基生物活素-(吡咯烷)-脲六氟磷酸酯(HAPyU)，二环己基碳二亚胺(DCC)，二异丙基碳二亚胺，3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)，水溶性碳二亚胺(WSCDI)，o-(氰基-乙氧基羰基-亚甲基氨基)-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸酯(TOTU)或o-(苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)。其它偶联技术利用预制的活性酯如羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和对-硝基苯酚(HONp)酯；预制的对称酐；不对称酐如N-羧基酐(NCAs)；或酸性卤化物如酰基氟化物和酰基氯化物。
适当的偶联溶剂可以用于液相偶联反应中。应该理解，所用的偶联溶剂可以影响形成的肽键的外消旋程度；肽和/或肽片段的溶解性；和偶联反应速率。在一些实施方案中，偶联溶剂包括一种或多种水易混合性试剂。水易混合性溶剂的实例包括，例如，DMSO，吡啶，氯仿，二噁烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二噁烷，或它们的混合物。
在其它实施方案中，偶联反应可以包括一种或多种非水易混合性试剂。示例性的非水易混合性溶剂是二氯甲烷。在这些实施方案中，所述非水易混合性溶剂优选地与去保护反应相容；例如，如果使用非水易混合性溶剂，则优选它不会不利地影响去保护反应。
在形成SEQ ID No.9的肽后，在需要时，产物可以进行去保护、纯化、冻干、进一步加工(例如，与另一种肽反应以形成融合蛋白)；这些的组合，和/或类似的。
例如，按照本发明，在整个固相合成过程中，并且还在整个液相偶联反应过程中，侧链保护基典型地保留在肽中间体片段上。通常，在液相步骤完成后，可以进行一步或多步去保护步骤，以从肽上去除一个或多个保护基。通过完全去保护去除侧链保护基典型地利用包含酸水解试剂的去保护溶液，以裂解侧链保护基。通常用于完全去保护的酸水解试剂包括纯的三氟乙酸(TFA)，HCl，路易斯酸如BF3Et2O或Me3SiBr，液体氢氟酸(HF)，氢溴酸(HBr)，三氟甲烷磺酸，以及它们的组合。去保护溶液还包括一种或多种适当的阳离子清除剂，例如，二硫苏糖醇(DTT)，苯甲醚，对甲酚，乙二硫醇，或二甲硫。去保护溶液还可以包含水。当用于本文时，在去保护组合物中存在的试剂的量典型地以比例表示，其中单个成分的量表示为单位为“份”的分子(numerator)，诸如“份重量”或“份体积”，并且分母是该组合物的总份数。例如，包含比例为90∶5∶5(重量/重量/重量)的TFA∶H2O∶DTT的去保护溶液具有重量为90/100份的TFA，重量为5/100份的H2O，和重量为5/100份的DTT。
沉淀典型地使用醚，例如二乙基醚或MTBE(甲基叔丁醚)进行。沉淀后，在与其它成分组合之前，将肽理想地分离并干燥，冻干，包装，存储，进一步加工，和/或另外处理。这可以以任何适当的方式实现。按照一种适当的方式，肽通过过滤收集，用充足的MTBE洗液洗涤，以将最终盐含量减少到适当水平，然后干燥。
本发明还提供纯化宽泛范围的肽的有用技术，所述肽包括GLP-1肽和它们的负体。
特别优选的纯化方法包括经过层析介质的至少两次纯化流通，其中至少第一次流通在第一pH发生，并且至少第二次流通在第二pH发生。更优选地，第一次流通在酸性pH发生，而第二次流通在碱性pH发生。在优选实施方案中，至少一次在酸性条件下的流通在发生在碱性条件下的流通之前发生。实施这种纯化方法的示例性模式可以在纯化完全被保护的肽11的示例性情形中描述。首先，肽完全去保护。裂解N端和侧链保护基。第一次层析流通在水/ACN梯度中进行，使用足够的TFA以提供约1-5、优选地约2的pH。然后，第二次流通在水/ACN梯度中进行，使用少量氨水和/或乙酸铵，等等，以提供约8-9、优选8.5-8.9的pH。
pH值，不管是酸性还是碱性，促进了均一性，因为在每种情形中存在均一的离子种类。因此，酸性pH理想地充分低，以致基本上在所述肽物质中的所有氨基酸残基都被质子化。碱性pH理想地足够高，以致基本上在所述肽物质中的所有氨基酸残基都被去质子化。酸性和碱性层析可以以任何顺序进行。当肽醋酸盐是需要的产物时，便利地最后进行碱性层析，因为醋酸盐可能是层析产物。
常用的缩写包括：乙酰基(Ac)，偶氮-双-异丁酰腈(AIBN)，大气(Atm)，9-硼二环[3.3.1]壬烷(9-BBN或BBN)，叔丁氧基羰基(Boc)，二叔丁基焦碳酸酯或boc酐(BOC2O)，苄基(Bn)，丁基(Bu)，化学摘要注册号(CASRN)，苄氧基羰基(CBZ或Z)，羰二咪唑(CDI)，1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)，二乙基氨基三氟化硫(DAST)，二亚苄基丙酮(dba)，1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)，1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，1，2-二氯乙烷(DCE)，二氯甲烷(DCM)，二乙基偶氮二羧酸酯(DEAD)，(3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)酮)(DEPBT)，二-异丙基偶氮二羧酸酯(DIAD)，二-异-丁基氢化铝(DIBAL或DIBAL-H)，二-异-丙基乙胺(DIPEA)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)，4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)，乙二醇二甲醚(DME)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，1，1′-双-(二苯膦)乙烷(dppe)，1，1′-双-(二苯膦)二茂铁(dppf)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，乙基(Et)，乙酸乙酯(EtOAc)，乙醇(EtOH)，2-乙氧基-2H-喹啉-1-