JP4927746B2 - 樹脂上ペプチド環化 - Google Patents
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Description
a.固相に結合されたペプチドであって、そのペプチドは、少なくとも1つのシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基を具備し、そのシステインは側鎖においてS−tert−ブチル−スルフェニル基によって保護されているペプチドを合成する工程、
b.N−末端で3,3’−ジチオ−(1−カルボキシ−プロピル)−プロピオニル−ラジカルを有している更なるアミノ酸とそのNα上でカップリングさせるか、任意に、N−末端アミノ酸のNαを脱保護し、そしてフリーのNαを3,3’−ジチオ−プロピオン酸イミドと反応させて対応するNα−3,3’−ジチオ−(1−カルボキシ−プロピル)−プロピオンアミドを生成するか、又は、N−末端アミノ酸のNαを脱保護し、フリーのNαを式IVの化合物、
R7−S−S−[CH2]2−COOH (IV)
ここでR7はアリール−、ヘテロ核アリールを含んだアリール−、又はアラルキル−、アルキルアリール−又はアルキル−であり、ハロゲノ、アミド、エステル及び/又はエーテルによってさらに置換されていてもよい、と反応させるかの何れかの工程、
c.ペプチドをさらにS−tert.ブチル−スルフェニル保護基除去試薬と、好ましくは、ペプチドを置換又は非置換トリスフェニルホスフィン又はトリスアルキルホスフィンと反応させる工程、
d.空気及び/又は酸素の存在下、形式的にはシステインとNα上の3−チオ−プロピオンアミド部位との間のジスルフィド結合の形成によってペプチドを環化する工程。
好ましくは、アルギニン側鎖は、合成中に、例えばトシル、ベンジルオキシカルボニル、ペンタメチレンクロマンスルホニル(Pmc)、ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル(Pbf)、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル(Mtr)及びその4−tbu−2,3,5,6−テトラメチル同族体(tart)、アダマンチルオキシカルボニル又はBocを用いて付加的に共有結合的に保護されてもよい。Pmc,Pbf,Mtr又はTartはArgの保護のために強く推奨され、最も好ましくは、それはPbfである。
が思いがけなくも発見された。−チオール試薬は、自らがジスルフィド生成物を形成することによって、ジスルフィドを還元、したがって切断してしまうことは、しばしば見過ごされる。DTTの場合は、分子内閉環が有利であるが、β−メルカプトエタノールの場合は、例えばジスルフィド交換反応による、あらゆる分子内反応生成物が可能である。さらには、新たに生成したジスルフィドでさえも、更なる交換反応を被ってもよい。チオール試薬の広範な使用は、3級ホスフィン試薬を用いるときの例えば樹脂からの漏出などの副反応のおそれを、明らかに負う。
本発明の新規で改善された方法を案出することを目指して、樹脂上での環化のための保護されたモデルペプチドとして、Eptifibatideが選択された;eptifibatideのための固相合成法は、すでに米国特許第5318899号明細書に記載されている。
FMOC−Cys(S−tBu)−OHの合成は、既に記載されている(Rietman et al., 1994, Synth. Commun.v24, p. 1323 f)。Sieber樹脂は、Novabiochemの製品であり、Calbiochem-Novabiochem(EMD Biosciences、カリフォルニア/米国に属する)から購入された。FMOC−Cys(S−tBu)−OH(cat. No. B-1530)を含めた全てのFMOCアミノ酸は、Bachem AG(Bubendorf,スイス)から購入された。
FMOC−Har残基(Bachem, Burgendorf, スイス)のカップリングは、アミノ酸1当量に対して1当量のHOBtの存在下で(グアニジノ基をプロトン化されたままにするために)行われた;FMOCアミノ酸は、HOBt及びNMP中の1当量のジイソプロピルカルボジイミドとともに事前にインキュベートされ、その後樹脂と混合された。Harカップリングは、180分を要し(他のアミノ酸:30分)、その後、補充された試薬を用いて、約60分間、第2サイクルが続いた。このようにして、他の残基に対してのように、標準的な99.8%のカップリング効率がかなえられた。
氷浴中で10℃より低くまで冷却されたDMF中で、3,3’−ジチオプロピオンイミド(Novabiochem)との反応が行われた。1当量のジイソプロピル−カルボジイミドが、10分間に亘って、攪拌しながら、温度が15乃至20℃以下に留まるように制御しつつ、反応混合物中に添加された。その後、反応混合物は、1.2節からの脱保護され樹脂に結合したペプチド生成物中に添加された。カップリングは、周囲温度で6時間進行させられた。
樹脂は、テトラヒドロフラン(THF)中で3回、懸濁及び洗浄された。反応は、室温で1時間、19%(v/v)PBu3/77%(v/v)THF/4%(v/v)酢酸ナトリウム飽和水溶液として調製された50当量のトリブチルホスフィンを用いて行われ、沈殿した塩は使用前に濾過された。反応は一様に進行し、1つの主要な生成物ピークを与えた。収率は逆相HPLCにより決定され、98.9%の純粋な生成物に達することが分かった。
1.4からのペプチド−樹脂共役は洗浄で膨潤させられ、そして、NMP中で3回洗浄された。環化は、樹脂を1時間、室温でNMP中の6%DIEA(Hunig塩基)とともにインキュベートすることによりなされた;反応は、水平に二分する封入されたG3(16乃至40μm)ガラスフリットを下方部分に具備した鉛直ガラス容器中で行われた。ガラスフリット又はフリット板は下方からの空気によって孔あけされ、フリット上方の溶媒で覆われた反応物空間の断面全体を横切る空気バブリングを可能とし、そこでは、下方からのバブリング空気によって樹脂が浮かんでいた。厳密に純粋で均一な生成物が得られ、はっきりとした又は断片的な副生成物が、この反応工程後に現れることはなかった。逆相HPLC及びLC−MSにより独立に決定された生成物への変換は100%であった。RP−HPLCは、Hypersil-KeystoneTM Betabasic(Thermo Electron Corp., Waltham Mass./U.S.A.)C18 150x4.6 mm カラム上で、35℃のカラム温度において、15μlの注入体積及び262nmでの検出によって行われた。勾配ランは、