羧酸乙酯(EEDQ)，二***(Et2O)，O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’N’-四甲基脲六氟磷酸酯乙酸(HATU)，乙酸(HOAc)，1-N-羟基苯并***(HOBt)，高压液相色谱(HPLC)，异丙醇(IPA)，六甲基二硅氮烷锂(LiHMDS)，甲醇(MeOH)，熔点(mp)，MeSO2-(甲磺酰基或Ms)，甲基(Me)，乙腈(MeCN)，间氯过苯甲酸(MCPBA)，质谱(ms)，甲基叔丁醚(MTBE)，N-溴琥珀酰亚胺(NBS)，N-羧酐(NCA)，N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)，N-甲基吗啉(NMM)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，吡啶鎓氯铬酸酯(PCC)，吡啶鎓二铬酸酯(PDC)，苯基(Ph)，丙基(Pr)，异丙基(i-Pr)，磅/平方英寸(psi)，吡啶(pyr)，(苯并***-1-基氧基)三吡咯烷磷鎓六氟磷酸酯(PyBOP)，室温(rt或RT)，叔丁基二甲基甲硅烷基或t-BuMe2Si(TBDMS)，三乙胺(TEA或Et3N)，2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)，triflate或CF3SO2-(Tf)，三氟乙酸(TFA)，1，1′-双-2，2，6，6-四甲基庚烷-2，6-二酮(TMHD)，O-苯并***-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，薄层层析法(TLC)，四氢呋喃(THF)，三甲基甲硅烷基或Me3Si(TMS)，对甲苯磺酸一水合物(TsOH或pTsOH)，4-Me-C6H4SO2-或甲苯磺酰基(Ts)，N-尿烷-N-羧酐(UNCA)。当与烷基结构部分一起使用时，常规命名包括前缀正(n)，异(i-)，仲(sec-)，叔(tert-)和新(neo)具有它们常用的含义。(J.Rigaudy和D.P.Klesney，有机化学命名(Nomenclature in Organic Chemistry)，IUPAC 1979 Pergamon Press，Oxford.)。
现在，将参考下述示例性实施例进一步举例说明本发明的原理。在下文中，除非另外清楚地指明，所有的百分数和比例都是用体积表示的。
实施例
GLP-1固相合成GLP-1片段Fmoc-AA(7-17)-OH
Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(OtBu)-Asp(Ot Bu)-Val-Ser(OtBu)-OH
实施例1
固相合成Fmoc-AA(7-17)-O-2CT2CT
用以0.55mmole/g负载的15.0g of H-Ser(OtBu)-2-CT树脂(PeptidesInternational(肽国际)；Lot#601511)起始，进行Fmoc-AA(7-17)-OH的固相合成。将树脂在25℃在DCM(150mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤三次(每次洗涤90mL)。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸(2.0当量)和1-羟基苯并***水合物(HOBT，2.0当量)，溶解在43.3mL DMF中，然后通过与在DMF中的HBTU(2.0当量)溶液(浓度：205.76g/L；31.4mL)合并而活化，然后加入0°-5℃的DIEA(3.5当量)。将得到的溶液加入到含有树脂的反应容器中，将活化烧瓶用24.5mL的DCM润洗到反应器中，然后将其在25℃搅拌4-6小时。在搅拌偶联反应混合物4小时后，将偶联溶液排干，并且将树脂用DMF洗涤4次(每次洗涤90mL)。然后，将树脂用在DMF中的20％的哌啶处理两次(每次处理90mL)，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/DMF处理后，将树脂用DMF洗涤9次(每次洗涤90mL)。对于片段中的其余氨基酸(即，以Val→Asp(OtBu)→Ser(tBu)→Thr(tBu)→Phe→Thr(tBu)→Gly→Glu(OtBu)→Aib→His(trt)的顺序)，重复Fmoc保护基的去除和偶联反应循环。用于最后的His(trt)偶联反应的溶剂用在THF/NMP(3∶1)中的0.1M LiBr替换DMF。并且用于最后His偶联反应的偶联试剂使用作为在DMF中的溶液的DEPBT(浓度：162.33g/L；31.4mL)。并且His再一次重新偶联，以确保偶联完成。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure BDA0000104415680000351
将构建的树脂用NMP(90mL.)洗涤4次并用DCM(90mL.)洗涤7次。
从构建的树脂上裂解GLP-1片段Fmoc-AA(7-17)-OH
将由上述构建的树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，并且加入冰冷的1％v/v TFA/DCM溶液(150mL，在-5°至-10℃)并且在0℃搅拌。向裂解接收器中加入吡啶(4.0mL)用于中和TFA。在0℃处理构建的树脂15分钟后，将裂解溶液收集在裂解接收器中。加入另一份冰冷的1％TFA/DCM溶液(150mL，在-5°至-10℃)并且在0℃搅拌15分钟，然后排出到裂解接收器中。加入第三份冰冷的1％TFA/DCM溶液(150mL，在-5°至-10℃)并且在0℃搅拌30分钟，然后向裂解容器中加入吡啶(2.0mL)以中和TFA，并且也将最后的裂解溶液排出到裂解接收器中。在将容器加温至25℃的同时，将树脂用DCM洗涤5次(90mL)，并且排出到裂解溶液接收器中。将合并的DCM裂解溶液和洗涤溶液浓缩至90mL然后与水(90mL.)合并。将DCM在减压和激烈搅拌(在25℃350-50torr)下蒸馏。当去除DCM时，片段从水混合物中沉淀出来。然后，过滤产物，用水洗涤，并且在35℃下真空干燥。获得总共14.371g的Fmoc-AA(7-17)-OH，纯度为95.7％AN，产率为90.7％。
GLP-1固相合成GLP-1片段Fmoc-AA(18-22)-OH
Fmoc-Ser(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH
实施例2
固相合成Fmoc-AA(18-22)-O-2CT2CT
用以0.51mmole/g负载的20.0g H-Gly-2-CT树脂(Patras；Lot#2592)起始，进行Fmoc-AA(11-22)-OH的固相合成。将树脂在25℃在DCM(200mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP(120mL)洗涤三次。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸(2.0当量)和1-羟基苯并***水合物(HOBT.H2O；0.16g；0.1当量)，溶解在29.8mL NMP中，然后通过与在NMP中的HBTU溶液(浓度：172.4g/L；43.8mL；1.95当量)合并而活化，然后加入0°-5℃的DIEA(3.9mL；2.2当量)。将得到的溶液加入到含有树脂的反应容器中，将活化烧瓶用23.7mL的DCM润洗到反应器中，然后将其在22℃搅拌。在搅拌偶联反应混合物5.0-6.5小时后，将偶联溶液排干，并且将树脂用NMP洗涤4次(120mL)。然后，将树脂用在NMP(120mL)中的20％的哌啶处理两次，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP(120mL)洗涤9次。对于片段中的其余氨基酸(即，以Glu(OtBu)→Leu→Tyr(tBu)→Ser(tBu)的顺序)，重复Fmoc保护基的去除和偶联反应循环。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure BDA0000104415680000371
将构建的树脂用NMP(120mL.)洗涤4次并用DCM(120mL.)洗涤7次。
从构建的树脂上裂解GLP-1片段Fmoc-AA(18-22)-OH
将由上述构建的树脂用最后的DCM洗涤冷却至-5℃。将DCM排干，并且加入冰冷的1％v/v TFA/DCM溶液(160mL，在-5°至-10℃)并且在0℃搅拌。向裂解接收器中加入吡啶(2.0mL)用于中和来自第一裂解溶液的TFA。30分钟搅拌后，将裂解溶液收集在裂解接收器中。然后加入另一份冰冷的1％TFA/DCM溶液(160mL，在-5°至-10℃)并且在0℃搅拌30分钟。向裂解容器中加入吡啶(2.1mL)以中和TFA。在将第二裂解溶液排出到裂解接收器中后，将容器加温至25℃，将树脂用DCM洗涤6次(120mL)，并且排出到裂解溶液接收器中。将合并的DCM裂解溶液和洗涤溶液浓缩至150mL的体积，然后与水(150mL.)合并。将DCM在减压和激烈搅拌(在25℃350-50torr)下蒸馏。当去除DCM时，片段从水混合物中沉淀出来。将所述片段用水洗涤，并且在30°-35℃下真空干燥。获得总共8.76g GLP-1 Fmoc-AA(18-22)-OH，纯度为98.6％AN，产率为89.6％。
液相合成GLP-1片段Fmoc-AA(18-36)-NH 2
H-Ser(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)- Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH 2
实施例3
将GPA片段3’H-AA(23-36)-NH2(2.76g)、片段Fmoc-AA(18-22)-OH(0.99g)、和HOBT水合物(0.16g)溶解在DMF(14mL)中。对于该溶液，随着DMF润洗(10mL)，填入在DMF(15mL)中的BOP(0.56g)溶液和DIEA(0.29)。将反应物于20℃搅拌并通过HPLC监测。4小时后，偶联反应未完成。随着DMF润洗(1mL)，加入另外的片段Fmoc-AA(18-22)-OH(0.02g)的片段推料(kickers)、在1mL DMF中的BOP溶液(0.07当量)、和DIEA(0.07.)。在过夜搅拌后，反应完成。向反应混合物中填入哌啶(0.38g)。在38℃1小时后进行Fmoc去除。冷却至25℃后，在环境温度下将反应混合物用水(100mL)猝灭。猝灭的混合物用DCM(100mL)萃取。将DCM层用水洗涤(2X100mL)，并浓缩至～20g。将浓缩的DCM溶液送料到搅动的庚烷中以沉淀产物。然后，将沉淀混合物中的DCM在20°至25℃在真空(350-50mm Hg)下馏出，然后填入MTBE(100mL)并在25℃搅拌过夜。过滤固体并用MTBE/庚烷(1∶1，各为50mL)洗涤两次。将滤饼风干0.5小时，然后在35°-40℃真空干燥。获得总共3.37g，实际产率为96.6％，纯度为81.9％AN。
实施例4
将GPA片段3’H-AA(23-36)-NH2(通常按照U.S.S.N.12/316,309中的步骤合成)(共2.83g)在35°-40℃在DMF(24mL)和甲基-THF(5mL)中溶解3小时，然后冷却至0°-5℃。然后，随着DMF润洗(5mL)，填入在混合溶剂DMF(2mL)和Me-THF(24mL)中的片段Fmoc-AA(18-22)-OH(1.154g)和HOBT.水合物(0.018g)的冰冷的(0°-5℃)溶液。随着DMF润洗(10mL)，向该得到的溶液中填入在DMF(2mL)中的BOP(0.69g)溶液和DIEA(0.21g)。将反应物于0℃搅拌并通过HPLC监测。15.5小时后，偶联反应未完成。随着DMF润洗(1mL)，加入另外的片段3’(0.172g)的片段推料、在2mL DMF中的BOP(0.16g)溶液、和DIEA(0.15.)。在20℃过夜搅拌后，反应完成。向反应混合物中填入哌啶(0.44g)。在38℃1小时后进行Fmoc去除。冷却至25℃后，在环境温度下将反应混合物用水(75mL)和Me-THF(30mL)猝灭。相分离后，使用Me-THF(15mL)反萃取下层含水层。将合并的Me-THF层在旋转蒸发器上浓缩，然后填入新鲜的Me-THF(30mL)以溶解残留物。浓缩，再溶解在Me-THF(30mL)中，并且再重复浓缩操作一次。最后将残留物溶解在Me-THF(15mL)中，并且随着Me-THF(3mL)润洗送料到搅动的庚烷(120mL)中。将沉淀的固体过滤并用庚烷(各25mL)洗涤。将滤饼风干0.5小时，然后在35°-40℃真空干燥。获得总共3.66g，实际产率为95.5％，纯度为85.1％AN。