Claims (24)
- ペプチド合成方法であって、
a.固相に結合されたペプチドを合成する工程であって、前記ペプチドは、少なくとも1つのシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基を具備し、前記システインは、その側鎖中においてS−tert.ブチル−スルフェニル基によって保護されており、前記システインは最後のC−末端残基であり、前記S−tert.ブチル−スルフェニル基によって保護されたC−末端のシステインは、カルボキシ末端を介してエステル結合又はアミド結合により前記固相に結合されるが、前記結合はベンジルエステル結合ではなく、弱酸性反応条件下で切断される酸置換活性な結合であるという条件付きである工程、
b.3,3’−ジチオ−(1−カルボキシ−プロピル)−プロピオニル−ラジカルを有する更なるアミノ酸をN末端にカップリングさせるか、又は、そのN−末端アミノ酸のNαを脱保護して、フリーのNαと3,3’−ジチオ−プロピオン酸イミドとを反応させて対応するNα−3,3’−ジチオ−(1−カルボキシ−プロピル)−プロピオンアミドを生成するか、そのN−末端アミノ酸のNαを脱保護して、フリーのNαと式IVの化合物とを反応させるかの何れかの工程であって、
R7−S−S−[CH2]2−COOH (IV)
ここで、R7はヘテロ核アリールを含めたアリール−、又はアラルキル−、アルキルアリール−又はアルキル−、さらにハロゲノ、アミド、エステル、カルボキシ又はエーテルによって置換されていてもよい工程、及び、
c.ペプチドをS−tert.ブチル−スルフェニル−保護基除去試薬と反応させる工程、及び、
d.ジスルフィド結合形成によって前記ペプチドを樹脂上で環化する工程
を含んだ方法。 - 前記d.ジスルフィド結合形成によって前記ペプチドを樹脂上で環化する工程は、空気及び/又は酸素の存在下、ジスルフィド結合形成によって前記ペプチドを樹脂上で環化する工程である、請求項1に記載の方法。
- 前記システインは、前記ペプチドのN−末端アミノ酸残基から、少なくとも3アミノ酸残基離れていることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記システインは、前記ペプチドのN−末端アミノ酸基から、少なくとも5アミノ酸残基離れていることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記固相樹脂は2−クロロ−トリチル(CTC)又はアミド生成樹脂から選択されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ペプチドは、別々に保護された更なる複数のシステイン、ホモ−又はノル−システインを含んだ少なくとも1つの更なる側鎖保護基を有していることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 少なくとも前記S−tert.ブチル−スルフェニル基の除去は、前記ペプチドをトリアルキルホスフィンと反応させることによって達成されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ペプチドは、極性非プロトン性溶媒中、弱塩基の存在下で環化されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ペプチドの前記固相への結合は、酸置換活性であることを特徴とする請求項1、2および8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドの前記固相への結合は、室温でジクロロメタン中の60%TFAにおいて置換活性であることを特徴とする請求項1、2および8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記樹脂はSieber樹脂であることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ペプチドは、続く工程において、樹脂から切り離されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ペプチドは、続く工程において、包括的な脱保護によって、樹脂から切り離されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- R4,R5はHであり、R3はN−ベンジル−カルボニルであり、R2は3級ブチルである請求項14に記載のペプチド。
- 前記固相は、結果として前記ペプチド骨格と結合するアミド結合となるSieber樹脂であることを特徴とする請求項15に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、少なくとも1つのアミノ酸側鎖保護基を含むことを特徴とする請求項17に記載のペプチド。
- R6は、少なくとも3つの介在アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項17又は18に記載のペプチド。
- R6は、少なくとも4つの介在アミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項17又は18に記載のペプチド。
- 前記ペプチドは、システイン、ホモ−又はノル−システイン残基上にS−tert.ブチル−スルフェニル基以外の少なくとも1つのアミノ酸側鎖保護基を具備していることを特徴とする請求項21に記載のペプチド。
- 前記ペプチドは、システイン、ホモ−又はノル−システイン残基上にS−tert.ブチル−スルフェニル基以外の少なくとも1つのアミノ酸側鎖保護基を具備していることを特徴とする、請求項23に記載のペプチド。
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