按照方案1液相合成粗GLP-1
实施例5
将GLP-1片段Fmoc-AA(7-17)-OH(0.843g)溶解在THF(20mL)中。然后，合并该溶液与片段H-AA(18-36)-NH 2 )(1.433g)并搅拌，从而溶解所有的固体。随着THF润洗(3mL)，向该溶液中填入6-Cl-HOBt(0.101g)、DEPBT(0.199g)、然后是DIEA(0.132mL)。将反应物于室温下(18°-22℃)搅拌并通过HPLC监测。2天后，反应完成检查表明反应尚未完成(11％过量的片段Fmoc-AA(7-17)-OH)。加入片段H-AA(18-36)-NH 2 )(0.123g)、DEPBT(0.039g)、和DIEA(0.043mL)的推料，并且在室温下持续搅拌。19.5小时后，HPLC分析表明反应完成。填入哌啶(0.267g)并且在室温下搅拌所得到的反应混合物。搅拌7.5小时后，进行去保护反应。然后在真空下(35℃，在130mm Hg真空下)，将反应混合物中的THF用DCM(2X15mL)替换。将残留物溶解在DCM(5.6mL)中，并且在14℃与DTT(1.11g)、水(1.09g)、和TFA(19mL)的溶液合并。在15℃搅拌6小时后，反应混合物通过填入冰冷的(-5℃)MTBE(89mL)而猝灭。将猝灭的反应混合物在15°老化30分钟。将固体产物过滤，用MTBE(3x19mL)洗涤，并且在35℃在真空下干燥过夜。获得1.91g GPA粗产品(34.3％wt/wt)，纯度为63.4％AN；产率为45.6％。
GLP-1固相合成GLP-1片段Fmoc-AA(19-27)-OH
Fmoc-Ser(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)- Glu(OtBu)-OH
实施例6
固相合成Fmoc-AA(19-27)-O-2CT2CT
用以0.58mmole/g负载的20.0g Fmoc-Glu(OtBu)-2-CTC树脂起始，进行Fmoc-AA(19-27)-OH的固相合成。将树脂在25℃在DCM(200mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用DMF(120mL)洗涤三次。通过将溶胀的树脂用在DMF(120mL)中的20％哌啶处理两次而实现Fmoc保护基的去除。在第二次20％哌啶/DMF处理后，将树脂用DMF(120mL)洗涤9次。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸(2.0当量)和1-羟基苯并***水合物(HOBT.H2O；3.55g；2.0当量)，溶解在60.0mL DMF中，然后通过与在DMF中的HBTU溶液(浓度：205.76g/L；42.8mL；2.0当量)合并而活化，然后加入0°-5℃的DIEA(9.1mL；4.5当量)。将得到的溶液加入到含有树脂的反应容器中，将活化烧瓶用34.3mL的DCM润洗到反应器中，然后将其在25℃搅拌。在搅拌偶联反应混合物5.0小时后，将偶联溶液排干，并且将树脂用DMF洗涤4次(120mL)。然后，将树脂用在DMF(120mL)中的20％的哌啶处理两次，以去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/DMF处理后，将树脂用DMF(120mL)洗涤9次。对于片段中的其余氨基酸(即，以Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)→Gly→Glu(OtBu)→Leu→Tyr(tBu)的顺序)，重复Fmoc保护基的去除和偶联反应循环。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure BDA0000104415680000401
构建的树脂相继用DMF(120mL.)洗涤4次，DCM(120mL.)洗涤8次和IPA(120mL)洗涤4次。然后，将构建的树脂在35℃真空干燥，并且获得32.75g Fmoc-(19-27)-O-2CT树脂。基于获得的树脂的重量，产率为83.6％。
实施例7
固相合成Fmoc-AA(18-27)-O-2CT2CT
使用16.38g上述Fmoc-AA(19-27)-O-2-CTC树脂，进行Fmoc-AA(18-27)-OH的固相合成。将树脂在25℃在DCM(100mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用DMF(60mL)洗涤三次。通过将溶胀的树脂用在DMF(60mL)中的20％哌啶处理两次而实现Fmoc保护基的去除。在第二次20％哌啶/DMF处理后，将树脂用DMF(60mL)洗涤9次。
为了制备偶联溶液，称重Fmoc-Ser(OtBu)(4.48g，基于Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂为2.0当量)和1-羟基苯并***水合物(HOBT.H2O；1.78g；基于Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂为2.0当量)，溶解在30.0mL DMF中，然后通过与在DMF中的HBTU溶液(浓度：205.76g/L；21.4mL；基于Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂为2.0当量)合并而活化，接着加入0°-5℃的DIEA(4.5mL；基于Fmoc-Glu(OtBu)-O-2CT树脂为4.5当量)。将得到的溶液加入到含有树脂的反应容器中，将活化烧瓶用18.7mL的DCM润洗到反应器中，然后将其在25℃搅拌。在搅拌偶联反应混合物6.0小时后，将偶联溶液排干，并且将树脂用DMF洗涤4次(120mL)。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure BDA0000104415680000411
构建的树脂相继用DMF(120mL.)洗涤4次，DCM(120mL.)洗涤8次和IPA(120mL)洗涤4次。
实施例8
从构建的树脂上裂解GLP-1片段Fmoc-AA(18-27)-OH
将构建的树脂用DCM(200mL)溶胀30分钟，然后冷却至-5℃。将DCM排干，并且加入冰冷的1％v/v TFA/DCM溶液(200mL，在-5°至-10℃)并且在0℃搅拌。向裂解接收器中加入吡啶(6.5mL)用于中和来自裂解溶液的TFA。30分钟搅拌后，将裂解溶液收集在裂解接收器中。然后加入另一份冰冷的1％TFA/DCM溶液(200mL，在-5°至-10℃)并且在0℃搅拌30分钟。在将第二裂解溶液排出到裂解接收器中后，向裂解接收器中填入IPA(20mL)以避免凝胶形成。将裂解容器加温至25℃，将树脂用DCM(200mL)洗涤6次，并且排出到裂解溶液接收器中。将合并的裂解溶液和洗涤溶液浓缩至小于200mL的体积，然后与水(200mL.)合并。将DCM在减压和激烈搅拌(在25℃350-50torr)下蒸馏。当去除DCM时，片段从水混合物中沉淀出来。将所述片段过滤，用水洗涤，并且在30°-35℃下真空干燥。获得总共18.09g GLP-1片段Fmoc-AA(18-27)-OH，纯度为89.0％AN，产率为82.7％。
固相合成GLP-1片段3a，Fmoc-AA(28-35)-OH
Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-OH
实施例9
固相合成GLP-1备选片段3a，Fmoc-AA(28-35)-O-2CT
Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-2-CTC
在Roche肽合成仪上进行Fmoc-AA(28-35)-O-2CT的固相合成。将15.02g负载因子为0.36mmol/g的Fmoc-Aib-2-CTC树脂填到反应容器中，并且在25℃在DCM(150mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用DMF洗涤三次(每次洗涤6体积)。通过将树脂用在DMF中的20％哌啶处理两次(每次处理6体积)而进行树脂的完全去保护，从而去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/DMF处理后，将树脂用DMF洗涤9次(每次洗涤6.7体积)。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸和1-羟基苯并***水合物(HOBT.H2O)，溶解在DMF中，然后相继与在DMF中的HBTU溶液(0.503mmoles/mL)和0°-5℃的DIEA合并。将得到的溶液加入到反应容器中，烧瓶用DCM润洗到反应器中，将其与树脂在25℃搅拌4-16小时。取样进行开氏检验(Kaiser Test)或HPLC分析以检查反应完成。在偶联反应完成后，排出偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(每次洗涤6.7体积)。然后，对于片段中的其余氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe的顺序)重复Fmoc基团的去保护和偶联反应循环。
由于在2-甲基丙氨酸(Aib)和2-CTC树脂之间的支撑(buttressing)效应，对于促使前两个氨基酸偶联反应(Lys(Boc)-34和Val-33)完成存在相当大的困难。改进Lys(Boc)-34和Val-33的偶联条件，氨基酸和HOBT水合物的使用由1.7当量增加至2.35当量，DIEA的使用由4.0当量增加至5.0当量，从而促使偶联反应完成。此外，在本实施例中，在Lys(Boc)-34和Val-33偶联反应之后，使用乙酸酐将树脂上任何未反应的肽片段或氨基酸末端-封端。通过在层析纯化过程中将杂质移开远离需要的产物，这提高了纯化步骤的效率。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
在固相合成完成后，将树脂用DMF(4x 6.7体积)，DCM(7x 6.7)，和异丙醇(3x 6.7体积)洗涤。真空干燥所构建的树脂并且保持用于裂解。
实施例10
从构建的树脂上裂解GLP-1中间片段Fmoc-AA(28-35)-OH
将由上述构建的树脂在25℃在DCM(10体积)中溶胀30分钟。然后将容器混合物冷却至-5℃。排干DCM溶剂，并且将树脂用冰冷的2％TFA/DCM溶液(2x 7.5体积)通过在0℃搅拌30分钟处理两次。将裂解溶液收集在含有吡啶(总TFA的1.3当量)的烧瓶中。在将容器加温至25℃的同时，将树脂用DCM洗涤6次(10体积)，并且排出到DCM洗液中。将DCM溶液合并，浓缩，并且与水(10体积)混合。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(在25℃350-50torr)。当去除DCM时，片段从水中沉淀出来。将所述片段过滤，洗涤，并且在30°-35℃下真空干燥。获得产率为92.7％的GLP-1 Fmoc-AA(28-35)-OH，其纯度为95.2％AN。
实施例11
固相合成GLP-1片段3a Fmoc-AA(28-35)-O-2CT
Fmoc-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-2-CTC
在Roche肽合成仪上进行Fmoc-AA(28-35)-O-2CT的固相合成。将25.01g负载因子为0.59mmol/g的H-Aib-2-CTC树脂填到反应容器中，并且在25℃在DCM(250mL)中溶胀30分钟。排干DCM溶剂，并且将树脂用NMP洗涤三次(每次洗涤6体积)。
通过将树脂用在NMP中的20％哌啶处理两次(每次处理5.6体积)而进行树脂的完全去保护，从而去除Fmoc保护基。在第二次20％哌啶/NMP处理后，将树脂用NMP洗涤9次(每次洗涤5.6体积)。
为了制备偶联溶液，称重氨基酸和1-羟基苯并***水合物(HOBT.H2O)，溶解在NMP中，然后相继与在NMP中的HBTU溶液(0.46mmoles/mL)和0°-5℃的DIEA合并。将得到的溶液加入到反应容器中，烧瓶用NMP润洗到反应器中，将其与树脂在25℃搅拌4-16小时。取样进行开氏检验(Kaiser Test)或HPLC分析以检查反应完成。在偶联反应完成后，排出偶联溶液并用NMP洗涤树脂4次(每次洗涤6.7体积)。对于片段中的其余氨基酸(即，以Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe的顺序)重复Fmoc基团的去保护和偶联反应循环。
改进Lys(Boc)-34和Val-33的偶联条件，氨基酸和HOBT水合物的使用由1.7当量增加至2.0当量，DIEA的使用由2.13当量增加至2.5当量，从而促使偶联反应完成。此外，在本实施例中，在Lys(Boc)-34和Val-33偶联反应之后，使用在DCM中的乙酸酐将树脂上任何未反应的肽片段或氨基酸末端-封端。
在本实施例中所用的所有试剂在下表中列出：
Figure BDA0000104415680000451
在固相合成完成后，将树脂用NMP(4x 6.0体积)，DCM(7x 6.0体积)洗涤。
从构建的树脂上裂解GLP-1中间片段Fmoc-AA(28-35)-OH
将由上述构建的树脂在DCM(6体积)中冷却30分钟至-5℃。然后，排干DCM溶剂，并且将树脂用冰冷的2％TFA/DCM溶液(2x 10体积)通过在0℃搅拌30分钟处理两次。将裂解溶液收集在含有吡啶(总TFA的1.3当量)的烧瓶中。在将容器加温至25℃的同时，将树脂用DCM洗涤6次(10体积)，并且排出到DCM洗液中。将DCM溶液合并，浓缩，并且与水(6体积)混合。将得到的混合物在减压下蒸馏以去除DCM(在25℃350-50torr)。当去除DCM时，片段从水中沉淀出来。将所述片段过滤，洗涤，并且在30°-35℃下真空干燥。获得产率为96.9％的Fmoc-AA(28-35)-OH，其纯度为96.1％AN。
液相合成GLP-1片段3’a，H-AA(28-36)-NH2
H-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Aib-Arg-NH 2
实施例12
将备选片段3a(Fmoc-AA(28-35)-OH，6.11g，4.42mmoles)和二盐酸精胺酰胺(Argininamide dihydrochloride)(H-Arg(2HCl)-NH2，2.18g，8.84mmol，2当量)溶解在DMF(42mL)中。随着15mL DMF，向该溶液中相继地填入在DMF(42mL)中的HOBt.H2O(0.67g，1当量)和HBTU(3.38g，2当量)的溶液、DIEA(3.44mL，4当量)。将反应物于25℃搅拌并通过HPLC监测。2小时后，反应未完成。反应进行过夜(21小时)。然后，向反应混合物中加入哌啶(2.26g，6当量)。在35℃搅拌1小时后，没有完成Fmoc的去除。加入额外的哌啶(2.33g，6.2当量)并且再搅拌1.75小时。将反应混合物用水(240mL)猝灭。向沉淀的容器混合物中填入盐酸吡啶(8.33g，16.3当量)以中和哌啶。将所形成的白色固体过滤，用水(400mL)洗涤，并且部分干燥过夜。在将滤饼用100mL MTBE/正庚烷(1∶1＝体积∶体积)再混合成浆后，过滤，用MTBE/正庚烷(1∶1＝体积∶体积；2X25mL)洗涤，并且真空干燥，从而提供GLP-1备选片段3’H-AA(28-36)-NH2(6.22g，重量产率为106.9％)。HPLC分析显示纯度为87％AN。
实施例13
将备选片段3a(Fmoc-AA(28-35)-OH，6.12g，4.42mmoles)和二盐酸精胺酰胺(H-Arg(2HCl)-NH2，2.19g，8.84mmol，2当量)溶解在DMF(42mL)中。随着15mL DMF，向该溶液中相继地填入在DMF(42mL)中的HOBt.H2O(0.67g，1当量)和HBTU(3.38g，2当量)的溶液、DIEA(3.44mL，4当量)。将反应物于25℃搅拌并通过HPLC监测。反应进行过夜(16.3小时)。然后，向反应混合物中加入哌啶(4.52g，12当量)。在25℃搅拌35分钟后，完成Fmoc的去除。将反应混合物用水(200mL)猝灭。填入180mL DCM，并且提取沉淀的产物。将底部DCM层用水洗涤两次(2x100mL)并且浓缩至50mL的体积。部分进料该浓缩的DCM溶液以沉淀产物。DCM通过真空蒸馏。向沉淀混合物中填入MTBE。将所形成的白色固体过滤，用MTBE/正庚烷(1∶1＝体积∶体积；2x50mL)洗涤，并且真空干燥，从而提供GLP-1备选片段3’a H-AA(28-36)-NH2(6.54g，重量产率为112.4％)。HPLC分析显示纯度为92.1％AN。
按照方案2液相合成粗GLP-1
实施例14
将GLP-1片段Fmoc-AA(18-27)-OH(1.87g)与2-Me-THF(20mL)和DMSO(5mL)在22℃混合。然后，将该溶液与片段H-AA(28-36)-NH 2 )(1.30g，1.0当量)合并并且搅拌。随着Me-THF润洗(5mL)，向该混浊悬浮液中填入DEPBT(0.41g，1.3当量)，接着填入DIEA(0.40mL，2.3当量)。将反应物于室温下(22℃)搅拌并通过HPLC监测。4.5小时后，反应完成检查表明反应尚未完成(16.8％过量的片段Fmoc-AA(18-27)-OH)。加入片段H-AA(28-36)-NH 2 )(0.43g)、DEPBT(0.13g)、和DIEA(0.08mL)的推料填料(kicker charges)。在室温下搅拌过夜后，HPLC分析表明反应完成。填入哌啶(0.30mL，3当量)并且将得到的反应混合物在室温下搅拌。在搅拌1小时后，去-Fmoc完成检查表明反应未完成。加入哌啶(0.30mL)推料填料。过夜搅拌后取样表明去保护反应完成。填入水(35mL)猝灭反应，并且萃取有机相。在相分离后，向水相中加入Me-THF(20mL)作为反萃取。将合并的有机相在真空下(95torr，37℃浴)蒸馏成油，重新溶解在Me-THF(30mL)中，并且再蒸馏成油。将油再溶解在Me-THF(30mL)中，并且将得到的混合物(随Me-THF(10mL)润洗)在15℃倾倒至含有正庚烷(60mL)的反应容器中。在30分钟老化后，将沉淀的产物过滤，用正庚烷(20mL)洗涤，并且过夜干燥，从而提供2.78g产物，纯度为55.2％AN，基于片段Fmoc-AA(18-27)-OH的产率为94.1％。
实施例15
将GLP-1片段Fmoc-AA(7-17)-OH(1.00g)在22℃溶解在THF(20mL)中。然后，将该溶液与片段H-AA(18-36)-NH 2 (181g，1.2当量)合并，并且搅拌以溶解所有的固体。随着THF润洗(5mL)，向该溶液中填入DEPBT(0.181g，1.2当量)，接着填入DIEA(0.22mL，2.4当量)。将反应物于室温下(22℃)搅拌并通过HPLC监测。2.5小时后，反应完成检查表明反应尚未完成(21.9％过量的片段Fmoc-AA(7-17)-OH)。加入片段H-AA(18-36)-NH 2 )(0.80g)、DEPBT(0.10g)、和DIEA(0.11mL)的推料填料。在室温下搅拌过夜后，HPLC分析表明反应完成。填入哌啶(0.30mL，6当量)并且将得到的反应混合物在室温下搅拌。在搅拌5小时后，去保护反应完成。然后，将反应混合物中的THF在真空下(35℃，在50mm Hg真空下)用DCM(13mL)替换。将残留物溶解在DCM(10mL)中，并且在15℃随着DCM润洗(2mL)，与DTT(2.04g)、水(2.0g)、和TFA(40mL)的溶液合并。在15℃搅拌6小时后，将反应混合物冷却至-3℃，并且通过填入冰冷的(-20℃)MTBE(180mL)猝灭。将猝灭的反应混合物在15°老化30分钟。将固体产物过滤，用MTBE(3x50mL)洗涤，并且过夜干燥。获得2.78g GPA粗产品(21.0％wt/wt)，纯度为38.9％AN；产率为163.6％(基于片段Fmoc-AA(7-17)-OH)。
在前述说明书、或随附的权利要求中，以它们的具体形式或在实施公开的功能的方式或用于获得公开的结果的方法或过程方面表述的特征，适当地，可以单独地或以这些特征的任何组合以其多样化的形式用来实现本发明。
为了清楚和易于理解的目的，前述发明已经通过举例说明和实施例的方式详细进行了描述。本领域技术人员应该清楚可以在随附权利要求的范围内进行改变和改进。因此，要理解，上述说明书意欲举例说明而非限制。因此，本发明范围的确定不应该参考上述说明书，而应该参考随附的权利要求，以及被授予所述权利要求的等价物的全部范围确定。
Figure IDA0000104415770000011
Figure IDA0000104415770000021
Figure IDA0000104415770000031
Figure IDA0000104415770000041
Figure IDA0000104415770000051
Figure IDA0000104415770000061

Claims (18)

1.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.5)
Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.6)
Z-SYLEG
其中
Z是N-端保护基；和
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
d)去除第三肽片段的N-端保护基，以提供第四肽片段，所述第四肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
e)提供第五肽片段，所述第五肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供促胰岛素肽，所述促胰岛素肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO.9)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EX10TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
2.权利要求1的方法，由步骤h)产生的所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID NO.4)
HAibEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKAibR。
3.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.6)
Z-SYLEG-B’
其中
B’是固相树脂；
Z是H-；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
c)将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.11)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEG-B’
其中
B’是固相树脂；
Z是N-端保护基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.11)的第四肽片段：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEG-B’
其中
B’是-OH；
Z是N-端保护基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.5)
Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
4.权利要求3的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID NO.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2。
5.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.12)
Z-SYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-；并且
B’是固相树脂；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
c)将第二肽片段与第一肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO.13)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKE-B’
其中
Z是N-端保护基；
B’是固相树脂；
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.13)的第四肽片段：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-；
B’是-OH；
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.14)
Z-FIAWLVKX35R-NH2
其中
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
6.权利要求5的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID NO.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2。
7.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.14)
Z-FIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.12)
Z-SYLEGQAAKE-B’
其中
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ.ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
d)将第三肽片段的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ.ID NO.7)的第四肽片段：
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是N-端保护基；
B’是-OH；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；
f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且
h)将由步骤h)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO.9)的去保护的促胰岛素肽：
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
8.权利要求7的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID NO.4)
HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2。
9.制备去保护的促胰岛素肽的方法，所述去保护的促胰岛素肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO.9)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-；并且
X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基，
所述方法选自如权利要求1、3、5和7中所述的方法。
10.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.5)
Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
11.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
12.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.8)
Z-HX8EGTFTSDVS-B’
其中
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
Z是H-或N-端保护基；
B’是-OH或固相树脂；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
13.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.11)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEG-B’
其中
B’是-OH或固相树脂；
Z是H-或N-端保护基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
14.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.12)
Z-SYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-或N-端保护基；并且
B’是-OH或固相树脂。
15.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO.13)
Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKE-B’
其中
Z是H-或N-端保护基；
B’是-OH或固相树脂；
X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
16.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ.ID NO.7)
Z-SYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
17.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ.ID NO.14)
Z-FIAWLVKX35R-NH2
其中
Z是H-或N-端保护基；
X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
18.权利要求10-17中任一项的肽，其中Z是Fmoc。
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